专利名称：预防乳腺癌和卵巢癌的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及硒(或其盐或其衍生物或任意其它硒化物)的组合物以及在癌症的遗传性高易感性女性中，尤其是BRCA1基因突变的携带者中预防乳腺癌/卵巢癌的方法。
背景技术：
BRCA1(美国专利第5654155号)和BRCA2基因与癌症的高遗传素因相关。BRCA1和BRCA2基因已被克隆，目前，可在DNA和RNA水平对其异常进行检测。上述基因突变的携带者具有较高的乳腺癌和/或卵巢癌易感性。BRCA1是已知的与乳腺癌和卵巢癌的高易感性相关的第一个基因(Miki et al，Science，266-271，1994)。BRCA1(GENBANK登录号U14680和15595)含有24个外显子，散布于100kb基因组DNA之内，其mRNA长度为7.8kb。对该基因的深入研究已鉴定出多种BRCA1突变。例如，美国专利第5693473号报道了大量的这些变化并予以登记。国际公开第WO 99/29903号报道了另外的15个BRCA1突变。BRCA2基因(GENBANK登录号U43746)含有27个外显子，散布于70kb基因组DNA之内，其mRNA长度为11-12kb。已有众多BRCA2基因与癌症遗传素因相关的报道(例如，国际公开第WO 99/28506号)。
描述BRCA1和BRCA2基因突变的全部内容可参阅http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab-transfer/bic。
BRCA1和BRCA2的突变位于不同的外显子上。现已发现，在诸如德系犹太人的某些种族/人群，在乳腺癌/卵巢癌聚集的家族中，选定的突变的几率增加，高发生率的BRCA1中185位上的AG缺失和5382位上的C插入以及BRCA2中6174位上的T缺失是众所周知的。在波兰，报道了下列BRCA1突变的几率增加在外显子2中185位上的AG缺失，外显子5中300位上的T→G，外显子5中309位上的T→C，外显子11.15中3819位上的GTAAA缺失，外显子11.17中4153位上的A缺失，外显子20中5382位上的C插入(波兰专利第335917号)。在对异常进行检测的过程中，基于有限突变数量且不丧失灵敏度的DNA测定分析，为若干国家以极高的性价比进行BRCA1/BRCA2检测提供了难得的机会。在波兰，大约有100,000名女性是BRCA1突变的携带者。
过去25年的研究证明，当以5倍-10倍于营养需求的剂量为动物提供硒的时候，其可有效地降低癌症的发病率(El-Bayoumy K.，《硒在癌症预防中的作用机制》(The role of selenium in cancer prevention)，Philadelphia，Lippincott，1-15，1991)。在化学预防的动物模型中对硒的研究也说明，该元素即使不是对全部器官系统，也对绝大多数器官系统有效，并且对多种损伤的致癌效应具有保护作用(El-Bayoumy K.，《硒在癌症预防中的作用机制》(The role of selenium in cancerprevention)，Philadelphia，Lippincott，1-15，1991)。流行病学研究和补充实验(supplementation trails)都证实了其对于降低肝癌，直肠癌，前列腺癌和肺癌的发病率的功效(Yu S.Y.et al.《硒对Qidong中乙肝病毒与原发型肝癌的预防作用》(Protective role of selenium against hepatitisB virus and primary liver cancer in Qidong)，Biol Trace Elem Res，56117-124，1997，Clark L.C.et al.《硒补充对患有皮肤癌的患者的癌症预防作用》(Effects of selenium supplementation for cancer prevention inpatients with carcinoma of the skin).J Am Med Assoc，2761957-1963，1996，Yoshizawa K.et al.《趾甲中硒水平的预诊断与晚期前列腺癌的关系研究》(Study of prediagnostic selenium level in toenailsand risk of advanced prostate cancer)，J Natl Cancer Inst(Betsheda)，901219-1224，1998；Brooks J.D.et al.《在前列腺癌发展易感性与诊断之前的血浆硒水平》(Plasma selenium level before diagnosis and risk ofprostate cancer development)，J Urol，1662034-2038，2001)。然而，最近的报道却并不支持患者体内的硒水平与乳腺癌易感性的负相关。
Garland M.等人认为，在膳食中补充硒并不会对女性乳腺癌的易感性造成影响(J.Am.Coll Nutr.1993，Aug；12(4)400-11，J Natl CancerInst 1995，Apr 5；87(7)497-505)。类似的报道还可见于Ghadirian P.等人的相关研究(《趾甲硒与乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的病理对照研究》(A case-control study of noenail selenium and cancer of the breast，colon and prostate)，Cancer Detect Prev，24305-13，2000)。
此外，在欧洲专利第1003760号中还涉及到了使用含硒化合物保护动物免于毒物损伤的化合物和方法，该专利认为“现有的硒添加剂依赖于无机形式，比如亚硒酸钠(Na2SeO3)或硒酸钠(Na2SeO4)。尽管这些形式具有一定的价值，但却比所需要的毒性更强，在癌症的化学预防中并非特别有效”。
发明目的近来已经意识到乳腺癌是一种异质性病症(heterogeneousdisorder)，大约10％的乳腺癌/卵巢癌是遗传了较高的癌症遗传素因的后果。因此，本发明的目的是提供在具有较高乳腺癌/卵巢癌遗传素因的个体，尤其是BRCA1基因突变的携带者中有效降低乳腺癌/卵巢癌易感性的药物组合物与方法。本发明的另一目的是为带有BRCA1基因组成型突变的女性提供适于化学预防乳腺癌/卵巢癌的这类药物。
发明概述本发明出乎意料地解决了，至少是大部分地解决了上述问题。
本发明力图获得可在有疾病高遗传易感性的个体，尤其是BRCA1基因突变的携带者中降低乳腺癌/卵巢癌易感性的药物组合物，其特征在于包含治疗有效量的硒组分(例如，以其盐或其它衍生物或任意其它公知的含硒化合物形式)，以及，如果必要的话，药物可接受的载体。
如本发明的一个实施方案，硒可选自诸如硒半胱氨酸甲酯(selenomethylcysteine)，甲基亚硒酸(methylseleninic acid)，硒甲硫氨酸(selenomethionine)，硒半胱氨酸(selenocysteine)的有机形式或诸如二氧化硒，有机基亚硒酸(selenonic acid)，硒酸(selenic acid)及其盐的无机形式。还可推荐源自如富含硒的酵母或花椰菜的天然产物的硒。根据本发明的另一实施方案，硒化物可以是选自亚硒酸钡，亚硒酸锂，亚硒酸钙，以及特别有价值的亚硒酸钠的盐。优选地，药物组合物是硒浓度为0.1-10％重量比的等渗溶液。还推荐使用乙醇浓度为10-96％重量比的乙醇水溶液，蒸馏水，优选缓冲的生理溶液作为溶剂。还可推荐在乙醇的水溶液中包含如本发明所述的具有硒盐的组合物。
本发明的另一目的在于提供在遗传有肿瘤高遗传易感性的个体，尤其是BRCA1女性携带者中预防乳腺癌/卵巢癌的方法，其特征在于为患者补充含硒(或其盐或其衍生物)的化合物并使用上述的组合物。还可推荐，根据本发明所述的方法，为患者进行每天50-1000μg硒的补充。比较有价值的是，在本发明所述的方法中，在测定患者的组成型BRCA1基因突变之后再使用含硒的组合物。
出乎意料地，在BRCA1突变携带者中，使用基于Hsu的细胞遗传学检查测定出了对争光霉素(bleomycin)敏感性的升高(0.58vs.0.39染色体断裂/细胞；p＜10-4)，这是以约300μg/天的硒剂量进行膳食补充1个月之后的标准化结果。
此外，同样出乎意料的是观察到了乳腺癌/卵巢癌易感性的降低(参见实施例3)。对由30名最初健康、BRCA1突变携带者组成的实验组进行以剂量为300μg/天的亚硒酸钠乙醇溶液的补充，对照组由30名突变类型与出生年龄匹配的BRCA1携带者组成，分析2年期的新生乳腺癌/卵巢癌的发病情况。在该初步研究中，在补充硒的实验组中观察到了1个乳腺癌病例，而在对照组中观察到了4个乳腺癌和1个卵巢癌病例。
此外，还分析了以剂量为300μg/天的亚硒酸钠乙醇溶液补充的实验组和对照组的1年期的新生乳腺癌/卵巢癌的发病情况，实验组由最初未受影响的200名BRCA1携带者组成，对照组由200名突变类型与年龄(平均年龄为38.6岁)匹配的BRCA1携带者组成。在该初步研究中，在补充硒的实验组中观察到了1个乳腺癌和1个腹膜癌病例，而在对照组中则诊断出2个乳腺癌和2个卵巢癌病例。
发明详述本发明提供了可用于在具有较高乳腺癌/卵巢癌遗传素因的个体，尤其是BRCA1基因突变的携带者中降低乳腺癌/卵巢癌易感性的药物组合物和方法。而且，本发明还为具有BRCA1基因组成型突变的女性提供了适于化学预防乳腺癌/卵巢癌的药物。
本发明还提供了可在疾病高遗传易感性的个体，尤其是BRCA1突变的携带者中降低乳腺癌/卵巢癌易感性的药物组合物，该组合物含有硒(或其盐或其衍生物或任意其它含硒化合物)，以及，如果必要的话，药物可接受的载体。
除非特别说明，在此使用的术语“硒或其盐或其衍生物”，是指任意公知的含硒化合物。所述硒可以元素形式和/或作为所有的其它有机或无机硒化物形式存在。在这些化合物中，硒可以是-2，0，+2，+4或+6价的氧化状态。通常，机体通过将较高的氧化状态形式还原成-2价来解毒并且进行甲基化形成二甲硒(dimethyl selenide)。二甲基硒是优选的，且可与其它含硒化合物共同使用。特别是，可将诸如二氧化硒，有机基亚硒酸，硒酸及其盐，尤其是金属硒化物或亚硒酸盐(例如硒化钾，硒化钠，亚硒酸钠，硒化锌，亚硒酸钡，亚硒酸锂，亚硒酸钙和其它金属硒化物或亚硒酸盐)的化合物作为无机硒化物进行使用。此外，还可将例如硒代氨基酸作为硒的有机形式进行使用，该硒代氨基酸例如甲基硒半胱氨酸，甲基亚硒酸，硒甲硫氨酸，硒半胱氨酸。其它有用的有机硒化物的例子有二甲基硒，所有其它的有机硒化物，硒代谷胱甘肽，以及有机硒复合因子3。还可推荐源自诸如富含硒的酵母或花椰菜的天然产物的硒。硒以不同含量广泛天然存在于各种食物中，还可以天然含硫氨基酸中的杂质形式存在，例如，作为化合物硒代甲硫氨酸与甲硫氨酸共存。硒代甲硫氨酸的存在是由于硫和硒的化学行为与反应活性非常类似。所以，在食品级的含硫氨基酸中，通常也含有对应的硒代氨基酸，因而也含有显著量的硒。这些有用的可食用的含硫氨基酸的例子有半胱氨酸，甲硫氨酸，胱氨酸，胱硫醚，二硫化青霉胺半胱氨酸(pencillamine cysteine disulfide)，青霉胺，2-氨基-4，4-二甲基-巯基丁酸，维生素U，brasinine，甲烯胱氨酸(djenkolicacid)，2-氨基-4-异丙基-巯基丁酸，2-氨基-4-丁基-巯基丁酸，2-氨基-4，4-二乙基-巯基丁酸，二苯酰甲烯胱氨酸，甲烯胱氨酸的单盐酸化物，半胱氨酸的盐酸化物，2-氨基-2-乙基-3-巯基-丙酸，2-巯基组氨酸，硫代苹果酸，以及半胱氨酸，同型半胱氨酸，泛酰巯基乙胺，panthethine，辅酶A和磺丙氨酸的盐酸化物。可以使用所有的异构体。因其更易溶解于水，所以通常将含硫氨基酸，蛋白和多肽以盐酸的形式或弱酸盐或弱碱盐的形式使用。有用的天然含硫多肽的例子有谷胱甘肽(谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸的三肽，也称为γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)，半胱氨酰-甘氨酸和γ-半胱氨酰-甲硫氨酰-甘氨酸。有用的含硫蛋白质的例子有角蛋白，胰岛素，白蛋白，核糖核酸酶，丝蛋白，胶原蛋白和弹性蛋白。所有的硬蛋白质(硬蛋白)，包括以上提到的那些硬蛋白都可以作为有用的硒的天然来源。
在此使用的术语“药物可接受的载体”是本领域所属技术人员公知的术语。制备药物组合物的方法和药物载体是本领域内公知的技术，可参见《雷明顿制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，17th版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，USA.。本发明在下文中还提供了对优选制剂更多信息的详细描述(参见实施例1)。
术语“治疗有效量”是指如上所定义产生所需治疗反应，即在具有高乳腺癌/卵巢癌遗传素因的个体，尤其是BRCA1基因突变的携带者中有效地降低乳腺癌/卵巢癌易感性的含硒化合物的量。显然，特定的“治疗有效量”会因诸如患者的生理情况，所采用的特定制剂，和所使用“硒或其盐或其衍生物”的结构的因素变化而变化。特别地，可以推荐，如本发明的方法，以每天50-1000μg的剂量的硒或含有此硒量的适合剂量的含硒化合物对患者进行给药。本发明的化合物可与一或多种其它公知的抗肿瘤和/或防癌剂共同给药。本发明的化合物与所述第二种制剂可以同时给药或顺序给药。
为了体现本发明的意义，通过实施例1-3扩展对本发明的描述。然而，这并不意味着将本发明的权利要求局限于实施例中所描述的实施方案，因为根据本发明所体现出的意义，本领域所属技术人员可以将其与通常可获得的知识结合制备出在所限定的权利要求范围内的其它变化。
实施例1 含硒的组合物基于从药典上获得的信息，本领域所属技术人员可以制备出含有硒，尤其是硒(四价)的组合物的不同变体。例如，可以从诸如甲基半胱氨酸，甲基硒酸，硒代甲硫氨酸，硒代半胱氨酸的有机形式或从诸如二氧化硒，硒酸，H2SeO3或其盐的无机形式选择硒。例如，制备如本发明所述组合物的较有价值的硒(四价)盐是亚硒酸钠。具有较高浓度硒的天然产物，如富含硒的酵母或花椰菜也是非常引人瞩目的化合物。
特别有价值的是，尽管不是唯一的一种，本发明的组合物是硒浓度为0.1-10％重量比的溶液，尤其是等渗溶液。这样的溶液可以通过，例如，以乙醇浓度为10-96％重量比的水溶液，蒸馏水，特别是如果经过缓冲的生理溶液作为溶剂来进行制备。
还已获知50-1000μg硒的每日剂量可达到最适合的药理学效果。根据用于制备所述组合物的硒的生物获取，以及相关化合物和药物载体产生的影响，可对上述数值进行修改。
以下所述为经过选择的，但不是仅有的这些组合物的示例A)亚硒酸钠的乙醇溶液为了制备1000g组合物，将2.03g亚硒酸钠(Na2SeO3)溶解于334.32g H2O。向如上所得的亚硒酸钠水溶液中加入663.65g 96％的乙醇水溶液，然后小心混和所述溶液。通过该方法制备的组合物可用于对患者进行口服补充，每天10滴，2次，剂量相当于每天约300μg的纯硒。还可以推荐将所述组合物分入小瓶中，每个小瓶含有11-12g，因为这可以含盖一个月的药量。所述的组合物是稳定的，如果在4℃存放的话，其形状和活性可以至少保持18个月。患者使用它不会产生副作用。
B)水溶液可以通过用蒸馏水或生理溶液(优选为经过缓冲的)替换配方A中的乙醇来制备基于水剂的组合物。
实施例2 口服硒补充降低了BRCA1携带者中较高的染色体断裂比率受试个体是从波兰什切青的波美拉尼亚医学研究院遗传癌症中心的单个家族癌症门诊部的求诊病人中募集的。由于其乳腺癌或卵巢癌的家族史，女性更愿意来看该门诊。参与本研究的女性之前都已经接受过，或已经同意进行遗传检查。女性患者是从确定为在BRCA1基因中有缺失突变的携带者中募集的。最常见的突变是在5382位插入C的波兰基础突变(Polish founder mutation)(16名携带者)，还有10名女性具有其它的BRCA1突变。对照个体是从这些携带者(患者)的家族成员，且确定为不携带缺失突变的个体中募集的。得到了26对患者-对照配对。在20个病例中，对照是患者的姐妹，在另外6个病案中，对照是更远的亲戚。只有健康的女性被邀请加入本研究；具有乳腺癌，卵巢癌或其它类型癌症既往病史的女性被排除在外。在一年的研究过程中，每一名女性都在某个时候提供了血样。
根据Hsu等人的方法测定了染色体对争光霉素的敏感性(《人类中基因毒性作用的敏感性；环境致癌的可能关系》(Sensitivity to thegenotoxic effects of bleomycin in humans；possible relationship toenvironmental carcinogenesis)，Int J Cancer，1989，43，403-409)。在培养结束前5小时向细胞培养物中加入0.03IU/ml争光霉素(Nippon-Kayuka)。采用常规方法收获细胞并进行吉姆萨(Giemsa)染色。对每个个体读取100个中期的完整的整倍体细胞(染色体重叠的细胞排除在外)。将每种染色单体畸变(不包括断裂)记为一个断点，将每种交换型畸变记为两个断点。记录每个个体每100个细胞中的断点总数。由本研究组中的一个人对编号的片子进行盲读。对20个随机选择的切片，由两位细胞遗传学技术人员以较高的一致程度分别确定其读数。在对100个细胞进行镜检之后计算每个细胞的断裂平均数。使用配对t-检验在26对患者-对照配对中比较染色体断裂的平均水平。
BRCA1突变携带者的每细胞染色体断裂平均数为0.58(0.34-0.73)，对照组为0.39(0.28-0.62)(表1)。在26对组合中，有23例携带者的数值高于其对照，2对中对照的数值较高，有1对的两个数值相等(p＜0.0001；符号检验)。两组的平均值差异极显著(p＜0.0001)。
表1 BRCA1携带者及其配对对照的每细胞染色体断裂的比较
为了研究硒补充剂对染色体断裂频率的影响，从上述门诊部募集了第二组BRCA1携带者。在该研究的这一阶段有35名带有BRCA1突变的女性同意参与研究。在硒补充前采集血样，然后在开始每日硒补充后的1个月至3个月之间再采集一次。在硒补充之前，每细胞诱导的染色体断裂平均数为0.63(0.42-0.81)。为研究个体提供了，每毫升含有690μg纯硒的70％乙醇的形式为亚硒酸钠(Na2SeO3)口服硒溶液。受试个体被要求每天摄入两次0.2ml所述溶液。在开始硒补充后的1个月至3个月之间的某个时间采集一次血样，并且重复争光霉素的实验。在平均1.5月的硒补充之后，每细胞的染色体断裂平均数降低至0.40(0.27-0.60)。在每个病例中，补充后水平都表现出比原始基础水平的下降(表2)，且其平均值差异极显著(p＜10-10)。
表2硒补充前后BRCA1携带者每细胞染色体断裂的比较
综上，口服硒是对携带有BRCA1基因突变的女性进行化学预防的较好候选。
实施例3 为女性BRCA1突变携带者补充硒能显著降低乳腺癌/卵巢癌的易感性我们对30名最初健康、每天口服300μg亚硒酸钠乙醇溶液的BRCA1突变携带者，和30名突变类型与出生年代匹配的BRCA1携带者对照组进行了2年的研究，观察乳腺癌/卵巢癌的发病率。两组的平均年龄为46.5岁。在观察过程中，在补充硒组中诊断出1个乳腺癌病例，而在对照组中则诊断出4个乳腺癌和1个卵巢癌病例。(表3)此外，还分析了以剂量为300μg/天的亚硒酸钠乙醇溶液补充的实验组和对照组的为期1年的新生乳腺癌/卵巢癌的发病情况，实验组由最初未受影响的200名BRCA1携带者组成，对照组由200名突变类型与年龄(平均年龄为38.6岁)匹配的BRCA1携带者组成。在该初步研究中，在补充硒的实验组中观察到了1个乳腺癌和1个腹膜癌(peritoneal caner)病例，而在对照组中则诊断出2个乳腺癌和2个卵巢癌病例。
表3 硒补充后最初健康的BRCA1突变携带者与其配对对照的乳腺癌/卵巢癌的发病情况
权利要求
1.在乳腺癌/卵巢癌的遗传高易感性人群，尤其是BRCA1基因突变的女性携带者中降低乳腺癌/卵巢癌易感性的药物组合物，所述组合物包括治疗有效量的硒，其盐或其衍生物，以及可能的药物可接受的载体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述硒选自其有机形式或无机形式。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述有机形式的硒选自硒半胱氨酸甲酯，甲基亚硒酸，硒甲硫氨酸和硒半胱氨酸的化合物。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述无机形式的硒选自二氧化硒，硒酸(H2SeO3)或其盐。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述硒衍生自天然产物。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述天然产物是诸如花椰菜或富含硒的酵母的植物产物。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述硒是选自亚硒酸钠，亚硒酸钡，亚硒酸锂，亚硒酸钙的四价硒盐。
8.如权利要求7所述的组合物，其中包含所述硒的化合物是亚硒酸钠。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征为等渗溶液。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述硒化物是浓度为0.1-10％重量比的溶液。
11.如权利要求6所述的组合物，其中所述溶剂含有在药物可接受的溶剂中浓度为10-96％重量比的乙醇水溶液。
12.如权利要求6所述的组合物，其中所述溶剂选自蒸馏水，生理溶液，或缓冲的生理盐水。
13.如权利要求1所述的组合物，其含有硒盐乙醇水溶液。
14.在乳腺癌/卵巢癌的遗传高易感性人群中，尤其是在BRCA1基因突变的女性携带者中预防乳腺癌/卵巢癌的方法，该方法包括对个体进行如权利要求1-13中所述的硒或其盐或其衍生物或组合物给药。
15.在乳腺癌/卵巢癌的遗传高易感性人群中，尤其是在BRCA1基因突变的携带者中预防乳腺癌/卵巢癌的方法，该方法包括对个体给药如权利要求1-13中所述的硒或其盐或其衍生物或组合物。
16.如权利要求15所述的方法，该方法包括对所述个体进行每天50-1000μg硒的给药。
17.如权利要求15所述的方法，其中可在测定患者DNA中BRCA1基因的组成型突变后决定进行含硒组合物给药。
全文摘要
本发明涉及硒(或其盐或其衍生物或任意其它含硒化合物)的药物组合物及其特别在BRCA1突变携带者中预防乳腺癌/卵巢癌的使用方法。优选的化合物是硒酸及其盐，硒半胱氨酸甲酯，甲基亚硒酸，硒甲硫氨酸和硒半胱氨酸。
文档编号A61K31/185GK1835740SQ200480023124
公开日2006年9月20日 申请日期2004年8月10日 优先权日2003年8月11日
发明者杨·卢宾斯基, 史蒂文·纳罗德, 斯坦尼斯瓦夫·扎亚茨亚克, 埃尔兹比尔塔·科瓦尔斯卡, 博赫丹·古尔斯基, 托马什·胡扎斯基, 托马什·比尔斯基, 亚采克·格龙瓦尔德, 乔伊塔·胡扎斯卡, 芭芭拉·加夫龙斯卡－什克拉尔兹 申请人:波美拉尼亚医学研究院, 杨·卢宾斯基, 史蒂文·纳罗德, 斯坦尼斯瓦夫·扎亚茨亚克, 埃尔兹比尔塔·科瓦尔斯卡, 博赫丹·古尔斯基, 托马什·胡扎斯基, 托马什·比尔斯基, 亚采克·格龙瓦尔德, 乔伊塔·胡扎斯卡, 芭芭拉·加夫龙斯卡－什克拉尔兹