专利名称：含有作为疫苗辅药的磷酸铁的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，特别地涉及含有辅药的疫苗组合物的领域。更具体地，本发明涉及其中辅药包括磷酸铁的疫苗。
人们由现有技术知道疫苗组合物，它们含有在给予抗原时在质的方面能增加和改变所诱发免疫反应的辅药。事实上，在疫苗工业中进行的研制导致使用由病毒或细菌得到的抗原，然而要使用越来越完善的纯化方法，以及来自生物技术的抗原。这些抗原的优点一般比过去使用的某些抗原更纯些，但是，它们免疫作用往往要差些，因此需要使用辅药。
已经描述过许多辅药皂苷、乳液、阳离子类脂物等。
但是，直到今天，在这些商品中通常使用唯一的辅药是铝基辅药。然而，还应希望有其它的辅药。
在与辅药相关的现有技术中，特别可以列举专利US 5 895 653，它描述了呈胶体溶液形式的氢氧化铁化合物作为辅药，它的吸附能力与前面描述的呈凝胶形式的氢氧化铁相比获得了改善。
但是，如果说这样一些辅药是实际使用铝基辅药的替代品的话，它们并不可能总是有效替换它们，因此也希望拥有其它的化合物，其特性是这样的，即它们同时对服用它们的生物具有良好的耐受性，它们可以在与医药工业要求相容的条件下生产，并且特别地，它们能够增加或改变对疫苗抗原的免疫反应，以便至少与实际使用的铝基化合物同样有效。
为此，本发明的目的是一种疫苗组合物，它含有至少一种疫苗抗原和至少一种辅药，其特征在于这种辅药包括磷酸铁。
根据一个特别的特征，该磷酸铁呈微粒悬浮液形式，其微粒尺寸是0.01-300μm，更特别地1-40μm，特别是尺寸约7μm的微粒的含量很大。
根据一种本发明的特别实施方式，使用铁盐和磷酸盐溶液制备磷酸铁。
一种这样的制备方法能够得到一种微白色的非结晶产物，因此保证给一般健康状况好的人服用时所必需的任何安全条件。
在下面参照附图所作的描述过程中体会到本发明的许多优点，该
在实施例3描述的试验时所得到的结果；图1表示第一次免疫后得到的IgG1结果，而图2表示第二次免疫后得到的结果；图3表示第一次免疫后得到的IgG2a结果，而图4表示第二次免疫后得到的结果。
在本发明意义上，疫苗组合物应该理解是一种能给人或动物使用，以诱发免疫系统反应的组合物；这种免疫系统的反应可能表现在产生抗体，或仅仅激活某些细胞，特别是抗原表达细胞、淋巴细胞T、淋巴细胞B。这种疫苗组合物可以是一种具有防疫目标或具有治疗目标或两者兼而有之的组合物。
在本发明意义上，抗原应该理解是能用于疫苗的任何抗原，不管它涉及整个或亚单元抗原种，不管其性质肽、蛋白质、葡萄糖蛋白质、多糖、糖脂、脂肽等。可能涉及病毒、细菌或其它的抗原；在称之为DNA免疫作用的免疫技术的情况下，抗原术语还包括多核苷酸，其序列选择是为了给人们希望观察到人在服用这些多核苷酸时被表达的抗原编码。还可能涉及一个抗原系统，特别在含有能防止多种疾病的抗原，并一般为称为疫苗组合的多价疫苗组合物的情况下，或在含有防止单一疾病的多种不同抗原的组合物的情况下尤其如此，例如抗百日咳或流行性感冒的某些疫苗便是这种情况。
使用含有抗白喉、破伤风和脊髓灰质炎抗原的疫苗组合物尤其可以得到特别好的结果。
为了本发明，磷酸铁是一种以无定形、结晶或假结晶磷酸铁为基础的惰性无机化合物。使用无定形磷酸铁得到了非常满意的试验结果。
使用铁盐和磷酸盐溶液制备这种化合物。作为铁盐，特别可以使用柠檬酸铁，或特别有利地使用氯化铁。
作为磷酸盐，特别可以使用磷酸钠。
将两种原料组分同时或相继混合可以制备磷酸铁。其混合顺序可以是把氯化铁加到磷酸钠中，或反之，把磷酸钠加到氯化铁中。加入速度可以非常快，或相反地可以滴加。
为了得到适合于本发明需要的磷酸铁，指出铁盐与磷酸盐的比为2倍以上是令人满意的。
或者，可以使用喷雾器制备磷酸铁。在这种情况下，可以将磷酸钠喷到氯化铁溶液中，或相反地把氯化铁喷到磷酸钠中。
制备本发明的疫苗组合物时，可以在刚开始配制时，把磷酸铁加到疫苗组合物中。磷酸铁这时稀释到一定的浓度，然后往其中添加有意义的抗原。
另外也可以把磷酸铁添加到已经含有部分疫苗组合物的真空冷冻干燥制剂中，在该组合物中含有有意义的抗原。
根据本发明，磷酸铁是在疫苗组合物中，其量足以实施辅药作用。
在使用单一辅药的情况下，疫苗组合物的用药剂量可以是0.2-1.4mg磷酸铁。
在与其它辅药联用的情况下，现有的量可以根据所希望辅药作用和现有其它辅药的能力而减少。
家兔的局部和全身毒性试验表明，对磷酸铁的耐受性与氢氧化铝的一样。
下面的实施例说明了本发明的特别实施方式。
实施例1磷酸铁和氢氧化铁的制备将0.5M FeCl3·6H2O(由SIGMA以批号55H 1251提供的)混合到0.25MNa2HPO4·2H2O(由Merck以批号FA004911提供的)的溶液中制备磷酸铁。2种产品按照下述比例混合往含有108.12g FeCl3·6H2O的800ml超滤H2O的溶液中加入含有44.5gNa2HPO4·2H2O的11超滤H2O。在室温下进行混合。
使用搅拌棒搅拌15分钟，然后进行离心，相继用水洗涤沉淀。在每次洗涤后，借助用硝酸银测定氯离子的方法检测氯离子的存在。不再有氯离子时，即10次洗涤后，将沉淀置于水中，再在118□的压力釜中1小时以保证无菌。
以这种方式得到的溶液是一种含有16g Fe/l的磷酸铁溶液。
在室温下，将0.5M柠檬酸铁与2M NaOH混合制备氢氧化铁。往100ml柠檬酸铁溶液滴加NaOH，直至达到pH8。以与制备磷酸铁的同样方式，搅拌15分钟，然后进行离心，相继用水洗涤沉淀，并用硝酸银测定氯离子。不再检测到氯离子时，将沉淀置于水中，再在118℃的压力釜中1小时以灭菌。这时得到的溶液是一种6.3g Fe/l的氢氧化铁溶液。
实施例2制备疫苗组合物使用如前面指出制备的溶液、含有10.8g Al/l的氢氧化铝的水悬浮液(由Reheis提供)以及浓度330絮凝剂单位或Lf/ml(即蛋白质浓度0.9125g/l)的PTP制剂(纯化破伤风蛋白质)，制备下述组合物·仅PTP840μlH2O+120μl9％NaCl+100Lf/ml的240PTP，·PTP和AlOOH618μlH2O+222μl10.8g Al/l AlOOH+120μl9％NaCl+100Lf/ml的240PTP，·PTP和FePO4690μlH2O+150μL16g/1FePO4+120μL浓缩10倍的PBS缓冲溶液(即95mM Na2HPO4·2H2O)+100Lf/ml的240 PTP，·PTP和FeOOH458μlH2O+382μl6.3gFe/l FeOOH+120μl浓缩10倍的PBS缓冲溶液+100Lf/ml的240 PTP。
实施例3抗破伤风抗体的测定取4组各为6只6周龄雌鼠OF1。
每组鼠使用实施例2制备的其中一种配方。
在麻醉下，采用在股四头肌中肌肉内的方法，第1天和第22天2次注射，每次50μl进行用药。用药量因此是2絮凝剂单位或Lf的PTP和在含有辅药的配方情况下是0.2mg无机物(或者铝，或者铁)。
在第15天，从每支鼠后眼框窦取血约300μl。
在第36天，在麻醉下切断颈动脉，使这些鼠放血。
基于相应于回收血液的每份血浆，采用ELISA方法测量PTP的有效IgG1和IgG2a。
得到的结果示于图1-4中，这些结果表明磷酸铁是一种好的辅药；涉及IgG1时，得到的结果明显高于只用这种抗原时所得到的结果，虽然它们稍微低于用氢氧化铝得到的结果；涉及IgG2a时，达到的比率也比用氢氧化铝达到的结果高。
实施例4检验抗破伤风活性通过一个试验检验本发明组合物的抗破伤风活性，该试验在于用鼠评价这些组合物对采用皮下方法用药的毒素致死剂量的活性。
将保护50％有毒素作用动物所需要的剂量(DE50)与以UI/ml表示的已校准参比疫苗的相比，可确定试验组合物的活性。
将辅药(0.6mg/剂)与水、30LfADP(白喉类毒素)和10LfATP(破伤风类毒素)混合，然后添加20μg/剂量硫柳汞和盐溶液(90g/l NaCl和5mM Na2HPO4·2H2O溶液)，得到试验配方。
试验的疫苗组合物含有或者氢氧化铝，或者磷酸铁，或者氢氧化铁。
使用每个辅药得到的结果汇集于下表中，表明磷酸铁是一种好的辅药，比在同样条件下的氢氧化铁好得多
权利要求
1.含有至少一种疫苗抗原和至少一种辅药的疫苗组合物，其特征在于该辅药包括磷酸铁。
2.根据上述权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于磷酸铁呈微粒悬浮液形式，其微粒尺寸是0.01μm-300μm。
3.根据上述权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于其微粒尺寸是1-40μm。
4.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于其微粒尺寸的中心是在值7μm周围。
5.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于磷酸铁是用铁盐和磷酸盐溶液制备的。
6.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于它至少含有破伤风抗原。
7.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于它至少含有白喉抗原。
8.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于它至少含有一种脊髓灰质炎抗原。
全文摘要
本发明涉及疫苗组合物，它含有磷酸铁作为辅药。所述的磷酸铁呈微粒悬浮液形式，其微粒尺寸是0.01μm－300μm。它可以是将铁盐与磷酸盐溶液混合得到的。
文档编号A61K39/05GK1791432SQ200480013365
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月16日
发明者E·索兹特 申请人:赛诺菲巴斯德有限公司