专利名称：用于治疗情绪功能障碍的糖胺聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖胺聚糖、特别是那些平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖的新药学应用。
背景技术：
情绪紊乱属于精神疾病范畴，包括抑郁、焦虑、精神病和躁狂综合征，其主要表现形式为对环境的异常反应，范围从进攻性到意识模糊状态到情感淡漠。
根据情绪紊乱的起因，以各种方法对其进行药物治疗。单相情感障碍的治疗使用三环类抗抑郁药如丙咪嗪，或者杂环类抗抑郁药如选择性5-羟色胺吸收抑制剂如氟西汀，或者用单胺氧化酶抑制剂如苯乙肼(该类药物优选收录于药理学教材“治疗学的药理学基础”第19章，2001年X版)。
相比之下，双相情感障碍的治疗使用锂、丙戊酸或者具有抗惊厥作用的其他药物(该类药物优选收录于上述的药理学教材第20章)。
原发性焦虑症如泛化性焦虑症和强迫性综合征的治疗使用已提及的产品类别或者用苯并二氮杂类和/或丁螺环酮。
然而，所有上述病症具有综合征的内涵，并且在“精神障碍的诊断和统计手册(Manuale diagnostico e statistico dei disturbi mentali，DMS-IV-R)”中进行了定义。
强烈推荐治疗所有这些病症，并且认为约75％的患者从中获得临床显著益处。
但是，情绪紊乱的药物治疗伴随有众多副作用，其中包括正常意识状态的改变。
某些情绪紊乱如攻击性、意识模糊状态和不能适应新环境被认为是由于脑中细胞外基质在流动性和容量方面的改变，导致影响了脑突触和脑内信号传递(还有传递容量方面)的水平。
因此，能够改变ECM流动性和容量的产品可用于改善脑内信号传递。
另外，已知脑内注射糖胺聚糖具有高致焦虑(hyperanxiogenic)作用。
发明概述现已令人惊讶地发现在体内，平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖能够校正情绪紊乱而不改变正常意识状态，这是由于它们能够预防或减少脑中细胞外基质(ECM)的改变。
因此，平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖组分可用于制备适合于治疗情绪功能障碍的药物组合物。
发明详述因此，本发明涉及平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖组分在制备能够预防或减少脑中细胞外基质的病理改变的药物中的用途。所述组合物因此可用于治疗情绪功能障碍、特别是抑郁症、焦虑症、焦虑性神经症、激动和意识模糊。
众所周知，糖胺聚糖(GAG)是人体内最丰富的异源聚糖，由二糖重复单元组成，它们是按顺序由一个或两个经修饰的糖即N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡糖胺以及糖醛酸如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸形成。
本发明特别涉及平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖组分。
优选地，本发明的GAG得自透明质酸盐、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素和硫酸乙酰肝素，或硫酸角质素。
所述组分可通过将相应的糖胺聚糖经过不同步骤解聚而制备，包括伽玛射线照射糖胺聚糖，继之以凝胶过滤和超滤。得到根据本发明的糖胺聚糖的方法在现有技术中已知。
根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的GAG组分得自肝素，例如按照EP 1181024中所述的方法获得。
药理学实验对于根据本发明的糖胺聚糖组分的药理学研究而言，采用大鼠实验模型进行了以下评价1)对环境的反应，采用“开场(open field)”或OF试验；2)在水迷宫中的学习能力，采用“莫氏水迷宫”(Morris water maze，MWM)试验；3)对敌对环境的条件反射，采用“情境依赖性恐惧条件反射”(context-dependent fear conditioning，CDFC)试验。
试验所用材料使用十三只Brown Norway大鼠，体重300-350g，11月龄，得自HarlanSprague-Dawey公司(Indianapolis In.)。
在开始任何治疗或生物学试验之前，使动物适应新环境两周。随机分组为药物治疗组(7只动物)或单独载体组(6只动物)。将动物置于单独的笼子中，在调控温度(22-26℃)和12小时昼夜光节律(给光起始于7:00)的环境下，根据实验动物保护评价和鉴定委员会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的条例进行评价。动物随时进食和饮水。所有的行为评价在9:00-13:00之间于邻近生活区域的隔音环境中进行。在实验结束时，即用研究产品治疗或用载体治疗42-44天后，以大剂量戊巴比妥钠处死动物(腹膜内注射100mg/kg)。所有程序均经过Loyala大学医学中心的科研动物保护和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。
平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖组分(此后用符号C3表示)是通过伽玛射线照射肝素进行解聚、随后分级分离得到所需分子量而获得，如EP 118024所述，而且由水溶性白色粉末组成。将其以一定浓度溶于饮用水中，该浓度使动物在42至44天的期间内，每天接受25mg/kg的施用量。在前两周的适应期内，监测每只动物的水消耗量。在实验期间，每3-4天更新含有C3的饮用水。
以下方案示出行为分析的实验步骤，细分为周
两周后(一周用于适应，另一周用于监测水消耗量)，对动物进行一系列的三种试验OF、MWM、CDFC。
OF(开场试验)暴露于新环境(12分钟)后产生的行为可用于测量恐新反应(neophobicresponse，对新环境的恐惧)和探查反应。
OF试验于尺寸为100cm×100cm×40cm高的平台上进行。墙壁由涂膜胶合板构成。地板涂为白色，并用细黑线标出25个方格(25cm×25cm)。在中央九个方格所组成方格的四角上，各有一个直径为3.5cm的洞。
平台置于无直接光照的隔音室内。
将动物置于平台中央，观察12分钟。
将它们的行为记录在录像带上。评价以下行为要素1)以秒计算的离开方格中央所用的时间(恐惧或起始“惊呆(freezing)”的量度)和进入一个沿墙壁方格的时间(趋触性)；2)踏过方格的数量(水平探查)；3)直立次数，即大鼠用后腿站起的次数(垂直探查)；4)大鼠将其口鼻探入地板上任一洞口的次数。
每次实验后，用70％酒精清洗OF，以除去任何与单个动物有关的嗅觉刺激。
MWM(莫氏水迷宫)学习和空间记忆力可利用水迷宫来评价，其中测量动物学习和记忆可使其离开水的平台位置的能力。另外，该试验可评价动物的兴奋或镇静状态。
迷宫是由涂为白色的塑料圆柱体构成(直径152cm、高74cm)，充水至56cm高并且划分为象限。在中心到边缘的正中、水面下1.5cm处有一个9cm2的平台。加入奶粉，使水不透明，温度保持在22-26℃之间。保持迷宫外的参照点不变。将每个动物的行为记录在录像上(SMART Video跟踪系统，San Diego Instruments，San Diego，CA)。将与电脑相连的摄像头放置于迷宫中央的上方。由电脑计算1)动物到达隐藏平台的路程长度(cm)；2)在每个象限的暂停(秒)和穿行距离(cm)；3)找寻和爬上平台的潜伏期(秒)。
一天对动物进行4次该试验。每次试验时，将动物放置于迷宫边缘。在最初的6天里(学习)，平台总是固定于同一个位置(象限1)，在随后7-9三天里，将平台置于不同的位置(象限3)进行“逆转”试验。
在第一次试验中，将动物放置于象限2中，与平台所在象限(即象限1)相邻。在同一天的随后三次试验中，将动物置于顺时针移动相邻的象限中。试验进行至动物到达平台或达到60秒的最大值。如果动物在60秒之内不能成功到达平台，则将其轻轻地放置到平台上，并保持60秒不被打扰。每只动物置于平台60秒，随后立即重复试验。在4次试验结束时，用毛巾轻轻擦干动物并放回到笼中。
CDFC(情境依赖性恐惧条件反射)该试验测量动物学习和记忆与不利无条件刺激(UCS)配对的条件刺激(CS)的能力。
该试验于连续五天中进行，可用于分析动物学习和记忆事件(“前景”)与环境(“背景”)之间关系的能力，所述事件是条件性事件(CS或灯光)和无条件性事件(UCS适度电击)。
连续两天使动物适应第一种环境情景(情景A)。
第三天，分析动物在三个连续刺激期内的行为，这些刺激由分别代表CS和UCS的光、然后电击(爪下通过微小电流，中等强度但足以产生疼痛)组成；这些刺激引起恐惧状态，表现为“惊呆”现象(动物突然停滞于一种特征性姿态)，可精确测量恐惧的程度。该系列刺激实际上代表了在情景A中进行的被称为“前景”的事件。
第四天，将动物放回情景A中，但不给予任何CS或UCS刺激。这就有可能分析动物在“背景”(即先前发生CS-UCS事件的环境)中的行为。以前的实验表明海马损伤关系到完全不能记住该“背景”与条件反射(即“前景”)相关。第四天完全缺乏惊呆表明记忆功能障碍，即动物没有记住事件发生的情景。
第五天，将动物置于一个不同的环境(情景B)并且只给予光刺激(CS)，以测定动物是否记住该刺激代表一种与环境无关的不利事件(在本阶段不施加UCS类刺激)。动物对这种不同情景表现惊呆反应的能力表明它觉察到灯光刺激的负面意义，即其后跟随着疼痛刺激。
通过小实验箱来展现情景A和B(48cm长×25cm深×28cm高)，实验持续8分钟。
在情景A中，地板由金属管制成的栅栏组成，金属管直径为2.5mm、相距10mm(中心到中心)。实验箱的壁面都为PlexiglasTM，正面壁透明，后面的为黑色，其他为白色。用于光刺激的7.5W灯位于实验箱侧壁之一的中央，距离实验箱后壁14cm。
第三天的“前景”条件反射如下2分钟的间隔后，打开灯(CS)，20秒钟后通过金属栅栏电击动物的四足(“足电击”)，0.8mA强度的交流电持续2秒钟，由Grason-Stadler发电机供电，其型号为E1064GS。再给予动物另外两个阶段的CS和UCS，每次间隔两分钟，共给予3对CS-UCS。将所有阶段录像，然后评价。
利用秒表以秒为单位，基于录像记录测量四个阶段(共2×4分钟＝8分钟/天)内“惊呆”的程度。
第四天再使用情景A，但不对动物进行任何刺激，因此该实验用于评价对单独背景的反应，即对敌对环境的记忆。如第三天测量惊呆。
第五天使用情景B。实验箱的尺寸与情景A中的相同，但是栅栏和后壁用胶合板代替。每一阶段之后，立即用PetZymeTM(能去除颜色和气味)清洁实验箱。PetZymeTM产生的嗅觉刺激不同与第1-5天情景A中所用的70％酒精。两分钟间隔后，以两分钟间隔三次给予CS(20秒钟灯光)，不给予UCS。因此，第五天用于测量前景条件反射，即环境与敌意的关系。如第三天测量惊呆。
基于计算平均值和标准偏差(SE)进行数据的统计分析，采用非参数统计(Mann-Whitney“U”检验)进行两组间的比较。
结果动物每天的液体消耗量为35.7±1.1ml，C3不影响该消耗量。
开场试验1)离开中央的时间(秒)平均值±SE(标准偏差)(水平探查)对照组 25.0±8.0C3组 12.6±2.5U检验P＜0.052)踏过方格总数平均值±SE对照组 56.5±3.4C3组 76±8.4U检验P＜0.05这些结果显示用C3治疗减轻了对环境的恐惧，因此增加了动物的探查态度。
MWM(莫氏水迷宫)有关该试验，在治疗动物与对照动物之间没有观察到显著差异。习得和“逆转”的情形都出现重叠性(数据未报告)。由于该试验的评价是基于到达平台的路程长度和所用时间，因此可以说明C3不改变学习或能动性，因此不施加任何刺激作用。换言之，经C3治疗的动物既不镇静也不兴奋。CDFC(情境依赖性恐惧条件反射)1)惊呆时间(秒)第三天四个阶段的平均值±SE
*U检验P＜0.05结果显示C3显著减少了运用了CS和UCS刺激的所有阶段的惊呆，表明了对前景的作用，包括当面对敌对环境时恐惧减少。
2)正如方法中所示CDFC的第四天，将动物放置于实验箱达8分钟时间，其中各个2分钟的阶段不安排任何刺激。
但是在这些条件下，动物倾向于将环境(背景)与敌对事件(前景)的记忆联系起来，因此产生恐惧情况。
结果示于下表中惊呆时间(秒)第四天四个阶段中的平均值±SE
*U检验P＜0.05
在第一阶段中，C3治疗组的平均值相对于对照组显著更为降低，通常表明当面对敌对环境时更能控制恐惧。后来阶段中，组间不再存在差异，惊呆时间的增加值在两组间无显著差异，表明两组中都仍然存在对曾经敌对环境的记忆。
3)下表显示第五天的结果，即当环境情景改变、只给予光刺激而不给予疼痛刺激(因此无栅栏)。
惊呆时间第五天所有阶段中的平均值±SE
*U检验P＜0.05结果显示两组中的惊呆行为相似，即两组中都有平稳的增加。在C3治疗组中，第六分钟时惊呆衰减，与零有显著性差异，并基本上在整个阶段降低更多。
结论以25mg/kg/天的剂量用C3进行为期42-44天的治疗，表现以下益处1)OF情感反应减少，探查增加。
2)CDFC习得期内(第三天)的惊呆减少，暴露于单独的敌对环境但没有制造敌意时惊呆衰减(第四天)，以及暴露于类似的新情景并具有部分刺激刺激时惊呆衰减(第五天)。所有这三个元素、尤其是与习得期有关的元素明确表明对环境及其可能敌意的更好适应。
3)在所述条件和各个时期内(学习和逆转)，没有学习和空间记忆损伤，可借助水迷宫测评。
4)无CNS兴奋或抑制作用，可通过运动活性的变化来揭示。
因此，所获得的结果证明C3可改善对环境的情感反应，且无CNS抑制剂或兴奋剂的作用。
平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖因此可用于制备适合用于治疗情绪功能障碍的药物组合物。
所述组合物包含药学有效量的活性成分以及药学可接受的稀释剂或赋型剂，并且可以是适合于皮下、肌肉内、静脉内和口服施用的形式。
药学可接受的稀释剂或赋型剂的实例有生理盐水溶液、硅胶。
所述组合物通常含有10mg至100mg量的糖胺聚糖。
治疗情绪功能障碍包括向患者施用约10mg至400mg/天的活性成分。
具体而言，对于皮下、肌肉内和静脉内施用，优选施用10-50mg/天，对于口服施用，优选施用50-100mg/天。
权利要求
1.平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖组分在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物能够预防或减少脑中细胞外基质的病理性改变。
2.根据权利要求1的用途，其中所述糖胺聚糖组分通过解聚透明质酸盐、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素而获得。
3.根据权利要求2的用途，其中所述糖胺聚糖组分通过解聚肝素而获得。
4.根据权利要求1至3的用途，其中所述药物组合物用于治疗情绪功能障碍。
5.根据权利要求4的用途，其中所述情绪功能障碍为抑郁症、焦虑症、焦虑性神经症、激动、意识模糊。
6.根据权利要求1-5的用途，其中所述药物组合物含有10至100mg所述平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖。
7.治疗情绪功能障碍患者的方法，包括施用10至400mg/天的平均分子量为2400(200)D的糖胺聚糖。
8.根据权利要求7的方法，其中通过皮下、肌肉内或静脉内途径向所述患者施用10至50mg/天的所述糖胺聚糖。
9.根据权利要求7的方法，其中通过口服途径向所述患者施用50至100mg/天的所述糖胺聚糖。
全文摘要
本发明涉及平均分子量为2400D(200)的糖胺聚糖组分在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物适合于治疗情绪障碍、特别是抑郁症、焦虑症、焦虑性神经症、激动、意识模糊。
文档编号A61P25/28GK1791416SQ200480013609
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月19日 优先权日2003年5月21日
发明者翁贝托·科尔内列, L·德安布罗西, S·洛伦斯, J·法里德, J·李, I·哈宁, R·梅尔维斯 申请人:翁贝托·科尔内列