专利名称：氚化的生长激素促分泌素 mk－0677的制作方法
由垂体分泌的生长激素，刺激能够生长的身体的所有组织的生长。此外，已知生长激素对于身体的代谢过程具有如下基本作用(1)增加身体所有细胞的蛋白质合成的速度；(2)减少身体的细胞中的碳水化合物的利用的速度；(3)增加游离脂肪酸的转移和将脂肪酸用于能量。在生长激素分泌中的缺陷可导致各种医学疾病，诸如侏儒症。
已知释放生长激素的多种途径。例如，化学品诸如精氨酸，L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，胰高血糖素，血管升压素，和胰岛素诱导低血糖症，以及活动诸如睡眠和运动，其通过以某种方式作用在下丘脑从而也许减少促生长素抑素的分泌或增加已知促分泌素生长释放因子(GRF)或未知内源生长激素释放激素的分泌或所有这些来间接导致生长激素从垂体中释放。
至于术语“生长激素促分泌素”(GHS)指在动物中直接或间接刺激或增加生长激素释放的任何化合物或试剂。生长激素促分泌素(特别是具有放射性标记的生长激素促分泌素)作为体外了解生长激素分泌是怎样在垂体水平被调节的独特工具是有用的。这包括在被认为或已知影响生长激素分泌的许多因子诸如年龄、性别、营养因素、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸以及空腹和非空腹状态的评价中的应用。此外，生长激素促分泌素在评价其它激素是怎样调节生长激素释放活性中是有用的。例如，已经确定生长激素抑素抑制生长激素释放。作为重要的和需要研究它们对生长激素释放的影响的其它激素包括性激素，例如，睾酮，雌二醇，和孕酮；肾上腺激素，例如，皮质醇和其它皮质激素类，肾上腺素和去甲肾上腺素；胰和胃肠激素，例如胰岛素，胰高血糖素，促胃液素，胰泌素；血管活性肽，例如，铃蟾肽、神经激肽；和甲状腺激素，例如，甲状腺素和三碘甲腺原氨酸。还可将生长激素促分泌素用于研究一些垂体激素，例如生长激素和内啡肽对垂体的可能的反向或正向反馈影响以调节生长激素的释放。在科学上的特别重要性是应用生长激素促分泌素来阐明调节生长激素释放的亚细胞机制。
本领域已知确定作为生长激素促分泌素的化合物的活性的方法。例如，Smith，et al.，Science，260，1640-1643(1993)描述的来自体内(ex vivo)的测定(见本文图2正文)，但是该测定需要使用细胞培养物并不给出竞争性结合活性的指示。因此，开发用于鉴定和表征在生长激素促分泌素的活性中具有作用的细胞受体的放射性配体将是理想的。获得放射性配体用在测试化合物的生长激素促分泌素活性的测定中也将是理想的。
这些研究通常需要高特异性活性的放射性配体。以前使用来自GHRP-6的[T]-标记或[125I]-标记的肽配体开发结合测定取得了有限的成功。见R.F.Walker，et al.Neuropharmacol.989，28，1139和C.Y.Bowerset al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.1991，178，31.通常，这些肽配体的结合是低亲和性的并且具有非常高的能力。而且，结合亲和性与肽的生长激素分泌活性不相关。结合和生长激素分泌活性的相关性的缺乏最可能是放射性配体的相对低的特异性活性(在[T]GHRP-6的情形中)和非-特异性结合特性的结果。
WO 9722367提供刺激内源生长激素释放并具有高特异性放射化学活性的[35S]放射性标记的化合物。所述化合物作为非肽的生长激素促分泌素属于在WO 94113696/EP0615977和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7001-7005(1995 7月)中公开螺环(Spiro)化合物。这些化合物具有刺激天然或内源生长激素释放的能力。在本文公开的优选的化合物中的是具有高生长激素分泌活性的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1t-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺。这些化合物是作为未标记化合物被公开的。本发明的目标存在于提供WO 94113696/EP0615977中描述的类型的放射性标记的化合物，以用在筛选方法分析中。通常，在其中需要特异性活性＞100Ci/mmol的情形中，放射性碘是研究受体的标记的选择。见K.G.McFarthing，In Receptor-Ligand InteractionsA PracticalApproach；Hulme，E.C.，Ed.；Oxford University Press，Oxford，1992；Chapter 1。但是，卤素原子(例如，氯，溴)在苄基基团的对位位置或在螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲基-氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺的螺-二氢吲哚苯基基团的5-位置的结合导致在来自大鼠垂体细胞的生长激素释放上的固有活性的＞20倍的丧失。这说明在这些位置上的碘取代(诸如用125I)将不提供高效配体。而且，碘具有高程度的亲脂性并可进一步改变配体的亲和性。增加的亲水性(水溶解性)通常与观察到的放射性配体的“粘性”呈逆相关，所述配体的“粘性”经常严格限制其在各种受体制剂中的有用性，见M.W.Cunningham，et al.In Radioisotopes in BiologyA Practical Approach；Slater，R.J.，Ed.；Oxford University Press，Oxford，1990；Chapter 6。在这点上注意与125I同族元素(1的X值＝1.12)相比，具有甲氨磺酰(methane sulfonamide)基团的配体应显示减少的亲脂性(NHSO，CH，的X值＝1.18)。见C.Hansch，et al.J.Med.Chem.1973，16，1207。此外，发现氨基官能度对于生物学活性是必需的并因此其与广泛应用的Bolton-Hunter试剂的结合不是可行的备选方案。见，K.G.McFarthing，InReceptor-Ligand InteractionsA Practical Approach；Hulme，E.C.，Ed.；OxfordUniversity Press，Oxford，1992；Chapter 1。
在WO 9722367中，获得了用[35S]进行放射性标记到高比活的N-[1(R)-[(1，2-二氢-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1t-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺。
然而，使用35S标记的放射性配体的主要缺点是短半衰期和对废物处理的要求。如已经在上面指出的，以前使用衍生自GHRP-6的氚标记的肽配体开发的结合测定取得了有限的成功。令人惊奇的是，本发明者发现可以充分高比活提供三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氢-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-，单甲磺酸酯(monomethanesulfonate)，可将其成功用在结合测定中。
发明描述本发明涉及放射性标记的生长激素促分泌素，其包括下式的至少一个化合物
其中，R1-R6互相独立的是H或T，并且其中R1-R6的至少一个是T。
用于本文时，术语“放射性标记的生长激素促分泌素”指在上文中描述的个体化合物以及在上文中描述的化合物的混合物。因此，本发明的放射性标记的生长激素促分泌素还可通过所述化合物的每个分子出现的T的平均数目来表征。
用于本文时“T”指氚原子。
术语“三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氢-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-，单甲磺酸酯”指上文描述的放射性配体，其中在所述放射性配体中存在平均数约3T。
术语“MK0677”指上述指出的式的未标记的化合物，其中R1-R6是氢。用于本文时，术语“T-MK0677”指本发明的氚-放射性标记的生长激素促分泌素。
已经在专利EP 0615977公开了未标记的化合物的结构。
在一个优选的实施方案中，上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素具有介于86.4 Ci/mmole和115.2 Ci/mmole之间的比活。在一个更加优选的实施方案中，上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素具有97.5Ci/mmole的比活。
本发明提供将上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素应用于鉴定可与生长激素促分泌素受体结合的化合物。还提供了鉴定作为生长激素促分泌素受体的细胞受体的上文描述的放射性标记的生长激素的应用。此外，可将上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素用于鉴定作为生长激素促分泌素的化合物的活性。
而且，本发明提供合成放射性标记的生长激素促分泌素的方法，所述方法包括使具有下式 的化合物与X-α-氨基异丁酸-[甲基-T]反应，其中将X定义为保护基，如果出现，随后将所述保护基去除并且如果需要形成盐。
本发明还涉及可通过上文所述的方法获得的放射性标记的生长激素促分泌素。
除此之外，本发明涉及鉴定在宿主中被表达为生长激素促分泌素受体的细胞受体的方法，所述方法包括使细胞受体与上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素接触并确定所述放射性标记的生长激素促分泌素的结合是否已经发生。所述宿主可以是组织，初级细胞或被认为表达生长激素促分泌素受体的培养的细胞。
本发明提供一种鉴定可与生长激素促分泌素受体结合的化合物的方法，所述方法包括在存在上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素存在时，使所述化合物与表达生长激素促分泌素受体的宿主接触，并监测所述化合物是否影响放射性标记的生长激素促分泌素与生长激素促分泌素受体的结合。所述宿主可以是组织样品，初级细胞或培养的细胞，所述培养的细胞天然表达生长激素促分泌素受体，或被生长激素促分泌素受体瞬时或稳定转染。转染细胞的方法是本领域众所周知的(Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA)。
而且，本发明还提供鉴定作为生长激素促分泌素的化合物的活性的方法，所述方法包括在上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素存在时，使被认为具有生长激素促分泌素活性的化合物与表达生长激素促分泌素受体的宿主接触，并监测被认为具有生长激素促分泌素的活性的化合物是否影响上文描述的放射性标记的生长激素促分泌素与生长激素促分泌素受体的结合。所述宿主可以是组织样品，初级细胞或培养的细胞，所述培养的细胞天然表达生长激素促分泌素受体，或被生长激素促分泌素受体瞬时或稳定转染。转染细胞的方法是本领域众所周知的(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA)。
本发明还提供通过上文描述的方法鉴定的化合物或其药用盐。此外，本发明提供包括上文描述的化合物和药用载体的药物组合物。
用于本文的短语“药用的”指在合理医疗诊断范围内，适合于用在与人和动物组织的接触中而不会造成过量毒性、刺激作用、变态反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物，材料，组合物，和/或剂型。
用于本文时，“药用盐”指被鉴定的试剂的衍生物，其中通过获得其的酸或碱盐来修饰这些来源试剂。药用盐的实例包括，但不限于，碱性残基诸如酰胺的矿物盐或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱性盐或有机盐；等。所述药用盐包括形成的来源化合物的常规非毒性盐或季铵盐，例如，来自非毒性无机或有机酸。例如，这些常规非毒性盐包括衍生自无机酸诸如盐酸的，氢溴酸的，硫酸的，氨基磺酸的，磷酸的，硝酸的等的那些；和制备自有机酸诸如乙酸的，丙酸的，琥珀酸的，羟基乙酸(glycolic)的，硬脂酸的，乳酸的，苹果酸的，酒石酸的，柠檬酸的，抗坏血酸的，pamoic，马来酸的，羟基马来酸的，苯基乙酸的，谷氨酸的，苯甲酸的，水杨酸的，磺胺酸的，2-乙酸基苯甲酸的，反丁烯二酸的，苯磺酸的，甲苯磺酸的，甲磺酸的，乙烷二磺酸的，草酸的，羟乙磺酸的等的那些。
通过常规化学方法，可自包含碱性或酸性部分的来源试剂合成本发明的药用盐。通常，这些盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的在水中或在有机溶剂，或在两者的混合物中的合适的碱或酸反应来进行制备；通常，优选非水性的介质如醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇，或乙腈。合适的盐的列表见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p.1418，将其内容结合于此作为参考。
可对通过本发明方法鉴定的试剂进行修饰从而获得(i)修饰的作用位点，活性光谱，和/或(ii)效能增加，和/或(iii)毒性减少(提高的治疗指数)，和/或(iv)减少的副作用，和/或(v)修饰的作用的开始，效果的持续时间，和/或(vi)修饰的动力学参数(再吸收，分布，代谢和分泌)，和/或(vii)修饰的物理-化学参数(溶解性，吸湿性，颜色，味道，气味，稳定性，状态)，和/或(viii)提高的一般特异性，器官/组织特异性，和/或(ix)最佳的应用形式和路径，上述修饰是通过(i)羧基基团的酯化作用，或(ii)羟基基团与碳氢酸(carbon acids)的酯化作用，或(iii)羟基基团与，例如磷酸盐、焦磷酸盐或硫酸盐或半琥珀酸盐的酯化作用，或(iv)药用盐的形成或(v)药用复合物的形成，或(vi)药用活性聚合物的形成，或(vii)亲水性部分的引入，或(viii)在aromates或侧链上的取代基的引入/交换，取代模式的变化，或(ix)通过引入电子等排或生物电子等排部分进行修饰，或(x)合成同源化合物，或(xi)引入支化侧链，或(xii)将烷基取代基转变成环状类似物，或(xiii)将羟基基团衍生化为缩酮，乙缩醛，或(xiv)N-乙酰化为酰胺，氨基甲酸苯酯，或(xv)合成曼尼期碱，亚胺，或(xvi)将酮或醛转化为席夫碱类，肟，乙缩醛，缩酮，烯醇酯，噁唑烷，thiozolidines或其组合进行；和(b)将所述修饰的产物与适合于芳香或香味组合物或产物的药用载体或载体/稀释剂一起进行配制。
可以使用任何常规载体材料。所述载体材料可以是适合于eteral、经皮或肠胃外施用的有机或无机的载体材料。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇、凡士林等。而且，药用制剂可包含其它药用活性剂。可将另外的添加剂诸如芳香剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等按照药用组合的被接受的习惯加入。
本发明还涉及基本如上文描述的、特别是参考下面的实施例的放射性标记的配体、化合物、方法、过程、应用和组合物。
附图简述
图1显示终产物，三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氢-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-单甲磺酸酯的分析的质谱分析的结果。术语[3H]指氚(T)。
图2A显示了T-MK0677与人胚肾HEK 293(EBNA)细胞膜的结合曲线。术语[3H]指氚(T)。
图2B显示了通过不同的生长激素促分泌素受体拮抗剂，T-MK0677与人胚肾HEK 293(EBNA)细胞膜的竞争性结合。术语[3H]指氚(T)。
实施例
实施例1.1制备4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈 将NaH分散体(55％在油中，5.92g，148mmol，4.65当量)加入2-氟苯基乙腈(5g，37mmol，1.16当量)在DMSO(75mL)的溶液中，剧烈搅拌。30分钟后，将在DMSO(75mL)中的2，2′-二氯-N-甲基二乙基胺盐酸盐(6.12g，31.8eq.1eq.)的溶液逐滴加入，并将所述混合物于75℃搅拌4小时30分。然后加入冰水(300g)，并用二乙醚抽提混合物。与盐酸(2N)一起摇动所述合并的醚溶液。弃去有机层。用碳酸氢钠(84g)碱化水层，并用二乙醚抽提。蒸发溶剂后，用快速分离色谱(flash chromatography)纯化得到的油。分离一个级分，将其在真空中进行蒸发和干燥，得到棕色油形式的3.0g(43％)的4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈。ISP-MSm/e＝218.1([M]+)。
实施例1.2制备1′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶) 将无水乙醇(7.6mL，165mmol，12当量)缓慢加入冷(0℃)氢化铝锂(2.09g，55mmol，4.0当量)在二甲氧基乙烷(70mL)的混悬液中。加入后，将所述混合物缓慢加热回流。在30分钟时间内，加入4-(2-氟-苯基)-1-甲基-哌啶-4-腈在二甲氧基乙烷(30mL)的溶液。在72小时内维持回流。将反应混合物冷却至室温并用水(2.2mL)、氢氧化钠水溶液(15％，2mL)，最终水(7mL)分解。
30分钟后，过滤所述混合物，并用温二氯甲烷漂洗滤饼两次。将滤饼在真空中干燥，产生黄色固体形式的2.12g(76％)的1′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝203.1([M+H]+)。
实施例1.3制备N-甲磺酰基-N′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶) 在30分钟内，将在二氯甲烷中的甲磺酸氯化物溶液(10mL)缓慢加入冷(0℃)1′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)在二氯甲烷中的溶液(40mL)中。于0℃2小时20分后，将溶液用二氯甲烷(150mL)稀释，将其倾注到碳酸氢钠水溶液中(250mL)，用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤，然后在真空中干燥。获得黄色半固体形式的2.85g的N-甲磺酰基-N′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝281.2([M+H]+).
实施例1.4制备N-甲磺酰基-N′-羧基苯氧基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶) 于20℃，将N-甲磺酰基-N′-甲基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)和氯甲酸苯酯在二氯甲烷中的溶液搅拌20小时。将反应混合物用氢氧化钠水溶液，然后用水洗涤。浓缩后，通过快速分离色谱进行纯化。分离一个级分，在真空中蒸发和干燥，得到作为白色固体的3.0g的N-甲磺酰基-N′-羧基苯氧基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)。ISP-MSm/e＝387.2([M+H]+)。
实施例1.5制备螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氢-1-(甲磺酰) 将N-甲磺酰基-N′-羧基苯氧基螺(二氢吲哚-3，4′-哌啶)(3.0g，7.76mmol)和氢氧化钾(6.0g，90.9mmol，11.7当量)在乙二醇(45mL)中的溶液于160-170℃在氮气下搅拌105分钟。将反应混合物冷却到室温，用冰水(400mL)稀释并用二氯甲烷抽提。用水洗涤有机层并在真空中浓缩，得到1.87g的白色固体形式的螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氢-1-(甲磺酰)。
ISP-MSm/e＝267.2([M+H]+).
实施例1.6制备螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氢-1-(甲磺酰) 将水(20mL)，二环己基碳二亚胺(1.576g，7.64mmol，1.1当量)和1-羟基苯并三唑(1.02g，7.57mmol，1.09当量)和Boc-O-苄基-D-丝氨酸(2.26g，7.64mmol，1.10当量)加入螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1，2-二氢-1-(甲磺酰)(1.85g，6.94mmol)在乙酸异丙酯(50mL)的溶液中。将混合物于20℃搅拌5小时，然后进行过滤。
将固体过滤并用乙酸异丙酯(30mL)洗涤。分离水层，并用氢氧化钠(sodium hydroxide)的水溶液(1M，30mL)、盐酸水溶液(0.5M，2×30mL)和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤有机相。蒸发有机层，得到3.94g的浅白色(white light)固体。将该固体用乙醇(16mL)进行稀释。加入甲磺酸(1.35mL，20.8mmol，3.0当量)。将所述混合物在40℃加温7.5小时。
加入水(50mL)。将所述混合物冷却至5℃达30分钟并进行过滤。通过加入氢氧化钠水溶液(3M，7.5mL)，将pH调到pH＞12。用乙酸异丙酯抽提所述混合物。浓缩后，通过快速分离色谱纯化所述粗混合物。收集一个级分，在真空中蒸发和进行干燥，得到白色固体形式的2.32g的螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氢-1-(甲磺酰)ISP-MSm/e＝444.2([M+H]+)。
实施例17制备三-氘化的2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氢-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-单甲磺酸酯 其中R1-R6彼此独立的是H或T。
将88.51mCi的N-Boc-α-氨基异丁酸-[甲基-T]，(100Ci/mmole，International Isotopes Clearing House，Inc.，Leawood，Kansas USA)的乙醇水溶液进行过滤并转移到0.3mL的反应器中。将溶剂在氩气下蒸发。N，N′二环己基碳二亚胺(0.206mg)和1-羟基苯并三唑(0.135mg)加入螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]，1′-[(2R)-2-氨基-1-氧代-3-(苯基甲氧基)丙基]-1，2-二氢-1-(甲磺酰)(0.444mg)在乙酸异丙酯的溶液中。加入水(13.5μL)。将所述混合物于室温剧烈搅拌2小时。
用乙酸乙酯稀释反应混合物并用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤。在硫酸钠上干燥有机溶液，并将溶剂在真空中蒸发。加入甲磺酸在乙醇中的溶液(0.4mL，5％v/v)。将该溶液于40℃搅拌过夜。
如上所述相同的方法(work-up)提供47.9mCi的产物，所述产物具有按照HPLC的77％的放射化学纯度。
通过HPLC(柱Zorbax Bonus RP5，5μm)纯化产生17.78mCi的三-氚化的-2-氨基-N-[(1R)-2-[1，2-二氢-1-(甲磺酰)螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基]-2-氧代-1-[(苯基甲氧基)甲基]乙基]-2-甲基-单甲磺酸酯，其具有按照HPLC的99.5％放射化学纯度。
固体反应产物的比活是97.5Ci/mmole(通过质谱分析法确定，见图1)。
实施例2结合测定实施例2.1膜制备使人胚肾HEK 293(EBNA)细胞生长在混悬液中并按照前面描述的方法(Schlaeger and Christensen，Cytotechnology，30，71-83，1999)对其进行转染。将细胞于500rpm离心10分钟，用PBS-0.7mM EDTA/(4℃)洗涤1次，并以2ml/g的细胞在PBS-EDTA-PI(具有蛋白酶抑制剂混合物)中重悬。在冰上用Ultra Turax level green 3×15″，间断30″来破裂细胞。为了去除碎片，将混悬液在Sorvall SS34转子中于2′000rpm离心20分钟。收集上清液并在20′000rpm离心40分钟。将沉淀重悬于PBS-EDTA。使用T-MK0677以饱和结合测定证实受体密度是4.9pmol/mg蛋白质。
实施例2.2结合测定将膜重悬于结合缓冲液(25mM Hepes，pH7.4，25mM MgCl2，1mMCaCl2，0.1％BSA，0.03％Bacitracine(蛋白酶抑制剂))中至0.1-2μg/孔。
将结合缓冲液，T-MK0677(来自Amersham 10mM，97.5Ci/mmol，到10nM的终浓度)，未标记的配体(到1μM的终浓度)和重悬的膜(终浓度0.5μg/孔)加至200μl/孔的终体积到96孔微量培养板(Corning 3600非结合表面)中。将所述混合物于20℃温育60分钟。
用0.5μL/孔的在PBS中的0.5％聚乙烯亚胺(PEI)对滤板(PackardGF/B unifilter板)进行处理15分钟。将结合的混和物经过滤板进行过滤，用冰冷的PBS洗涤滤板3次。然后于50℃将滤板在预热的培养器中干燥50分钟。然后在每孔中将50μl的Microscint 0加入并在Packard Instruments的topcount中计算T衰变。
权利要求
1.一种放射性标记的生长激素促分泌素，其包括下式的至少一种化合物 ，其中R1-R6彼此独立地是H或T，并且其中R1-R6中至少一个是T。
2.权利要求1的放射性标记的生长激素促分泌素，其中放射性标记的生长激素促分泌素的比活介于86.4Ci/mmole和115.2Ci/mmole之间。
3.权利要求2的放射性标记的生长激素促分泌素，其中放射性标记的生长激素促分泌素的比活是97.5Ci/mmole。
4.权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素用于鉴定可与生长激素促分泌素受体结合的化合物的应用。
5.权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素用于鉴定作为生长激素促分泌素受体的细胞受体的应用。
6.权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素用于鉴定作为生长激素促分泌素的化合物的活性的应用。
7.一种合成放射性标记的生长激素促分泌素的方法，其包括使具有下式的化合物 与X-(α-氨基异丁酸-[甲基-T]反应，和如果需要形成盐，其中将X定义为保护基，所述保护基如果出现，随后被去除。
8.一种鉴定作为生长激素促分泌素的细胞受体的方法，所述方法包括使被认为表达生长激素促分泌素受体的宿主与权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素接触并确定结合是否已发生。
9.一种鉴定可与生长激素促分泌素受体结合的化合物的方法，所述方法包括在权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素存在时，使所述化合物与表达生长激素促分泌素受体的宿主接触，并监测所述化合物是否影响权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素与生长激素促分泌素受体的结合。
10.一种鉴定作为生长激素促分泌素的化合物的活性的方法，所述方法包括在权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素存在时，使被认为具有生长激素促分泌素活性的化合物与表达生长激素促分泌素受体的宿主接触，并监测被认为具有作为生长激素促分泌素的活性的化合物是否影响权利要求1-3的任一项的放射性标记的生长激素促分泌素与生长激素促分泌素受体的结合。
11.一种通过权利要求9或10的任一项的方法被鉴定的化合物，或其药用盐。
12.一种药物组合物，其包括权利要求11的化合物和药用载体。
13.基本如上文所述的、尤其地，参考前述实施例的放射性标记的配体、化合物、方法、过程、应用和组合物。
全文摘要
本发明涉及氚化的生长激素促分泌素，可将其用于鉴定能够与生长激素促分泌素受体结合的化合物，或具有如生长激素促分泌素的活性的化合物。
文档编号A61K51/04GK1812815SQ200480018079
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月25日
发明者科妮莉亚·赫特尔, 菲利普·乌格宁, 桑纳何·詹森－索夫曼, J-M·普兰凯尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司