用于治疗用途的热敏聚合物及其制备方法

专利名称：用于治疗用途的热敏聚合物及其制备方法
技术领域：
本发明一般涉及聚合材料及其制备方法，包括适合用于医疗应用如伤口敷裹及细胞移植的纳米多孔聚合物。
背景技术：
由于伤口愈合对烧伤治疗、后外科粘连的预防以及整容外科的重要性，因此对于许多研究者来说是一个令人感兴趣的活跃领域。使用伤口敷料的目的在于通过防止过度的液体流失和细菌感染以及通过促进组织再生的加速来加速伤口的愈合(T.Stephen，Woundmanagement and dressings，The Pharmaceutical Press，London，(1990)，1)。
目前，现有的敷料材料倾向于由易磨损的纱布组成。纱布的纤维容易变得陷入到愈合伤口的分生组织中，使得敷料的最后去除非常困难并且很疼痛。这也可能会扯开已经增生并迁移到敷料材料上的成纤维细胞或上皮细胞，因此会由于造成伤口处的二次伤口而损害正常的愈合过程(Cochrane et al.，Biomaterials(1999)201237)。这是敷料定期更换时的通常情形。

发明内容
一方面，本发明提供了一种用于制备热敏聚合物的方法，其包括使微乳液聚合，所述微乳液包括能够形成热敏聚合物的第一单体以及可聚合表面活性剂。
另一方面，本发明提供了一种伤口敷裹和去除伤口敷料的方法，其包括将热敏聚合物敷在伤口处；在将聚合物从伤口处去除之后，立即降低热敏聚合物的温度以利于聚合物的去除；以及从伤口处去除聚合物。
还有另一个方面，本发明提供了一种将治疗剂输送到伤口处的方法，其包括将治疗剂结合到热敏纳米多孔聚合物中；并将该热敏纳米多孔聚合物敷在伤口处。
更进一步的方面，本发明提供了一种将细胞输送到移植部位的方法，其包括在热敏纳米多孔聚合物上培养细胞；并将包含细胞的聚合物安置在移植部位。
还有更进一步的方面，本发明提供了一种纳米多孔的热敏聚合物。本发明也提供了依照本发明方法的不同实施方案制备的热敏纳米多孔聚合物。本发明进一步提供了一种从包含能够形成热敏聚合物的第一单体和可聚合的表面活性剂的微乳液形成的热敏纳米多孔聚合物。
本发明提供了一种用于从微乳液制备热敏聚合物的方法。该聚合物在医疗应用如伤口敷裹以及用于输送细胞到移植部位方面是有用的。
本发明也因此涉及依照本发明不同实施方案的热敏聚合物作为伤口敷料以及用于输送治疗剂到伤口处和输送细胞到移植部位的应用。
聚合物通过聚合包含一种能够形成热敏聚合物的单体以及一种可聚合表面活性剂的微乳液而制备。
通过从结合这样单体的微乳液形成聚合物，聚合物就具有了当聚合物在医疗应用范围中使用时提供优点的热敏溶胀特征。例如，聚合物可以作为敷料敷在伤口处以使细菌感染的危险降到最低。环境温度的控制导致聚合物亲水性的改变，利于聚合物从伤口处去除，从而降低伤口处愈合过程的破坏。
聚合物可以被制成纳米多孔的，以供气体交换和提供保温之用。正如本领域的技术人员所熟知的，聚合物也可以被制成透明的以使得不需要仓促地去除敷料就可以进行伤口的观察。此外，本发明的聚合物提供了一层通常微生物不能渗透的遮壁，从而有助于使伤口感染的危险减到最小。
聚合物的多孔性使得它适合用于将治疗剂，如药物、抗生素、细胞因子、核酸或肽输送到伤口处。将治疗剂与聚合物结合在一起，使得一旦将聚合物敷在伤口处时治疗剂就持续释放。
聚合物也可以被用作将培养细胞或组织输送到伤口处或移植部位的载体。
对于本领域技术人员来说，在对以下本发明具体实施方案连同附图的描述审阅之后，本发明的其它方面和特点将变得更为明显。


附图只作为示例举例说明本发明的实施方案。
图1为描述热敏多孔膜表面形貌的原子力显微图像；图2为热敏多孔膜横截面的扫描电子显微图像；图3为含有不同单体组成的膜的溶胀比与温度的关系曲线，以说明膜随温度变化的溶胀性能；图4为众数性药物东莨菪碱从装载东莨菪碱的膜中体外释放的分布图；图5为细胞在具有以下不同单体组成的膜上生长的摄影图像(A)HMN 1；(B)HMN 2；(c)HMN 2a；(D)HMN 3；(E)HMN 4；和(F)细胞培养板。
图6为细胞在不同表面生长的摄影图像(a)热敏多孔膜(HMN1)；(b)细胞培养板；以及(c)膜上连接生长丛的细胞的特写镜头；图7为从不同膜脱离的细胞百分比作为温度函数的曲线；
图8为细胞从不同膜脱离、再附着以及在培养板上生长的摄影图像(a)HMN 1；(B)HMN 2；(C)HMN 2a；(D)HMN 3；和(E)HMN4图9为有代表性的说明膜的透明性的膜的照片。
具体实施例方式
理想情况下，伤口敷料应该是柔软的、气体可渗透的、耐久的以及具有控制水分损失的能力。它应该实现迅速的伤口封闭以防止败血症和过量的通过开放伤口的液体损失。它应该很好地附着在伤口处并容易涂敷和去除而不会造成对肉芽组织或新上皮的损伤。优选地，它应该是透明的以允许在不需要导致伤口愈合过程中断的仓促去除敷料的情况下进行伤口的观察。它应该在涂敷伤口处期间保持它的形状并且当定位时也应该是舒适的。此外，它不应该表现出抗原性，或者局部和全身的毒性。最后，它应该是低成本的。尽管人们进行了广泛的研究，但是目前还是不能提供这种材料(Wiseman等，Wound dressingsDesign and use(主编Cohen，Diegelmann和Linndblad)PhiladelphiaWE Saunders Co.1992，562；Dale，Prof Nurse12 Suppl，1997，12；Rothe和Falanga，Arch Dermatol 1989，1251390；Puma和Babu，Bums，2000，2656；Pruitt和Levine，Arch Surg 198419312)。
热敏聚合物如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(“PNIPAAm”)会表现出下限临界溶解温度(“LCST”)。PNIPAAm是众所周知的表现出明确的在水中约为32℃的LCST的热敏聚合物。PNIPAAm在水溶液中低于32℃下是完全水合的，具有伸长链构型，并且在这个温度之上又会大量脱水并且紧缩。
热敏聚合物是当它们的温度经过下限临界溶解温度(“LCST”)时经历相转变的聚合物。在LCST之上，聚合物倾向于脱水，使它很少溶于水中。在LCST之下，聚合物大量与水化合，从而更加溶于水。大量的聚(丙烯酰胺)衍生物，例如，聚(烷基化丙烯酰胺)包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)(“PNIPAAm”)或聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)(“PDEAAm”)是热敏的。
在本发明范围中，术语“热敏聚合物”是指在指定温度(这里指LCST)之下具有增加的水亲合性并且因此能够溶胀的聚合物。
能够形成热敏聚合物的单体是能够本身或与其他单体化合物聚合以形成聚合物即热敏聚合物的单体化合物。例如，单体可以自聚形成热敏均聚物，或者它可以与另外的单体化合物聚合形成无规共聚物或嵌段共聚物，其每个都会表现出热敏性能。
本发明者发现包含一种能够形成热敏聚合物的单体以及可聚合的表面活性剂的微乳液的聚合会得到热敏聚合物。聚合物因此具有当材料在医疗应用范围中使用时提供优点的热敏溶胀特征。例如，纳米多孔的热敏聚合物膜可以作为敷料敷在伤口处。当需要去除敷料时，膜可以通过将伤口处的温度降到低于聚合物的LCST之下而溶胀，从而利于它从伤口处的去除。
因而，本发明提供了一种用于制备热敏聚合物的方法，其包括聚合微乳液，该微乳液包括能够形成热敏聚合物的第一单体和可聚合表面活性剂。
正如在本领域中所理解的，“微乳液”指透明的由亲水溶液相、疏水溶液相和表面活性剂组成的连续或双连续的分散液体体系，具有平衡域大小的微乳液通常大约1～100nm。微乳液的制备在本领域中是众所周知的，并且已经使用包含可聚合表面活性剂的微乳液用于制备透明的具有不同纳米结构的固体聚合物。可聚合的表面活性剂能够本身或与其它单体化合物聚合形成聚合物。由于将表面活性剂引入到聚合物中，因此可以避免聚合后将表面活性剂从聚合物中分离的需要。
第一单体和可聚合的表面活性剂可以与水结合形成混合物，该混合物然后然后再被分散。混合物可以通过对制备微乳液的技术人员来说标准的工艺分散以形成微乳液。例如，混合物可以经超声波处理、涡流处理、或者其他方式的搅拌以产生混合物内不同相的微滴，微滴直径为约1～约100nm。或者，例如，可以将混合物经过带有纳米尺寸毛孔的过滤器以产生精细的液滴。
用于微乳液中的第一单体可以是任何一种通过聚合形成热敏聚合物的单体。通常，这种单体对于使用的主体必须是安全的并且优选能够与其它单体聚合，其包括，但不限于，丙烯酰胺衍生物如N-异丙基丙烯酰胺和N，N-二乙基丙烯酰胺。另外，最优选地是单体聚合形成纳米多孔基体以实现好的气体渗透以及结合在聚合物中的生物活性药物的持续释放。正如本领域的技术人员所理解的，当微乳液的组分处于适当的比例以便形成双连续相时能够得到纳米多孔基体。更进一步优选地是单体能够在有紫外线辐射和光敏引发剂参与的情况下聚合，或者在氧化还原对如过硫酸铵(APS)和N，N，N，N′-四甲基乙二胺(TMEDA)存在下聚合，或者在加热情况下聚合，例如通过偶氮二异丁腈(AIBN)的使用利用加热而聚合。
在一个实施方案中，第一单体为丙烯酰胺衍生物如烷基化丙烯酰胺，例如N-异丙基丙烯酰胺(“NIPAAm”)或N，N-二乙基丙烯酰胺(“DEAAm”)，其聚合分别形成聚(N-异丙基丙烯酰胺)(“PNIPAAm”)或聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)(“PDEAAm”)。PNIPAAm是众所周知的表现出明确的在水中约32℃的LCST的热敏聚合物。PNIPAAm在水中低于32℃下是完全水合的，具有伸直链构造，在这个温度之上又会大量脱水并且紧缩。PNIPAAm已经成功用于细胞培养，它的热响应性质使得培养细胞的脱离无需酶的处理(Takezawa等，Bioetechnol(1990)8854)。培养表面一旦涂有PNIPAAm，处理的培养表面就会保持疏水直到培养温度低过PNIPAAm的LCST。此外，Lin等人报道了装载PNIPAAm微凝胶珠的Eudragit E膜在25℃和37℃之间表现出明显降低的剥离强度。这可能是归因于在低于25℃PNIPAAm的LCST下，流体通过相关亲水的PNIPAAm微凝胶珠的吸收会降低膜的粘着性能的事实，从而导致更低的剥离强度(Lin等，Biomaterials(2001)222999)。其它的典型单体包括N-烷基丙烯酰胺，N-烷基甲基丙烯酰胺，N-乙基丙烯酰胺，N，N-二乙基丙烯酰胺，N-丙基丙烯酰胺，N-正丙基甲基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N，N-异丙基甲基丙烯酰胺，N-环丙基丙烯酰胺，或者类似的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、丙烯酸羟丙基酯共丙烯酰胺，双丙酮丙烯酰胺共羟乙基丙烯酸酯、丙烯酸羟丙酯共丙烯酸羟乙酯、乙基丙烯酰胺、环丙基丙烯酰胺、正-丙基丙烯酰胺或异丙基丙烯酰胺。
微乳液中使用的表面活性剂是任何一种可聚合的表面活性剂，因此能够与单体共聚合。在不同的实施方案中，表面活性剂可以是ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯(“C1-PEO-C11-MA-40”)，或者它可以是fluronic68-二丙烯酸酯。
微乳液可以进一步包含一种或多种可以或不能够形成热敏聚合物的并且其可以与能够形成热敏聚合物的第一单体以及可聚合的表面活性剂共聚形成聚合物的单体。除了能够形成热敏聚合物的第一单体之外包含在微乳液中的单体这里指“共聚单体”。
共聚单体可以包括任何一种聚合形成适合用于医疗应用的材料并且可以与能够形成热敏聚合物的单体共聚的单体。在不同的实施方案中，共聚单体包括甲基丙烯酸甲酯(“MMA”)和/或甲基丙烯酸2-羟乙酯(“HEMA”)。这些共聚单体用于分别改进或调整所得聚合物的力学性能和亲水性能。
正如有经验的技术人员所欣赏的，微乳液中每个上述成分的精确量不是必要的，而是取决于许多因素，并且对于每种成分来说可以取决于残余成分的比例而变化。例如，应该包括足够量的能够形成热敏聚合物的单体，以使得所得到的聚合物具有所希望的热敏性能。此外，通过使用适当的共聚单体并且通过改变共聚单体与第一单体的比例可以调整任一给定聚合物的LCST。这意味着，正如具体应用所希望的，溶胀的不连续变化可以发生在不同的温度范围。同样，总的单体含量也不应该太多，以防止所得到的聚合物变得太硬或非柔性。
可包括的不同类型单体的类型和比例可以变化以便影响所得到聚合物的性能。例如，聚合物的疏水性可以通过包括增加共聚单体的量或者比能够形成热敏聚合物的第一单体更疏水的共聚单体的量而增加。有经验的技术人员会理解怎样结合不同的单体以及变化比例以确定对所得到膜的不同性能如LCST、疏水性和抗拉强度的影响。
在用于形成微乳液的混合物中，第一单体与共聚单体的比可以依赖于所得到聚合物的所希望的性能而变化。在不同的实施方案中，比例为1∶0、5∶3、3∶1、1∶1、或1∶3。通过变化比例，可以按所希望的修改所得到膜的热敏性以及它的溶胀性能。
在一个实施方案中，混合物中水、可聚合表面活性剂的浓度以及总的单体含量分别在约15％和约50％之间、约20％和约45％之间以及约25％和约50重量％之间。
在另一个实施方案中，所述方法可以可选地进一步包括使用交联剂进行交联的步骤。例如，交联可以通过化学交联、光化学交联、电子束交联、紫外线交联或其它对于有经验的技术人员来说显然的方法而达到。交联的方法取决于要交联的微乳液组成的特性。
例如，当使用确定的表面活性剂如C1-PEO-C11-MA-40作为可聚合的表面活性剂时，微乳液可以包含一种化学交联剂，如例如乙二醇二甲基丙烯酸酯(“EGDMA”)。化学交联剂可以是任何一种交联微乳液不同组分的化学交联剂，例如，任何一种能够交联具有乙烯基或丙烯酸双键的单体的交联剂。因此，具体交联剂的选择将取决于微乳液中单体和可聚合表面活性剂的特性。
在一个实施方案中，交联剂的浓度按总单体重量的百分比计约为5％。
微乳液可以按照对于有经验的技术人员来说显然的标准工艺而聚合。例如，微乳液可以通过加热、催化剂的加入、通过微乳液的辐射或者通过将自由基引入微乳液中而聚合。聚合方法的选择取决于微乳液组分的特性。
微乳液的聚合可以包含催化剂的使用。催化剂可以是任何一种促进不同类型的单体和表面活性剂之间聚合的催化剂或聚合引发剂。具体催化剂的选择取决于具体的单体(第一单体和所有共聚单体)、以及所使用的可聚合表面活性剂或聚合方法。例如，如果光敏引发剂用作催化剂，那么聚合可以通过将微乳液进行紫外线辐射而达成。例如，可以使用光敏引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，或者可以使用烷基芳基酮。
在一个实施方案中，光敏引发剂的浓度按总单体和表面活性剂结合量的百分比计在约0.1％～约0.3％之间。
微乳液可以在聚合之前形成所希望的最终形状。例如，膜可以通过在微乳液的聚合形成聚合物膜之前将微乳液浇注或刷涂至所希望厚度的薄层中而形成。微乳液也可以，如果需要，例如通过在聚合之前将微乳液浇注至铸件中形成纤维状或管状。聚合后，由聚合物形成的膜可以漂洗并用水平衡，以及可选的干燥并且可以在制备用于在医疗或临床应用中所使用的膜时进行灭菌。
聚合物和所得到的膜，可以是纳米结构的，这意味着材料拥有有序结构区域，这些有序区域是纳米尺度的，通常在约1～约100nm之间的范围内。微乳液中的毛孔通过由水占据的体积而形成。这样，在不同的实施方案中，材料和所得到的膜中的毛孔具有微乳液中约1～约100nm、约10～约100nm、约50～约100nm、或约50nm的亲水相尺寸。
当依照本发明的方法制备聚合物时，聚合物优选是透明的，这样使得在作为伤口敷料的使用中可以做到下层伤口的可视化从而监控愈合过程。
通过上述方法制备的热敏聚合物优选为坚固的、可弯曲的及可伸长的。这些性能受用来形成微乳液的单体的类型和用量影响。例如，在某些实施方案中，共聚单体HEMA的掺杂可以由于它的亲水性能而改进聚合物的柔韧性。
在具体的实施方案中，聚合物的抗拉强度可以从约4到约20MPa变动。在某些实施方案中共聚单体甲基丙烯酸甲酯的掺杂可以降低聚合物的抗拉强度，但是可以增加弹性，这可能是由于提供聚合物链之间疏水性相互作用的疏水共聚单体的引入。有经验的技术人员能够很容易地改变不同的单体组分以达成不同的所希望的聚合物的机械性能。
由差的水蒸气渗透性所造成的伤口敷料之下的体液滞留，或由快速的水分损失所造成的肉芽伤口层的脱水，对于伤口的愈合提出了严重的问题。理想的伤口敷料以最佳的速率保持蒸发的水从伤口处的损失以便既能防止过度脱水又能防止渗出液的积累。肉芽伤口面要经历大约5138g/m2/天的蒸发去水，差不多为一度烧伤皮肤的20倍。
具有非常低的水蒸气传输速率(WVTR)的伤口敷料包括，Vigilon、Vigilon覆盖膜和拉伸‘n’Seal敷料，其分别具有168±32、139±23和326±44g/m2/天的WVTR(Ruiz-Cardona等，Biomaterials(1996)171639)。Tegaderm和Bioclusive以及许多粘附膜敷料，也具有低的水蒸气传输速率，其WVTR分别为491±44和382±26g/m2/天15。OpSite(426g/m2/天的WVTR)大约28μm厚，尽管必须经常通过刺穿材料并抽吸流体而去除流体收集液，它还是已经较为成功地作为皮肤移植供体部位敷料而使用。
与此相反，亲水材料如Geliperm具有高的WVTR。Geliperm具有10972±995g/m2/天的WVTR。然而，使用带有这么高WVTR的伤口敷料会导致伤口表面的全部脱水(Queen等，Biomaterials(1987)8367)。
在某些实施方案中，这里描述的热敏纳米多孔膜可以表现出从约500到约2000g/m2/天变动的WVTR值。在某些实施方案中，WVTR从约500到约900g/m2/天变动。从而，聚合物可以特别适合用于引起少量蒸发去水的伤口面。WVTR受毛孔大小以及用于制备膜的单体成分的影响。因而，通过选择不同的表面活性剂或者通过调整单体含量或微乳液的水含量，能够调整具体纳米多孔膜的WVTR。
优选地，通过上述方法制备的热敏聚合物具有与生物学有关的LCST。即LCST应该在这样的温度范围以使得聚合物在定位时的温度在LCST之上，并且当聚合物需要溶胀时温度能够很容易地降低到LCST之下，而不会对患者造成伤害。膜的LCST优选至少稍低于具有伤口的患者的体温。在一个实施方案中，聚合物具有低于伤口处温度的LCST。在一个实施方案中，具有伤口的患者是人，膜的LCST在约32℃和37℃之间。给定聚合物的LCST可以通过改变膜在它的LCST之下转变的条件而调整，例如，通过在冷却期间将不同的盐引入到适用于膜的溶液中。通常，LCST在包含盐的溶液中会更低。
聚合物和所得到的膜的溶胀性能是随温度而变化的，温度低于LCST越多，聚合物就会更大程度的溶胀。温度依赖性不一定是线性的，聚合物可以在LCST附近表现出不连续的溶胀率。
聚合物的溶胀性能还取决于用于形成材料的第一单体的浓度。更大的这种单体浓度的增加，响应于温度的材料溶胀性降低。
优选地，聚合物和所得到的膜是耐热的以虑及膜在用于医疗应用之前的消毒。在不同的实施方案中，聚合物具有至少约300℃的分解温度。热稳定性好象是不受不同微乳液组成的影响，从而提供了有意义的膜可以在临床应用之前通过例如高压灭菌而消毒的优点。
在不同的实施方案中，所得到的聚合物是生物相容的、无细胞毒素的以及无过敏性反应的并且只会对伤口部位的组织引起最小的刺激。
按照本发明方法的不同实施方案制备的热敏聚合物作为用于封闭需要愈合的开放伤口的伤口敷料是有用的。伤口可以在任何一种动物身上，例如但不限于，哺乳动物，例如人类。由于当敷料需要更换时，膜在从伤口处去除之前的溶胀使其易于去除并且将愈合过程的破坏减到最小，因此膜的溶胀性能使其作为伤口敷料来说是特别有用的。
因而，提供了一种包括将热敏聚合物敷在伤口处；在将聚合物从伤口处即刻去除之前，降低热敏聚合物的温度以利于聚合物的去除；以及从伤口处去除聚合物的用敷料包扎伤口和去除伤口敷料的方法。
聚合物可以是纳米多孔的并且可以以溶胀的或非溶胀的状态敷在伤口处。如果聚合物以溶胀的状态涂敷，那么在涂敷之前于低于LCST的温度下将其浸在水中。由于聚合物的温度-依赖性溶胀性能，敷料将会在加温下紧缩。
然而，如果聚合物以干燥的状态涂敷，例如，当过量的渗出液存在于伤口处时，那么在涂敷之前先将它干燥。
为了以对愈合伤口最小的破坏去除敷料，在去除之前，在水存在下降低聚合物的温度。聚合物冷却的温度越低，聚合物的溶胀越大。温度应该是足够易于去除并且使对患者的不适或伤口处组织的损伤降到最小的温度。
按照本发明方法的不同实施方案制备的热敏纳米多孔聚合物可以用于将不同的治疗剂输送到伤口处以促进伤口的愈合。例如，所希望的是将抗生素，药物如消炎药或凝结药物、涉及伤口修复的激素或其它生物分子如核酸或多肽输送到伤口处。
通常，考虑到一旦聚合物定位在伤口处时治疗剂的控制释放，因此治疗剂可以被结合到聚合物基体中。
因而，提供了一种将治疗剂输送到伤口处的方法，其包括将治疗剂结合到热敏纳米多孔聚合物中；并将热敏纳米多孔聚合物敷在伤口处。
治疗剂可以是任何一种在伤口处对于愈合或感染的预防来说具有治疗或预防作用的药物。例如，但不限于，治疗剂可以是药物、抗生素、抗炎药、凝血因子、激素、核酸、肽、细胞因子或用于细胞表面受体的配体。
药物优选对伤口部位的刺激最小，并且对愈合过程的干扰也最小。同样，治疗剂为一种不干扰热敏纳米多孔聚合物的物理或化学性能的药物是优选的。
治疗剂可以例如通过将聚合物膜浸渍在包含药物的溶液中而被结合到聚合物中。或者，如果药物在要使用的具体聚合条件下是稳定的，那么它可以在聚合过程中被结合到纳米多孔膜中。
改变膜的组成就会改变治疗剂的释放分布并且也可以更改治疗剂的最初破裂释放程度。通常，治疗剂以持续释放的方式从膜中释放。
同样，所希望的是将移植细胞或组织输送到伤口处或者其它的移植部位以便将健康生长的细胞或组织移植在那里。依照本发明的不同实施方案的聚合物的多孔特性与它的热敏溶胀特征的结合，有助于聚合物作为用于将细胞或组织输送到移植部位的载体的实用性。
一方面，本发明提供了一种包括在热敏纳米多孔聚合物上培养细胞；并将包含细胞的聚合物安置在移植部位处的将细胞输送到移植部位的方法。在不同的实施方案中，在其上培养细胞之前，聚合物可以被透明质酸、胶原蛋白或其他生物相容的基体涂层。
聚合物可以用来将一个细胞、大量的细胞或组织输送到移植部位。因而，“一个细胞”包括一个单一细胞以及若干个细胞，包括组织。细胞或组织可以源自要被移植的患者本身，或它们可以源自其它来源。细胞或组织可以是基因被改变的细胞或组织，其中转基因会使细胞或组织更适合用于基因疗法。
通过降低聚合物的温度，聚合物溶胀并且细胞更易于从聚合物上释放到移植部位。在新组织形成之后，聚合物可以从移植部位去除。或者，聚合物可以在细胞和聚合物移植后的潜伏期之后，但在新组织形成之前去除。在一个实施方案中，聚合物可以在敷在移植部位之前溶胀。
不同的细胞类型可以在不同的适宜温度下从聚合物上脱离。具体的细胞类型从聚合物上脱离时的温度可以通过调整用于形成聚合物的具体的单体类型以及比例而变化。
移植部位可以是任何一个移植部位，包括伤口部位，以及任何其它的容易接近的希望输送细胞的部位，包括耳朵和角膜。例如，聚合物可以用于输送细胞以修复人耳中的圆窗膜或输送细胞用于人造角膜移植。
本发明的聚合物可以优选用于其它希望材料具有温度-依赖的溶胀特征的应用。例如，纳米多孔聚合物可以用作用于细胞或组织培养包括干细胞培养的脚手架。使用热敏纳米多孔膜或纤维作为用于培养细胞生长的支撑物使得培养细胞的输送不再需要苛刻的酶的使用或者物理破坏以使细胞从培养容器中去除。此外，由于聚合物的纳米多孔性，本发明的热敏纳米多孔聚合物可以用于分离技术以过滤或分离具有纳米尺度的颗粒。同样，聚合物可以通过将能够结合特定类型的要被分离的细胞的配体共轭结合到膜上而用于分离细胞。
以下实验只是说明制备热敏聚合物的方法和所得到的聚合物以及它们的使用方法，并不限定这里所公开的工艺、聚合物或使用方法的主要方面。
实施例1.使用的材料将从Sigma公司得到的甲基丙烯酸甲酯(MMA)和甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)在减压下蒸馏。通过结晶(正己烷)纯化N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)。使用从Aldrich得到的乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)而无需进一步的纯化。依照Liu等在J.Macromol.Sci，Pure Appl.Chem.(1996)A33，3337中描述的方案合成ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯大单体(C1-PEO-C11-MA-40)。
对于fluronic68-二丙烯酸酯的合成，将fluoric-68溶解在干燥的CH2Cl2与三乙胺中。在氮气环境中，搅拌下将甲基丙烯酰氯逐滴加入到溶液中，然后将溶液在冰浴中保温半小时。再将混合物在室温下搅拌一整夜。将沉淀的氯化三乙基铵过滤，通过旋转蒸发除去过量的丙烯酰氯、CH2Cl2和三乙胺。将残余物溶解在蒸馏的三氯甲烷中并用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤两次。再用饱和的盐水将三氯甲烷溶液洗涤两次。蒸发后将固体产物从三氯甲烷溶液中回收。通过三次将粗产物从三氯甲烷到醚的再沉淀而得到纯产物。
2.膜制备直接通过微乳液聚合制备多孔膜。这种微乳液包含可变量的HEMA、MMA、NIPAAm、超纯水以及表面活性剂C1-PEO-C11-MA-40或fluronic68-二丙烯酸酯，当使用C1-PEO-C11-MA-40时，还包括交联剂EGDMA以及光敏引发剂DMPA。
室温下洗涤并干燥二块20cm×20cm的玻璃板。使用带有少量硅油的棉纸将要与微乳液接触的玻璃表面抛光以使聚合物膜在聚合之后能够去除。将大约1g的每种微乳液首先浇注到玻璃板上，随后通过用另一块玻璃板缓慢覆盖而使之铺展。这样就减少了气泡截留在二块玻璃板之间的机会。使用小块的薄铝箔片作为玻璃板之间的隔离物以调整膜的厚度。
聚合反应在紫外线反应器中进行6h。将膜浸于去离子水中，并且在进行进一步表征之前每天更换水持续一个星期。
表1列出了所制备膜的组成。交联剂EGDMA形成了每份组成物2％的残余物。
表1 所选微乳液体系的组成以重量份％计的组成物

3.形貌分析膜的表面形貌观察使用Thermo Microscope Autoprobe CPResearch原子力显微镜(AFM)系统(Park Scientific Instrument，Sunnyvale，CA)以接触的模式进行。使用力常数为0.40N/m的安装在硅悬臂上的圆锥形的氮化硅接点。Si3N4悬臂(带有一个积分接点)具有180μm的长度、38μm的宽度、1μm的厚度以及45KHz的共振频率。每个图像包含521×512个数据点。使用IP2.1图像软件处理表面形貌图像。
使用JEOL 6700场致发射枪扫描电子显微镜(FEG-SEM)观察膜的横截面形貌。将膜在液氮中冷冻断裂以露出横截面。在观察之前，将样品在室温下真空干燥24小时，然后使用JEOL离子-溅射JFC-1100镀金机镀上一薄层金。
如图1所示，表面形貌分析表明膜表面包含毛孔，一般小于100nm。如图2所示，膜的横截面扫描电子显微照片显示在制造过程中由水分产生的任意分布的纳米结构通道，通道直径为50～100nm。
4.热性能通过Perkin Elmer热重分析仪(TGA)分析聚合膜的分解温度。从30℃～800℃评价大约10mg放置于铂池中的样品的热行为。在干燥的氮气流下使用10℃/min的温度梯度并且连续记录重量损失。样品重量急剧减少的温度范围被认为是分解温度。
热分析表明，具有不同单体组成的膜有着相似的从300℃～350℃范围的分解温度(Td)。这个结果表明，膜在直到300℃下是热稳定的并且微乳液组成的改变不会影响所得到膜的热稳定性。这个热稳定性是一个非常大的优点，因为它意味着膜可以通过高压灭菌或其它方法在临床应用之前进行消毒。
5.溶胀性能使用下列方法测量聚合膜的平衡溶胀率(“ESR”)。预先称重干燥样品，将其在不同温度下浸在蒸馏水中达到平衡，在用滤纸除去多余的表面水分后，记录充分溶胀样品的重量。依照等式ESR(％)＝(Ws-Wd)/Ws×100确定ESR，其中Wd为干燥样品的重量，Ws为溶胀平衡后湿样品的重量。
膜表现出温度-依赖的溶胀率(图3)。它们看上去在低温下会溶胀到更高的程度。不连续降低的溶胀率发生在32～37℃的范围内，这表明溶胀行为很可能受PNIPAAm的LCST影响。在高于这个温度范围的环境温度下，膜的亲水性降低，导致更低的溶胀率。总之，微乳液中增加的NIPAAm单体含量改进了膜对温度的敏感性。
在一系列温度下测量了不同膜的以总膜重的百分比计的水分含量，如表2中所示。
表2 所选纳米多孔膜的水分含量以重量份％计的水分含量

6.水蒸气传输速率依照ASTM E96水方法测定膜的水蒸气传输速率(WVTR)。简要地说，每次将直径为16mm的膜圆片借助于不能渗透水的密封剂安装在倒转位置放置的包含10ml蒸馏水的塑料容器上，以使水能够通过膜蒸发到环境室中。在温度为32℃，相对湿度为50％下，将容器定期称重以测定水穿过膜样品进入环境室的运动速率。从等式WVTR＝W/(t×A)计算WVTR，其中W为在时间t通过具有面积A的膜样品所透过的水蒸气的重量。表3列出了实测的某些膜的WVTR值。
表3 所选纳米多孔膜的水蒸气传输速率

7.机械性能从工程学观点来看，好的机械性能会使得材料在用于伤口敷料的涂敷期间保持它们的形状。这里通过测量三个参数，抗拉强度、最大百分比应变和杨氏模量以测定纳米结构膜的机械性能。
通过Instron微力试验机测量膜的断裂应变(％)、杨氏模量和抗拉强度。使用ASTM 638中所述标准尺寸的样品。拉伸速率为0.25mm/min。
发现不同组成的膜机械行为是不同的(表4)。它们的抗拉强度从4.8～6.9MPa范围内变化，最高为HMN 2。只包含NIPAAm和HEMA的膜虽然牺牲了它们的断裂百分比应变，但是表现出更高的抗拉强度和杨氏模量。这可以归结于聚合物链之间强的亲水性相互作用。随着MMA加入到微乳液中，膜损失了一些它们的抗拉强度但它们的伸长百分比增加到48～86％的范围。相比较而言，皮肤的抗拉强度和杨氏模量通常分别为2.5～16MPa以及6～40MPa。具有相似强度以及稍高杨氏模量的聚合物最通常用于替换皮肤组织(Silve，Biomaterials，Medical Devices and Tissue EngineeringAn IntegratedApproach，Chapman和Hall，United Kingdom，1994，46)。纳米结构膜的4.8～6.9MPa范围内的抗拉强度以及140～380Mpa范围内的杨氏模量的事实表明这些膜具有足够的耐用性以用作伤口敷料。
表4 所选干燥膜的机械性能

也研究了膜在溶胀状态下的机械性能。HMN 1和HMN 4润湿后降低了机械性能，而HMN 2和HMN 3则保持了它们的抗拉强度和它们的部分韧性(表5)。
表5 所选膜润湿后的机械性能

8.与固体膜接触下的细胞成活力研究为了制备用于体外细胞毒性研究的膜，将膜切成2×2mm的片并浸在PBS溶液中过夜。在70℃烘箱中干燥后，将它们高压灭菌以便细胞毒性研究之用。在具有不同的原始单体浓度的膜上进行初步研究。在计数活细胞之前将EL4细胞(C57BL/6J鼠类lympoma细胞株)培养24和48小时。将对照样(无试样的细胞)和试样进行3次平行测定。结果以活细胞相对于对照样的百分比来表示。
在用膜培养24和48小时后，细胞分别表现出107.5～60.8以及104.5～69.2％之间的成活力(表6)。在一些试验中细胞成活力的增加可以表示细胞适应并重新开始正常生长后的习服期。
表6 EL4细胞暴露于所选膜后的成活力成活力(％对照样)

9.药物装载为了确定是否膜能够用于将治疗剂如药物输送到伤口部位，使用众数性药物东莨菪碱测试膜。在4℃下将膜浸在浓度为1g/100ml的东莨菪碱中3天。然后在体外测试之前将装载药物的膜风干。体外测试在Vankel VK 7000溶出试验台上于37℃下PBS(pH值为7.4)中进行。以预先确定的间隔时间，抽取1ml样品用于HPLC分析并用新的PBS缓冲剂取代。
观察HMN 1和HMN 2膜中东莨菪碱3天的持续释放(图4)，表明膜适合用于药物如抗菌剂或伤口愈合促进剂的持续输送，很可能产生更大的伤口愈合效率。
10.细胞从膜的输送使用鼠类肿瘤成纤维细胞研究温度对细胞从膜上脱离的影响(L929、ATCC，USA)。在用细胞培养物使用之前将膜高压灭菌。在这个实验中，每个膜被切成24#池板中精确池直径大小的片，然后将其放置在测试池中。对照池的表面未作更改。然后将L929鼠类成纤维细胞以5×l05细胞/ml的密度播种在膜上或者池的表面，并在37℃5％CO2的潮湿气氛下培养。约48小时后，将培养物在4、10、15、20和27℃下保温半小时作为冷却处理。随后，将每个池的内含物吸出并转移至新的24#池板。然后将这些新的板返回到培养箱中以使所有脱离的细胞再附着并重新开始细胞生长。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)在25℃下轻柔洗涤每个原始板的池，并使用MIT测定法估定每个池中所有残余细胞的成活力。
如图5所示，细胞很好地附着在所有膜的表面。细胞连续地自我组织成通过细胞质的芽枝连接的聚集体(比较图6B和6C)，在对照样品中没有观察到这种现象。
在4℃培养大约30分钟后，发现50～70％附着在膜上的细胞脱离。在对照板中没有观察到明显的细胞脱离。也研究了冷却温度对脱离的影响，如图7所示。细胞的最大数在15℃从膜脱离。然而，应该注意到，冷却温度对膜的影响可以因不同类型的细胞以及改变膜的组成而变化。从热敏膜上脱离并移植的细胞附着在新的表面并重新开始令人满意的生长(图8)。这个结果表明了脱离细胞的成活力并且构成了反对初始细胞死亡是所观察到脱离的原因的证据。膜的这种性能表明膜适合用于作为细胞移植载体而使用。
图9为一种有代表性的膜，其说明了使下面伤口处可视化的膜的透明性。
正如本领域的技术人员所能够理解的，对这里所描述的示范性实施方案的许多修改是可能的。本发明更意欲将所有这样的修改包含在它的如权利要求书所限定的范围之内。
这里所提到的所有文献都作为参考而全部并入。
权利要求
1.一种用于制备热敏聚合物的方法，其包括使微乳液聚合，所述微乳液包含能够形成热敏聚合物的第一单体和可聚合的表面活性剂。
2.权利要求1的方法，其中第一单体为丙烯酰胺衍生物。
3.权利要求2的方法，其中第一单体为烷基化丙烯酰胺。
4.权利要求3的方法，其中第一单体为N-异丙基丙烯酰胺。
5.权利要求4的方法，其中可聚合的表面活性剂为ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯或fluronic68-二丙烯酸酯。
6.权利要求5的方法，其中微乳液包含共聚单体。
7.权利要求6的方法，其中微乳液包含甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸2-羟乙酯。
8.权利要求7的方法，其中可聚合的表面活性剂为ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯，并且微乳液还包含化学交联剂。
9.权利要求8的方法，其中交联剂为EGDMA。
10.权利要求9的方法，其中微乳液还包含光敏引发剂。
11.权利要求10的方法，其中光敏引发剂为2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮。
12.权利要求11的方法，其中聚合包括将微乳液进行紫外线辐射。
13.权利要求12的方法，其包括在聚合之前制备所希望厚度的微乳液层的步骤。
14.权利要求13的方法，其中微乳液包含约20重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约10重量％的甲基丙烯酸甲酯、约10重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
15.权利要求13的方法，其中微乳液包含约10重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约10重量％的甲基丙烯酸甲酯、约20重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
16.权利要求13的方法，其中微乳液包含约7.5重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约7.5重量％的甲基丙烯酸甲酯、约15重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约33重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
17.权利要求13的方法，其中微乳液包含约10重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约20重量％的甲基丙烯酸甲酯、约10重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
18.权利要求13的方法，其中微乳液包含约25重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约10重量％的甲基丙烯酸甲酯、约5重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
19.权利要求13的方法，其中微乳液包含约30重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约10重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
20.权利要求13的方法，其中微乳液包含约10重量％的N-异丙基丙烯酰胺、约25重量％的甲基丙烯酸甲酯、约5重量％的甲基丙烯酸2-羟乙酯、约35重量％的ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、约23重量％的水以及约2％的乙二醇二甲基丙烯酸酯。
21.一种伤口敷裹和从伤口去除敷料的方法，其包括将热敏聚合物敷在伤口处；在将聚合物从伤口处即刻去除之前，降低热敏聚合物的温度以利于聚合物的去除；以及从伤口处去除聚合物。
22.一种将治疗剂输送到伤口处的方法，其包括将治疗剂结合到热敏纳米多孔聚合物中；以及将该热敏纳米多孔聚合物敷在伤口处。
23.权利要求22的方法，其中治疗剂为药物、抗生素、抗炎药、凝血因子、激素、核酸、肽、细胞因子或用于细胞表面受体的配体。
24.权利要求22的方法，其中治疗剂为药物或抗生素。
25.权利要求22的方法，其中治疗剂为伤口愈合促进剂。
26.一种将细胞输送到移植部位的方法，其包括在热敏纳米多孔聚合物上培养细胞；以及将包含细胞的聚合物安置在移植部位处。
27.权利要求26的方法，其还包括降低热敏纳米多孔聚合物的温度以利于聚合物的去除；以及从移植部位去除聚合物。
28.权利要求27的方法，其中降低温度的步骤是在将携带细胞的热敏纳米多孔聚合物安置在移植部位上之后进行。
29.一种通过权利要求1～20之一的方法制备的热敏纳米多孔聚合物。
30.一种通过权利要求13的方法制备的热敏纳米多孔膜。
31.一种热敏聚合物，其为纳米多孔的。
32.权利要求31的热敏纳米多孔聚合物，其具有至少约300℃的分解温度。
33.权利要求32的热敏纳米多孔聚合物，其具有约500～约2000g/m2/天的水蒸气传输速率。
34.权利要求33的热敏纳米多孔聚合物，其具有约4～约20MPa的抗拉强度。
35.权利要求34的热敏聚合物，其由包含能够形成热敏聚合物的第一单体和可聚合的表面活性剂的微乳液形成。
36.权利要求35的热敏纳米多孔聚合物，其中第一单体为N-异丙基丙烯酰胺。
37.权利要求36的热敏纳米多孔聚合物，其中可聚合的表面活性剂为ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯或fluronic68-二丙烯酸酯。
38.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约20∶10∶10∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
39.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约10∶10∶20∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
40.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约7.5∶7.5∶15∶35∶33∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
41.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约10∶20∶10∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
42.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约25∶10∶5∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
43.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约30∶10∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
44.权利要求37的热敏纳米多孔聚合物，其中微乳液包含大约10∶25∶5∶35∶23∶2比例的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、ω-甲氧基聚(氧化乙烯)40十一烷基α-甲基丙烯酸酯、水和乙二醇二甲基丙烯酸酯。
45.权利要求28的方法，其中移植部位为个体的耳的圆窗膜或角膜。
全文摘要
本发明提供了一种用于从微乳液制备热敏聚合物的方法。微乳液包含一种能够形成热敏聚合物的单体以及一种可聚合的表面活性剂。微乳液可以包括另外的共聚单体以改变所制备聚合物的性能。所得到的热敏聚合物是纳米多孔的。依照本发明的聚合物适合用于医疗应用，包括作为伤口敷料以及用于输送细胞到移植部位的应用。
文档编号A61K9/50GK1826360SQ200480020822
公开日2006年8月30日 申请日期2004年4月15日 优先权日2003年7月18日
发明者杨义燕, 王丽珊 申请人:新加坡科技研究局