专利名称：提高治疗的葡聚糖的制作方法
本申请是2003年7月16日提交的美国系列号No.10/621,027的部分继续申请，其内容在此以其整体引入本申请中作为参考。
贯穿本申请，引用了各种参考文献。这些出版物的公开内容在此以其整体引入本申请中作为参考，来更全面地描述本发明所属的现有技术状况。
背景技术：
该公开涉及将物质引入细胞的方法，该方法包括使含有口服给药的β-葡聚糖的组合物接触所述细胞。本发明的一方面提供了将物质引入患者的方法，包括将有效量的上述组合物给药于患者。可以口服递送的物质包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、化疗剂、生物活性剂和质粒。也可以使用其它小分子和化合物。本发明的另一方面是含有能够提高IgM抗体功效的口服给药的β-葡聚糖的组合物。
源自酵母细胞壁的葡聚糖可以用于上述组合物中，酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或美国专利No.5,250,436中所述的突变酵母菌株，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法来制备具有β(1-3)和β(1-6)键的葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法来制备适于口服给药的可溶性或含水葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。
在小鼠中测试β-葡聚糖用于肿瘤治疗已有近40年了1，2。在日本临床使用几种形式的源自蘑菇的β-葡聚糖来治疗癌症，包括PSK(来自云芝(Coriolus versicolor))、香菇多糖和裂裥菌素。日本的随机试验中，PSK在一些癌症试验中胃切除术3，4，结直肠手术5，6和食管切除7来除去原发性肿瘤后具有适度地，但显著提高的存活率。在乳癌8，9和白血病10中的结果较少鼓舞人心。裂裥菌素对患有可行手术的胃癌11，不宜动手术的胃癌12，13和宫颈癌14的患者具有提高的存活率。此外，尽管组之间的存活差异是统计学上显著性的，但是这些提高是适度的。虽然β-葡聚糖没有得到西方肿瘤学家的广泛使用，但含有β-葡聚糖的植物药物如Reishi和maitake15是美国癌症患者广泛使用的，来作为替换/辅助癌症治疗。寻找β-葡聚糖治疗作用的这些之前的研究，没有将治疗性单克隆抗体(MoAb)的共同给药引入作为实验方案的一部分。存在越来越多的证据抗体是沉积作为人肿瘤有效淀素的iC3b所必需的。当给药β-葡聚糖而没有共同给药MoAb时，其肿瘤细胞毒性作用需要在患者中甚至在实验小鼠中是非常可变的天然生成抗肿瘤抗体的存在。
之前描述了当结合癌症特异性抗体时的β-葡聚糖的抗肿瘤作用。之前的研究已经显示了源自大麦或燕麦的口服β-葡聚糖在异种移植模型中可以极大地提高抗肿瘤单克隆抗体的抗肿瘤活性。参见Therapy-Enhancing Glucan，国际申请No.PCT/US02/01276，2002年1月15日申请。Cheung等，口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖与抗神经节苷脂GD2单克隆抗体3F8在成神经细胞瘤治疗中的协同作用。ClinCancer Res.2002；81217-1223。Cheung NK等，口服给药的β-葡聚糖提高单克隆抗体的抗肿瘤效果。Cancer Immunol Immunother.2002；51557-564。I期临床试验支持大麦β-葡聚糖可以提高抗体对转移性癌症作用的预测。如前所述的，香菇多糖和昆布多糖，都为(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖，没有和大麦葡聚糖一样有效16。此外，在(1→3)，(1→4)-β-D葡聚糖中，小分子量制剂和地衣多糖也没有效果。β-葡聚糖的分子大小和精细结构对针对肿瘤的抗体的协同作用具有实质性影响。
在欧洲和美国，尤其是来自面包酵母的β-葡聚糖作为动物的饲料添加剂、作为人的膳食补充物17、在治疗创伤中18和作为皮肤霜剂中的活性成分已经使用很长时间了。β-葡聚糖中的基本结构单位是β(1→3)连接的葡糖基单位。根据来源和分离的方法，β-葡聚糖具有各种程度的支化和侧链中的连接。侧链的出现率和铰链结构决定了其免疫调节的效果。真菌和酵母来源的β-葡聚糖通常不溶于水中，但是可以通过酸水解或通过将带电荷的基团如-磷酸盐、-硫酸盐、-胺、-羧甲基等等引入分子中的衍生作用来制得可溶性的β-葡聚糖19，20。
从面包酵母、酿酒酵母中分离出具有以下分子结构的可溶性葡聚糖 其中(1→3)-β-D-葡聚糖单位形成主链，带有由位于(1→6)-β-D-葡聚糖铰链的(1→3)-β-D-葡聚糖单位构成的支链。获得高分子量部分并在肿瘤模型中测试与单克隆抗体的协同作用。如下详述的当结合人癌症特异性单克隆抗体时，发现可溶性酵母β-葡聚糖的抗肿瘤效果与可溶性大麦β-葡聚糖的抗肿瘤效果类似。
发明内容
本发明提供了将物质引入细胞的方法，该方法包括使含有口服给药的β-葡聚糖的组合物接触所述的细胞。
本发明的另一方面是将物质引入患者的方法，该方法包括将有效量的上述组合物给药于患者。可以口服递送的物质包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、化疗剂、生物活性剂和质粒。还可以使用其它小分子和化合物。
本发明的再一个方面是含有能够提高IgM抗体功效的口服给药的β-葡聚糖的组合物。
图1.大麦(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗体来治疗患者转移性成神经细胞瘤。
在患有多次量化疗难医治的转移性成神经细胞瘤的患者治疗之前和之后进行MIBG扫描。患者接受静脉内抗GD2抗体3F8(10mg/m2/天)，总共10天，在相同的时间段内加口服大麦β-葡聚糖。图1A显示了患者的基线MIBG扫描。在股骨、腓骨、骨盆、肋骨、左肩胛骨、右锁骨、肱骨、颅骨和脊柱中可以看到大范围的骨转移。心脏、肝脏、胃和结肠吸收是生理性的。图1B显示了用3F8加葡聚糖单循环治疗后的同一患者2个月后的MIBG扫描。转移的面积得到显著改善。
图2.大麦(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗体来治疗SCID小鼠中异种移植的皮下人淋巴瘤。
具有建立的皮下Daudi(n＝9)(图2A)、Hs445(n＝5)(图2B)、EBV-衍生的LCL(n＝9)(图2C)和RPMI 6666(n＝10；数据未显示)异种移植物的SCID小鼠，用200μg静脉内美罗华每周两次，共8剂(■)，每日通过胃内管饲口服给药400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(△)或美罗华和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的组合(×)治疗，或留下未治疗(◆)。在y轴上标出肿瘤生长的百分比，治疗后的天数开始于x轴上。误差直方图表示SEM并仅显示了美罗华单独和组合组。对于所有的异种移植物，只有组合治疗与肿瘤生长的降低相关。与美罗华单独相比较，除了美罗华以外接受β-葡聚糖的组中每天肿瘤生长降低，对Daudi是2.0％(95％CI 1.3-2.7％；p＜0.0005)，对EBV-衍生的LCL为0.8％(95％CI 0.4-1.2％；p＜＝0.01)，对Hs445为2.2％(95％C.I.1.2-3.2％；p＝0.0009)，对RPMI 6666为1.8％(95％CI 1.0-2.7％；p＜0.0002；数据未显示)。
图3.大麦(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗体来治疗SCID小鼠中异种移植的弥散性人淋巴瘤。
将100μl生理盐水中的5×106个Daudi(图3A)或Hs445(图3B)细胞静脉内注射(IV)进SCID小鼠中。肿瘤植入后10天开始，用200μg静脉内美罗华每周两次，共8剂(---)，每天通过胃内管饲口服给药400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(…)或美罗华和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的组合(—)来治疗小鼠，或留下未治疗 肿瘤全身生长，当肿瘤细胞浸润脊椎管时小鼠变得瘫痪，导致后腿瘫痪。在瘫痪发作时或当动物体重减轻10％时将小鼠处死。各组的Kaplan-Mailer存活曲线显示于图2A(Daudi)和2B(Hs445)中。与所有其它治疗组(对于Daudi p＜0.0005，对于Hs445 p＝0.001)相比较时或与美罗华单独相比较时(对于Daudi p＜0.0005，对于Hs445p＝0.01)，用(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖和美罗华组合治疗的小鼠具有显著提高的存活。没有治疗、美罗华单独、BG和美罗华+BG组小鼠的中值存活天数对于Daudi异种移植物各自为27、71、43和124天，而对于Hs445异种移植物各自为12、16、31和243天。
图4.在大麦β-葡聚糖存在下3G6(抗GD2 IgM抗体)在治疗人成神经细胞瘤中的剂量反应。
将两百万LAN1成神经细胞瘤细胞皮下异种移植入无胸腺的Balb/c小鼠中。每组5只小鼠，在肿瘤植入2周后可见肿瘤达到0.7-0.8cm直径时开始治疗。3G6组(实心方块)通过后眼眶丛用200μg静脉内注射的3G6来治疗，每周两次(M和Th)。3G6+BG组用每周两次200μgi.v.3G6加每日管饲400μg口服β-葡聚糖(BG)共治疗14-18天。以3个不同的剂量给药3G6(空心三角每剂8μg，空心方块40μg，空心圆200μg)。BG组(实心圆)仅接受400μg口服β-葡聚糖。从治疗的第一天测量肿瘤大小，最大直径的乘积表示为治疗0天的大小百分比。直条表示标准误差，为了清楚只描绘了4组。虽然BG单独和3G6单独显示出没有抗肿瘤效果，但BG+200μg 3G6组显示出高度显著的3G6剂量依赖性的肿瘤缩减和抑制(p＜0.05)。
图5.在酵母(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖存在下使用3G6(抗GD2IgM抗体)治疗人成神经细胞瘤。
将两百万LAN1成神经细胞瘤细胞皮下异种移植入无胸腺的Balb/c小鼠中。每组5只小鼠，肿瘤植入2周后可见肿瘤达到0.7-0.8cm直径时开始治疗。3G6组(实心方块)通过后眼眶丛用200μg静脉内注射的3G6来治疗，每周两次(M和Th)。微粒酵母葡聚糖组(实心三角)单独接受400μg口服微粒酵母葡聚糖。3G6+整个酵母颗粒(空心菱形)用每周两次200μg i.v.3G6加每日管饲400μg酵母颗粒共治疗14-18天。3G6+可溶酵母葡聚糖组用每周两次200μg i.v.3G6加每日管饲400μg可溶酵母葡聚糖共治疗14-18天。3G6+颗粒酵母葡聚糖组用每周两次200μg i.v.3G6加每日管饲400μg颗粒酵母葡聚糖共治疗14-18天。从治疗的第一天测量肿瘤大小，最大直径的乘积表示为治疗0天的大小百分比。直条表示标准误差，为了清楚只描绘了4组。虽然葡聚糖单独和3G6单独显示出没有抗肿瘤效果，但可溶性和颗粒酵母葡聚糖与3G6结合时的组显示出高度显著的肿瘤缩减和抑制(p＜0.05)。
图6.在大麦和酵母β-葡聚糖存在下使用3F8(抗GD2 IgG抗体)来治疗人成神经细胞瘤。
将两百万LAN1成神经细胞瘤细胞皮下异种移植入无胸腺的Balb/c小鼠中。每组5只小鼠，肿瘤植入2周后可见肿瘤达到0.7-0.8cm直径时开始治疗。3F8组(实心方块)通过后眼眶丛用200μg静脉内注射的3G6来治疗，每周两次(M和Th)，共5剂。大麦葡聚糖组(实心方块)接受单独的400μg大麦葡聚糖。3F8+大麦葡聚糖组(空心菱形)用每周两次200μg i.v.3F8加每日管饲400μg大麦葡聚糖共治疗14-18天。3F8+可溶酵母葡聚糖组(空心方块)用每周两次200μg i.v.3G6加每日管饲400μg可溶酵母葡聚糖共治疗14-18天。从治疗的第一天测量肿瘤大小，最大直径的乘积表示为治疗0天的大小百分比。直条表示标准误差，为了清楚只描绘了4组。虽然葡聚糖单独和3F8单独显示出没有抗肿瘤效果，但可溶性和颗粒酵母葡聚糖与3G6结合时的组显示出高度显著的肿瘤缩减和抑制(p＜0.05)。
图7.使用Rituxan和大麦或酵母β-葡聚糖来治疗SCID小鼠中的弥散性人淋巴瘤。
将100μl生理盐水中的5×106个Daudi细胞静脉注射(IV)入SCID小鼠中。肿瘤全身生长，当肿瘤细胞浸润脊椎管时小鼠变得瘫痪，导致后腿瘫痪。在瘫痪发作时或当动物体重减轻10％时将小鼠处死。注射肿瘤细胞10天后开始治疗。每周两次静脉注射40μg美罗华(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次，每日通过胃内管饲口服给药400μg葡聚糖29天。每周称重小鼠并至少每日一次临床观察。接受rituxan加大麦葡聚糖或rituxan加酵母可溶性葡聚糖的小鼠具有高度显著延长的存活(p＜0.05)。
图8说明了从BD Biosciences(Palo Alto，CA)购买的pEGP-C1载体。
图9显示了葡聚糖有助于基因转移进单核细胞中。
图10说明了较高分子量的β-葡聚糖和基因转移。
图11说明了循环单核细胞中GFP mRNA的存在。
发明详述本发明提供了用于口服摄取物质的组合物，该组合物包括合适量的糖类。在一个实施方案中，所述糖类是葡聚糖。
当口服给药时，葡聚糖通过巨噬细胞和单核细胞吸收，这些细胞携带这些糖类至骨髓和网状内皮组织系统，从那以适当加工的形式释放至包括嗜中性白细胞的骨髓细胞上和包括自然杀伤(NK)细胞的淋巴样细胞上。该加工过的葡聚糖结合这些嗜中性白细胞和NK细胞上的CR3，在肿瘤特异性抗体存在下激活它们在肿瘤中的细胞毒性。
由于巨噬细胞和单核细胞从消化道摄取葡聚糖(不管是可溶的、凝胶还是颗粒)，因此葡聚糖是用于基因治疗的潜在通道。与蛋白质不一样，DNA和质粒是相对热稳定的，且可以容易地掺入温热的可溶性大麦葡聚糖中，并当冷却至室温或体温时形成凝胶。当给小鼠喂食这些DNA-葡聚糖复合物时，数天内在外周血单核细胞和巨噬细胞中可以检测到报道基因。更重要的是在摄取这些DNA复合物数天后，这些报道基因在这些细胞中报道表达。这些发现具有潜在的生物学含义。葡聚糖和相似的糖类可以是DNA或质粒进入人体的通道。口服葡聚糖可以是用于改正巨噬细胞/单核细胞的遗传缺陷或给药遗传疫苗的便捷载体。
同样本领域技术人员可以容易地认识到，可以鉴定能够和葡聚糖一样起作用的其它糖类并以相似的方式来使用。使用葡聚糖作为阳性对照可以建立一种容易地筛选这样的糖类的方法。
葡聚糖包括但不限于β(1-3)和β(1-4)混合键的葡聚糖，且葡聚糖具有高分子量。葡聚糖还可以具有β(1-3)和β(1-6)键。
本发明还提供了用于将物质引入细胞的方法，该方法包括使上述组合物接触所述细胞。本领域技术人员可以使用报道基因或其它标记来测定所述引入的效率。报道基因或标记是分子生物学领域公知的。此外，本发明提供了用于将物质引入患者的方法，该方法包括将有效量的上述组合物给药于患者。
本发明提供了用于口服递送一种和多种物质的组合物，该组合物包括有效量的口服给药的β-葡聚糖和一种或多种化疗剂。
在一个实施方案中，所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合键，或1，3-1，6和1，3-1，4混合键的混合物。在另一实施方案中，葡聚糖提高了化疗剂或抗癌抗体的功效。
在进一步的实施方案中，所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麦、真菌、小麦或海藻。葡聚糖可以具有高分子量。葡聚糖的分子量可以至少为10,000道尔顿。
在进一步的实施方案中，所述物质是肽、蛋白质、RNA、DNA、质粒或化疗剂。如在此所用的，化疗剂包括抗击动物体内疾病的化学药品或用于治疗各种形式癌症的药物。
本发明提供将物质引入细胞的方法，该方法包括使上述组合物接触所述细胞。
可以口服递送的物质包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA和质粒。也可以使用其它小分子和化合物。
本发明提供治疗患者的方法，该方法包括将有效量的上述组合物给药于患者。在一个实施方案中，该方法进一步包括所述物质。
本发明提供了治疗患有遗传疾病患者的方法，该方法包括将治疗有效量的上述组合物和能够矫正所述遗传疾病的物质给药于患者。所述物质包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、质粒以及其它小分子和化合物。
本发明提供了含有有效量的能够提高I gM抗体功效的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。
本发明提供了含有有效量的能够提高抗体功效的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。源自酵母细胞壁的葡聚糖可以用于上述组合物中，酵母如酿酒酵母或美国专利No.5,250,436中所述的突变酵母菌株，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法来制备具有β(1-3)和β(1-6)键的葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法来制备适于口服给药的可溶性或含水葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，或针对癌症或肿瘤细胞的抗体，其包括但不限于抗CEA抗体、抗CD20抗体、抗CD25抗体、抗CD22抗体、抗HER2抗体、抗结合腕蛋白抗体、MoAb M195、Dacluzimab、抗TAG72抗体、R24、赫赛汀、美罗华、528、IgG、IgM、IgA、C225、依帕珠单抗和MoAb 3F8。在另一个实施方案中，所述抗体是肿瘤结合抗体。
此外，所述抗体能够激活补体和/或激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在另一个实施方案中，所述抗体调节T-细胞或B-细胞的功能。
在进一步的实施方案中，所述抗体瞄准表皮生长因子受体、神经节苷脂如GD3和GD2。
在进一步的实施方案中，所述抗体是有效对抗癌症的，癌症包括成神经细胞瘤、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、爱泼斯坦-巴尔相关的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成视网膜细胞瘤、小细胞肺癌、脑瘤、白血病、表皮样癌、前列腺癌、肾细胞癌、移行细胞癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌或其它胃肠道癌。
在进一步的实施方案中，上述组合物是在药物学上可接受载体中的。
本发明提供了治疗患者的方法，该方法包括将上述组合物给药于患者。
本发明提供了含有有效量的能够提高疫苗功效的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。在一个实施方案中，所述疫苗是对抗癌症或传染物的，如细菌、病毒、真菌或寄生虫。
本发明提供了含有有效量的能够提高天然抗体或传染物功效的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。
本发明提供了含有有效量的能够提高宿主免疫力的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。
本发明提供了含有有效量的能够提高药剂预防组织排异作用的口服给药的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的组合物。在一个实施方案中，所述组织是移植的组织或移植的器官或如患有移植物抗宿主疾病的宿主。
在一个实施方案中，上述组合物的葡聚糖具有高分子量。葡聚糖的分子量至少为10,000道尔顿。在另一个实施方案中，所述葡聚糖源自大麦、燕麦、蘑菇、海藻、真菌、酵母、小麦或苔藓。在进一步的实施方案中，所述葡聚糖是对热处理稳定的。
在进一步的实施方案中，上述组合物在煮沸3小时后是稳定的。上述组合物的有效剂量是约＞＝25mg/kg/天，一周五天，共2-4周。
具体实施例方式
通过参考以下实验详述将更好地理解本发明，但是本领域技术人员将易于认识到详述的具体实验仅仅是说明性的，并不意味着限制在此所述的本发明，本发明是通过此后的权利要求来限定的。
实施例I大麦β-葡聚糖与抗GD2抗体联用在4期成神经细胞瘤中的I期研究。
总共研究了24名患者。这些患者全部是儿童或青少年，患有转移至骨、骨髓或远端淋巴结的复发或难愈的4期成神经细胞瘤，一些带有大的软组织块。β-葡聚糖具有很好的耐受性，无剂量限制毒性。记录骨髓疾病(组织学、MIBG扫描)、软组织肿瘤(CT)以及生化标记(尿VMA和HVA肿瘤标记)的抗肿瘤反应。肿瘤反应的一个实例显示于图1A和图1B中131I-间碘苯甲基胍(MIBG)扫描显示了3F8加β-葡聚糖的一个治疗循环后，大范围转移接近完全的消退。这些反应在用3F8单独或3F8结合细胞因子治疗的患有难愈或复发转移性4期NB的患者中是罕见的。迄今为止对3F8最好的反应率是II期试验中3F8加GMCSF结合中33名儿童中的7名(21％)获得了MIBG改善。相反，62％(21名中13名)可评价的患者对3F8+β-葡聚糖具有MIBG改善，接近3倍的反应率(通过χ2p＝0.008)。此外，患有骨髓疾病的15名患者中，5名获得了完全的骨髓缓解(30％)，和8名骨髓疾病稳定。(参见图1)。
实施例II美罗华激活了补体介导的和抗体依赖细胞介导的细胞毒性，且有效对抗B-细胞淋巴瘤。β-葡聚糖是结合CR3凝集素结构域的天然生成葡萄糖聚合物，CR3是在淋巴细胞中广泛表达的受体，激发其来结合被抗体激活的iC3b。大麦衍生的(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖(BG)，当口服给药时(400μg每天×29天)，和低于治疗剂量的静脉内美罗华(200μg两次/周×8剂)在治疗CD20-阳性人淋巴瘤中具有强烈的协同作用。当与用美罗华或BG单独治疗的小鼠相比较时，异种移植入SCID小鼠中建立的皮下非霍金奇淋巴瘤(NHL)(Daudi和EBV-衍生的B-NHL)或霍金奇疾病(Hs445或RPMI6666)的生长得到了显著抑制。患有弥散性淋巴瘤(Daudi和Hs445)小鼠的存活显著提高。治疗动物中没有体重减轻或临床毒性。该BG加美罗华的治疗效果和无毒性支持进一步研究其临床用途。
介绍在数量日益增加的疾病中有待评价嵌合抗CD20抗体美罗华。最初证明了对抗复发和难愈的滤泡/轻度非霍金奇淋巴瘤的临床效果后1，已经报道了其它恶性和非恶性B-细胞疾病中对美罗华的反应2。已经提出了几种作用机理，包括凋亡(apoptotic)途径的激活3，细胞因子的详细阐明4，宿主补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的激发5。尽管许多患有B-细胞疾病的患者对美罗华作出反应，但缓解通常是暂时的6。美罗华治疗后高于50％的淋巴瘤复发未能第二次作出反应7。对美罗华抗药性的机理还不清楚，可能包括靶抗原的缺少或丢失8、各个患者之间药物动力学的改变、FcR多态性9、对补体活性的抗药性10，或淋巴瘤的内在基因表达11。
β-葡聚糖是葡萄糖的复合聚合物，带有对白细胞上CR3受体的凝集素位点的亲和性12。带有结合的β-葡聚糖，通过补体激活抗体激发CR3(CD11b)结合沉积于细胞上的iC3b片段。该受体介导白细胞通过内皮的血细胞渗出并刺激吞噬作用、去粒和肿瘤细胞毒性。许多真菌在其细胞表面上呈现β-葡聚糖或β-葡聚糖样CR3结合配体。因此，当发生iC3b沉积时，CD11b和凝集素位点都变成结合的，并激发了吞噬作用和呼吸爆发13。相反，肿瘤细胞缺少这样的分子，甚至当被覆iC3b时，通常也不激活CR3且不能激活白细胞。可溶形式的β-葡聚糖结合凝集素位点并激发吞噬细胞和NK细胞两者来杀灭iC3b被覆的肿瘤靶14。
(1→3)，(1→4)-D-β-葡聚糖(BG)，一种可溶的、源自大麦的β-葡聚糖比之前研究的(1→3)，(1→6)-β-葡聚糖有利，尤其是当口服给药时的效果和良好的安全特征15。BG和补体固定抗体3F8对抗人成神经细胞瘤异种移植物的体内协同作用15，16是最近证明的。BG和美罗华对抗淋巴瘤的协同作用是现在报道的。
研究设计细胞系从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)购买人伯基特淋巴瘤细胞系，Daudi，以及霍金奇疾病(HD)细胞系Hs445和RPMI 6666。使用之前所述的方法建立人HBV-BLCL17。
小鼠在制度允许的准则和试验方案下饲养Fox Chase ICR SCID小鼠(Taconic，White Plains，NY)。
肿瘤模型通过将悬浮于0.1ml Matrigel(Becton-Dickinson，FranklinLakes，NJ)中的5×106个细胞注射入小鼠的横腹部中来建立皮下肿瘤。一周测量肿瘤尺寸两到三次，并以两个最大直径的乘积来计算肿瘤大小。当最大肿瘤尺寸超过20mm时将小鼠处死。如之前所述的在SCID小鼠中建立弥散性肿瘤模型18。简言之，将100μl生理盐水中的5×106个Daudi或Hs445细胞静脉内注射入SCID小鼠中。肿瘤全身生长，当肿瘤细胞浸润脊髓时小鼠变得瘫痪，导致后腿瘫痪。瘫痪发作时或当动物体重减轻10％时将小鼠处死。
治疗方案对于具有皮下肿瘤的小鼠，肿瘤建立(7-8mm直径)后开始治疗。对于弥散性肿瘤模型，注射肿瘤细胞十天后开始治疗。每个治疗方案至少5只小鼠一组，接受美罗华或BG，或两者都不接受或两者都接受。每周两次静脉内注射200μg美罗华(Genetech，San Francisco，CA)，共注射八次，每天通过胃内管饲口服给药400μg BG(Sigma，St.Louis，MO)29天。动物每周称重，且每天至少临床观察一次。
统计学分析
使每只单独小鼠的回归斜率适于肿瘤大小的对数转化值来计算肿瘤生长。使用之前所述的用于检查观察的方法使用t-测试来比较组之间的斜率19。使用Kaplan-Meier分析来比较患有弥散性疾病小鼠中的存活和通过Fisher’s精确的χ2测试来比较死亡的比例。使用STATA7来进行分析。
结果和讨论所有皮下异种移植模型中，注意到美罗华和BG联合治疗的小鼠中肿瘤生长的显著降低。用美罗华单独治疗的小鼠中显示出肿瘤生长的普通降低，而用BG单独治疗的或留下未治疗的小鼠具有未减轻的肿瘤生长(图1A、1B、1C)。除了用联合治疗治疗的小鼠之外，所有肿瘤生长都超过20mm大小，小鼠不得不被处死。甚至在停止治疗后，联合治疗的小鼠具有持久稳固的肿瘤抑制。肿瘤生长率的多变量线性模型中，使用治疗的哑变量，BG和美罗华之间的相互作用是正向的和显著的，证明是协同作用。
对于弥散性异种移植，NHL和HD模型两者的组合和对照组之间的存活存在显著差异(p＜0.005，按照对数-等级)(图2)。用结合BG和美罗华治疗患有弥散性Daudi和Hs445肿瘤的小鼠各自有5/38和2/8小鼠在停止治疗后存活＞12个月，表明了疾病的完全根除。相反，各自组中接受单独美罗华的有0/29和0/8小鼠存活(15％对0％存活；χ2＝0.01)。没有显著体重减轻或其它明显的临床副作用。可以从下列事实推断出BG被吸收通过免疫荧光可以在固定和渗透的外周血白细胞中细胞内检测到BG(数据未显示)。
这些研究中，BG和美罗华之间的协同作用是非常显著的，与CD-20阳性淋巴瘤的类型无关。Daudi异种移植中与Hs445相比较提高的反应可以归因于前者中较高的CD20表达(对于Daudi 241和对于Hs445184相比较的平均几何荧光通道)。当通过单细胞悬浮液的免疫荧光研究或冰冻切片的间接免疫组织化学来检查发展肿瘤的CD20表达时，没有注意到用美罗华、BG单独或美罗华+BG治疗的组之间的显著差异(数据未显示)，表明了美罗华+BG的治疗与CD20的丢失无关。
其它补体激活单克隆抗体和BG之间的协同作用15，16是之前证明的。现有的数据将该观察扩展到美罗华。认为CDC对于美罗华细胞毒性是重要的机理。侵蚀性补体通过人补体调节蛋白质(mCRP)没有得到有效抑制。因此，CDC在异种移植模型中是有效的抗肿瘤机理。然而在研究中，低于治疗剂量的抗体，美罗华介导的ADCC和CDC对实现肿瘤细胞杀灭是不够的。由于BG对ADCC没有直接作用20，该协同作用是iC3b介导的肿瘤细胞毒性的最可能结果。淋巴瘤细胞表达mCRP包括CD46、CD55和CD5910，21。然而，iC3b介导的细胞毒性没有受到CD59存在的影响，其仅影响了MAC介导的补体细胞毒性22。因此，人乳癌肿瘤中，尽管存在mCRP，已经证明了iC3b的沉积23，表明了与其对MAC的抑制作用不同，对iC3b介导的肿瘤细胞毒性的作用不是绝对的。
如果该协同作用在人中可以安全地再现，iC3b介导的细胞毒性可以是克服患有B-细胞恶性肿瘤患者中美罗华抗药性的潜在策略。由于T或B细胞都不是这种协同作用所需要的，因此甚至在免疫缺失的淋巴瘤患者中BG也可能具有潜在的作用。此外，患有自体免疫疾病的患者中，可以用该非毒性口服治疗来提高B-细胞耗竭。相反地，β-葡聚糖可以提高细胞因子如TNF-α和IL-6的释放24，且因为美罗华的急性细胞毒性还与继发于补体激活的细胞因子释放相关25，所以当BG和美罗华联合使用时，存在增加毒性的可能性。谨慎地设计I期研究是必要的，为了确定在B-细胞疾病治疗中和其它癌症基于抗体的治疗中开发BG作为美罗华治疗辅剂的安全性和有效性。
实施例II的参考文献1.Maloney DG，Liles TM，Czerwinski DK，Waldichuk C，Rosenberg J，Grillo-Lopez A，Levy R.使用嵌合抗CD20单克隆抗体(IDEC-C2B8)逐渐提高的单剂量灌输在患有复发B-细胞淋巴瘤患者中的I期临床试验(Phase I clinical trial using escalatingsingle-dose infusion of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody(IDEC-C2B8)in patients with recurrent B-cell lymphoma).Blood.1994；842457-2466。
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Haematol.2001；115807-811实施例III大麦β-葡聚糖提取物与IgM抗体的协同作用当来自人血清的天然IgM抗体i.v.给药时，对人成神经细胞瘤(NB)细胞是细胞毒性的，使得无胸腺大鼠中皮下实体人NB异种移植物停止生长。(1，2)肿瘤吸收IgM，24小时后大量血管周围的补体激活和粒细胞聚集。(3)转移性NB模型中，IgM抗体对消除肿瘤在90％小鼠中是有效的。(4)在幼年期间和NB患者(任何年龄)中该抗NBIgM抗体的不存在，12个月后其发病率上升，假设天然IgM抗体可以起对抗NB的免疫控制机理一样的作用。(5)3G6是抗GD2小鼠IgM单克隆抗体(MoAb)。i.v.注射生物素化3G6 48小时内，皮下NB异种移植物显示出肿瘤细胞的膜着色。尽管3G6和3F8相比较时具有较低的平均荧光(53±19荧光通道单位，n＝7只小鼠)，3F8为IgG MoAb(149±44，n＝7)，3G6加β-葡聚糖有效对抗sc人NB(p＜0.05)，其剂量响应曲线(图4)与3F8的类似。(6)这些发现和使用人天然抗NB IgM的那些相一致。(1，2)这些数据支持β-葡聚糖不仅可以提高IgG诱导疫苗，而且可以提高IgM诱导疫苗的观点。
实施例III的参考文献1.David K，Ollert MW，Juhl H，等通过健康人的天然IgM来阻止无胸腺大鼠中异种移植的实体人成神经细胞瘤的生长(Growtharrest of solid human neuroblastoma xenografts in nude rats bynatural IgM from healthy humans).Nat Med 2686-9，19962.Ollert MW，David K，Schmitt C，等正常人血清含有对人成神经细胞瘤细胞为细胞毒性的天然IgM抗体(Normal human serumcontains a natural IgM antibody cytotoxic for humanneuroblastoma cells).Proc Natl Acad Sci USA 934498-503，19963.Ollert MW，David K，Vollmert C，等人天然IgM体内抗成神经细胞瘤活性的机理(Mechanisms of in vivoanti-neuroblatoma activity of human natural IgM).Eur J Cancer331942-8，19974.Engler S，Thiel C，Forster K，等一种反应人成神经细胞瘤临床表现的新的转移性动物模型通过天然的、细胞毒性的人免疫球蛋白M抗体来阻止常位肿瘤的生长(A novel metastatic animalmodel reflecting the clinical appearance of human neuroblastomagrowth arrest of orthotopic tumors by natural，cytotoxic humanimmunoglobulin M antibodies).Cancer Res 612968-73，20015.Erttmann R，Schmitt C，Ollert MW，等健康人和NB患者中对抗成神经细胞瘤(NB)细胞的天然生成体液细胞毒性(Naturallyoccurring humoral cytotoxicity against neuroblastoma(NB)cells in healthy persons and NB patients).Pediatr Hematol Oncol13545-8，19966.Cheung N，Modak S成神经细胞瘤治疗中口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖与抗神经节苷脂GD2单克隆抗体3F8的协同作用(Oral(1-3)，(1-4)-beta-glucan syngergizes with anti-ganglioside GD2monoclonal antibody 3F8 in the therapy of neuroblastoma).ClinCancer Res 81217-1223，2002实施例IV源自面包酵母(源自酿酒酵母)的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖对提高癌症的抗体治疗也是有效的皮下植入100μl Matrigel(Sigma)中的(2×106细胞)LAN-1肿瘤细胞。用游标卡尺每周测量肿瘤尺寸两到三次，以两个最大的垂直直径的乘积来计算肿瘤大小。每组4-5只小鼠，当肿瘤直径达到0.7-0.8cm时所有治疗研究开始。小鼠接受抗体(3F8或3G6)治疗(200μg每天)i.v.(通过尾静脉注射)每周两次×5剂，和每天胃内注射口服β-葡聚糖(400μg每天)共14-18天。(参见图5和6)源自酵母细胞壁的葡聚糖可以用于上述组合物中，酵母如酿酒酵母或美国专利No.5.250,436中所述的突变酵母菌株，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.5,233,491和4,810,646中所述的方法来制备具有β(1-3)和β(1-6)键的葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。可以通过美国专利No.4,810,646和5,519,009中所述的方法来制备适于口服给药的可溶性或含水葡聚糖，其所公开的内容在此以其整体引入作为参考。也可以使用β-葡聚糖如可溶性β-1，3/1，6葡聚糖或Biotec Pharmacon(Norway)制得的SBG。
在相似的实验中研究了皮下淋巴瘤模型。在此将悬浮于0.1mlMatrigel(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中的5×106个细胞植入小鼠横腹部中。一周测量肿瘤尺寸两到三次，以两个最大直径的乘积来计算肿瘤大小。当最大的肿瘤尺寸超过20mm时小鼠死亡。每周静脉内注射200μg美罗华(Genentech，San Francisco，CA)两次，共注射八次，每天通过胃内管饲口服400μg葡聚糖29天。每周将小鼠称重并每天至少临床观察一次。大麦葡聚糖和酵母葡聚糖的肿瘤响应率和获得完全缓解的小鼠百分比是可比较的。这些系列的皮下肿瘤模型显示了大分子量(＞10,000道尔顿)可溶性酵母(1→3)，(1→6)β-葡聚糖具有和大麦(1→3)，(1→4)β-葡聚糖同样有效。此外，酵母葡聚糖的来源和物理形式可以形成显著差异。
还研究了转移性淋巴瘤模型。如之前所述的在SCID小鼠中建立弥散性肿瘤的模型。(1)简言之，将100μl生理盐水中的5×106个细胞静脉内(i.v.)注射进SCID小鼠中。肿瘤全身生长，当肿瘤细胞浸润脊髓时小鼠变得瘫痪，导致后腿瘫痪。在瘫痪发作时或当动物体重减轻10％时，将小鼠处死。肿瘤细胞注射后十天开始治疗。每周两次静脉内注射40μg美罗华(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次。每日通过胃内管饲口服400μg葡聚糖29天。将小鼠每周称重并至少每天临床观察一次。(参见图7)此外，和美罗华联合使用时，大麦葡聚糖和酵母葡聚糖两者显示出类似的作用。当单独使用时，大麦葡聚糖和酵母葡聚糖对存活都没有任何作用(数据未显示)。
实施例IV的参考文献1.Wei BR，Ghrtie MA，Vitetta ES联合使用免疫毒素和放射性免疫缀合物来治疗免疫缺陷小鼠中的弥散性人B-细胞淋巴瘤(Thecombined use of an immunotoxin and a radioimmunoconjugate totreat disseminated human B-cell lymphoma in immunodeficientmice).Clin Cancer Res 6631-642，2000实施例V口服给药的β-葡聚糖与抗肿瘤单克隆抗体一同起作用来介导肿瘤退化的机理。(1)使用野生型(WT)C57B1/6小鼠对CR3-缺乏(CD11b-/-)或C3-缺乏(C3-/-)C57B1/6小鼠的同系肿瘤(GD2+RMA-S)，MoAb单独没有引起肿瘤退化，而结合i.v.抗GD2MoAb和口服大麦或酵母β-葡聚糖在WT中引起显著退化，但在CR3-缺乏小鼠中没有。此外，用i.v.MoAb和口服β-葡聚糖的联合治疗在WT小鼠中产生了60-100％的无肿瘤生存者，但是在CR3-缺乏小鼠中仅有0-20％存活。这些实验证明了对于抗肿瘤效果对白细胞CR3接近绝对的需要，尤其当口服大麦β-葡聚糖和抗肿瘤MoAb一起给药时。比较WT对C3-缺乏小鼠的实验方案相似地显示出口服β-葡聚糖需要血清C3。当用荧光素(BG-F和YG-F)标记大麦β-葡聚糖和酵母β-葡聚糖并通过胃内注射给药于小鼠时，跟随β-葡聚糖的运行。在BG-F或YG-F每日口服给药的三天内，脾和淋巴结内的巨噬细胞含有荧光素标记的β-葡聚糖。4天后，还在骨髓的巨噬细胞中观察到YG-F和BG-F。当比较WT对CR3缺乏小鼠摄取的YG-F和BG-F时，含有摄入的β-葡聚糖-F的巨噬细胞的百分比或每个细胞中β-葡聚糖-F的量没有明显差异。因此，通过胃肠道巨噬细胞摄取大麦和酵母β-葡聚糖不需要CR3，而可能是由Dectin-1介导的。(2)体外和骨髓中的巨噬细胞能够将大分子的大麦或酵母β-葡聚糖降解成β-葡聚糖的较小生物活性片段，然后得到释放。
为了测定巨噬细胞释放的可溶性β-葡聚糖-F是否确实已经被骨髓粒细胞吸收，对已经给予了YG-F或BG-F10天的WT或CR3-缺乏小鼠组i.p.注射巯基乙酸盐介质来得出骨髓粒细胞进入腹膜腔的有边集合。只有WT粒细胞能够获得从巨噬细胞中释放的YG-F和BG-F。这些数据表明胃肠道巨噬细胞连续摄取β-葡聚糖，并将β-葡聚糖短程运输至骨髓，其中释放可溶性降解片段并通过膜CR3被粒细胞吸收。当从已经给予了口服β-葡聚糖的WT和CR3-缺乏小鼠中分离出腹膜粒细胞时，在体外只有WT粒细胞能够杀灭iC3b被覆的肿瘤细胞。这些实验显示了骨髓粒细胞和组织巨噬细胞从胃肠道巨噬细胞获得膜CR3-结合的可溶性β-葡聚糖，且该结合的β-葡聚糖激发了粒细胞和巨噬细胞两者的CR3，以致当它们补充至炎症部位时，它们能够杀灭iC3b被覆的肿瘤细胞。
实施例V的参考文献1.Hong F，Yan J，Baran JT，等口服给药的β(1，3)-葡聚糖和抗肿瘤单克隆抗体一起作用来介导肿瘤退化和无肿瘤存活的机理(Mechanism by which orally administered beta(1，3)-glucansfunction with anti-tumor monoclonal antibodies to mediate tumorregression and tumor-free survival).J Exp Med，20042.Herre J，Gordon S，Brown GDDectin-1及其在通过巨噬细胞识别β-葡聚糖中的作用(Dectin-1 and its role in therecognition of beta-glucans by macrophages).Mol Immunol40869-76，2004实施例VI可溶性β-葡聚糖可以用作质粒的通道口服DNA、RNA和蛋白质递送的主要障碍是胃的酸性和蛋白水解的环境，以及GALT对蛋白质有限的摄取。相信集合淋巴结和吞噬细胞中的M细胞是摄取微粒的主要载体。然而，纳微颗粒还可以通过副细胞(paracellular)机理1，2和通过转胞吞3进入GALT。任一种情况中，使用具有粘膜粘性特性的或对细胞上受体的亲和性的颗粒可以提高观察到的颗粒摄取。已经用于制造纳微颗粒的许多聚合物是粘膜粘性的。其中是藻酸盐、角叉胶和果胶。尽管这些材料通常用作纳微颗粒中的核心聚合物，但没有鉴定出这些聚合物的特异性受体，摄取效率仍然是次优的。目前已知Dectin-1是β-葡聚糖的通用受体，并发现于许多人组织包括单核细胞和吞噬细胞中。高分子量β-葡聚糖的凝胶特性使RNA、DNA和蛋白质得到包埋。由于糖对酸条件具有高度耐受性，因此在穿过胃肠道的过程中酶、蛋白质、RNA和DNA仍然得到了保护。通过β-葡聚糖的高亲和性Dectin-1受体，可以将这些物质引入吞噬细胞作为到达身体其它部分的潜在载体。
从BD Biosciences(Palo Alto，CA)购买pEGF-C1载体(参见图8)并根据制造商的说明来制备。pEGF-C1编码野生型GFP(1-3)的红色-移位变体，为了较亮的荧光和在哺乳动物细胞中较高的表达已经将其最佳化。(最大激发＝488nm；最大发射＝507nm)。只有当哺乳动物细胞表达SV40 T-抗原时，载体主链还含有用于在哺乳动物细胞中复制的SV40起点。该盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗药性。pEGF-C1主链还提供了用于在大肠杆菌中繁殖的pUC复制起点，和用于单链DNA产生的f1起点。
用混入100μl盐水中的400μg β-葡聚糖(～200,000道尔顿)中的50μg pEGFP-c1质粒通过口服管饲来喂养小鼠，而对照小鼠仅给予质粒。口服喂养连续进行3天(第1天、第2天和第3天)。RBC裂解后，通过FCAS分析来分析从尾静脉取出的50μl血液，记录单核细胞群体中表达GFP细胞的％。葡聚糖中绿细胞％对无葡聚糖组(每组n＝4-9只小鼠)的平均比率显示于图9中。贯穿实验的14天，无葡聚糖组中的绿单核细胞％在背景水平下保持稳定。另一方面，口服管饲第1天后，存在一贯较高％的循环绿单核细胞，其在约第8天达到最高。由于通常在小鼠单核细胞中不发现GFP，所以在质粒进入血液中循环的单核细胞中之后，绿细胞的存在和GFP蛋白质表达相一致。
使用较高分子量(～350,000道尔顿)的具有较好胶凝特性的大麦β-葡聚糖重复实验。图10中，看到相似的动力学，从第8天至第11天持续的较高百分比的绿细胞(每组n＝4只小鼠)。
使用定量逆转录PCR分析来测试GFP mRNA的存在。用混入100μl盐水中的400μg高分子量(～350,000道尔顿)β-葡聚糖中的50μgpRGFP-c1通过口服管饲喂养小鼠，而对照小鼠只给予质粒。使用50μl外周血来提取总RNA，使用之前所述方法的改进进行逆转录的和定量的实时PCR4。保持基因小鼠GAPDH的小鼠用作内部对照。使用已知的GFP和GAPDH标准计算转录水平。分开计算GFP和GAPDH的转录单位并以GFP对GAPDH的比例作为结果。图11中，平均RNA水平(GFP/GAPDH)表示为葡聚糖对非葡聚糖组(每组n＝4只小鼠)的比例。到第10天检测到GFP mRNA。
实施例VI的参考文献
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权利要求
1.一种用于口服吸收物质的组合物，该组合物包含合适量的糖类。
2.一种用于口服递送一种或多种物质的组合物，该组合物包含有效量的口服给药的β-葡聚糖和一种或多种化疗剂。
3.权利要求1或2任一项的组合物，其中所述糖类是葡聚糖。
4.权利要求3的组合物，其中所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合键，或者1，3-1，6和1，3-1，4混合键的混合物。
5.权利要求3的组合物，其中所述葡聚糖提高了化疗剂或抗癌抗体的功效。
6.权利要求3的组合物，其中所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麦、真菌、小麦或海藻。
7.权利要求3的组合物，其中所述葡聚糖具有高分子量。
8.权利要求3的组合物，其中所述物质是肽、蛋白质、RNA、DNA或质粒。
9.权利要求3的组合物，其中所述物质是化疗剂。
10.一种组合物，该组合物包含有效量的能够提高IgM抗体功效的口服给药的(1→3)，(1→6)或(1→3)，(1→4)β-葡聚糖。
11.权利要求10的组合物，其中所述抗体是对抗癌症的抗体。
12.权利要求11的组合物，其中所述抗体是结合肿瘤的抗体。
13.权利要求12的组合物，其中所述抗体能够激活补体。
全文摘要
本发明提供了将物质引入细胞的方法，该方法包括使含有口服β－葡聚糖的组合物接触所述细胞。本发明还提供了将物质引入患者的方法，该方法包括将有效量的上述组合物给药于患者。可以口服递送的物质包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、化疗剂、生物活性剂、质粒以及其它小分子和化合物。最后，本发明提供了含有能够提高IgM功效的口服β－葡聚糖的组合物，以及所述组合物的不同用途。
文档编号A61K39/395GK1823092SQ200480020356
公开日2006年8月23日 申请日期2004年7月16日 优先权日2003年7月16日
发明者N－K·V·陈 申请人:斯隆-凯特林癌症研究院