Vegf捕获剂及其治疗用途的制作方法

专利名称：Vegf捕获剂及其治疗用途的制作方法
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发明领域本发明包括具有特定理想性质的能结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)、VEGF家族成员以及剪接变体的融合多肽和使用的治疗方法。
发明概述在第一方面，本发明展示了编码包含受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y的融合多肽的分离的核酸分子，其中R1是血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体组分Flt-1的Ig结构域2(FltD2)，R2是VEGF受体组分Flk-1Ig结构3(Flk1D3)，以及R3是VEGF受体组分Flt-4的Ig结构域3(Flt1D3或R3)，并且其中X≥1和Y≥1。
在相关的第二方面，本发明展示了单体VEGF捕获剂(trap)或包含VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y的融合多肽，其中X≥1，Y≥1，并且R1、R2和R3如上面定义。该VEGF受体组分R1、R2和R3可直接相互连接或通过一个或多个间隔区序列连接。在一特定实施方案中，单体VEGF捕获剂是(R1R2)x，其中X＝2。在一更特定的实施方案中，单体VEGF捕获剂是SEQ ID NO24，或是它的功能等效氨基酸变体。本发明包括基本由VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y组成的单体VEGF捕获剂和它的功能等效氨基酸变体。
在第三方面，本发明展示了编码包含VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和选自多聚化组分(MC)、血清蛋白或能结合血清蛋白的分子的融合配偶体(FP)组分的多肽的分离的核酸分子。在一优选的实施方案中，FP是能与另一融合多肽上的多聚化组分相互作用以形成多聚体结构，如二聚体或三聚体的多聚化组分(MC)。最优选地，MC选自(i)包含可切割区(C-区)的多聚化组分、(ii)截短的多聚化组分、(iii)具有至少一个半胱氨酸的长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列、(iv)亮氨酸拉链、(v)螺旋环基序、(vi)卷曲-卷曲基序和(vii)免疫球蛋白结构域。更进一步包含的是基本上由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP组成的融合多肽。在优选的实施方案中，融合多肽基本由(R1R2)x和MC组成。
在第四个方面，本发明展示了如上描述的包含VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP的融合多肽。受体组分可以不同顺序排列，如(R1R2)x-FP；(R1R2)x-FP-(R1R2)x；FP-(R2R1)x等。融合多肽的组分可直接相互连接或通过间隔区序列连接。
在第五方面，本发明展示了包含两个或多个由VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP组成的融合多肽的多聚体的VEGF捕获剂，其中FP组分是含有C-区的多聚化组分(MC)。该C-区可以是天然出现的或人工的，并可以出现在多聚化组分中的任意位点，具有使得能切割母体MC得到截短的MC的功能。由两个或多个具有至少一个截短的MC的融合多肽组成的VEGF捕获剂称为“截短的小捕获剂”。
可在MC中通过插入、删除或突变来产生C-区，从而产生酶促或化学可切割的位点。C-区可在任意MC内和MC内任意位置产生；优选地，C-区在全长的Fc结构域或它的片段内，或CH3结构域内产生。C-区可以是通过酶如凝血酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶、matrilysin或氨酰基脯氨酸二肽酶可切割的位点或在化学上通过如蚁酸或CuCl2可切割的位点。
在第六个相关的方面，本发明展示了截短的VEGF小捕获剂，它是包含两个或多个融合多肽的多聚体蛋白，所述的融合多肽由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和通过从含有C-区的母体MC切割截短的多聚化组分(tMC)组成。
在第七方面，本发明展示了由VEGF受体组分(R1R2)x和/或(R1R3)Y及MC组成的融合多肽，其中MC是含有至少一个半胱氨酸的长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列，其中所述的半胱氨酸残基能与存在于另一融合多肽的MC(cMC)中的半胱氨酸形成二硫键。在一优选的实施方案中，cMC是含有至少一个半胱氨酸残基长度在1-50个氨基酸之间的氨基酸序列。在一较优选的实施方案中，cMC是含有至少一个氨基酸的长度在1-15个氨基酸之间的氨基酸序列。在一更优选的实施方案中，cMC是含有1-2个半胱氨酸的长度在1-10个氨基酸之间的氨基酸序列。本发明这种实施方案的一个范例由SEQ ID NO27表示，其具有一个信号序列(1-26)，接着的是R1(27-129)和R2(130-231)组分，随后是以半胱氨酸结尾的九个氨基酸的序列。在另一实施方案中，范例在SEQ ID NO28显示，其具有一个信号序列(1-26)，随后是R1(27-129)和R2(130-231)组分，接着的是以半胱氨酸残基结尾的六个氨基酸的序列。
在第8个方面，本发明展示了包含两个或多个融合多肽的多聚体的VEGF小捕获剂，所述的融合多肽由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和cMC组成。在更特定的实施方案中，小捕获剂是二聚体。本发明小捕获剂的本实施方案的一个范例是在SEQ ID NO2中表示的融合多肽的二聚体，其中每个融合多肽(R1R2-cMC)具有23.0kD的分子量并且pI是9.22。
在另一实施方案中，cMC含两个半胱氨酸，长度为4个氨基酸，例如XCXC(SEQ ID NO3)。在本发明该实施方案的一个范例中，小捕获剂由本发明的VEGF受体组分和包括ACGC的cMC(SEQ ID NO4)组成。本发明小捕获剂的该实施方案的一个范例是在SEQ ID NO5中表示的融合多肽的二聚体，其中每个单体具有23.0kD的分子量并且pI是9.22。本发明该实施方案的另一个范例在SEQ ID NO26中表示，其具有一个信号序列(1-26)，随后是R1(27-129)和R2(130-231)组分，接着的是以CPPC结尾的九个氨基酸的序列。
在本发明VEGF捕获剂的所有实施方案中(包括截短的VEGF小捕获剂、VEGF小捕获剂和单体VEGF小捕获剂)，可将信号序列(S)包含于本发明融合多肽的开头(或N-端)。信号序列可以是细胞固有的、重组的或合成的。当将信号序列连接至第一个受体组分的N-端时，融合多肽因而可以命名为如S-(R1R2)x。
融合多肽的组分可以相互之间直接连接或通过间隔区连接。在特定的实施方案中，融合多肽的一个或多个受体和/或融合配偶体组分不需要间隔区而相互直接连接。在其它实施方案中，一个或多个受体和/或融合配偶体组分用间隔区连接。
本发明包括包含本发明核酸分子的载体，包括包含有效连接至表达控制序列的核酸分子的表达载体。本发明进一步包括用于产生融合多肽的宿主-载体系统，该系统包括表达载体，位于合适的宿主细胞；宿主-载体系统中合适的宿主细胞是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞；大肠杆菌细胞或COS或CHO细胞。额外包含的是通过乙酰化或聚乙二醇化修饰的本发明VEGF捕获剂。将蛋白乙酰化或聚乙二醇化的方法为本领域熟知。
在相关的第九方面，本发明展示了产生本发明VEGF捕获剂的方法，方法包括在适合于在宿主细胞中表达蛋白的条件下，培养用含有本发明核酸序列的载体转染的宿主细胞，并回收所表达的融合多肽。
本发明VEGF捕获剂可用于治疗任何通过除去、抑制或减少VEGF可改进、改善或抑制的疾病或病症。通过抑制或减少VEGF而改善的特定病症的不完全名单包括例如不当的血浆渗出或血管渗透性，不当的血管生长，例如肿瘤中的，与炎性疾病如银屑病或关节炎相关的水肿，所述关节炎包括类风湿性关节炎；哮喘；与烧伤相关的一般性水肿；与肿瘤、炎症或外伤相关的腹水和胸膜积液；慢性呼吸道炎症；哮喘；毛细血管渗漏综合征；败血症；与增加的蛋白渗漏相关的肾病；胰管腺癌(PDAC)和眼部疾病如与年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病。VEGF小捕获剂特别地可用于眼部疾病的治疗并作为眼部手术包括青光眼手术的辅药；以及通过玻璃体内递送用于治疗眼内肿瘤例如眼色素层黑色素瘤、视网膜母细胞瘤。
因此，在第十方面，本发明展示了用于治疗VEGF相关的疾病或病症的治疗方法，该方法包括将本发明VEGF捕获剂施用至遭受VEGF相关的疾病或病症的受试者上。尽管任何哺乳动物可通过本发明治疗方法治疗，受试者优选为遭受或有可能遭受可用VEGF捕获剂改善、减轻、抑制或治疗的疾病或病症的人患者。
在第十一方面，本发明进一步展示了诊断和预测方法以及采用本发明小捕获剂用于检测、定量和/或监控VEGF的试剂盒。
在第十二方面，本发明展示了包含可药用载体和本发明VEGF捕获剂的药物组合物。这种药物组合物可包含二聚体融合多肽捕获剂，或编码融合多肽的核酸。在一些情形下发现本发明小捕获剂具有特定的用途，在所述的这些情形下期望具有减少的血清半衰期(例如更快被清除)和/或因为更小的大小而具有增加的组织渗透性的VEGF捕获剂。VEGF小捕获剂的特定应用包括例如用于治疗一些疾病，其中所述疾病期望将药物局部施用至特定的组织或细胞中。这种疾病或病症的实例是眼部的眼病。
在研究随后的详细描述后，本发明其它的目标和优势变得显而易见。
发明详述在本发明得以描述以前，应该理解本发明不限于描述的特定方法和试验条件，因为所用的方法和条件可以不同。因为本发明范围仅由附加的权利要求书限制，所以也应该理解这里使用的术语目的仅在于描述特定的实施方案，用意并不在于用作限制。
如该说明书和附加权利要求书中使用，除非上下文另外明确规定，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此例如，提及“amethod”包括一种或多种方法和/或这里描述的类型的步骤和/或在读过本公开内容后对那些本领域技术人员显而易见的方法等。
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同的含义。虽然与这里描述那些相似或相当的任何方法和材料都可用于实践或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。所有在这里提到的出版物在这里通过引用作为参考来描述与引用的文献相关的方法和/或材料。
一般描述本发明包括能结合并抑制VEGF活性的VEGF捕获剂，该捕获剂是单体或一个或多个融合多肽的多聚体。本发明的分子结合并抑制VEGF的生物学作用和/或生理学反应或响应。对于基于VEGF受体的拮抗剂VEGF捕获剂Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO7-8)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)的描述，见PCT WO/0075319，其全部内容在这里引用作为参考。
本发明小捕获剂比完整捕获剂要小，如约50-60kD，而母体捕获剂为120kD，并包括基本由VEGF受体结构域(R1R2)x、(R1R3)Y或它们的组合组成的单体捕获剂、通过切割具有融合配偶体组分的母体多聚化捕获剂的一部分产生的捕获剂，其中所述的融合配偶体组分是含有切割区(C-区)的多聚化组分(MC)；或通过连接半胱氨酸残基或含有一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列至受体组分或在两个受体组分之间连接半胱氨酸残基或含有一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列产生的捕获剂。在特定的实施方案中，用SDS-PAGE分析法测量，本发明的小捕获剂小于约60kD；较优选地约50kD；更优选地约为20-30kD；或约25kD并能以与在PCT/US00/14142中描述的完整母体捕获剂相当的亲和性结合VEGF。
核酸构建体和表达本发明提供能编码结合VEGF的单独的融合多肽或多聚化VEGF捕获剂的核酸分子构建体。本发明核酸分子能编码野生型R1、R2和/或R3受体组分或它们的功能上相当的变体。本发明捕获剂的R1、R2和/或R3受体组分的氨基酸变体也可以通过在编码核酸分子中产生突变而得以制备。这种变体包括，如删减，或插入或取代R1、R2和/或R3的氨基酸序列中的氨基酸而得到的变体。可对删减、插入和取代做任意组合来得到最终的构建体，前提是最终构建体具有结合和抑制VEGF的能力。
将这些核苷酸分子插入载体中，当将所述的载体引入合适的宿主细胞时能表达融合多肽。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体的任何方法可用于构建在转录/翻译控制信号控制下编码本发明融合多肽的表达载体。
本发明核苷酸分子的表达可通过另一核苷酸序列调控，因而该分子在用重组DNA分子转化的宿主中得以表达。例如，表达可通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。可用于控制嵌合多肽分子表达的启动子包括但不限于长末端重复序列(Squinto等(1991)Cell651-20)；SV40早期启动子区、CMV、M-MuLV、胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(metallothionine)基因的调控序列；原核表达载体如b-内酰胺酶启动子或tac启动子(也见Scientific American(1980)24274-94)；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADH、PGK、碱性磷酸酶和源于基因如弹性蛋白酶I基因的组织特异性转录控制区。
使用包括本发明核酸分子的能在细菌或真核宿主中复制的表达载体来转染宿主并因而指导表达这种核酸分子来产生本发明的融合多肽，所述多肽构成能结合至VEGF的捕获剂。转染的细胞可暂时地或优选为组成性地和永久地表达本发明VEGF捕获剂。
可通过任何技术纯化本发明捕获剂，这种纯化使得能随后形成稳定的、有生物活性的捕获剂。例如，但不作为限定，可从细胞以可溶蛋白的形式或以包涵体的形式回收该因子，从中可定量地通过8M盐酸胍和透析提取(见，例如美国专利号5,663,304)。为了进一步纯化该因子，可使用常规的离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反向色谱或凝胶过滤。
VEGF受体组分VEGF小捕获剂的VEGF受体组分由Flt-1的Ig结构域2(Flt1D2)(R1)、Flk-1的Ig结构域3(Flk1D3)(R2)(一起成为R1R2)和/或R1和Flt-4的Ig结构域3(Flt1D3)(R3)(一起成为R1R3)组成。术语Flt-1、Flt-4或Flk-1的“Ig结构域”意指不仅包括完整的野生型结构域，也包括野生型结构域的插入的、删减的和/或取代的变体，其中所述的变体基本保留完整结构域的功能特性。对本领域技术人员显而易见，可以获得上述Ig结构域的能保持与野生型结构域基本相同的功能特性的许多变体。
当用于指R1、R2或R3时，术语“功能等同”意指包括具有至少一种改变如删减、添加和/或取代的R1、R2或R3结构域，所述结构域保持与野生型R1、R2或R3结构域基本相同的功能特性，即基本等同地与VEGF结合。应当理解可在R1、R2或R3中作各种氨基酸取代而在关于这些受体组分结合并抑制VEGF活性的能力上不偏离本发明的精神。本发明捕获剂的功能特性可通过任何用于测量目标特性的本技术领域已知的合适的筛选检测法测定。这种检测法的实例在下面的实验部分有描述，所述的检测法使得能测定VEGF(Kd)捕获剂的结合特性和测定它们的捕获剂-配体复合物解离半衰期(T1/2)。其它检测法，例如特异性结合至VEGF的能力的改变可通过竞争型VEGF结合检测法测定。蛋白特性的修饰如热稳定性、疏水性、蛋白水解降解的易感性或积聚倾向性可通过本领域那些技术人员已知的方法测定。
融合多肽的组分可直接相互连接或通过间隔区连接。通常，术语“间隔区”(或连接区)指一个或多个分子，例如核酸或氨基酸或非肽部分如聚乙二醇，它们可插入至一个或多个组分结构域之间。例如，间隔区序列可用于在组分之间提供合意的靶标位点来使得操作变得容易。也可以提供间隔区来增强融合多肽在宿主细胞中的表达、减少空间位阻从而该组分可采取它最佳的三级结构和/或与它的靶标分子正确地相互作用。关于间隔区和鉴定理想间隔区的方法，见例如George等(2003)Protein Engineering 15871-879页，在这里特别将其引用作为参考。间隔区序列可包括一个或多个天然连接至受体组分的氨基酸或可以是后加上去的序列以用于增强融合蛋白的表达、提供特定理想的靶标位点、使得组分结构域能形成最佳的三级结构和/或增强组分与其靶标分子的相互作用。在一实施方案中，间隔区包含在一个或多个组分之间的一个或多个肽序列，这些多肽序列在1-100个氨基酸之间，优选在1-25个之间。
在最特定的实施方案中，R1是SEQ ID NO8的氨基酸27-126，或SEQ ID NO8的氨基酸1-126(包括信号序列1-26)；或SEQ ID NO10的氨基酸27-129，或SEQ ID NO10的氨基酸1-129(包括信号序列1-26)。在最特定的实施方案中，R2是SEQ ID NO8的氨基酸127-228，或SEQ ID NO10的氨基酸130-231。在最特定的实施方案中，R3是SEQ ID NO13的氨基酸127-225(没有信号序列)。当例如，将R2置于融合多肽的N端时，信号序列在受体组分之前是理想的。连接在多聚化组分的受体组分可进一步包含间隔区组分，例如SEQ IDNO7的氨基酸229-231的GPG序列。
融合配偶体和多聚化组分融合配偶体是增强融合多肽功能性的任何组分。因此，例如融合配偶体可增强融合多肽的生物活性，有助于其产生和/或回收，或通过例如增强其血清半衰期、组织穿透性、缺乏免疫源性、或稳定性来增强融合多肽的药理学性质或药代动力学特性。在优选的实施方案中，融合配偶体选自多聚化组分、血清蛋白或能结合血清蛋白的分子。
当融合配偶体是血清蛋白或其片断时，它选自α-1微球蛋白、AGP-1、血清类粘蛋白(orosomuciod)、α-1酸性糖蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、血红素结合蛋白、人血清白蛋白(hSA)、运铁蛋白、铁蛋白、afamin、结合珠蛋白、α-甲胎蛋白、甲状腺球蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-2-糖蛋白、透明质素-结合蛋白、syntaxin、C1R、Clq链、galectin3-Mac2结合蛋白、纤维蛋白原、聚合Ig受体(PIGR)、α-2-巨球蛋白、尿素转运蛋白、结合珠蛋白、IGFBPs、巨噬细胞清除受体、纤连蛋白、giantin、Fc、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(antichyromotrypsin)、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、载脂蛋白A-I、载脂蛋白B、β-2-微球蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体成分C3或C4、CI酯酶抑制剂、C-反应蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和蛋白C。在更特定的实施方案中，融合配偶体选自α-1微球蛋白、AGP-1、血清类粘蛋白、α-1酸性糖蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、血红素结合蛋白、人血清白蛋白(hSA)、afamin和结合珠蛋白。当需要时，包含融合配偶体可延长本发明融合多肽的血清半衰期。见例如美国专利6,423,512、5,876,969、6,593,295和6,548,653，在这里特别地全文引用作为参考，例如引用血清白蛋白融合多肽作为参考。hSA在周身特别是在肠和血液成分中广泛分布，并在维持摩尔渗透压浓度和血浆体积中起重要作用。它在肝脏中缓慢被清除并在人中通常具有14-20天的体内半衰期(Waldmann等(1977年)Albumin，StructureFunction and Uses；Pergamon Press；255-275页)。
当融合配偶体是能结合血清蛋白的分子时，该分子可以是合成的小分子、脂类或脂质体、核酸(包括合成的核酸，例如aptomer)、肽或寡糖。此外该分子可以是蛋白，例如FcγR1、FcγR2、FcγR3、聚合Ig受体(PIGR)、ScFv和其它血清蛋白特异性抗体片段。
当融合配偶体是多聚化组分(MC)时，它是任何天然或合成的序列，这种序列能与另外的MC反应而形成更高级的结构如二聚体、三聚体等。合适的MC可包括亮氨酸拉链，包括源于c-jun或c-fos的亮氨酸拉链结构域；源于κ或λ轻链的恒定区序列；合成的序列如螺旋-环-螺旋基序(Müller等(1998)FEBS Lett.43245-49页)、卷曲-卷曲基序等或其它本技术领域已知的通常接受的多聚化结构域。在一些实施方案中，融合组分包括来自如人IgG、IgM或IgA的免疫球蛋白衍生的结构域。在特定的实施方案中，免疫球蛋白衍生的结构域可选自IgG的Fc结构域、IgG的重链和IgG的轻链。IgG的Fc结构域可选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4及每个同种型组中的任何异型。在本发明VEGF捕获剂的一个实施例中，多聚化组分是IgG4 Fc结构域(SEQ ID NO29)。
截短的VEGF小捕获剂的产生在本发明捕获剂的一个实施方案中，将具有含有C-区的MC的母体捕获剂处于某种条件下，在所述的条件下一个或多个含有C-区的MC得以切割，从而产生包含两个或多个本发明融合多肽的截短的VEGF小捕获剂。
含有C-区的MC可以是任何能与另外的MC相互作用来形成更高级结构如二聚体或三聚体的MC。可在MC中任意理想的位置产生C-区。根据下面实施例中提供的指导，本领域任意一位技术人员应该能基于得到的截短的捕获剂的期望特性如分子量、单体或二聚体等特性而选择理想的位点来产生C-区。
在特定的实施方案中，C-区是插入至紧随N-端CPPC序列(SEQ IDNO1)的FcΔC1结构域中的凝血酶切割位点(LVPRGS)(SEQ ID NO6)。在该实施方案中，完整的母体VEGF捕获构建体在细胞中表达为Fc标记蛋白，因而使得能通过如蛋白A柱捕获并纯化。在形成二聚体和在CPPC序列(SEQ ID NO1)的一个或两个半胱氨酸残基之间形成共价结合后，在某些条件下将二聚体暴露给凝血酶，在这些条件下凝血酶切割一个或两个FcΔC1结构域，由此产生了具有约50kD-90kD分子量的截短的二聚体小捕获剂，并且这种小捕获剂具有与母体捕获剂相当的VEGF亲和性。切割的条件可以由本领域技术人员控制来促成部分切割产物或完全切割产物的形成，根据对具有特定性质如分子量的特定产物的期望来选择切割条件。
在特定的实施方案中，C-区是插入至在CPPC序列(SEQ ID NO1)N-端的FcΔC1结构域中的凝血酶切割位点(LVPRGS)(SEQ ID NO6)。在形成二聚体和在CPPC序列(SEQ ID NO1)的一个或两个半胱氨酸残基之间形成共价结合后，在某些条件下将二聚体暴露给凝血酶，在其中一个或两个FcΔC1结构域出现并生成截短的单体小捕获剂。因而产生的单体截短的小捕获剂包含受体组分和Fc的小片段且大小约为25kD，并相对于截短的二聚体捕获剂和全长母体捕获剂表现出减少的VEGF亲和性。作为重组蛋白产生的一个相似单体捕获剂已经表现出具有约1nM的KD值。
VEGF小捕获剂的产生在一个实施方案中，本发明刻画了具有一个或多个受体组分结构域(R1R2)x和/或(R1R3)Y的VEGF小捕获剂，其中X≥1，Y≥1，并且R1、R2和R3如上定义，并任选地具有融合配偶体，所述融合配偶体优选地是MC结构域，该MC结构域是长度在1-约200个氨基酸之间的包含至少一个半胱氨酸的氨基酸序列，其中所述的半胱氨酸残基能与存在于另一个融合多肽的MC(cMC)中的半胱氨酸残基形成二硫键。cMC可出现在融合多肽的N端或C端，或在两个受体组分结构域之间。在一特定的实施方案中，将半胱氨酸加至VEGF受体组分的C-端，如R1R2C，这使得融合多肽能通过在一个融合多肽C-端的半胱氨酸残基和另一个融合多肽C-端的半胱氨酸残基之间形成共价二硫键来形成共价二聚体。在该示范中，小捕获剂是在SEQ ID NO2中表示的融合多肽的二聚体，其中每个融合多肽(R1R2-cMC或R1R2C)具有约23.0kD的分子量。
在另一实施方案中，cMC是4个氨基酸(XXXX)的序列(SEQ ID NO11)，其中X是任意氨基酸并且该序列包含至少一个半胱氨酸残基。在一特定的实施方案中，将cMC加至受体组分结构域的C-端。在更特定的实施方案中，该4个氨基酸的序列是ACGC(SEQ ID NO4)并且该cMC与存在于第二个融合多肽的半胱氨酸残基形成两个二硫键。如下面显示(表2)，作为例子的两个小捕获剂都表现出与母体捕获剂相当的VEGF亲和性。
治疗用途本发明的VEGF小捕获剂可用于治疗任何通过除去、抑制或减少VEGF可改善、减轻、抑制或预防的疾病和病症。通过抑制或减少VEGF来改善的特定疾病的不穷尽的名单包括特征为过度的血管内皮细胞增殖、血管穿透性、水肿或炎症如与外伤相关的脑水肿、中风或肿瘤；与炎性疾病如银屑病或关节炎相关的水肿，所述关节炎包括类风湿性关节炎；哮喘；与烧伤相关的一般性的水肿；与肿瘤、炎症或外伤相关的腹水和胸膜积液；慢性呼吸道炎症；毛细血管渗漏综合征；败血症；与增加的蛋白渗漏相关的肾病；眼部疾病如与年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病的临床症状。
本发明组合物在治疗上可用于治疗与升高的VEGF水平相关的广泛的多种疾病。例如，过度的Th2炎症和呼吸道重塑在哮喘的发病机理中是特有的(见如Elias等(1999)J.Clin.Invest.1041001-1006页)。在来自有哮喘的患者的组织和生物样品中已经检测到上升的VEGF水平，VEGF水平直接与疾病活性相关(Lee等(2001)J.AllergyClin.Immunol.1071106-1108页)并与呼吸道的口径及呼吸道的响应负相关。另外，已经公认VEGF对哮喘组织水肿起作用。
与上升的VEGF相关的另外的疾病是胰管腺癌(PDAC)。这种恶性肿瘤常常表现出增强的内皮细胞增殖病灶并经常过度表达VEGF(Ferrara(1999)J.Mol.Med.77527-543页)。PDAC是造成超过20％的由肠胃道恶性肿瘤引起的死亡的原因，这使得它成为美国及其它工业化国家中第四最普遍的与癌症相关的死亡率原因。实验证据支持VEGF在胰腺癌中起重要作用，因而VEGF抑制剂有希望作为治疗剂来消弱胰腺内的肿瘤生长及区域性的和向远处的肿瘤转移。
在大肠杆菌中表达的更小的、非糖基化的小捕获剂(实施例4)、在CHO细胞中表达的糖基化的小捕获剂(实施例5)或基于受体的单体捕获剂(实施例6)具有用于局部/玻璃体内递送的最优化的特性，即更短血清半衰期使得能更快的清除和使不必要的全身暴露量最小化。而且由于有更小的大小，小捕获剂具有穿透眼睛内界膜(ILM)，并通过玻璃体扩散至视网膜色素上皮细胞(RPE)层的能力，这有助于治疗视网膜疾病。而且，小捕获剂可用于局部施用来治疗眼病如脉络膜新生血管、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病视网膜病变、角膜新生血管化/移植排斥反应。更进一步，可将小捕获剂用于任何需要暂时(短期)阻断VEGF如用以避免处于长期的VEGF阻断下的情形，例如用于治疗银屑病。
导致青光眼手术后失败的一个严重问题是初期的炎症和血管新生以及太快的伤口复原。因此，可有效地使用本发明的VEGF捕获剂用作青光眼手术的辅药来预防青光眼手术后早期的血管和淋巴管新生以及巨噬细胞募集至滤过泡，并提高手术成果。
组合疗法在许多实施方案中，可将VEGF捕获剂与一种或多种额外的化合物或疗法，包括第二种VEGF捕获剂分子、化疗剂、手术、导管装置和放射结合施用。组合疗法包括施用包含VEGF捕获剂和一个或多个额外的试剂的单一药物剂量制剂；也包括施用VEGF捕获剂和在其自己独立的药物剂量制剂中的一个或多个额外的试剂。例如，可将VEGF捕获剂和细胞毒性剂、化疗剂或生长抑制剂以单一剂量组合物的形式如组合制剂的形式一起施用给患者，或每种试剂可以以独立的剂量制剂施用。当使用独立的剂量制剂时，本发明VEGF特异性融合多肽和一种或多种额外的试剂可同时施用或在分别交错的时间即按顺序施用。
如此处所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻碍细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意指包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物源的酶促活性毒素或它们的片段。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如塞替派、环磷酰胺制剂(Cytoxan)；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；次乙亚胺类和methylamelamine类包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺、trimethylolomelamine；氮芥子气类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、氮芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀、亚硝基苯脲类(nitrosoureas)如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类如aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁斯(新制癌菌素)、佐柔比星、抗代谢药如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、叶酸类似物如denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、Thiamiprine、硫鸟嘌呤、嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟脲苷、依诺他滨、氟尿苷；
雄激素类如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、抑制肾上腺类药物如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、叶酸再补充类药物如frolinic酸；醋葡醛内酯；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺、地吖醌、elfornithine；依利醋铵；依托格鲁、硝酸镓、羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；phenamet；吡柔比星、鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；urethan；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；派泊溴烷；Gacytosine；腺嘌呤阿糖甙(arabinoside)；环磷酰胺；噻替派；紫杉醇类药物(Taxanes)，如紫杉醇(Taxol，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)；多西他塞(Taxotere；Aventis Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类药物如顺铂和卡铂(Carboplatin)；长春碱；铂；依托泊苷(VP16)(etoposide(VP-16))；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维苯；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸；esperamicin类；卡培他滨；以及任意上述药物的可药用盐、酸或衍生物。用作调节或抑制激素对肿瘤起作用的抗激素剂也包含在本定义中，所述的抗激素剂包括例如抗雌激素类药物；如他莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟三苯氧胺(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston))；和抗雄激素类药物如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任意上述药物的可药用盐、酸或衍生物。
当在这里使用“生长抑制剂”时指在体外或体内抑制细胞生长，特别是癌细胞生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除了S期的其它阶段)的试剂，例如诱导G1期阻断和M期阻断的试剂。经典的M期阻断剂包括Vincas(长春新碱和长春碱)、Taxol和拓扑异构酶II抑制剂如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻断G1的那些剂也延长到S期的阻断，例如DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。
施用方法本发明提供治疗方法，包括施用给受试者有效量的本发明VEGF捕获剂。在一优选的方面，捕获剂是充分纯化的(例如，基本没有限制其效果或产生非期望的副作用的物质)。受试者优选地是哺乳动物并最优选地是人。
不同的递送体系是已知的并可用于施用本发明的试剂，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(见例如Wu和Wu，1987年，J.Biol.Chem.2624429-4432页)、作为逆转录病毒载体或其它载体的一部分的核酸构建体等中。引入的方法可以是经肠的或肠胃外的，并包括但不限于皮内的、肌肉的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、眼内的和经口的途径。化合物可通过任意便利的途径施用，例如通过灌注、推注注射、通过经由上皮或粘膜衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收并可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部。施用可以是急性的或慢性的(例如每日、每周、每月等)或与其它试剂结合施用。也可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及使用含有雾化剂制剂。
在另外的实施方案中，活性剂可在泡囊中，特别是在脂质体中、在受控制的释放体系中或在泵中递送。在另外的实施方案中，其中本发明活性剂是编码蛋白的核酸，可在体内施用该核酸来促进其编码的蛋白的表达，通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并将其施用使得它进入细胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(见例如美国专利4,980,286)、通过直接注射或通过使用微粒轰击或通过用脂类或细胞表面受体或转染剂包被施用该核酸，或通过与已知的能进入细胞核的类似同源异型框的肽连接施用该核酸(见例如，Joliot等，1991年，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)。备选地，例如通过同源重组，可将核酸引入细胞内并整合进宿主细胞DNA来表达。
在特定的实施方案中，期望将本发明药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不以此作为限制，在手术期间局部灌注、局部施用完成，所述的局部灌注和局部施用是例如通过注射、通过导管的方式或通过植入物的方式进行，其中的植入物是多孔的、非多孔的或凝胶状的物质，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜、纤维或商业的皮肤代用品。
用于实践本发明方法的组合物可以是包含本发明试剂的溶液、悬液或两者的液体。术语“溶液/悬液”指液体组合物，其中第一部分活性剂存在于溶液中而第二部分活性剂表现为颗粒的形式，所述颗粒在液体基质中悬浮。液体组合物也包括凝胶体。液体组合物可以是含水的或是以软膏剂的形式。进一步，组合物可采用固体物的形式，可将该固体物放入眼睛中，例如放入眼和眼睑之间或结膜囊中，在这里释放VEGF捕获剂。VEGF一般从这种物体释放至角膜，通过泪液，或直接传至角膜本身，固体物一般与角膜直接接触。适合植入眼睛的固体物通常主要由生物溶蚀或非生物溶蚀聚合物组成。水溶液和/或悬液可以是滴眼液的形式。理想的活性剂的剂量可以通过施用已知数量的滴数至眼中测量。例如，对于25μl体积一滴，施用1-6滴将递送25-150μl组合物。
用于实践本发明方法的含水悬液或溶液/悬液可包含一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物，如纤维素聚合物，和不可水溶的聚合物如交联的含有羧基的聚合物。本发明的含水悬液或溶液/悬液优选地是粘性的或粘膜粘附性的，或更优选地两者都是粘性的或两者都是粘膜粘附性的。
在另外的实施方案中，用于实践本发明方法的组合物是原位能形成凝胶的含水组合物。这种组合物含有胶凝剂，该胶凝剂的浓度在与眼睛或泪液接触时能有效促使形成凝胶。合适的胶凝剂包括但不限于热固性聚合物。如此处所用的术语“可原位形成凝胶的”不仅包括在与眼睛或泪液接触时形成凝胶的低黏度液体，也包括更有粘性的液体如在施用至眼睛时表现出相当大增加的黏度或凝胶硬度的半流体的和触变的凝胶。
诊断和筛选方法本发明VEGF捕获剂可作诊断性使用和/或用于筛选方法。例如，该捕获剂可用于在临床研究阶段监控VEGF的水平来评价治疗效率。在另外的实施方案中，本发明方法和组合物可用于筛选个体进入临床研究来鉴定具有例如太高或太低VEGF水平的个体。该捕获剂能用于在涉及VEGF的定位和活性例如诊断方法中的成像、在合适的生理学样品中检测其水平等的领域中已知的方法。
本发明捕获剂可用于体内和体外筛选检测法来定量存在的非结合的VEGF的量，例如可用于筛选方法来鉴定能降低VEGF的表达的检测试剂。更一般地，本发明捕获剂可以用于在其中期望定量和/或分离VEGF的任意检测法或方法。
药物组合物本发明也提供包含本发明VEGF小捕获剂的药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的一种或多种小捕获剂和可药用载体。术语“可药用的”指用于动物以及更特别是用于人的经过联邦政府或州政府核准的或在美国药典或其它一般公认的药典中列出的。术语“载体”指与药物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这种药用载体可以是无菌液体如水或油，包括源于石油的、动物的、植物的或合成的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等形式。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、二元醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物也可包含小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。合适的药用载体的实例由E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。
本发明的VEGF小捕获剂可配制成中性形式或盐的形式。可药用盐包括与自由氨基基团形成的那些盐，如源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，和那些与自由羧基基团形成的那些盐，如源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
此外，用于实践本发明方法的含水组合物具有与眼睛相容的pH值和摩尔渗透压浓度。可将一种或多种眼睛可接受的pH值调节剂和/或缓冲剂包含于本发明组合物中，其包括酸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、醋酸钠、乳酸钠；以及缓冲液如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。将使组合物的pH值维持在眼睛可接受的范围内所需要的量的这些酸、碱和缓冲液包含于组合物内。可将足够能使组合物的摩尔渗透压浓度达到眼睛可接受范围的量的一种或多种眼睛可接受盐包含于组合物内。这种盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐。
能有效用于其预期的治疗用途的捕获剂的量可通过基于本描述的标准临床技术测定。而且，可任选地采用体外检测法来帮助鉴定最佳的剂量范围。通常，用于静脉内施用的合适的剂量范围一般是每千克体重约50-5000微克活性化合物。用于鼻内施用的合适的剂量范围一般是约0.01pg/kg体重到1mg/kg体重。从来自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推可得到有效的剂量。
对于全身施用，可从体外检测法初步估计治疗有效剂量。例如，在动物模型中可配制剂量来获得循环浓度范围，包括在细胞培养物中测定的IC50值。这种信息可用来在人中更有效地确定有用的剂量。也可用本技术领域熟知的方法从体内数据例如从动物模型得到数据估计初始的剂量。本技术领域中一般水平的技术人员可基于动物数据便利地优化对人的施用。
可个别调整剂量和施用的时间间隔以提供足够用以保持治疗效果的血液中化合物的浓度水平。在局部施用或选择性摄取的情况下，有效的化合物局部浓度可能与血浆浓度不相关。本领域技术人员将能够优化治疗有效量的局部剂量而不需要过多的试验。
当然施用的化合物的量将取决于受试者、取决于他的体重，病痛的严重性、施用方式和主治医生的判断。治疗可在检测到症状时或甚至在检测不到症状时间歇性的重复。治疗可单独进行或与其它药物结合进行。
细胞转染和基因治疗本发明包括使用编码本发明融合多肽的核酸来在体外和体内转染细胞。可将这些核酸插入至任意数量的熟知的载体来转染靶标细胞和生物体。通过载体和靶标细胞之间的相互作用，可将核酸离体和体内转染进细胞中。将组合物以足够引起治疗反应的量施用(例如通过注射进肌肉中)至受试者。将足够达到引起治疗反应的量定义为“治疗有效剂量或量”。
在另外的方面，本发明提供在人或其它动物中减少VEGF水平的方法，方法包括用编码本发明融合多肽的核酸转染细胞，其中核酸包含有效地连接至编码融合多肽或小捕获剂的核酸上的可诱导启动子。有关治疗或预防人的疾病的基因治疗方法，参见例如Van Brunt(1998年)Biotechology 61149-1154页。
试剂盒本发明也提供生产的商品，该商品包括包装材料和包含于包装材料中的药剂，其中药剂包含至少一种由两种或多种本发明融合多肽组成的VEGF捕获剂，并且其中所述的包装材料包含标签或说明书，标签或说明书说明该VEGF特异性融合多肽能用于治疗VEGF介导的疾病或病症。
转基因动物本发明包括表达本发明捕获剂的非人类转基因动物。可由如通过微注射、逆转录病毒感染将核酸引入受精卵母细胞的雄性原核中并让卵母细胞在假孕的雌性代育动物中发育而产生转基因动物。任何有调节作用的或其它在表达载体中有用的序列可构成转基因序列的一部分。可将组织特异性调控序列有效地连接至转基因以在特定的细胞中指导表达该转基因。表达本发明融合多肽或小捕获剂的非人类转基因动物可用于多种应用，包括作为产生这种融合多肽的手段。而且，可将转基因处于可诱导启动子的控制下，这样融合多肽或小捕获剂的表达可由例如施用小分子来控制。
特定的实施方案在下面描述的试验中，小VEGF捕获剂得以产生并且研究了它们结合VEGF的能力。这种小捕获剂优选地用于特定的应用中。例如，某种病症或疾病可优选地通过局部施用VEGF捕获剂至特定的器官、组织或细胞中而不是通过全身施用来治疗。在本发明小捕获剂的一个范例中，通过直接切割二聚化的VEGF捕获剂而产生更小的VEGF捕获剂，所述的二聚化VEGF捕获剂具有产生于Fc结构域中的切割区域(C-区)(实施例2)。截短的捕获剂表现出与完整的母体捕获剂相当的VEGF亲和性和半衰期。实施例3-5描述了具有VEGF受体组分和含有一个或两个半胱氨酸残基的多聚化组分的融合多肽的构建。亲和性测定表明在大肠杆菌中表达的非糖基化融合多肽或在CHO细胞中表达的糖基化多肽具有与完整的母体捕获剂相当的VEGF亲和性。实施例6进一步阐述了能结合并抑制VEGF的由(R1R2)2组成的单体VEGF捕获剂。实施例7描述了VEGF小捕获剂(SEQ ID NO26)的构建，该捕获剂表现出与完整捕获剂(SEQ ID NO10)相当的高的结合VEGF的亲和性。
本发明其它的特征在随后对作为范例的实施例的描述期间将变得显而易见，其中作为范例的实施方案是给出来作为本发明的例子并且用意不在于用来限制。
实施例提出下面的实施例以给本领域一般技术人员提供完全的公开内容和描述怎样获得和使用本发明的方法和组合物，并且用意不在于限制发明者认定的他们的发明的范围。已经努力确保使用的数字(例如数量、温度等)的精确性，但应该说明一些试验的误差和偏差。除非另外说明，份数是基于重量的份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏温度，以及压强是大气压或接近大气压。
实施例1.Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的构建母体VEGF捕获剂，即Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO7-8)、VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO12-13)的构建在PCT出版物WO/0075319中详细描述，这里特别通过全文引用作为参考。在WO/0075319中也描述了构建方法和表达编码VEGF捕获剂的核酸构建体的方法、检测和测量与VEGF结合的VEGF捕获剂的方法、通过BIAcore分析法和药代动力学分析法测定结合VEGF的化学定量关系的方法。
实施例2凝血酶切割的二聚体VEGF小捕获剂通过在Fc结构域的CPPC(SEQ ID NO1)后插入凝血酶切割位点修饰VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)构建体。将纯化的VEGF捕获剂(5μg)与凝血酶(Novagen公司)在20mM Tris-HCl(pH 8.4)、50mM NaCl、2.5mM CaCl2中于37℃孵育16小时。对照包括不与凝血酶孵育的切割对照蛋白(CCP)和母体VEGF捕获剂蛋白。用SDS-PAGE分析(Tris-甘氨酸4-20％凝胶；每泳道5μg蛋白)证实了正确的切割(结果没有展示)。
亲和性测定。如WO/0075319中描述，每个VEGF捕获剂与hVEGF165结合的Kd值得以测定，即测定了母体VEGF捕获剂、含有凝血酶切割位点的未切割的VEGF捕获剂(“未切割的VEGF捕获剂”)、经切割的VEGF小捕获剂和重组的单体R1R2-myc myc his的Kd值。更特别地，使用原代人类内皮细胞(HUVECs)测定了捕获剂阻断依赖VEGF165的受体磷酸化的能力。在不同浓度的测试捕获剂存在时孵育VEGF165，并将该混合物加至HUVECs以刺激VEGFR2的酪氨酸磷酸化。处于VEGF捕获剂的亚化学剂量浓度时，未结合的VEGF诱导受体磷酸化。然而，当VEGF捕获剂对配体大于1∶1的摩尔比时，观察到受体信号传导作用完全被阻断，因而确定单个分子的捕获剂二聚体能阻断单个分子的人VEGF165。因此，VEGF捕获剂对VEGF的高度的结合亲和性导致复合物的形成，该复合物阻止VEGF与细胞表面受体相互作用。对母体VEGF捕获剂、未切割的VEGF捕获剂和经切割的VEGF小捕获剂进行相同的磷酸化抑制试验时可观察到相当的结果。结果在表1中显示。
表1
实施例3.编码VEGF小捕获剂的质粒的构建从母体VEGF捕获剂前体即VEGFR1R2.FcΔC1(a)构建VEGF小捕获剂，其中三个氨基酸甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸作为Flk1D3和FcΔC1(a)之间的连接序列。可将pTE115这种质粒用于VEGF小捕获剂的构建，因为连接区DNA序列包含Srf I限制性核酸内切酶识别序列，这有助于改造VEGF捕获剂。在所有其它方面，由pTE115编码的VEGF捕获剂与在PCT出版物WO/0075319中描述的VEGF捕获剂、VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)相同。
构建具有多聚化结构域的两个VEGF小捕获剂，其中所述的多聚化结构域包括接在受体组分Flt1D2.Flk1D3的C-端的一个半胱氨酸(R1R2C)(SEQ ID NO2)或氨基酸序列ACGC(SEQ ID NO4)(R1R2ACGC)(SEQ ID NO5)。这两种构建体都能形成同型二聚体分子，所述的二聚体由一个(R1R2C)或两个(R1R2ACGC)分子间的二硫键稳定。
通过除去由用Srf I和Not I消化pTE115产生的690bp片段并插入通过退火寡聚R1R2NC(SEQ ID NO14)和R1R2CC(SEQ ID NO15)形成的合成DNA片段而得到质粒pTE517。
得到的质粒编码R1R2C，R1R2C包括以一个半胱氨酸结尾的Flt1D2.Flk1D3结构域(SEQ ID NO23)。同样，通过除去由用SrfI和Not I消化pTE115DNA产生的690bp片段并随后连接通过退火寡聚R1R2NACGC(SEQ ID NO16)和R1R2CACGC(SEQ ID NO17)形成的合成DNA片段而得到质粒pTE 518。得到的质粒编码R1R2ACGC，R1R2ACGC包括以氨基酸ACGC结尾的Flt1D2.Flk1D3结构域(SEQ ID NO25)。
也构建质粒来指导在大肠杆菌中表达这些小捕获剂。将引物R1R2N-Ncol(SEQ ID NO18)和R1R2CNot1(SEQ ID NO19)用于从pTE115扩增DNA片段，相对于母体VEGF捕获剂所述的DNA片段编码氨基酸G30-K231(SEQ ID NO10)。扩增该片段导致5’端的起始甲硫氨酸的融合和3’端的半胱氨酸的密码子的融合(SEQ ID NO2)，随后是终止密码子。然后将该DAN片段克隆至大肠杆菌表达质粒pRG663的NcoI和Not I位点中以产生pRG1102，这样使得R1R2C的表达取决于从噬菌体T7φ1.1启动子的转录。诱导pRG1102的基因表达导致R1R2cys在大肠杆菌宿主株RFJ238的细胞质中的积聚。同样，将启动子R1R2N-Nco1(SEQ ID NO18)和R1R2ACGC-Not1(SEQ ID NO20)用于扩增编码氨基酸G30-K231的pTE115的DNA片段(SEQ ID NO10)，导致5’端的起始的甲硫氨酸密码子和ACGC密码子(SEQ ID NO4)的融合，随后是3’端的终止密码子(SEQ ID NO5)。然后将该片段克隆至大肠杆菌表达质粒pRG663的NcoI和Not I位点中以产生pRG1103，这样以至于R1R2ACGC的表达取决于从噬菌体T7φ1.1启动子的转录。诱导pRG1102和pRG1103的基因表达分别导致R1R2c或R1R2ACGC在大肠杆菌宿主株RFJ238的细胞质中的积聚。
实施例4.来自大肠杆菌的VEGF小捕获剂的纯化和表征R1R2c和R1R2ACGC都作为细胞质蛋白在大肠杆菌中得以表达并通过相同方法纯化。诱导大肠杆菌宿主株K12株RFJ238中的pRG1102或pRG1103上的噬菌体T7φ1.1启动子导致蛋白在细胞质中的积聚。诱导后，通过离心收集细胞，将其再悬浮于50mMTris-HCl(pH 7.5)、20mM EDTA中，并通过将细胞穿过Niro-Soavi细胞匀浆器进行裂解。通过离心从裂解的细胞中收集包涵体，在蒸馏水中洗涤一次，然后溶解于8M胍-HCl、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、100mM亚硫酸钠、10mM连四硫酸钠中，并室温下孵育16小时。将澄清的上清液在用6M胍-HCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的S300柱上分级，含有R1R2C的级分被收集并用6M脲、50mM Tris-HCl(pH7.5)透析。将经透析的蛋白稀释至2M脲、50mM Tris-HCl(pH 8.5)、2mM半胱氨酸中，然后4℃下缓慢搅拌7天。将重新折叠的蛋白用50mM Tris-HCl(pH 7.5)透析，然后上样到用50mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的SP-琼脂糖柱上并用50mM Tris-HCl(pH 7.5)中的0-1M的NaCl梯度洗脱。合并含有R1R2c的级分，将其浓缩并上样至用50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl平衡的Superdex 200柱上。收集并合并含有小捕获剂二聚体的级分。纯化的小捕获剂的分子量通过SDS-PAGE估计为约46kD。
将BIAcore检测法用于(如WO/0075319中描述)检测捕获剂对VEGF的亲和性，结果显示R1R2c和R1R2ACGC小捕获剂具有与全长VEGF捕获剂相当的VEGF亲和性(表2)。
表2
实施例5.VEGF小捕获剂在CHO K1中的表达由pTE517和pTE518编码的VEGF小捕获剂的表达取决于从人CMV-MIE启动子的转录，并当在CHO细胞中表达时导致小捕获剂分泌至培养基中。当作为分泌蛋白在CHO K1中表达时，两种小捕获剂都能在条件培养基中找到，并通过SDS-PAGE显示估计它们的分子量，正如期望的，这些蛋白是糖基化的。通过SDS-PAGE分析也表示小捕获剂能形成同型二聚体分子，该二聚体分子通过C-端半胱氨酸之间的分子间二硫键稳定。特别地，当在CHO细胞中作为分泌蛋白表达时，R1R2c小捕获剂有效地形成共价二聚体。
实施例6.单链VEGF小捕获剂的构建和表达不需要多聚化结构域的VEGF小捕获剂(SEQ ID NO24)也得以构建。这种小捕获剂可通过将一个Flt1D2.Flk1D3结构域(R1R2)(SEQID NO24的氨基酸30-231)直接融合至第二个Flt1D2.Flk1D3结构域(R1R2)(SEQ ID NO24的氨基酸234-435)上而构建，在这些串联受体结构域之间有一Gly-Pro的连接序列(SEQ ID NO24的氨基酸232-233)。
为了构建编码串联的Flt1D2.Flk1D3结构域的基因，合成了一段DNA片段(Blue Heron Biotechnology)，该DNA片段编码一个Flt1D2.Flk1D3结构域，其与在pTE115中发现的编码Flt1D2.Flk1D3结构域的DNA有最小的DNA同源性。将合成的DNA片段作为Srf I-NotI片段克隆进pTE115的Srf I-Not I位点以产生pTE570，pTE570从CMV-MIE启动子表达R1R2-R1R2 VEGF小捕获剂。当将该质粒转染至CHOK1细胞中时，R1R2-R1R2 VEGF小捕获剂在培养基中积聚。
实施例7.VEGF小捕获剂的构建和表达如上面描述，通过直接将一个Flt1D2.Flk1D3结构域(R1R2)(SEQID NO26的氨基酸30-231)与以CPPC终止的C-端九个氨基酸的序列融合构建VEGF小捕获剂。当将该质粒转染进CHO K1细胞中时，SEQID NO26的VEGF小捕获剂分泌至培养基中。用非还原SDS-PAGE电泳进行随后的纯化，自然光散射分析鉴定了一种分子量为约64kDa的捕获剂分子。该分子量说明在两个SEQ ID NO26的融合多肽之间形成了共价二聚体。对编码SEQ ID NO27和28的融合多肽的质粒进行类似的试验，并同样表明这些分子形成了同型二聚体捕获剂。对人VEGF-165结合至包括SEQ ID NO10和SEQ ID NO26的二聚体的EGF捕获剂的亲和性测定结果显示在表3中。
表3
序列表<110>Regeneron Pharmaceuticals.Inc.
<120>VEGF捕获剂及其治疗用途<130>RGE 710D2<140>To Be Assigned<141>2004-06-29<150>10/609,775<151>2003-06-30<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>智人<400>1Cys Pro Pro Cys1<210>2<211>200<212>PRT<213>智人<400>2Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile1 5 10 15His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser20 25 30Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile35 40 45Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile50 55 60
Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr65 70 75 80Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr85 90 95Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val100 105 110Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val115 120 125Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys130 135 140Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys145 150 155 160Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln165 170 175Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr180 185 190Phe Val Arg Val His Glu Lys Cys195 200<210>3<211>4<212>PRT<213>智人<220>
<221>变体<222>1，3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>3Xaa Cys Xaa Cys1<210>4<211>4<212>PRT<213>智人<400>4Ala Cys Gly Cys1
<210>5<211>203<212>PRT<213>智人<400>5Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile1 5 10 15His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser20 25 30Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile35 40 45Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile50 55 60Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr65 70 75 80Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr85 90 95Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val100 105 110Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val115 120 125Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys130 135 140Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys145 150 155 160Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln165 170 175Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr180 185 190Phe Val Arg Val His Glu Lys Ala Cys Gly Cys195 200<210>6<211>6<212>PRT<213>智人<400>6Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5
<210>7<211>1453<212>DNA<213>智人<400>7aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc cccgggcgag ctcgaattcg 60caaccaccat ggtcagctac tgggacaccg gggtcctgct gtgcgcgctg ctcagctgtc 120tgcttctcac aggatctagt tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc 180ccgaaattat acacatgact gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac 240ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420atcgacaaac caatacaatc atagatgtgg ttctgagtcc gtctcatgga attgaactat 480ctgttggaga aaagcttgtc ttaaattgta cagcaagaac tgaactaaat gtggggattg 540acttcaactg ggaataccct tcttcgaagc atcagcataa gaaacttgta aaccgagacc 600taaaaaccca gtctgggagt gagatgaaga aatttttgag caccttaact atagatggtg 660taacccggag tgaccaagga ttgtacacct gtgcagcatc cagtgggctg atgaccaaga 720agaacagcac atttgtcagg gtccatgaaa agggcccggg cgacaaaact cacacatgcc 780caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 840ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 900gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 960ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1020ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1080ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 1140aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 1200gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 1260cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1320atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 1380tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 1440aatgagcggc cgc1453<210>8<211>458<212>PRT<213>智人<400>8Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu20 25 30Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
35 40 45Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu50 55 60Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile65 70 75 80Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu85 90 95Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys100 105 110Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val115 120 125Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val130 135 140Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn145 150 155 160Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg165 170 175Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr180 185 190Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys195 200 205Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg210 215 220Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys225 230 235 240Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro245 250 255Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys260 265 270Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp275 280 285Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu290 295300Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu305 310 315 320His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn325 330 335Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly340 345 350Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu355 360 365Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr370 375 380Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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ctaacatcac tgttacttta aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac 300gcataatctg ggacagtaga aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag 360ggcttctgac ctgtgaagca acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac 420atcgacaaac caatacaatc atagatatcc agctgttgcc caggaagtcg ctggagctgc 480tggtagggga gaagctggtc ctcaactgca ccgtgtgggc tgagtttaac tcaggtgtca 540cctttgactg ggactaccca gggaagcagg cagagcgggg taagtgggtg cccgagcgac 600gctcccaaca gacccacaca gaactctcca gcatcctgac catccacaac gtcagccagc 660acgacctggg ctcgtatgtg tgcaaggcca acaacggcat ccagcgattt cgggagagca 720ccgaggtcat tgtgcatgaa aatggcccgg gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 1320tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagcgg 1440ccgc 1444<210>13<211>455<212>PRT<213>智人<400>13Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu20 25 30Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu35 40 45Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu50 55 60Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile65 70 75 80Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu85 90 95Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys100 105 110Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Ile Gln115 120 125
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<400>19agagaggcgg ccgctttatc aacacttttc atggaccctg acaaatgt 48<210>20<211>57<212>DNA<213>智人<400>20agagaggcgg ccgctttatc aacaaccgca tgccttttca tggaccctga caaatgt 57<210>21<211>39<212>DNA<213>智人<400>21agttccggaa gtgccatggg tagacctttc gtagagatg 39<210>22<211>44<212>DNA<213>智人<400>22agagaggcgg ccgctgttat cacttctcgt gcacgcgcac gaag 44<210>23<211>235<212>PRT<213>智人<400>23Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro GIu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80
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Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Arg Pro Phe Val Glu Met225 230 235 240Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu245 250 255Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys260 265 270Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp275 280 285Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile290 295 300Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly Hi s Leu Tyr Lys Thr305 310 315 320Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu325 330 335Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu340 345 350Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp355 360 365Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp370 375 380Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu385 390 395 400Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala405 410 415Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val420 425 430His Glu Lys435<210>25<211>238
<212>PRT<213>智人<400>25Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asn Thr Leu Ile Pro Asn Gly Lys65 70 75 80Ala Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Ala Cys Gly Cys225 230 235<210>26<211>240<212>PRT<213>智人<400>26Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys225 230 235 240<210>27<211>240<212>PRT<213>智人<400>27Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60
Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys225 230 235 240<210>28<211>237<212>PRT<213>智人<400>28Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110
Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys225 230 235<210>29<211>434<212>PRT<213>智人<400>29Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu1 5 10 15Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val20 25 30Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr35 40 45Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe50 55 60Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu65 70 75 80Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg85 90 95Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile100 105 110Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr115 120 125Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys130 135 140His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr165 170 175Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met180 185 190Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Glu Ser Lys195 200 205Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly210 215 220Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile225 230 235 240Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu245 250 255Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His260 265 270Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg275 280 285Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys290 295 300Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu305 310 315 320Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr325 330 335Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu340 345 350Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp355 360 365Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val370 375 380Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp385 390 395 400Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His405 410 415Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu420 425 430Gly Lys
权利要求
1.分离的核酸分子，其编码由组分(R1R2)x或(R1R3)Y及融合配偶体(FP)组成的融合多肽，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体组分Flt-1的Ig结构域2，R2是Flk-1的Ig结构域3，R3是Flt-4的Ig结构域3。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述的融合配偶体(FP)是能与另外的MC相互作用形成多聚体结构的多聚化组分(MC)。
3.如权利要求3所述的分离的核酸，其中所述的MC选自(i)含有可切割区域(C-区)的多聚化组分，(ii)截短的多聚化组分，(iii)具有至少一个半胱氨酸残基且长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉链，(V)螺旋环基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白结构域。
4.融合多肽，其由权利要求1-3所述的核酸分子编码。
5.如权利要求4所述的融合多肽，其具有SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列。
6.能在转化的宿主细胞中复制的表达载体，其包含权利要求1-3所述的核酸分子。
7.产生VEGF融合多肽的方法，其中所述的方法包括将权利要求6所述的表达载体引入合适的表达系统，并实现VEGF融合多肽的表达。
8.血管内皮细胞生长因子(VEGF)捕获剂，其包含两个或多个如权利要求4所述的融合多肽的多聚体。
9.如权利要求8所述的VEGF捕获剂，其是二聚体。
10.二聚体VEGF捕获剂，其包含两个含有SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列的融合多肽。
11.药物组合物，其包含权利要求8或9所述的融合多肽和可药用载体。
12.治疗疾病或病症的方法，所述的疾病或病症通过除去或抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)得以改善、减轻或抑制，其中所述的方法包括施用如权利要求11所述的药物组合物至需要治疗的受试者。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的疾病或病症是眼睛的疾病或病症。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的眼睛的疾病或病症是年龄相关的黄斑变性。
15.分离的核酸分子，其编码由受体组分(R1R2)x或(R1R3)Y及能与另外的MC相互作用形成多聚体结构的多聚化组分(MC)组成的融合多肽，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体组分Flt-1的Ig结构域2，R2是Flk-1的Ig结构域3，R3是Flt-4的Ig结构域3，其中多聚化组分(MC)选自(i)含有可切割区域(C-区)的多聚化组分，(ii)截短的MC，(iii)具有至少一个半胱氨酸残基且长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉链，(V)螺旋环基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白结构域。
16.如权利要求15所述的分离的核酸分子，其中受体组分是(R1R2)x，多聚化组分是具有至少一个半胱氨酸残基且长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的分离的核酸分子，其中受体组分是R1R2，X是1，并且多聚化组分是具有1-2个半胱氨酸残基且长度为1-15个氨基酸的氨基酸序列。
18.能结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)的融合多肽，其中所述的融合多肽由如权利要求15-17所述的核酸分子编码。
19.如权利要求18所述的融合多肽，其包含SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列。
20.融合多肽，其由受体组分(R1R2)x或(R1R3)Y及能与另外的多聚化组分(MC)相互作用形成多聚体结构的MC组成，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体组分Flt-1的Ig结构域2，R2是Flk-1的Ig结构域3，R3是Flt-4的Ig结构域3，其中多聚化组分(MC)选自(i)含有可切割区域(C-区)的MC，(ii)截短的MC，(iii)具有至少一个半胱氨酸残基且长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉链，(V)螺旋环基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白结构域。
21.如权利要求20所述的融合多肽，其中所述的受体组分是(R1R2)x，多聚化组分是具有至少一个半胱氨酸残基且长度在1-约200个氨基酸之间的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的融合多肽，其中所述的受体组分是R1R2，X是1，并且多聚化组分是具有1-2个半胱氨酸残基且长度为1-15个氨基酸的氨基酸序列。
23.二聚体VEGF捕获剂，其由两个如权利要求20-22所述的融合多肽组成。
24.生产的商品，其包括(a)包装材料；和(b)容纳于所述包装材料中的药剂；其中所述的药剂包含至少一种VEGF捕获剂，其中所述的捕获剂由受体组分(R1R2)x或(R1R3)Y及能与另外的多聚化组分(MC)相互作用形成多聚体结构的MC组成，其中，X≥1，Y≥1，并且，其中所述的包装材料包含标签或说明书，该标签或说明书说明该VEGF特异性融合多肽能用于治疗VEGF介导的疾病或病症。
全文摘要
核酸分子和能结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)的多聚化蛋白质。公开了在治疗上用于治疗VEGF相关的病症和疾病的VEGF捕获剂，并且将其特定地设计用于局部施用至特定的器官、组织和/或细胞中。
文档编号A61K38/00GK1816566SQ200480018573
公开日2006年8月9日 申请日期2004年6月29日 优先权日2003年6月30日
发明者T·J·戴雷, J·P·凡德尔, N·J·帕帕佐普罗斯 申请人:瑞泽恩制药公司