修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用的制作方法

专利名称：修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了含有减毒或修饰的微生物(microorganism)(包括微生物(microbe)和细胞)的疫苗，及制备所述微生物和疫苗的方法。特别地，本发明提供了修饰的细菌、真核细胞和病毒及其用于治疗增生性和炎症疾病和用于在肿瘤中产生产物的方法。
背景在19世纪后期，进行了用微生物治疗癌症患者的许多尝试。一名外科医生，William Coley，给予肿瘤患者活的化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)取得有限的成就。在20世纪早期，科学家们证明了痘苗病毒(vaccinia virus)在小鼠中的溶癌作用(oncolysis)，导致在1940-1960年间给予肿瘤患者一些活的病毒。这些癌症治疗尝试未获得成功。
自此以后，对于进行癌症治疗测试了许多遗传工程化的病毒。例如在一项研究中为携带非转移性结肠腺癌的裸鼠全身性注射修饰的痘苗病毒WR株，所述修饰是具有痘苗生长因子缺失及插入胸苷激酶基因座中的增强的绿色荧光蛋白。观测到尽管在修饰的病毒中缺少外源治疗基因，但所述病毒具有抗肿瘤作用，包括一种完全应答(McCartet al.(2001)Cancer Res 18751-8757)。在另一项研究中，将痘苗黑素瘤癌溶物(VMO)注射至临床III期试验的黑素瘤患者的接近黑素瘤阳性淋巴结的部位。作为对照，将痘苗病毒(VV)纽约市卫生局毒株(NewYork City Board of Health strain)给予黑素瘤患者。用VMO处理的黑素瘤患者存活率好于未处理的患者，但与VV对照处理的患者相似(Kim et al.(2001)Surgical Oncol 1053-59)。
其他研究证明了这种方案的有限的成就。这种治疗不完全是有效的，特别是对于全身性输送的病毒或细菌而言。对微生物载体在体内起作用加以控制的限制导致无效的治疗结果以及产生安全问题。希望可以改善这种类型的治疗或开发更有效的方法以治疗肿瘤疾病。因此，本发明一个目的是提供治疗肿瘤及其他疾病的治疗方法和微生物。
概述本发明提供了用于治疗肿瘤疾病及其他疾病的治疗方法和微生物，包括病毒、细菌和真核细胞。所治疗的疾病是其中靶组织和/或细胞是免疫豁免的(immunoprivileged)的疾病，所述靶组织和/或细胞以及通常其局部环境在一定程度上能逃脱免疫系统或者难以接近免疫系统。这种组织包括肿瘤及参与其他增生性病变、创伤的其他组织和细胞及参与炎症应答的其他组织。微生物(包括细菌细胞、病毒和哺乳动物细胞)被选择或设计为非致病性的及优先在免疫豁免组织中积聚。所述微生物一旦积聚在所述组织或细胞或其附近则影响这种组织中细胞的细胞膜，从而使其变得渗漏(leaky)或溶解，但足够缓慢以便靶向的细胞和肿瘤在足够长的时间漏出足够的抗原或其他蛋白质以激发免疫应答。
所述微生物通过任何途径给予，包括全身性给予，如静脉内给予或者使用经口或经鼻或其他将活性物质给予至淋巴器官的输送系统。在示例性的方法中，所述微生物用于治疗肿瘤并预防复发和转移散播。示例性微生物包括高度减毒的病毒和细菌以及哺乳动物细胞。所述微生物任选地修饰为输送其他产物至靶向的组织，包括输送治疗产物。
当所述微生物被给予含有肿瘤的宿主时，宿主中的肿瘤基本上成为抗原和蛋白质的工厂。对此可以加以利用以便所述肿瘤可用于生产由所述微生物编码或产生的蛋白质或其他细胞产物。另外，可以收获所述宿主血清以分离由所述微生物以及肿瘤细胞产生的产物的抗体。因此本发明还提供了通过给予动物(通常为非人动物)所述微生物以产生基因产物，并收获所述肿瘤以分离所述产物的方法。本发明还提供了产生抗选择的蛋白质或细胞产物(如代谢物或中间体)的抗体的方法，其通过给予宿主(典型为非人宿主)表达或产生所述蛋白质或其他产物的微生物，并从宿主中收获血清及分离特异结合所述蛋白质或其他产物的抗体而进行。
本发明因此提供了消除免疫豁免细胞或组织、特别是肿瘤的方法和微生物。所述方法包括给予(典型为全身性给予)一种微生物，所述微生物优先积聚在免疫豁免细胞如肿瘤细胞中，导致蛋白质和其他化合物如肿瘤抗原漏出，导致宿主针对非宿主蛋白质如肿瘤抗原的免疫，从而通过宿主的免疫系统消除免疫豁免细胞如肿瘤细胞。所述微生物不是根据其迅速溶解细胞的能力进行选择，而是根据其在免疫豁免细胞如肿瘤中积聚、引起抗原以足够量漏出一段足够长的时间以激发免疫应答的能力而选择。
因此本发明提供了含有异源DNA、多肽或RNA的微生物或细胞在诱导生物体针对肿瘤的自身免疫中的应用。特别地，选择或设计微生物使其在肿瘤中积聚，而在非肿瘤细胞、组织或器官中几乎不积聚(对所述宿主无毒性)，并且以某种方式导致肿瘤细胞溶解或者细胞膜破坏，由此肿瘤抗原漏出。这种微生物例如是LIVP-衍生的痘苗病毒及本文描述的细菌以及被修饰为靶向肿瘤并破坏细胞膜的哺乳动物细胞。所述微生物可以被修饰为表达介导或增加肿瘤细胞抗原漏出和/或是治疗性的异源产物，如抗肿瘤化合物。
本发明还提供了通过如下步骤产生针对肿瘤的抗体的方法(a)将含有编码所希望的多肽或RNA的DNA序列的微生物或细胞注入携带肿瘤的生物体中，(b)分离针对所述肿瘤的抗体。
本发明提供了减毒的微生物，其在免疫豁免组织和细胞如肿瘤细胞中积聚，但在非靶向器官和组织中不积聚至毒性水平，并且当被给予携带所述免疫豁免组织和细胞的动物时，引起自身免疫，如通过所述免疫豁免细胞或其产物的抗肿瘤(或者抗肿瘤抗原)抗体的产生而引起。选择或产生所述微生物以使得所述免疫豁免细胞渗漏，如通过缓慢溶解或细胞凋亡过程而使得渗漏。本发明的目标是达到这种渗漏，而不是迅速溶解细胞而使得宿主不能发动免疫应答。
本发明提供了所述微生物在消除免疫豁免中的应用及应用方法。所述微生物任选地包括报道基因和/或其他异源核酸，所述异源核酸破坏微生物中的基因并且还可以编码并提供治疗性产物如RNA，包括RNAi，所述产物改变所述微生物所积聚其中的细胞或组织中基因和/或蛋白质表达。本发明提供的病毒是减毒的痘病毒，其含有修饰的TK和HA基因及修饰的F3基因或相应于痘苗中F3基因的基因座。特别地，本发明提供了重组痘苗病毒，其含有修饰的TK和HA基因及任选地含有修饰的F3基因或基因座，其中所得病毒在非靶向器官中不积聚至毒性水平。本发明提供了其中TK基因和F3基因被修饰的痘苗病毒及其中HA和F3基因被修饰的痘苗病毒以及其中所有这三个基因均被修饰的病毒。修饰包括通过插入、缺失或置换一或多个核苷酸碱基而导致的失活，从而病毒的活性或产物被改变。所包括的改变是插入异源核酸，如编码治疗性蛋白质的核酸。
在示例性的实施方案中，所述痘苗病毒是Lister毒株病毒，特别是LIVP毒株病毒(LIVP是指来自俄罗斯莫斯科Institute of ViralPreparations的Lister病毒，这是这种目前广泛散布的毒株的起源)。修饰包括在称为F3的基因座中唯一的NotI位点对病毒进行修饰。特别地，所述修饰是在痘苗病毒LIVP毒株DNA的F3基因的第35位或者在HindIII-F片段内的第1475位。
所述异源核酸可包括与编码所述蛋白质的核酸可操纵地连接的调节序列。调节序列包括启动子，如痘苗病毒早期/晚期启动子p7.5及早期/晚期痘苗pE/L启动子。微生物中的异源核酸可以编码一种可检测的蛋白质或者一种能诱导可检测信号的产物。包含可检测的蛋白质或者可以产生可检测信号的产物使得可以监测所给予的微生物的分布以及监测治疗效力，因为当免疫豁免细胞被消除时所述微生物也被消除。
本发明提供了含有重组病毒(如本发明例证的三重突变的痘苗病毒)的宿主细胞。本发明还涉及含有本发明提供的或者本发明的方法中使用的任何微生物的肿瘤细胞。
本发明提供了用于本发明方法中的药物组合物，所述药物组合物含有处于药物可接受的载体中的微生物。所述药物组合物可以针对任何给药模式进行配制，所述给药模式包括但非限于全身性给药，如静脉内给药。所述组合物可含有输送载体，如基于脂质的载体，包括与所述微生物缔合的脂质体和微团。
本发明还提供了消除动物体内免疫豁免细胞如肿瘤细胞的方法(及所述微生物的应用)，所述方法是将所述药物组合物给予动物，从而所述病毒积聚在免疫豁免细胞内，由此介导自身免疫，导致所述细胞消除或数目减少。
本发明提供了消除动物体内免疫豁免细胞或组织的治疗方法，所述方法是给予动物一种微生物，其中所述微生物在免疫豁免细胞内积聚，但在未受影响的器官和组织中不积聚，并且在该动物中具有低毒性，所述微生物导致免疫豁免细胞中细胞膜渗漏，从而所述动物产生针对所述细胞或所述细胞产物的自身抗体。这些方法包括肿瘤治疗、炎症病变包括创伤及增生性疾病包括牛皮癣、癌症、糖尿病视网膜病变、再狭窄及其他病变的治疗。希望的是所述微生物不积聚在未受影响的器官内，特别是不积聚在卵巢或睾丸内。
所述微生物是减毒的细菌、减毒的病毒和哺乳动物细胞，如痘病毒(pox virus)及其他胞质病毒，细菌如弧菌(vibrio)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(salmonella)、链球菌(streptococcus)和李斯特氏菌(listeria)，及哺乳动物细胞如免疫细胞，包括B细胞和淋巴细胞，如TIL细胞，及干细胞。
重组痘苗病毒的方法如下(a)产生(i)含有插入在限制位点x的修饰的F3基因的痘苗病毒穿梭质粒及(ii)去磷酸化的在一限制位点消化的wt VV(VGL)DNA；(b)用步骤a的构建体(i)和(ii)的混合物转染被补骨脂素-UV(PUV)-失活的辅助病毒VV(VGL)感染的宿主细胞；(c)从转染子中分离所述重组痘苗病毒。宿主细胞包括CV-1细胞。
本发明还提供了产生多肽或RNA或化合物如细胞产物的方法及由此的微生物的应用。这些方法可包括如下步骤(a)给予携带肿瘤的动物一种含有编码所述多肽或RNA的核酸或产生所述产物化合物的微生物，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚，但在不包含免疫豁免细胞或组织的器官和组织中不积聚至毒性水平；(b)从所述动物中收集肿瘤组织；(c)从所述肿瘤中分离所述多肽或RNA或化合物。
如上所述，所述微生物包括真核细胞、原核细胞和病毒，如胞质病毒或减毒的细菌或干细胞或免疫细胞。所述细菌可以选自减毒的弧菌、大肠杆菌、李斯特氏菌、沙门氏菌和链球菌菌株。所述微生物可表达或产生可检测的产物，如荧光蛋白(即绿色、红色和蓝色荧光蛋白及其修饰的变体)，和/或萤光素酶，当其与Lucifer接触时产生光，并且还可以编码另外的产物如治疗性产物。在本发明提供的方法和应用中，所述动物可以是非人动物或者可以包括人。
本发明还提供了同时产生多肽、RNA分子或细胞化合物，和与所述多肽、RNA分子或化合物特异性反应的抗体的方法，通过如下方法进行a)给予携带肿瘤的动物一种微生物，其中所述微生物表达或产生所述化合物、多肽或RNA分子；b)从所述动物血清中分离所述抗体。所述方法在步骤a)后任选地包括从所述动物中收集肿瘤组织；以及从所述肿瘤组织中分离所述多肽、RNA分子或细胞化合物。
本发明还提供了消除动物中免疫豁免细胞或组织如肿瘤细胞的方法，及通过给予至少两种微生物而施行的所述微生物的应用，其中所述微生物是同时、相继或间隔给予的，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚，从而所述动物针对所述免疫豁免细胞或组织自身免疫。
本发明提供了至少两种微生物在配制消除免疫豁免细胞或组织的药物中的应用，其中它们在所述免疫豁免细胞中积聚，从而所述动物针对所述免疫豁免细胞或组织自身免疫。本发明提供了配制用于给予动物以消除免疫豁免细胞或组织的含有至少两种微生物的组合物。本发明提供了含有包装的组合及任选地附有给药说明书及其他试剂的试剂盒。
本发明提供了编码异源核酸的微生物在诱导针对免疫豁免细胞产生的产物的自身免疫中的应用，其中当被给予时，所述微生物在免疫豁免组织中积聚，但在其他组织或器官内不积聚或者积聚水平足够低从而对含有所述免疫豁免组织的动物是无毒性的。
本发明提供了产生针对在免疫豁免组织或细胞中产生的产物的抗体的方法，包括(a)将一种含有编码选择的蛋白质或RNA的核酸的微生物给予含有所述免疫豁免组织或细胞的动物，(b)从所述动物的血液或血清中分离针对所述蛋白质或RNA的抗体。
本发明还提供了抑制对象中免疫豁免细胞或组织生长的方法，包括(a)给予对象一种修饰的微生物，其中所述修饰的微生物编码可检测的基因产物；(b)监测对象中可检测的基因产物的存在情况，直至所述可检测的基因产物基本上仅存在于对象的免疫豁免组织或细胞中；(c)给予对象一种治疗性化合物，该化合物与所述微生物联合起作用以抑制所述免疫豁免细胞或组织的生长；或者所述方法包括(a)给予对象一种编码可检测的基因产物的修饰的微生物；(b)给予对象一种降低所述微生物的致病性的治疗性物质；(c)监测对象中所述可检测的基因产物的存在情况，直至所述可检测的基因产物基本上仅存在于对象的免疫豁免组织或细胞中；(d)停止或暂停给予所述治疗性化合物，从而所述微生物致病性增加及在免疫豁免细胞或组织中的生长被抑制。
附图简述

图1A所用的重组痘苗病毒RVGL8的示意图。重组痘苗病毒RVGL8通过实施例1所述的体内重组方法构建。将用NotI消化的野生型痘苗病毒DNA与未消化的质粒DNA pNZ2的复合物转染进PUV-VV感染的细胞中以在体内重组。VGL野生型痘苗病毒(Lister毒株，ATCC VR-1549)；RVGL8在NotI位点中编码lacZ基因的重组痘苗病毒；NotL和NotR痘苗病毒基因组中唯一的NotI限制位点的左侧和右侧节段；pE/L合成的早期/晚期痘苗病毒启动子；p7.5早期/晚期痘苗病毒启动子；lacZ大肠杆菌的1acZ基因。
图1B实施例中描述的各种痘苗病毒株的示意图。获得病毒的结果在实施例中描述。
图2示出了在肿瘤中生产产物如核酸分子、蛋白质和代谢化合物或者其他细胞产物的方法的流程图。
发明详述A.定义B.用于肿瘤特异性疗法的微生物1.特征a.减毒的i.降低的毒性ii.在肿瘤中积聚，在其他器官中基本不积聚
iii.激发或增强对肿瘤细胞免疫应答的能力iv.致病性与肿瘤抗原的释放之间的平衡b.免疫原性c.复制能力d.遗传变体i.修饰的特征ii.外源基因表达iii.可检测的基因产物iv.治疗性基因产物v.表达一种超抗原vi.表达待收获的一种基因产物2.病毒a.胞质病毒i.痘病毒a.痘苗病毒b.修饰的痘苗病毒c.F3基因d.多重修饰e.Lister毒株ii.其他胞质病毒b.腺病毒、疱疹病毒、反转录病毒3.细菌a.需氧菌b.厌氧菌4.真核细胞C.制造减毒微生物的方法1.遗传修饰
2.筛选上述特征3.在人体中产生这种微生物的方法D.治疗方法1.给予a.给予所述微生物之前的步骤b.给予模式c.剂量d.给予次数e.共同给予i.给予多种微生物ii.治疗性化合物f.对象状态2.监测a.监测微生物基因表达b.监测肿瘤大小c.监测抗体效价d.监测一般健康诊断e.监测协同治疗E.产生基因产物和抗体的方法1.重组蛋白质和RNA分子的产生2.抗体的产生F.药物组合物、组合和试剂盒1.药物组合物2.宿主细胞3.组合4.试剂盒G.实施例
A.定义除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常已知的含义。贯穿本公开全文的所有专利、专利申请书、公布的申请书和出版物、网址及其他公布的材料除非特别说明则均以其全文并入参考。在本文所用术语具有多种解释的情况中，以本章节所述为准。当指出参考URL或其他类似标识或网址时，应理解这些标识可以改变，并且互联网上的特定信息可以随时添加或删除，但是等同的信息是已知的并且可以很容易地得到，例如通过查询互联网和/或适当的数据库得到。关于这些的参考表明了这些信息是可用的并且是在公众中广为人知的。
如本文所用，微生物(microorganism)是指分离的细胞或病毒，包括真核细胞如哺乳动物细胞、病毒和细菌。所述微生物是根据其在肿瘤及其他免疫豁免细胞和组织中积聚而在其他组织或器官中最低程度积聚的能力而修饰或选择的。积聚通过对所述微生物的特殊性状的选择或修饰或者通过适当选择细胞而发生。所述微生物可进一步加以修饰以改变其性状和/或输送基因产物。本发明提供的微生物是相对于野生型而典型修饰的，以呈现一或多种特性如降低的致病性、降低的毒性、相对于正常器官和组织而优先积聚在肿瘤中、增加的免疫原性、增加的激发或增强对肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的溶解或杀死肿瘤细胞的能力、降低的溶解或杀死肿瘤细胞的能力。
如本文所用，免疫豁免(immunoprivileged)细胞和组织是指与免疫系统隔离的细胞和组织，如实体瘤和创伤组织。通常给予一种微生物会激发清除所述微生物的免疫应答，然而免疫豁免部位被遮蔽或者与免疫系统隔离，使得所述微生物存活并通常复制。免疫豁免的组织包括炎症组织如创伤组织，及增生的组织如肿瘤组织。
如本文所用，“修饰的(modifed)”基因是指缺失的基因，或者编码具有一或多个截短、突变、插入或缺失的基因产物的基因，典型地具有至少一种改变，通常丧失部分功能。
如本文所用，F3基因是指病毒如痘苗病毒中的一个基因或基因座，其相应于痘苗病毒LIVP毒株的F3基因。这包括编码基本上具有相同或至少相关生物学功能的基因产物的任何痘苗病毒株或痘病毒的F3基因或基因组中的基因座。本文涵盖的F3基因与SEQ IDNo1所示全长核苷酸序列典型具有至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约93％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、或至少大约99％相同性。本文涵盖的F3基因编码的蛋白质与SEQ ID No2所示全长氨基酸序列典型具有至少大约50％、至少大约60％、至少大约65％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约93％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、或者至少大约99％相同性。本发明还包括其他病毒中的相应基因座，当其被修饰或消除时导致毒性降低和/或在肿瘤中积聚增强(与非肿瘤细胞、组织和器官相对比)。与LIVP中F3基因相等同的其他病毒中的相应基因座可以通过病毒基因组中基因的结构定位确定LIVP F3基因位于痘苗病毒的HindIII-F片段上，在开放读框F14L和F15L之间，由Goebel et al.，Virology(1990)179247-266阐明，并且与ORFs F14L和F15L的方向相反；因此本发明包括其他病毒如痘病毒包括正痘病毒(orthopoxvirus)中的相应基因座。
如本文所用，减弱(attenuate)微生物的毒性是指在给予所述微生物时与给予未减毒的微生物相比降低或消除对宿主的有害或毒性作用。
如本文所用，具有低毒性的微生物是指在给予微生物的基础上，所述微生物在宿主的器官和组织中不积聚至导致器官损害或伤害的程度或者对宿主存活的影响高于所治疗的疾病对宿主存活的影响的程度。
如本文所用，对象(subject)(或生物体(organism))是指一种动物，包括人。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但非限于灵长类动物，包括人、猩猩和猴子；啮齿类动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；及其他动物包括猪、马、猫、狗和兔。非人动物排除人作为所包括的动物。
如本文所用，微生物在靶组织中的积聚(accumulation)是指所述微生物在足以感染宿主器官或组织的时间之后遍及生物体的分布。本领域技术人员意识到感染微生物的时间将根据所述微生物、靶器官或组织、宿主的免疫力及剂量而变化。一般地，积聚可以在微生物感染后大约1天至大约1周期间确定。为此，所述微生物优先积聚在靶组织如肿瘤中，但被从宿主的其他组织和器官中清除至所述微生物毒性轻微或者可耐受程度，至多是不致命的。
如本文所用，优先积聚(preferential accumulation)是指微生物以高于在第二部位的积聚水平积聚在第一部位。因此，相对于正常组织或器官而优先积聚在免疫豁免组织如肿瘤中的所述微生物是指以高于在正常组织或器官中积聚的水平积聚在免疫豁免组织如肿瘤中的微生物。
如本文所用，在肿瘤或其他免疫豁免部位产生的“化合物”是指在肿瘤中由于存在导入的微生物而产生的任何化合物，所述微生物一般是表达一或多个基因的重组微生物。例如，在肿瘤中产生的化合物可以是例如代谢物、编码的多肽或RNA，或者由重组多肽(例如酶)和肿瘤或免疫豁免组织或细胞的细胞系统产生的化合物。
如本文所用，用于给予的输送载体是指基于脂质或其他聚合物的组合物，如脂质体、微团或反向微团，其与活性物质如本发明提供的微生物缔合以输送至宿主动物中。
如本文所用，术语“病毒载体”是根据其在本领域公认的含义应用的。该术语是指一种核酸载体构建体，包括至少一个病毒起源元件并且可以包装进入病毒载体颗粒中。所述病毒载体颗粒可用于将DNA、RNA或其他核酸在体外或体内转移进入细胞中。病毒载体包括但非限于反转录病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(例如HSV)、杆状病毒载体、巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒(SV40)载体、萨姆利基森林(semliki forest)病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体及腺伴随病毒(AAV)载体。
如本文所用，溶瘤病毒(oncolytic viruses)是指在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。
如本文所用，“疾病或病变”是指生物体由于例如感染或遗传缺陷所致的病理状况，特征在于可确认的症状。
如本文所用，瘤(neoplasm)(瘤形成(neoplasia))是指异常的新的生长，并因此与肿瘤(tumor)含义相同，可以是良性或恶性的。与增生不同，瘤形成性增生甚至在没有原始刺激的情况中也持续。
如本文所用，肿瘤疾病是指包含癌症的任何疾病，包括肿瘤发育、生长、转移和进展。
如本文所用，癌症是由于或者特征在于任何类型恶性肿瘤的疾病的总称。
如本文所用，恶性肿瘤是指具有转移能力及失去生长控制和位置控制的原发肿瘤。
如本文所用，转移是指疾病进程相关的异常或致瘤性细胞远离原发部位的生长。
如本文所用，抗癌剂或化合物(与“抗肿瘤或抗肿瘤发生剂”可互换应用)是指抗癌治疗中使用的任何活性物质或化合物。当单独或与其他化合物组合使用时，这些包括可减轻、降低、改善、预防或处于或保持消除与肿瘤疾病、肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标记的状态，并可用于本发明提供的方法、组合和组合物中的任何活性物质。抗肿瘤发生的活性物质例如包括本发明提供的微生物，单独使用或组合使用和/或与其他活性物质组合使用，如与烷化剂、抗代谢物、某些天然产物、铂配位络合物、蒽醌(anthracenediones)、取代的脲、甲基肼(methylhydrazine)衍生物、肾上腺皮质抑制剂、某些激素、拮抗剂和抗癌多糖。
一般地，为实践本发明的方法及当使用本发明提供的微生物时，原始的肿瘤不被切除，而是用于积聚给予的微生物，并当细胞变得渗漏或溶解时成为抗原或其他产物因子。所述抗原可用于激发宿主中的免疫应答。所述抗原和产物可自肿瘤中分离。
如本文所用，血管发生是指涵盖了直接或间接参与新血管建立和维持(新血管形成)的总体过程，包括但非限于与肿瘤相关的新血管形成及与创伤相关的新血管形成。
如本文所用，同源性是指大约高于25％的核酸序列相同性，如25％、40％、60％、70％、80％、90％或95％。如果需要，可以指定同源性百分比。术语“同源性”和“相同性”通常可互换应用，但是蛋白质的同源性可包括保守氨基酸改变。一般地，对序列(蛋白质或核酸)加以排列以便获得最高等级的匹配(见例如ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAM JApplied Math 481073)。通过序列相同性，相同的氨基酸数目通过标准排列对比算法程序及使用每个供应商制定的默认缺口罚分(gappenalty)而确定。基本同源的核酸分子典型地在中等严格或高度严格条件下与感兴趣的核酸的全长序列或者至少大约70％、80％或90％的序列杂交。本发明还提供了含有代替杂交核酸分子中密码子的简并密码子的核酸分子。(对于蛋白质，为确定同源，可以排列保守氨基酸以及相同的氨基酸；在这种情况中相同性百分比和同源性百分比是不同的)。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列“相同性”，可以使用已知计算机算法如FASTA程序使用例如默认参数确定，如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444所述(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J Molec Biol 215403(1990))；Guide to Huge Computers，Mrtin J.Bishop，ed.，AcademicPress，San Diego，1994，及Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math481073)。例如National Center for Biotechnology Information数据库的BLAST可用于确定相同性。其他可商购或公开获得的程序包括DNAStar″MegAlign″程序(Madison，WI)及University of WisconsinGenetics Computer Group(UWG)″Gap″程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如使用GAP计算机程序通过对比序列信息而确定(例如Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48443，由Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2482修订)。
简而言之，GAP程序将相似性限定为相似的排列符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列较短一个中的符号总数。GAP程序的默认参数可包括(1)一元对比矩阵(unary comparison matrix)(含有对于相同性数值为1及对于非相同性数值为0)及Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.146745的加权的对比矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，NationalBiomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)中所描述的；(2)对于每个缺口罚分为3.0，以及对于每一个缺口中的每一个符号附加0.10的罚分；(3)对于末端缺口无罚分。因此，如本文所用，术语“相同性”代表测试多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的对比。
如本文所用，相应于公开的序列中氨基酸的多肽的氨基酸(如序列表中所示的氨基酸)的叙述是指根据使用标准对比算法如GAP算法在所述多肽与公开的序列最大相同性或同源性对比基础上鉴别的氨基酸(其中对比了保守氨基酸)。
如本文所用，术语“至少90％相同”是指相对于参考多肽从90％至100％的相同性百分比。90％或更高水平的相同性是指假定为了示例目的，对比长度为100个氨基酸的测试和参考多核苷酸，测试多肽中不超过10％(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。可以在测试和参考多核苷酸之间进行相似对比。这种差异可以解释为在全长氨基酸序列中随机分布的点突变，或者它们可以以各种长度簇集在一或多个位置，所述长度可以直至最大许可，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异限定为核酸或氨基酸的取代、插入或缺失。在高于大约85-90％的同源或相同性水平，结果应不依赖于程序和缺口参数系列；这种高水平的相同性通常可不依赖于软件而可易于确定。
如本文所用，引物是指含有两或多个典型地超过三个脱氧核糖核酸或核糖核酸的寡核苷酸，从中可以起始引物延伸产物的合成。有益于合成的条件例如包括存在三磷酸核苷及用于聚合和延伸的活性物质，如DNA聚合酶，及合适的缓冲液、温度和pH。
如本文所用，化学发光是指一种化学反应，其中能量被特异性导向分子，导致其变为电子激发态并随后释放光子，从而发出可见光。温度对这种能量导向无作用。因此，化学发光包含化学能直接转变为光能。
如本文所用，发光是指可检测的EM射线，一般是当释能的化学过程的激发态产物伴随光发射而恢复其基态时产生的UV、IR或可见的EM射线。化学发光是得自化学反应的发光。生物发光是得自使用生物分子(或者其合成形式或类似物)作为底物和/或酶的化学反应的化学发光。
如本文所用，生物发光是化学发光的一种类型，是指由生物分子特别是蛋白质发射光。生物发光的基本条件是在一种加氧酶——萤光素酶存在的情况下存在结合的或游离的分子氧，所述萤光素酶作用于底物——萤光素。生物发光是由酶或是一种加氧酶的其他蛋白质(萤光素酶)产生的，所述加氧酶在存在分子氧的情况中作用于底物萤光素(一种生物发光底物)，并将底物转化为激发态，当恢复至较低能量水平时以光的形式释放能量。
如本文所用，生物发光的底物和酶一般分别是指萤光素和萤光素酶。当对于特殊物种提及时，为清楚起见，每个一般性术语与其衍生自其中的生物的名称一起使用，例如细菌萤光素或萤火虫萤光素酶。
如本文所用，萤光素酶是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌萤光素酶催化黄素单核苷酸(FMN)和脂族醛的氧化，这个反应产生光。在海洋节肢动物中发现的另一类萤光素酶催化海萤(Cypridina)(Vargula)萤光素的氧化，另一类萤光素酶催化鞘翅目昆虫(Coleoptera)萤光素的氧化。
因此，萤光素酶是指催化生物发光反应(产生生物发光的反应)的一种酶或发光蛋白。萤光素酶如萤火虫和角尖水蚤(Gaussia)及海肾(Renilla)萤光素酶是在产生生物发光反应期间起催化作用并且无变化的酶。萤光素酶发光蛋白如萤光素非共价结合的水母发光蛋白在产生生物发光反应期间被改变，如通过萤光素的释放而改变。萤光素酶是一种在生物体中天然发生的蛋白质或其变体或突变体，所述变体或突变体例如是通过诱变产生的具有一或多种与天然发生的蛋白质不同的性质如热稳定性的变体。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式为本领域所熟知。对于本发明的目的，提及的萤光素酶是指发光蛋白或萤光素酶。
因此，例如“海肾萤光素酶”是指分离自海肾属成员的一种酶或者得自任何其他来源如另一种相关桡足类动物或者合成制备的一种等价分子。其涵盖具有保守氨基酸取代而基本不改变活性的海肾萤光素酶。本领域技术人员已知合适的保守氨基酸取代，通常不改变所得分子的生物学活性而产生。本领域技术人员意识到通常在多肽的非必要区域中的单一氨基酸取代基本不改变生物学活性(见例如Watsonet al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
如本文所用，“水母(Aequora)GFP”是指水母(Aequora)属及其突变体或变体的GFP。这种变体和其他物种的GFP为本领域技术人员所熟知并可获得。这个术语涵盖了具有基本上不改变活性和物理性质(如发射光谱和改变生物发光产生系统的光谱输出能力)的保守氨基酸取代的GFP。所述萤光素酶和萤光素及其激活物是指产生生物发光的试剂或成分。典型地，这些试剂的一个亚集合会被提供或者根据生产说明而被组合。生物发光基于将所述组合与剩余试剂接触而产生。因此，如本文所用，所述萤光素酶、萤光素及其他因子成分如O2、Mg2+、Ca2+也称作生物发光产生试剂(或活性物质或成分)。
如本文所用，生物发光底物是指在存在萤光素酶及任何必需的激活物的情况中被氧化并产生光的化合物。这些底物在本文中是指例如萤光素，是在生物发光反应中经历氧化的底物。这些生物发光底物包括任何萤光素或其类似物或者萤光素酶与之相互作用产生光的任何合成的化合物。典型的底物包括在产生光的反应中在存在萤光素酶或蛋白质的情况中被氧化的那些底物。生物发光底物因此包括本领域公认为萤光素的那些化合物。萤光素例如包括萤火虫萤光素、海萤(Cypridina，也称作Vargula)萤光素(腔肠素(coelenterazine))、细菌萤光素，以及这些底物的合成类似物或者在产生生物发光的反应中在存在萤光素酶的情况中被氧化的其他化合物。
如本文所用，能转变为生物发光底物是指易受化学反应如氧化或还原反应影响而产生生物发光底物。例如，生物发光细菌的发光反应包含黄素单核苷酸基团(FMN)通过黄素还原酶还原为还原的黄素单核苷酸(FMNH2)的反应。还原的黄素单核苷酸(底物)然后与氧(激活物)和细菌萤光素酶反应，形成一种中间状态的过氧化黄素，其在存在长链醛的条件下经历进一步反应产生光。对于这个反应，还原的黄素和长链醛是底物。
如本文所用，生物发光产生系统是指进行生物发光反应所需要的一系列试剂。因此，完成生物发光反应需要的特异性萤光素酶、萤光素及其他底物、溶剂及其他试剂组成生物发光系统。因此，生物发光产生系统是指在合适的反应条件下产生生物光的任何系列试剂。适当的反应条件是指发生生物发光反应必需的条件，如pH、盐浓度及温度。通常地，生物发光系统包括生物发光底物、萤光素、萤光素酶(包括萤光素酶及发光蛋白)，及一或多种激活物。特定的生物发光系统可参考衍生萤光素酶的特异生物体而鉴别，例如海肾生物发光系统包括海肾萤光素酶，如分离自海肾或者使用重组方式或者对这些萤光素酶进行修饰产生的萤光素酶。这个系统还包括完成生物发光反应必需的特定激活物，如氧和在存在氧的条件下萤光素酶与之反应产生光的底物。
如本文所用，荧光蛋白是指具有发出荧光能力的蛋白质(即在一个波长吸收能量并在另一个波长发射能量)。例如，绿色荧光蛋白是指发射光谱峰值为大约510nm的一种多肽。
如本文所用，遗传疗法或基因疗法包括将异源核酸如DNA转移至患有尝试进行这种治疗的疾病或病变的哺乳动物特别是人的某些细胞(靶细胞)中。将所述核酸如DNA以一定的方式直接或者处于载体或其他输送载体中导入选择的靶细胞中，所述方式使得异源核酸如DNA表达并由此产生其编码的治疗性产物。或者所述异源核酸如DNA可以一些方式介导编码治疗性产物的DNA的表达，或者其可以编码一种以某种方式直接或间接介导治疗性产物的表达的产物如肽或RNA。遗传疗法也可以用于输送编码一种基因产物的核酸，所述基因产物代替缺陷的基因或者补充由其被导入的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码一种治疗性化合物，如其生长因子抑制剂或者肿瘤坏死因子或其抑制剂如其受体，所述治疗性化合物在哺乳动物宿主中通常不产生或者不以治疗有效量或在治疗有效时间产生。编码治疗性产物的异源核酸如DNA可以加以修饰之后再导入患病宿主的细胞中以增强或另外改变其产物或表达。遗传疗法还可包含输送基因表达的抑制剂或阻抑剂或其他调节剂。
如本文所用，异源核酸是这样的核酸，其不是在体内由表达其的微生物产生的，或者是由微生物产生的，但处于不同的基因座或者不同表达，或者其介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调节的生物化学过程而改变内源核酸如DNA表达的调节物。异源核酸通常不是其导入的细胞内源的，但是得自另外的细胞或合成制备。然而，异源核酸可以是内源的，但是是从不同基因座表达的核酸或者其表达或序列被改变。通常地，尽管不是必要的，这种核酸编码不是由所述细胞通常产生的RNA和蛋白质或者不是以同样方式在所述细胞中表达。异源核酸如DNA也可以称作外源核酸如DNA。因此，异源核酸或外源核酸包括不以基因组中发现的其对应核酸分子如DNA的正确方向或位置存在的核酸分子。其也可以指来自另外的生物体或物种的核酸分子(即外源的)。本领域技术人员公认或认为对于表达所述核酸的细胞是异源或外源的任何核酸如DNA在此认为是异源核酸；异源核酸包括也是内源表达的外源加入的核酸。异源核酸例如包括但非限于编码授予药物抗性的可追踪的标记蛋白的核酸、编码治疗有效物质如抗癌剂、酶和激素的核酸、及编码其他类型蛋白质如抗体的核酸如DNA。由异源核酸编码的抗体可以在被导入异源核酸的细胞的表面分泌或表达。
如本文所用，基因疗法的治疗有效产物是由异源核酸(典型为DNA)编码的一种产物(或RNA产物如dsRNA、RNAi，包括siRNA)，在核酸导入宿主的基础上，该产物被表达，由此改善或消除症状、遗传或获得性疾病的表现，或者治愈疾病。还包括生物学活性核酸分子，如RNAi和反义核酸。
如本文所用，癌症或肿瘤治疗或活性物质是指任何治疗方案和/或化合物，当单独使用或与其他治疗或化合物组合使用时可减轻、减少、改善、预防或处于或保持与不足的血管发生相关的临床症状或诊断标记的消除状态。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当对于任选地是如用可检测的标记如萤光或放射标记物标记的探针或引物而言时，本发明提供了单链分子。这种分子的长度典型为对于探查或引发文库，其靶位在统计学上是唯一的或低拷贝数的(典型少于5个，一般少于3个)。通常探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续的核苷酸。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，异源核酸与核苷酸的调节和效应序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点及其他信号序列的可操纵地连接是指这种核酸如DNA与这种核苷酸序列之间的关系。例如，异源DNA与启动子的可操纵地连接是指DNA与启动子之间的物理关系，由此这种DNA的转录由该启动子通过特异性识别、结合并转录所述DNA的RNA聚合酶起始。因此，可操纵地连接或相关是指核酸如DNA与核苷酸的调节和效应序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点及其他信号序列的功能关系。例如，DNA与启动子的可操纵地连接是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，由此该DNA的转录由所述启动子通过特异性识别、结合并转录DNA的RNA聚合酶起始。为了优化表达和/或体外转录，可能需要除去、加入或改变克隆的5’未翻译部分以消除额外的、潜在不适当的可选翻译起始密码子或可在转录或翻译水平干扰或降低表达的其他序列。或者，可以将共有的核糖体结合位点(见例如Kozak J.Biol.Chem.26619867-19870(1991))插入起始密码子的5’端并可以增强表达。根据经验确定是否需要这种修饰。
如本文所用，对于反义寡核苷酸而言，与RNA的至少一部分互补的序列是指具有足够的互补性以一般能在中等或高度严格条件下与所述RNA杂交形成稳定双链体的核苷酸序列；在双链反义核酸的情况中，可以因此测试双链DNA(或dsRNA)的一条单链，或者可以测定三链体形成。杂交的能力依赖于互补程度及反义核酸的长度。一般地，杂交的核酸越长，则其可以含有的与编码RNA的碱基错配越多，并仍形成稳定的双链体(或在可能的情况下形成三链体)。本领域技术人员可使用标准程序确定错配的耐受程度，以确定杂交复合物的熔点。
如本文所用，通过给予特定的药物组合物所致特定疾病症状的改善是指症状的无论是持续还是暂时的任何减轻，持续或暂时归因于或与组合物的给予相关。
如本文所用，反义多核苷酸是指与mRNA或双链DNA的有义链互补的核苷酸碱基的合成序列。有义和反义多核苷酸的混合物在合适条件下导致这两个分子的结合或杂交。当这些多核苷酸与mRNA结合(杂交)时，出现蛋白质合成(翻译)抑制。当这些多核苷酸结合双链DNA时，出现RNA合成(转录)抑制。所得翻译和/或转录的抑制导致由有义链编码的蛋白质的合成抑制。反义核酸分子典型地含有足够数目的核苷酸以特异性结合靶核酸，一般为至少5个连续的核苷酸，通常为至少14或16或30个连续的核苷酸或者修饰的与编码感兴趣的基因的核酸分子的编码部分互补的核苷酸。
如本文所用，抗体是指免疫球蛋白，其可以是天然产生的或者是部分或全部合成产生的，该术语还包括保留抗体的特异性结合能力的其任何衍生物。因此抗体包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。抗体包括任何类别的免疫球蛋白成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
如本文所用，抗体片段是指抗体的任何衍生物，其短于全长抗体，保留至少一部分全长抗体的特异性结合能力。抗体片段包括例如但非限于Fab、Fab′、F(ab)2、单链Fv(scFV)、FV、dsFV二聚抗体(diabody)和Fd片段。所述片段可以包括如通过二硫键桥连接在一起的多条链。抗体片段通常含有至少大约50个氨基酸，典型含有至少200个氨基酸。
如本文所用，Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链结构域组成的抗体片段。
如本文所用，dsFV是指具有工程化的分子间二硫键的Fv，其稳定VH-VL对。
如本文所用，F(ab)2片段是得自用胰蛋白酶在pH4.0-4.5消化的免疫球蛋白的抗体片段，其可以是重组产生的以产生等价的片段。
如本文所用，Fab片段是得自用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白的抗体片段，其可以是重组产生的以产生等价的片段。
如本文所用，scFV是指含有以任何顺序通过多肽接头共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。所述接头的长度是使两个可变结构域基本无妨碍地连接的长度。本发明包括的接头是(Gly-Ser)n残基，以及一些遍及分布的Glu或Lys残基以增加可溶性。
如本文所用，人源化抗体是指抗体被修饰为包括人氨基酸序列，由此给予人体不激发免疫应答。已知制备这种抗体的方法。例如，为产生这种抗体，将表达单克隆抗体的杂交瘤或其他原核细胞或真核细胞如大肠杆菌或CHO细胞中的编码核酸通过重组核酸技术加以改变以表达抗体，所述抗体其中非可变区的氨基酸组成基于人抗体。已设计计算机程序鉴别这种非可变区域。
如本文所用，二聚抗体(diabody)是二聚scFV；二聚抗体典型地具有短于scFv的肽接头，并且它们通常二聚化。
如本文所用，重组产生是指使用重组DNA方法，利用分子生物学熟知的方法表达克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，术语评定(assessing)或确定(determining)是指包括定量和定性确定以获得产物活性的绝对值，以及获得活性水平的指数、比率、百分比、表观数值及其他指征活性水平的数值。可以直接或间接评定。
如本文所用，生物学活性是指化合物或微生物的体内活性或者基于体内给予所述化合物或微生物或其组合物或其他混合物所引起的生理学应答。生物学活性因此涵盖了这种化合物、组合物和混合物的治疗效果和药物学活性。生物学活性可以在设计的体外系统中观测以测试或使用这种活性。
如本文所用，微生物或化合物治疗一特定疾病的有效量是足以改善，或者以某种方式减少与疾病相关的症状。这种量可以是单一剂量给予，或者根据治疗方案给予，从而是有效的。所述量可以治愈疾病，但典型地是给予患者以改善疾病的症状。可需要重复给予以达到希望的症状改善。
如本文所用，当就核酸的两个序列而言时，等价物(equivalent)是指所述两个序列编码氨基酸的相同序列或等价的蛋白质。当用于指两个蛋白质或肽或其他分子时，等价物是指所述两个蛋白质或肽具有基本相同的仅具有氨基酸取代(例如但非限于保守改变)的氨基酸序列或相同结构，并且所述改变均基本上不改变所述蛋白质或肽的活性或功能。当等价物是指性质时，所述性质不需要相同程度存在(例如两种肽可呈现相同类型的酶活性的不同速率)，但所述活性通常是相同的。当指两个核苷酸序列时，互补是指核苷酸的两个序列能杂交，相对的核苷酸之间典型具有少于25％、15％或5％的错配。如果需要，可以指定互补百分比。典型地，选择可以在高度严格条件下杂交的两个分子。
如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的活性物质或化合物降低或增加或另外改变蛋白质的活性，或者以某种方式增量或减量调节或另外改变所述核酸在细胞中的表达。
如本文所用，治疗或预防肿瘤疾病的方法是指疾病特征性的任何症状，如肿瘤、其转移瘤，肿瘤的血管化或其他参数被降低、改善、预防、处于好转状态或者保持好转状态。也是指肿瘤疾病和转移瘤的标记(hallmark)通过治疗可以被消除、降低或预防。所述标记的非限制性实例包括不受控制的基膜和临近的胞外基质降解、内皮细胞的迁移、分裂和组织为新的功能性毛细血管，以及这种功能性毛细血管的维持。
如本文所用，前体药物是这样的化合物，其在体内给予的基础上被代谢或另外转变为生物学、药物学或治疗活性形式的化合物。为产生前体药物，对具有药物学活性的化合物进行修饰，由此所述活性化合物通过代谢过程而再生。所述前体药物可以设计为改变药物的代谢稳定性或者转运特性、减少副作用或毒性、改良药物的味道或改变药物的其他特性或性质。根据体内药动力学过程和药物代谢的知识，本领域技术人员一旦已知一种药物学活性化合物，则可以设计该化合物的前体药物(见例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry ABiochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages388-392)。
如本文所用，启动子区域或启动子元件或调节区域是指控制与其可操纵地连接的DNA或RNA转录的DNA或RNA节段。所述启动子区域包括足以进行RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特异性序列。启动子区域的这部分称作启动子。另外，启动子区域包括调节这种RNA聚合酶识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用或者可以应答反式作用因子。启动子根据调节的性质可以是组成型或被调节的。用于原核细胞的启动子例如包括噬菌体T7和T3启动子。
如本文所用，受体是指与配体具有亲和性的分子。受体可以是天然发生的或者合成的分子。在本领域受体也可以称作抗配体(anti-ligand)。如本文所用，受体和抗配体是可互换应用的。受体可以其未改变的状态或者以与其他多肽结合包括作为同源二聚体结合的状态使用。受体可以与一种结合成员直接或间接通过特异性结合物质或接头而共价或非共价附着或者发生物理接触。受体例如包括但非限于抗体、细胞膜受体表面受体和内在化受体、与特异性抗原决定簇(如位于病毒、细胞或其他材料上)反应的单克隆抗体和抗血清、药物、多核苷酸、核酸、肽、辅助因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。
如本文所用，样品是指可含有希望进行分析物测定的分析物的任何东西。所述样品可以是生物学样品，如生物学体液或生物学组织。生物学体液例如包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊液、泪液、粘液、羊水，等等。生物学组织是细胞的聚集体，通常是一种特定类型与其细胞间物质组合在一起的聚集体，所述聚集体形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构原料之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物学组织例如还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和各个细胞。
如本发明所用，确定错配百分比的杂交严格度如下1)高度严格0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃2)中等严格0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃3)低度严格1.0×SSPE、0.1％SDS、50℃本领域技术人员已知选择稳定杂交体的洗涤步骤，也已知SSPE的组成成分(见例如Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，inMolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，vol.3，p.B.13，也见于描述常用的实验室溶液的众多目录)。SSPE是pH7.4的磷酸盐缓冲的0.18M NaCl。另外，本领域技术人员认可杂交体的稳定性通过Tm确定，这是钠离子浓度与温度的一个函数(Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-600/l))，由此洗涤条件中对杂交体稳定性仅有的关键参数是SSPE(或SSC)中钠离子浓度和温度。本发明提供的任何核酸分子也可包括在至少低度严格条件下，通常为中等或高度严格条件下与所公开的分子全长的至少70、80、90％杂交的那些分子。应理解使用不同的缓冲液、盐和温度可以达到等同的严格度。非限制性例如使用如下的低度严格条件(也见于Shilo and Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786789-6792(1981))将含有DNA的滤膜在40℃在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA(10×SSC是1.5M氯化钠和0.15M柠檬酸钠，pH调节为7)的溶液中预处理6小时。在进行如下修改的相同溶液中进行杂交0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20×106cpm32P-标记的探针。将滤膜在40℃在杂交混合物中温育18-20小时，然后在55℃在含有2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤溶液用新鲜的溶液代替并在60℃另外温育1.5小时。将滤膜吸干并曝光以进行放射自显影术。如果需要，将滤膜在65-68℃第3次洗涤并再曝光成像。可以使用的其他低度严格条件为本领域所熟知(例如用于杂交物种杂交)。
作为非限制性实例，使用中等严格条件的程序包括例如但非限于如下程序将含有DNA的滤膜在55℃在含有6×SSC、5×Denhart′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA的溶液中预处理6小时。在相同的溶液中进行杂交，使用5-20×106cpm32P-标记的探针。将滤膜在杂交混合物中在55℃温育18-20小时，然后在60℃在含有1×SSC和0.1％SDS的溶液中洗涤两次。将滤膜吸干并曝光以进行放射自显影术。可以使用的其他中等严格条件为本领域所熟知。滤膜的洗涤在37℃在含有2×SSC、0.1％SDS的溶液中进行1小时。使用高度严格条件的程序的非限制性实例如下将含有DNA的滤膜在65℃在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中预杂交8小时至过夜。将滤膜在65℃在含有100μg/ml变性鲑精DNA和5-20×106cpm的32P-标记的探针的预杂交混合物中杂交48小时。在37℃在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中洗涤滤膜1小时。随后在50℃在0.1×SSC中洗涤45分钟，之后进行放射自显影术。可以使用的其他高度严格条件为本领域所熟知。
术语基本相同或同源或相似随着文章的上下文关系而变化使用，这为相关领域技术人员所理解，通常是指至少60％或70％、优选是指至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性。
如本文所用，与产物基本相同是指足够相似，由此感兴趣的性质基本上不变，从而所述基本相同的产物可用于代替所述产物。
如本文所用，基本上纯的是指足够均一地显示不含有通过本领域技术人员使用的评估这种纯度的标准分析方法易于检测的杂质，所述分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，或者是指足够纯的，进一步的纯化不会可检测到地改变该物质的物理和化学性质，如酶活性和生物学活性。纯化化合物以产生基本为化学纯的化合物的方法为本领域技术人员所已知。然而，基本为化学纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可提高所述化合物的比活性。
如本文所用，分子如特异结合多肽的抗体的结合亲和性(Ka)典型为至少大约106l/mol、107l/mol、108l/mol、109l/mol、1010l/mol或更高，与感兴趣的蛋白质的结合亲和性是与其他蛋白质结合亲和性的至少2倍、5倍，通常为10倍或者甚至100倍或更高。例如，与全长分子如酶原形式相比，特异结合蛋白酶结构域的抗体与仅含有蛋白酶结构域的多肽结合亲和性是与全长酶原形式的结合亲和性的至少大约2倍，典型为5倍或10倍。这种特异性结合也是指选择性结合。因此，特异性或选择性结合是指与非靶位点或非靶基因座相比与靶位点或靶基因座的更高结合亲和性(通常为至少2倍、5倍、10倍或更多倍)。
如本文所用，术语治疗剂、治疗化合物、治疗方案或化疗包括本领域技术人员熟知的常规药物和药物疗法，包括疫苗。
如本文所用，治疗是指使病变或疾病的症状改善或者另外有益改变的任何方式。治疗还涵盖了本发明所述和提供的微生物的任何药物学应用。
如本文所用，增生性疾病包括包含细胞异常增殖的任何疾病。这种疾病包括但非限于肿瘤疾病、牛皮癣、再狭窄、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、炎症应答及包括创伤愈合应答的疾病。
如本文所用，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制的离散元件。所述载体典型地保留附加型(episomal)，但可以设计为导致基因或其一部分整合入基因组的染色体中。本发明还包括人工染色体载体，如酵母人工染色体及哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和应用为本领域技术人员所熟知。表达载体包括能表达与调节序列如启动子区域可操纵地连接的DNA的载体，其能使得这种DNA片段表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，在导入合适的宿主细胞的基础上，导致克隆的DNA的表达。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中能复制的那些载体及保留附加型的那些载体或者整合入宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，组合是指两或多种物质(item)的任何联合。
如本文所用，组合物是指任何混合物。其可以是乳液、悬浮液、乳状液、液体、粉末、糊、水溶液、非水溶液或其任何组合。
如本文所用，液体是指可以流动的任何组合物。液体因此涵盖了以半固体、糊状、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳液或其他此类组合物形式存在的组合物。
如本文所用，试剂盒是一种包装的组合物，任选地包括所述组合物和/或其他反应及用于这种应用的成分的使用说明书。
为了更清晰地公开本发明，但无限制之意，将详细描述分为如下部分。
B.用于肿瘤特异性疗法的微生物本发明提供了微生物及生产和应用这种微生物以治疗肿瘤疾病及其他增生性病变和炎症病变的方法。本发明提供的微生物介导的治疗方法包括给予宿主所述微生物，所述微生物在靶细胞或组织如肿瘤中积聚，导致细胞渗漏或溶解，从而激发针对漏出或释放的抗原的免疫应答，引起其中积聚微生物的组织或细胞的抑制。
除了癌症治疗的基因治疗方法之外，活的减毒微生物可用于疫苗接种，如用于癌症疫苗接种或抗肿瘤免疫。例如抗肿瘤的免疫可包括通过微生物输送的抗原或细胞因子由肿瘤特异性T细胞介导的应答。为此，所述微生物可特异性靶向于肿瘤组织，最小限度感染任何其他重要器官，并且也可以被修饰或提供以产生抗原和/或细胞因子。
本发明提供的微生物及这种微生物的应用可积聚在免疫豁免细胞或免疫豁免组织中，所述组织或细胞包括肿瘤和/或转移瘤，也包括创伤组织和细胞。本发明提供的微生物可典型地从给予所述微生物的对象体内通过所述对象的免疫系统活性而清除，然而微生物可在免疫豁免细胞和组织如肿瘤中积聚、存活并增殖，因为这种免疫豁免区域与宿主的免疫系统中隔绝。因此，本发明提供的用于肿瘤和/或转移瘤的方法及相关的治疗方法可易于应用于其他免疫豁免细胞和组织，包括创伤的细胞和组织。
1.特征本发明提供的及本发明方法中应用的微生物是减毒的、免疫原性的及有复制能力的微生物。
a.减毒的(attenuated)本发明提供的方法中应用的微生物典型是减毒的。减毒的微生物导致宿主患病的能力降低。所述降低的致病能力可得自对致病性微生物的能力作各种不同的修饰。例如，微生物可以是毒性降低、积聚在非肿瘤器官或组织中的能力降低、导致细胞溶解或细胞死亡的能力降低、或者与其非减毒形式相比复制能力降低。然而本发明提供的减毒微生物至少保留一些复制能力及导致免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞渗漏或溶解，经历细胞死亡，或者以另外方式导致或增强对免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞的免疫应答的能力。
i.降低的毒性微生物通过产生损害宿主健康状况的一或多种化合物而对其宿主有毒性。对宿主的毒性可以各种方式出现，包括脓毒性休克(septicshock)、对神经系统的作用或对肌肉的作用。本发明提供的微生物对宿主的毒性降低。本发明的方法和组合物中微生物的降低的毒性范围可以是从对宿主无毒性至宿主不典型死于微生物的毒性作用。在一些实施方案中，所述微生物毒性降低，由此宿主典型地对宿主中存在微生物无明显的长期作用，除了对肿瘤、转移或坏死的器官或组织的任何影响之外。例如，降低的毒性可以是轻微的发热或感染，持续时间少于大约1个月，在发热或感染后，宿主无得自所述发热或感染的不利影响。在另一个实施例中，降低的毒性可以是给予微生物后体重非目的性地降低大约5％或更少。在其他实施例中，所述微生物对宿主无毒性。
应用示例性的与其他痘苗病毒相比毒性降低的LIVP毒株(广泛可得的减毒的Lister毒株)痘苗病毒并进一步修饰。制备修饰的LIVP。这些LIVP包括在TK和HA基因及任选地包括在称为F3的基因座中进行插入。作为毒性降低的实例，测试这些重组痘苗病毒相对于相应野生型痘苗病毒对免疫系统损伤的小鼠(裸鼠)的毒性。以1×107PFU/小鼠剂量静脉内(i.v.)注射野生型痘苗病毒VGL(LIVP毒株)在裸鼠中产生毒性7只小鼠有3只体重降低并死亡(1只小鼠在注射病毒后1周内死亡，1只小鼠在注射病毒后10天死亡)。称为RVGL8的重组痘苗病毒(在F3基因座插入LacZ)以1×107PFU/小鼠剂量静脉内注射后，对裸鼠未示出毒性作用。不容易检测到RVGL8病毒相关的毒性迹象。因此，在LIVP毒株的痘苗病毒基因组的NotI位点(位于F3基因中)进行插入降低痘苗病毒对宿主的毒性。对其他痘病毒及其他病毒可以作相似修饰以降低其毒性。这种修饰如果必要的话可以根据经验鉴别。
ii.在免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中积聚，在其他器官中基本不积聚微生物可以积聚在宿主的各种组织和器官中。积聚甚至可以遍及整个宿主生物体，或者可以集中在一或几个器官或组织中。本发明提供的微生物可以积聚在靶组织如免疫豁免细胞和组织如肿瘤和转移瘤中。在一些实施方案中，本发明提供的微生物表现为积聚在免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中，与野生型微生物在正常器官或组织中的积聚相等或较高。在其他实施方案中，本发明提供的微生物表现为积聚在免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中，与在任何其他特定器官或组织中的积聚相等或较高。例如，本发明提供的微生物可表明积聚在免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中，比在任何其他特定器官或组织中的积聚高至少大约2倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约100倍、至少大约1000倍、至少大约10,000倍、至少大约100,000倍或者至少大约1,000,000倍。
在一些实施方案中，微生物可以积聚在靶组织和细胞如免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中，而不积聚在一或多种选择的组织或器官中。例如，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在脑中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在神经细胞中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在卵巢中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在血液中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在心脏中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在膀胱中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在睾丸中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在脾中。在另一个实例中，微生物可以积聚在肿瘤细胞中而不积聚在肺中。
本领域技术人员可以确定所述微生物选择性积聚在靶组织或细胞如免疫豁免细胞和组织如肿瘤中而不是积聚在非靶器官或组织中的所希望的能力，根据本领域已知的各种因素进行，包括但非限于所述微生物的毒性、剂量、待治疗的肿瘤、宿主的免疫活性及宿主的疾病状况。
本发明提供了相对于正常器官或组织而选择性积聚在免疫豁免细胞和组织如肿瘤中的实例，在肿瘤样品和不同的器官中测定各种痘苗病毒的存在。从肿瘤、睾丸、膀胱和肝脏以及脑中回收野生型VGL。发现重组病毒RVGL8主要在肿瘤中(在#24小鼠发现病毒在睾丸、膀胱和肝脏中，在#22小鼠发现病毒在睾丸中)，在6只测试动物的脑组织中未回收到病毒。因此，这个发现表明在F3基因有一个插入的重组痘苗病毒LIVP毒株对于肿瘤治疗目的的肿瘤积聚性质。
iii.激发或增强对肿瘤细胞免疫应答的能力本发明的微生物引起或增强对靶组织或细胞如免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中抗原的免疫应答。所述免疫应答可以通过各种机制触发，包括存在免疫刺激性细胞因子及释放可引起免疫应答的抗原性化合物。
对于感染如微生物感染的应答，细胞可以发出信号刺激针对细胞的免疫应答。由这种细胞发出的信号例如包括抗原、细胞因子和趋化因子如干扰素γ和白细胞介素-15。本发明提供的微生物可导致靶细胞发出这种信号应答微生物感染，引起对针对靶细胞或组织如肿瘤细胞的宿主免疫系统的刺激。
在另一个实施方案中，靶细胞或组织如肿瘤细胞可以含有可由宿主免疫系统识别的一或多种化合物以引起对肿瘤的免疫应答。这种抗原性化合物可以是细胞表面或肿瘤细胞上的化合物，并且可以是蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。微生物介导的抗原性化合物的释放可导致触发宿主免疫系统针对肿瘤的免疫应答。肿瘤细胞释放的抗原性化合物的量是足以触发对象免疫应答的任何量，例如从一或多种肿瘤细胞中释放的抗原性化合物可以触发已知可接触白细胞的生物体中的宿主免疫应答。
抗原释放的持续时间是足以使宿主对一或多个肿瘤抗原建立免疫应答的时间量。在一些实施方案中，持续时间是足以使宿主对一或多个肿瘤抗原建立持续免疫应答的时间量。本领域技术人员可以基于影响对象产生免疫应答的持续时间的各种因素确定这种持续时间，包括对象中肿瘤抗原的水平、不同肿瘤抗原的数目、抗原的抗原性、宿主的免疫活性、及抗原物质进入宿主的脉管系统。典型地，抗原释放的持续时间可以为至少大约1周、10天、2周或至少大约1个月。
本发明提供的微生物可具有导致靶细胞和组织如肿瘤细胞释放抗原化合物的任何性质。所述性质例如是溶解细胞的能力及激发肿瘤细胞凋亡的能力。然而不能溶解肿瘤细胞或者导致肿瘤细胞死亡的微生物当可导致抗原性化合物从肿瘤细胞中释放或展示时可用于本发明提供的方法中。本领域已知抗原释放或展示而无溶解细胞或细胞死亡的各种机制，任何这种机制均可由本发明提供的微生物应用，包括但非限于当宿主免疫系统可以接触肿瘤细胞时在肿瘤细胞中分泌抗原性化合物、增强细胞膜通透性、或者改变细胞表面表达或者改变MHC呈递。不管宿主免疫系统被激活的机制如何，肿瘤中所述微生物存在的最终结果是刺激针对所述肿瘤细胞的宿主免疫系统，至少是部分地。在一个实例中，所述微生物可引起针对未感染所述微生物的肿瘤细胞的免疫应答。
在一个实施方案中，本发明提供的微生物可导致肿瘤细胞释放在肿瘤细胞表面上不存在的抗原。肿瘤细胞可以产生化合物如可导致免疫应答的蛋白质；然而，在抗原性化合物不在肿瘤细胞表面的情况中，所述肿瘤可以增殖，甚至转移，而无抗原化合物导致免疫应答。在本发明方法的范围内，本发明提供的微生物可导致细胞内的抗原性化合物远离所述细胞和肿瘤释放，这可导致触发对这种抗原的免疫应答。即使不是所有的肿瘤细胞均释放抗原，免疫应答最初仍可靶向“渗漏的”肿瘤细胞，免疫应答的旁观者效应(bystander effect)可在“渗漏的”肿瘤细胞周围导致进一步的肿瘤细胞死亡。
iv.致病性与肿瘤抗原的释放之间的平衡已设计包括处理靶细胞和组织如免疫豁免的细胞和组织如肿瘤在内的典型的方法以导致其快速及完全地除去。例如许多病毒、细菌或真核细胞可以导致多种细胞包括肿瘤细胞的溶解和/或凋亡。可以强力溶解细胞或导致细胞死亡的微生物可以是高度致病性的，并且甚至可以杀死宿主。另外，基于这种快速和完全溶解的治疗方法典型是治疗无效的。
相反，本发明提供的微生物不是侵略性地导致细胞死亡或溶解的微生物。它们积聚在靶细胞或组织中时仅有限或不能导致细胞死亡，其导致细胞膜改变使得引起免疫应答的抗原漏出。希望其凋亡或溶解作用足够缓慢或低效以使得足够的抗原漏出足够的时间以使得宿主激发针对靶组织的有效免疫应答。单独的这种免疫应答或者组合所述微生物的溶解/凋亡作用导致靶组织的消除及这种组织或细胞进一步发展如转移及复发的消除。本发明提供的微生物可具有有限的导致细胞死亡的能力，然而本发明提供的微生物刺激宿主免疫系统攻击肿瘤细胞。结果，这种微生物也典型地不太可能对宿主具有实质的毒性。
在一个实施方案中，所述微生物具有有限的或者不具有导致肿瘤细胞死亡的能力，而仍导致或增强针对肿瘤细胞的免疫应答。在一个实例中，微生物介导的肿瘤细胞死亡的速度低于肿瘤细胞生长或复制的速度。在另一个实例中，微生物介导的肿瘤细胞死亡的速度足够低，使得宿主建立对一或多种肿瘤抗原的持续免疫应答。典型地，细胞死亡的时间足以建立抗肿瘤免疫应答，并且根据宿主和靶细胞或组织而可以是至少大约1周，至少大约10天，至少大约2周，或者至少大约1个月。
在另一个实施方案中，本发明提供的微生物可以导致肿瘤细胞内细胞死亡，而不导致非肿瘤细胞组织中大量细胞死亡。在这种实施方案中，所述微生物可侵略性地杀死肿瘤细胞，而在非肿瘤细胞中无大量细胞死亡发生，并且任选地宿主具有足够的能力激发针对所述肿瘤细胞的免疫应答。
在一个实施方案中，所述微生物导致细胞死亡的能力比宿主对该微生物的免疫应答慢。宿主控制微生物感染的能力可以通过针对微生物抗原的免疫应答(例如抗体效价)而确定。典型地，在宿主激发对微生物的免疫应答之后，所述微生物在宿主中的致病性降低。因此，当所述微生物导致细胞死亡的能力慢于宿主对微生物的免疫应答时，可发生微生物介导的细胞死亡，但对宿主无严重疾病或死亡的危险。在一个实例中，所述微生物导致肿瘤细胞死亡的能力慢于宿主对该微生物的免疫应答。
b.免疫原性本发明提供的微生物也可以是免疫原性的。免疫原性的微生物可以产生针对该微生物的宿主免疫应答。在一个实施方案中，所述微生物是足够免疫原性的，产生较高的抗微生物抗体效价。本发明提供的微生物可具有激发免疫应答的能力。所述免疫应答可以应答病毒抗原而激活，或者由于微生物感染诱导产生细胞因子或趋化因子的结果而激活。针对所述微生物的免疫应答可降低对于宿主生物体的致病性的可能性。
针对所述微生物的免疫应答也可以导致靶组织或细胞如肿瘤细胞被杀死。在一个实施方案中，针对微生物感染的免疫应答可引起针对肿瘤细胞的免疫应答，包括产生针对肿瘤抗原的抗体。在一个实例中，针对所述微生物激发的免疫应答可导致肿瘤细胞被所述“旁观者效应”杀死，其中感染的肿瘤细胞附近的未感染的肿瘤细胞与感染的细胞同时被杀死，或者其中胞外微生物附近的未感染的肿瘤细胞与微生物同时被杀死。由于旁观者效应肿瘤细胞死亡，肿瘤细胞抗原可从细胞中释出，宿主生物体的免疫系统可激发针对肿瘤细胞抗原的免疫应答，导致针对肿瘤细胞自身的免疫应答。
在一个实施方案中，对所述微生物加以选择或修饰以表达一或多种抗原性化合物，包括超抗原化合物。抗原性化合物如超抗原可以是内源基因产物或者可以是外源基因产物。超抗原，包括类毒素为本领域所已知并在本文的另处描述。
c.复制能力本发明提供的微生物可以具有复制能力。在多种病毒或细菌系统中，被给予的微生物不具备复制能力以限制对宿主的致病性危险。不具备复制能力可保护宿主免于微生物侵袭，但这也限制了微生物感染并杀死肿瘤细胞的能力，典型地仅引起短期影响。相反，本发明提供的微生物可以是减毒的但具备复制能力，导致对宿主的低毒性并主要或仅积聚在肿瘤中。因此，本发明提供的微生物可以具有复制能力而对宿主不产生致病性危险。
本发明提供的微生物的减毒可包括但非限于降低微生物的复制能力。例如可以对微生物加以修饰以降低或消除复制相关的活性，如在微生物中调节复制的转录激活子。在一个实例中，微生物如病毒可以具有修饰的病毒胸苷激酶基因。
d.遗传变体本发明提供的微生物可以是从其野生型形式修饰的。修饰可包括任何改变，并典型地包括改变微生物的基因组或核酸分子。核酸分子修饰例如包括截短、插入、缺失和突变。例如在一种修饰中，微生物基因可以通过截短、插入、缺失或突变而修饰。例如在一种插入中，可以在微生物的基因组中插入一个外源基因。
i.修饰的特性本发明提供的微生物的修饰可以导致微生物特性的修饰，包括本发明提供的那些特性如致病性、毒性、优先积聚在肿瘤中的能力、溶解细胞或导致细胞死亡的能力、激发针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力。变体可以通过一般的方法如诱变及在细胞或组织培养中传代并选择所希望的性质，这种方法为本领域所已知，如Murphy et al.，Virus Res.1994，3213-26对呼吸道合胞病毒所进行的示例。
变体也可以通过诱变方法获得，其中相对于野生型，加入、除去或修饰所述微生物的核酸残基。可以使用任何已知的诱变方法，包括基于重组的方法、基于限制性核酸内切酶的方法及基于PCR的方法。诱变方法可以针对特定的核苷酸序列如基因，或者可以是随机的，其中可以使用基于所希望的特性的选择方法以选择突变的微生物。根据选择的微生物及所述选择的微生物的特定已知修饰，可以进行任何微生物修饰。
ii.外源基因表达本发明提供的微生物也可以具有表达一或多种外源基因的能力。基因表达可包括由基因编码的蛋白质的表达和/或由基因编码的RNA分子的表达。在一些实施方案中，所述微生物可在足够高的水平表达外源基因，使得可以从肿瘤收获外源基因的产物。内源基因的表达可以由组成型启动子控制，或者由诱导型启动子控制。表达也可以通过所述微生物表达的一或多种蛋白质或RNA分子影响。示例性的可诱导的启动子系统可包括一种嵌合的转录因子，其含有与酵母GAL4DNA-结合结构域及单纯疱疹病毒蛋白VP16的激活结构域融合的孕酮受体，及一个含有位于腺病毒主要晚期E1B TATA box上游的一系列GAL4识别序列的合成的启动子，所述启动子与一或多个外源基因连接；在这个示例性的系统中，给予对象RU486可引起外源基因的诱导。表达的外源基因可包括编码治疗性基因产物的基因、编码可检测的基因产物(如可用于成像的基因产物)的基因、编码待收获的基因产物的基因、编码待收获的抗体的抗原的基因。本发明提供的微生物可用于在体内和在体外表达基因。蛋白质例如包括报道蛋白(大肠杆菌β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、协助检测的蛋白质即可检测的蛋白质或能诱导可检测信号的蛋白质(例如萤光素酶、绿色和红色荧光蛋白、运铁蛋白受体)、用于肿瘤治疗的蛋白质(假单胞菌外毒素A、白喉毒素、p53、Aff、Bax、肿瘤坏死因子α、HSV TK、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶、制管张素、血管内皮抑制素(endostatin)、不同的细胞因子)及许多其他蛋白质。
iii.可检测的基因产物本发明提供的微生物可表达一或多种基因，所述基因的产物是可以检测的或者可以提供可检测信号。本领域已知许多可检测的基因产物，如可检测的蛋白质，并且可以与本发明提供的微生物一起使用。可检测的蛋白质包括可特异性结合可检测化合物的受体或其他蛋白质，可发出可检测信号如荧光信号的蛋白质，可催化可检测反应或催化可检测产物形成的酶。
在一些实施方案中，所述微生物表达编码可发出可检测信号或者可催化可检测反应的蛋白质的基因。本领域已知许多编码可发出可检测信号或可催化可检测反应的蛋白质如发光或荧光蛋白的DNA序列，并且可以用于本发明提供的微生物和方法中。编码发光蛋白的基因例如包括来自哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的细菌萤光素酶(Belas etal.，Science 218(1982)，791-793)、来自费氏弧菌(Vibrio fischerii)的细菌萤光素酶(Foran and Brown，Nucleic acids Res.16(1988)，177)、萤火虫萤光素酶(de Wet et al.，Mol.Cell.Biol.7(1987)，725-737)、来自水母(Aequorea victoria)的水母发光蛋白(Prasher et al.，Biochem.26(1987)，1326-1332)、来自的Renilla renformis的海肾萤光素酶(Lorenz et al.，PNAS USA 88(1991)，4438-4442)和来自水母的绿色荧光蛋白(Prasheret al.，Gene 111(1987)，229-233)。这些基因在微生物中的转化和表达使得可以检测微生物集落，例如使用弱光成像相机(low light imagingcamera)进行检测。lux A与lux B基因的融合可产生完全功能的萤光素酶蛋白(Escher et al.，PNAS 86(1989)，6528-6532)。这种融合基因(Fab2)已经导入许多微生物中，随后感染微生物并基于萤光素酶表达而成像。在一些实施方案中，在细菌中表达的萤光素酶可需要外源加入的底物如癸醛或腔肠素以发光。在其他实施方案中，微生物可表达一个完全的lux操纵子，其可包括可提供萤光素酶底物如癸醛的蛋白质。例如当腹膜内、肌内或静脉内注射时，含有完全的lux操纵子序列的细菌使得细菌在活体小鼠内观测到并定位，这表明萤光素酶光发射可以穿透组织并可以在外部检测到(Contag et al.，Mol.Microbiol.18(1995)，593-603)。
在其他实施方案中，所述微生物可以表达可结合可检测化合物或者可形成能够结合可检测化合物的产物的基因。本领域已知许多可特异性结合可检测化合物的基因产物如蛋白质，包括受体、金属结合蛋白、配体结合蛋白和抗体。可以使用任何可检测化合物，所述化合物可以通过任何已知成像方法成像。所述化合物例如包括受体配体和抗体的抗原。所述配体可以根据使用的成像方法标记。成像方法例如包括任何磁共振方法如磁共振成像(MRI)和磁共振波谱分析(MRS)，还包括任何断层方法包括计算机断层X射线照相术(CT)、计算机轴向X射线断层照相术(CAT)、电子束计算机断层X射线照相术(EBCT)、高分辨率计算机断层X射线照相术(HRCT)、内摆线断层X射线照相术(hypocycloidal tomography)、正电子发射断层X射线照相术(PET)、单一光子发射计算机断层X射线照相术(SPECT)、螺旋计算机断层X射线照相术和超声断层X射线照相术。
适于磁共振成像的标记为本领域所已知，包括例如钆螯合剂和铁氧化物。螯合剂在造影剂中的应用为本领域所已知。适于X射线断层照相方法的标记为本领域所已知，包括例如β-发射体如11C、13N、15O或64Cu或者(b)γ-发射体如123I。可用作PET的追踪物的其他放射性核素例如包括55Co、67Ga、68Ga、60Cu(II)、67Cu(II)、57Ni、52Fe和18F。有用的放射性核素标记的活性物质例如是64Cu-标记的工程化的抗体片段(Wu et al.，PNAS USA 97(2002)，8495-8500)、64Cu-标记的促生长素抑制素(Lewis et al.，J.Med.Chem.42(1999)，1341-1347)、64Cu-丙酮醛-二(N4甲基缩氨基硫脲)(64Cu-PTSM)(Adonai et al.，PNASUSA 99(2002)，3030-3035)、52Fe-柠檬酸盐(Leenders et al.，J.Neural.Transm.Suppl.43(1994)，123-1 32)、52Fe/52mMn-柠檬酸盐(Calonder etal.，J.Neurochem.73(1999)，2047-2055)和52Fe-标记的氢氧化铁(III)-蔗糖复合物(Beshara et al.，Br.J.Haematol.104(1999)，288-295，296-302)。
iv.治疗性基因产物本发明提供的微生物可表达一或多个基因，其产物导致细胞死亡或者其产物导致抗肿瘤免疫应答，这种基因可以认为是治疗性基因。许多治疗性基因产物如毒性或细胞凋亡蛋白或者siRNA为本领域所已知，并可以与本发明提供的微生物一起应用。所述治疗性基因可以通过直接杀死宿主细胞而起作用，例如作为通道形成蛋白或其他溶解蛋白、或者通过触发细胞凋亡、或者通过抑制必要的细胞过程、或者通过触发针对所述细胞的免疫应答、或者通过与具有相似作用的化合物相互作用(例如通过将低活性的化合物转变为胞毒性化合物)而起作用。
在一些实施方案中，所述微生物可表达一种治疗性蛋白质。可以表达的以进行肿瘤治疗的许多治疗性蛋白质为本领域所已知，包括但非限于肿瘤抑制剂、毒素、抑制细胞蛋白和细胞因子。这种蛋白质例如但非限制性包括WT1、p53、p16、Rb、BRCA1、囊性纤维化跨膜调节传导调节蛋白(CFTR)、因子VIII、低密度脂蛋白受体、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、胰岛素、甲状旁腺素、α-1-抗胰蛋白酶、rsCD40L、Fas-配体、TRAIL、TNF、抗体、微生物素E492、白喉毒素、假单胞菌外毒素、大肠杆菌Shig毒素、大肠杆菌志贺样毒素(Verotoxin)1和贯叶金丝桃素。
在其他实施方案中，所述微生物可表达将较低活性化合物转变为导致肿瘤细胞死亡的化合物的一种蛋白质。这种前体药物化合物的转变方法例如包括酶转变和光解转变方法。许多蛋白质/化合物对为本领域所已知，包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、水痘-带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β-内酰胺酶/头孢菌素-阿霉素、羧肽酶G2/4-[(2-氯乙基)(2-mesuloxyethyl)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、细胞色素P450/扑热息痛(acetominophen)、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基氧基喜树碱(carbonyloxycamptothecin)、蘑菇酪氨酸酶/双-(2-氯乙基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、β-半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚、β-葡糖苷酸酶/表柔比星(epirubicin)-葡糖苷酸、胸苷磷酸化酶/5’-脱氧5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷及linamerase/亚麻苦苷(linamerin)。
在另一个实施方案中，治疗性基因产物可以是siRNA分子。所述siRNA分子可以针对肿瘤促进基因的表达，所述基因例如但非限于癌基因、生长因子、血管发生促进基因或者受体。所述siRNA分子还可以针对细胞生长、细胞复制或细胞存活的任何必需基因的表达。所述siRNA分子也可以针对稳定细胞膜或者另外限制从肿瘤细胞中释放的肿瘤细胞抗原数目的任何基因。根据siRNA的选择的靶位，可易于确定siRNA的设计；本领域已知siRNA设计和基因减量调节的方法，如美国专利出版物No.20030198627所例证。
在一个实施方案中，所述治疗性化合物可以通过调节序列控制。合适的调节序列例如在哺乳动物宿主细胞中起作用的调节序列为本领域所熟知。在一个实例中，所述调节序列可含有一个天然或合成的痘苗病毒启动子。在另一个实施方案中，所述调节序列含有一个痘病毒启动子。当使用病毒微生物时，可以使用强晚期启动子以达到高水平的外源基因表达。然而可以使用早期和中期启动子。在一个实施方案中，所述启动子含有早期和晚期启动子元件，例如痘苗病毒早期/晚期启动子p7.5、痘苗病毒晚期启动子p11、合成的早期/晚期痘苗病毒pE/L启动子(Patel et al.，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，9431-9435；Davison and Moss，(1989)，J Mol Biol 210，749-769；Davison et al.，(1990)，Nucleic Acids Res.18，4285-4286；Chakrabarti etal.，(1997)，BioTechniques23，1094-1097)。
v.表达超抗原本发明提供的微生物可以修饰为表达一或多种超抗原(superantigen)。超抗原是可激活巨大免疫应答的抗原，通常引起T细胞的巨大应答。本领域已知众多的超抗原，包括但非限于白喉毒素、葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)、毒性休克综合征毒素1、剥脱性毒素(EXft)、链球菌高热性外毒素A，B和C(SPE A，B和C)、小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白(MMTV)、链球菌M蛋白、产气荚膜梭菌(Clostridial Perfringens)肠毒素(CPET)、支原体关节炎超抗原。
由于许多超抗原也是毒素，如果毒性降低的微生物的表达是需要的，则所述超抗原可以修饰为保留至少一些其超抗原性而毒性降低，产生如类毒素的化合物。本领域已知许多重组的超抗原和超抗原的类毒素，其可易于在本发明提供的微生物中表达。类毒素例如包括白喉毒素的类毒素，如美国专利No.6,455,673所例证，及葡萄球菌肠毒素的类毒素，如美国专利出版物No.20030009015所例证。
vi.表达待收获的基因产物可由微生物表达以进行收获的基因包括人基因。所述基因的示范性列表包括人基因和遗传疾病的列表，由Dr.Victor A.McKusick及其同事在Johns Hopkins University及别处揭示，并且已经被NCBI(theNational Center for Biotechnology Information)、Online MendelianInheritance in Man(OMIMTM)、Center for Medical Genetics(JohnsHopkins University，Baltimore，Md.)和National Center forBiotechnology Information(National Library of Medicine，Bethesda，Md.)，1999开发用于国际互联网(World Wide Web)，的那些以及可从公共数据库如pubmed和genbank(见例如(ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)获得的那些。这些基因包括但非限于239f2h9、3pk、4ebp1、4ebp2、al1、al2m1、al2m2、al2m3、al2m4、al5、a1b、albg、alst、a2m、a2mr、a2mrap、aa、aaa、aaa、aabt、aac1、aac2、aact、aadac、aanat、aars、aas、aat、aavs1、abc1、abc2、abc3、abc7、abc8、abcr、abi1、abl1、abl2、abl1、abo、abp、abp1、abpa、abpx、abr、acaa、acac、acaca、acacb、acad1、acadm、acads、acadsb、acadv1、acat、acat1、acat2、acc、accb、accn1、accn2、accpn、ace1、ach、ache、achm1、achm2、achrb、achrd、achrg、acls、acly、aco1、aco2、acox、acox1、acox2、acox3、acp1、acp2、acp5、acpp、acr、acrv1、acs3、acs3、acs4、act2、act35、acta1、acta2、acta3、actb、actc、actg1、actg2、act11、actn1、actn2、actn3、actsa、acug、acvr1、acvr2b、acvrl1、acvrlk1、acvrlk2、acvrlk3、acy1、ad1、ad2、ad3、ad4、ad5、ada、adam10、adam11、adam12、adam3、adam3a、adam3b、adam8、adar、adarb1、adarb2、adcp1、adcp2、adcy1、adcy2、adcy3、adcy3、adcy4、adcy5、adcy6、adcy7、adcy8、adcy9、adcyap1、adcyaplr1、add1、add2、add3、add1、adfn、adh1、adh2、adh3、adh4、adh5、adh7、adhaps、adhc1@、adhr、adhr、adk、ad1、adm、admlx、adora1、adora2a、adora2b、adora21、adora21、adora3、adprt、adra1a、adra1b、adra1c、adra1d、adra2a、adra2b、adra2c、adra211、adra212、adra2r、adrb1、adrb1r、adrb2、adrb2rl1、adrb3、adrbk1、adrbk2、adsl、adss、adtb1、adx、adxr、ae1、ae2、ae3、aegl1、aemk、aes、af10、af17、af4、af6、af8t、af9、afd1、afdn、afg3、afg311、afm、afp、afx1、aga、agc1、ager、ag1、agmx1、agmx2、agp1、agp7、agps、agm、agrp、agrt、ags、agt、agti1、agtr1、agtr1a、agtr2、agtrl1、agxt、ahc、ahcy、ahd、ahds、ahnak、aho2、ahr、ahsg、ahx、aib1、aic、aic1、aied、aih1、aih2、aih3、aim1、air、airc、aire、ak1、ak2、ak3、akap149、akt1、akt2、aku、alad、alas1、alas2、alb、alb2、alba、alcam、ald、aldh1、aldh10、aldh2、aldh3、aldh4、aldh5、aldh6、aldh9、ald11、aldoa、aldob、aldoc、aldr1、alds、alk、alk1、alk2、alk3、alk6、alms1、alox12、alox15、alox5、alp、alpi、alp1、alpp、alpp12、alr、alr、als1、als2、als4、als5、alss、ambn、ambp、amcd1、amcd2b、amcn、amcn1、amcx1、amd1、amdm、amelx、amely、amfr、amg、amg1、amgx、amh、amhr、amhr2、aml1、aml1t1、aml2、aml3、amog、ampd1、ampd2、ampd3、amph、amph1、ampk、amt、amy1a、amy1b、amy1c、amy2a、amy2b、an2、anc、ancr、ang、ang1、anh1、ank1、ank2、ank3、anop1、anova、anp、anpep、anpra、anprb、anprc、ans、ant1、ant2、ant3、ant3y、anx1、anx11、anx13、anx2、anx214、anx3、anx4、anx5、anx6、anx7、anx8、aoah、aoc2、aox1、ap2tf、apah1、apba1、apba2、apbb1、apbb2、apc、apcs、ape、apeced、apeh、apex、api1、api2、api3、apj、aplp、aplp1、aplp2、apnh、apo31、apoa1、apoa2、apoa4、apob、apobec1、apoc1、apoc2、apoc3、apoc4、apod、apoe、apoer2、apoh、apolmt、apolp1@、apolp2@、app、appbp1、appl1、aprf、aprt、aps、apt1、aptl1g1、apx1、apy、aqdq、aqp0、aqp1、aqp2、aqp21、aqp3、aqp4、aqp5、aqp6、aqp7、ar、ar1、ara、araf1、araf2、arcn1、ard1、ard1、areg、arf1、arf2、arf3、arf41、arf5、arg、arg1、args、arh12、arh6、arh9、arha、arhb、arhc、arhg、arhgap2、arhgap3、arhgap6、arhgdia、arhgdib、arhh、arix、arl2、armd1、arnt、arnt1、aro、arp、arp1、arpkd、arr3、arrb1、arrb2、arsa、arsacs、arsb、arsc1、arsc2、arsd、arse、arsf、art、art1、art3、art4、arts、arvd1、arvd2、arvd3、arvd4、as、asat、asb、ascl1、ascl2、asct1、asd1、asd2、asgr1、asgr2、ash1、asip、as1、asln、asm1、asma、asmd、asmt、asmtlx、asmty、asnrs、asns、aspa、ass、astm1、astn、asv、at、at1、at2r1、at3、ata、atbf1、atcay、atf1、ath1、aths、atm、atoh1、atox1、atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a11、atp1b1、atp1b2、atp1b3、atp1b11、atp1g1、atp2a1、atp2a2、atp2a3、atp2b、atp2b1、atp2b2、atp2b2、atp2b3、atp2b4、atp4a、atp4b、atp5、atp5a、atp5b、atp5g1、atp5g2、atp5g3、atp5o、atp6a、atp6b1、atp6c、atp6e、atp6n1、atp7a、atp7b、atpm、atpsb、atpsk1、atpsk2、atq1、atr、atr、atr1、atr1、atr2、atrc1、atrc2、atrx、ats、atsv、atx1、atx2、au、auf1、aufla、aut、avcd、aved、avp、avpr1a、avpr1b、avpr2、avpr3、avrp、avsd、awa1、ax1、axl1g、axsf、azf1、azf2、azgp1、azu1、b120、b144、blg1、b29、b2m、b2mr、b3galt4、b4galt1、ba2r、bab1、bag1、bai1、bai2、bai3、bak1、bam22、bap1、bap135、bapx1、bard1、bark2、bas、bat1、bat2、bat3、bat4、bat5、bax、bb1、bbbg1、bbbg2、bbs1、bbs2、bbs3、bbs4、bbs5、bcas1、bcat1、bcat2、bcate2、bcd1、bcei、bche、bckdha、bckdhb、bcl1、bcl10、bcl2、bcl2a1、bcl212、bcl3、bcl5、bcl6、bcl7、bcl7a、bcl8、bcl9、bclw、bcm、bcm1、bcma、bcns、bcns、bcp、bcpm、bcpr、bcr、bcrl2、bcrl3、bcrl4、bcsg1、bct1、bct2、bdb、bdb1、bdc、bde、bdkrb1、bdkrb2、bdmf、bdmr、bdnf、bed、bedp、bek、bene、bevi、bf、bf1、bf2、bfhd、bfic、bfls、bfnc2、bfp、bfsp1、bft、bglap、bgmr、bgn、bgp、bhd、bhpcdh、bhr1、bicd1、bid、bigh3、bin1、bir、bjs、bkma1、blast1、blau、blk、blm、blmh、bltr、blvra、blvrb、blym、bmal1、bmd、bmh、bmi1、bmp1、bmp2、bmp2a、bmp2b1、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8、bmpr1a、bmpr1b、bmx、bmyb、bn51t、bnc、bnc1、bnp、bor、bpad、bpag1、bpag2、bpes、bpes1、bpes2、bpgm、bph1、bpi、br、br140、braf、brca1、brca2、brca3、brcacox、brcd1、brcd2、brdt、brf1、brhc、bric、brks、brn3a、brn3b、brn3c、brrn1、brw1c、bs、bsap、bsep、bsf2、bsg、bsnd、bss1、bst1、bst2、btak、btc、btd、bteb、bteb1、btg1、btg2、bths、btk、btk1、btn、bts、bub1b、bubr1、bwr1a、bwr1b、bws、bwscr1a、bwscr1b、bzrp、bzx、c11orf13、c1nh、c1qa、c1qb、c1qbp、c1qg、c1r、c1s、c2、c21orf1、c21orf2、c21orf3、c2ta、c3、c3br、c3dr、c3g、c4a、c4b、c4bpa、c4bpb、c4f、 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tsc1、tsc2、tsd、tse1、tsg101、tsg7、tshb、tshr、tsix、tsp3、tspy、tssc3、tst1、tst1、tsta3、tsy、ttc1、ttc3、ttf、ttf1、ttf2、ttg2、ttim1、ttn、ttp、ttp1、ttpa、ttr、tuba3、tubal1、tubb、tufm、tuft1、tulp1、tuple1、tw、tweak、twik1、twist、txgp11、txk、txn、txnr、txnrd1、tyh、tyk1、tyk2、tyk3、tyms、tyr、tyr1、tyro3、tyrp1、tyrp2、tys、u17hg、ulrnp、u22hg、u2af1、u2aflrs1、u2aflrs2、u2aflrs3、uba52、ubb、ubc、ubc4、ubc7、ubc8、ubch2、ubc1、ube1、ube2、ube2a、ube2b、ube2e2、ube2g、ube2g2、ube2h、ube2i、ube211、ube2v1、ube3a、ubh1、ubid4、ub11、uch11、ucn、ucp1、ucp2、ucp3、udpgdh、uev1、ufd11、ufs、ugalt、ugb、ugcg、ugdh、ugn、ugp1、ugp2、ugpp2、ugt1、ugt1a1、ugt2b11、ugt2b15、ugt2b17、ugt2b4、ugt2b7、ugt2b8、ugt2b9、ugt1、uhg、uhx1、ukhc、umod、umph2、umpk、umps、unc18、unc18b、und、ung、unr、unr、uox、up、upk1b、ups、uqbp、uqcrb、uqcrc1、uqcrc2、uqcrfs1、uqor1、uqor13、uqor22、urk、urkr、uroc、urod、uros、usf1、usf2、ush1、ush1a、ush1b、ush1c、ush1d、ush1e、ush1f、ush2a、ush3、usp11、usp5、usp7、usp9x、usp9y、ut1、ut2、ute、utr、utm、utx、uty、uv20、uv24、uvo、vacht、vacm1、vamp1、vamp2、vars1、vasp、vat1、vat2、vav、vav1、vav2、vbch、vbp1、vcam1、vcf、vc1、vcp、vdac1、vdac2、vdd1、vdi、vdr、vegf、vegfb、vegfd、vegfr3、vgf、vg1、vgr1、vh1、vhr、vil1、vil2、vim、vip、vipr1、vipr2、vis1、vla1、vla5a、vlacs、vlcad、vldlr、vmat1、vmcm、vmd1、vmd2、vnra、vnt、vp、vpp1、vpp3、vpreb1、vpreb2、vrf、vrk1、vrk2、vrnf、vrni、vsn11、vtn、vwf、vws、waf1、wars、was、wbs、wd1、wdr2、wee1、wfrs、wfs、wfs1、wgn1、whcr、wi、wisp1、wisp2、wisp3、wnd、wnt1、wnt10b、wnt13、wnt14、wnt15、wnt2、wnt3、wnt5a、wnt7a、wnt7b、wnt8b、wrb、wrn、ws1、ws2a、ws2b、ws4、wsn、wss、wss、wt1、wt2、wt3、wt4、wt5、wts、wts1、wws、x11、xbp1、xbp2、xce、xdh、xe169、xe7、xe7y、xg、xgr、xh2、xiap、xic、xist、xk、xla、xla2、xlp、xlpd、xlrs1、xm、xpa、xpb、xpc、xpcc、xpct、xpf、xpf、xpg、xpmc2h、xpnpep2、xpo1、xrcc1、xrcc2、xrcc3、xrcc4、xrcc5、xrcc9、xrs、xs、xwnt2、yb1、yes1、yk140、y11、yrrm1、yt、ywha1、ywhab、ywhah、ywhaz、yy1、zac、zag、zan、zap70、zf87、zfm1、zfp3、zfp36、zfp37、zfx、zfy、zic1、zic2、zic3、zipk、znf1、znf10、znf117、znfl1a、znf11b、znf12、znf121、znf123、znf124、znf125、znf126、znfl3、znf14、znf141、znfl44、znfl46、znfl47、znfl57、znf16、znfl60、znfl62、znfl63、znf165、znf169、znf173、znf179、znf189、znf19、znf192、znf193、znf195、znf198、znf2、znf20、znf200、znf204、znf217、znf22、znf23、znf24、znf25、znf26、znf27、znf29、znf3、znf32、znf34、znf35、znf36、znf38、znf4、znf40、znf41、znf42、znf44、znf45、znf46、znf5、znf6、znf69、znf7、znf70、znf71、znf72、znf73、znf74、znf75、znf75a、znf75c、znf76、znf77、znf79、znf8、zn80、znf81、znf83、znf9、znfc150、znfc25、znfxy、znt3、znt4、zp3a、zp3b、zpk、zws1、和zyx.
另外，得自细菌、植物、酵母和哺乳动物(例如小鼠)的基因可与本文提供的微生物一起应用。大肠杆菌基因的非限制性实例包括aarF、aas、aat、abpS、abs、accA、accB、accC、accD、acd、aceA、aceB、aceE、aceF、aceK、ackA、ackB、acnA、acnB、acpD、acpP、acpS、acpX、acrA、acrB、acrC、acrD、acrE、acrF、acrR、acs、ada、add、adhB、adhC、adhE、adhR、adiA、adiY、adk、aegA、aer、aes、agaA、agaB、agaC、agaD、agaI、agaR、agaS、agaV、agaW、agaZ、agp、ahpC、ahpF、aidB、ais、alaS、alaT、alaU、alaV、alaW、alaX、aldA、aldB、aldH、alkA、alkB、alpA、alr、alsA、alsB、alsC、alsE、alsK、alx、amiA、amiB、amn、ampC、ampD、ampE、ampG、ampH、amtB、amyA、ansA、ansB、apaG、apaH、aphA、appA、appB、appC、appY、apt、aqpZ、araA、araB、araC、araD、araE、araF、araG、araH、araJ、arcA、arcB、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argM、argP、argQ、argR、argS、argT、argU、argV、argW、argX、argY、argZ、aroA、aroB、aroC、aroD、aroE、aroF、aroG、aroH、aroI、aroK、aroL、aroM、aroP、aroT、arsB、arsC、arsR、artI、artJ、artM、artP、artQ、ascB、ascF、ascG、asd、aslA、aslB、asmA、asnA、asnB、asnC、asnS、asnT、asnU、asnV、asnW、aspA、aspC、aspS、aspT、aspU、aspV、asr、asu、atoA、atoB、atoC、atoD、atoS、atpA、atpB、atpC、atpD、atpE、atpF、atpG、atpH、atpI、avtA、azaA、azaB、azl、bacA、baeR、baeS、barA、basR、basS、bax、bcp、bcr、betA、betB、betI、betT、bfd、bfm、bfr、bglA、bglB、bglF、bglG、bglJ、bglT、bglX、bioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH、bioP、bipA、birA、bisC、bisZ、blc、bolA、bRNQ、brnR、brnS brnT、btuB、btuc、btuD、btuE、btuR、bymA、cadA、cadB、cadC、cafA、caiA、caiB、caiC、caiD、caiE、caiF、caiT、calA、caiC、calD、can、carA、carB、cbl、cbpA、cbt、cca、ccmA、ccmB、ccmC、ccmD、ccmE、ccmF、ccmG、ccmH、cdd、cde、cdh、cdsA、cdsS、cedA、celA、celB、ceIC、celD、celF、cfa、cfcA、chaA、chaB、chaC、cheA、cheB、cheR、cheW、cheY、cheZ、chpA、chpB、chpR、chpS、cirA、citA、citB、cld、cipA、clpB、clpP、clpX、cls、cmk、cmlA、cmr、cmtA、cmtB、coaA、cobS、cobT、cobU、codA、codB、cof、 cog？、corA、cpdA、cpdB、cpsA、cpsB、cpsC、cpsD、cpsE、cpsF、cpsG、cpxA、cpxB、cpxP、cpxR、crcA、crcB、creA、creB、creC、creD、crg、crl、crp、crr、csdA、csgA、csgB、csgD、csgE、csgF、csgG、csiA、csiB、csiC、csiD、csiE、csiF、cspA、cspB、cspC、cspD、cspE、cspG、csrA、csrB、cstA、cstC、cup、cutA、cutC、cutE、cutF、cvaA(ColV)、cvaB(ColV)、cvaC(Co-lV)、cvi(ColV)、cvpA、cxm、cyaA、cybB、cybC、cycA、cydA、cydB、cydC、cydD、cynR、cynS、cynT、cynX、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE、cysA、cysB、cysC、cysD、cysE、cysG、cysH、cysI、cysJ、cysK、cysM、cysN、cysP、cysQ、cysS、cysT、cysU、cysW、cysX？、cysZ？、cytR、dacA、dacB、dacC、dacD、dadA、dadB、dadQ、dadX、dam、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、dbpA、dcd、dcm、dcp、dcrB、dctA、dctB、dcuA、dcuB、dcuC、ddIA、ddlB、ddpA、ddpB、ddpC、ddpD、ddpF、ddpX、deaD、dedA、dedD、def、degP、degQ、degS、del、deoA、deoB、deoC、deoD、deoR、dfp、dgd、dgkA、dgkR、dgoA、dgoD、dgoK、dgoR、dgoT、dgsA、dgt、dicA、dicB、dicC、dicF、dinB、dinD、dinF、dinG、dinI、dinY、dipZ、djlA、dksA、dld、dmsA、dmsB、dmsC、dnaA、dnaB、dnaC、dnaE、dnaG、dnaI、dnaJ、dnaK、dnaL、dnaN、dnaQ、dnaT、dnaX、dppA、dppB、dppC、dppD、dppF、dppG、dps、dsbA、dsbB、dsbC、dsbG、dsdA、dsdC、dsdX、dsrA、dsrB、dut、dvl、dxs、ebgA、ebgB、ebgC、ebgR、ecfa、eco、ecpD、eda、edd、efp、enirA、emrB、emrD、emrE、endA、eno、entA、entB、entC、entD、entE、entF、envN envP、envQ、envR、envT、envY、envZ、epd、EppA、minigene、EppB、minigene、EppC、minigene、EppD、minigene、EppE、minigene、EppG、minigene、EppH、minigene、era、esp、evgA、evgS、exbB、exbC、exbD、expA、exuR、exuT、fabA、fabB、fabD、fabF、fabG、fabH、fabI、fabZ、fadA、fadB、fadD、fadE、fadH、fadL、fadR、farR、fatA、fbaA、fbaB、fbp、fcl、fcsA、fdhD、fdhE、fdhF、fdnG、fdnH、fdnI、fdoG、fdoH、fdoI、fdrA、fdx、feaB、feaR、fecA、fecB、fecC、fecD、fecE、fecI、fecR、feoA、feoB、fepA、fepB、fepC、fepD、fepE、fepG、fes、fexB、ffh、ffs、fhlA、fhlB、fhuA、fhuB、fhuD、fhuE、fhuF、fic、fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、fipB、fipC、fis、fiu、fixA、fixB、fixC、fixX、fklB、fkpA、fldA、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhc、flhD、fliA、fliC、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、flip、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、flk、flu、fmt、fnr、focA、focB、folA、folC、dolD、folE、folK、folP、folX、fpr、frdA、frdB、frdC、frdD、frr、fruA、fruB、fruK、fruR、fsr、ftn、ftsA、ftsE、ftsI、ftsJ、ftsK、ftsL、ftsN、ftsQ、ftsW、ftsX、ftsY、ftsZ、fucA、fucI、fucK、fucO、fucP、fucR、fumA、fumB、fumC、fur、fusA、fusB、gabC 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serS、serT、serU、serV、serW、serX、sfa、sfcA、sfiC、sfsA、sfsB、shiA、sipC、sipD、sir、sixA、sloB、slp、slr、slt、slyD、slyX、smp、smtA、sodA、sodB、sodC、sohA、sohB、solA、soxR、soxS、speA、speB、speC、speD、speE、speF、speG、spf、spoT、sppA、spr、srlA、srlB、srlD、srlE、srlR、srmB、srnA、ssaE、ssaG、ssaH、ssb、sseA、sseB、sspA、sspB、ssrA、ssrS、ssyA、ssyD stfZ、stkA、stkB、stkC、stkD、stpA、strC、strM、stsA、suucA、sucB、sucC、sucD、sufI、sugE、suhA、suhB、sulA、supQ、surA、surE、syd、tabC、tag、talA、talB、tanA、tanB、tap、tar、tas、tauA、tauB、tauC、tauD、tbpA、tdcA、tdcB、tdcC、tdcD、tdcE、tdcF、tdcG、tdcR、tdh、tdi tdk、tehA、tehB、tesA、tesB、tgt、thdA、thdC、thdD、thiB？、thiC、thiD、thiE、thiF、thiG、thiH、thil、thiJ、thiK、thiL、thiM、thrA、thrB、thrC、thrS、thrT、thrU、thrV、thrW、thyA、tig、tktA、tktB、tldD、tlnA、tmk、tnaA、tnaB、tnaC、tnm、tol-orf1、tol-orf2、tolA、tolB、tolC、tolD、tolE、tolI、tolJ、tolM、tolQ、toIR、tonB、topA、topB、torA、torC、torD、torR、torS、torT、tpiA、tpr、tpx、treA、treB、treC、treF、treR、trg、trkA、trkD、trkG、trkH、trmA、trmB、trmC、trmD、trmE、trmF、trmH、trmU、trnA、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpR、trpS、trpT、truA、truB、trxA、trxB、trxC、tsaA、tsf、tsmA、tsr、tsx、ttdA、ttdB、ttk、tufA、tuffB、tus、tynA、tyrA、tyrB、tyrP、tyrR、tyrS、tyrT、tyrU、tyrV、ubiA、ubiB、ubiC、ubiD、ubiE、ubiF、ubiG、ubiH、ubiX、ucpA[]、udk、udp、ugpA、ugpB、ugpC、ugpE、ugpQ、uhpA、uhpB、uhpC、uhpT、uidA、uidB、uidR、umuC、umuD、ung、upp、uppS、ups、uraA、usg-1、usbA、uspA、uup、uvh、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、uvs、uxaA、uxaB、uxaC、uxuA、uxuB、uxuR、valS、valT、valU、valV、valW、valX、valY、valZ、vsr、wrbA、xapA、xapB、xapR、xasA、xerC、xerD、xni、xseA、xseB、xthA、xylA、xylB、xylE、xylF、xylG、xylH、xylR、yccA、yhhP、yihG、yjaB、f147、yjaD、yohF、yqiE、yrfE、zipA、zntA、znuA、znuB、znuC、zur、和zwf。
小鼠基因的非限制性实例包括Ilr1、Ilr2、Gas10、Tnp1、Inhbb、Inha、Creb1、Mpmv34、Acrd、Acrg、Il110、Otf1、Rab11b-r、Abl1、ald、Amh-rs1、Bc12B、Cchlla3、Ccnb1-rs2、Gpcr16、Htr5b、Idd5、Igfbp2、Igfbp5、I18rb、Kras2-rs1、Mov7、Mpmv6、Mpmv16、Mpmv22、Mpmv25、Mpmv29、Mpmv42、Mtv7、Mtv27、Mtv39、Oprk1、Otf3-rs1、Otf8、Otf11-rs1、Ptgs2、Ren1、Ren2、Ril3、Sxv、Taz4-rs1、Tgfb2、Wnt6、Xmmv6、Xmmv9、Xmmv36、Xmmv61、Xmmv74、Xmv21、Xmv32、Xmv41、I12ra、Ab1、Mpmv3、Rap1a-ps2、anx、Mpmv43、Ryr3、Ras12-4、Adra2b、Avp、Glvr1、Il1a、Il1b、Mpmv28、Oxt、Pcsk2、a、Xmv10、Tcf4、Acra、Acra4、Ak1、Bdnf、bs、Cyct、Cyp24、Dbh、Fshb、Gcg、Gdf5、Gnas、Gpcr8、Grin1、Hcs4、Hior2、Hsp84-2、Idd12、Ilrn、Jund2、Kras3、Mc3r、Mpmv14、Mtv40、Mxi1-rs1、Otf3-rs2、Ptgs1、Ptpra、Rapsn、Src、Svp1、Svp3、Tcf3b、Wt1、Xmmv71、Xmv48、Ccna、Fgf2、Fth-rs1、Csfm、Mov10、Egf、Acrb2、Cap1、Crh、Fim3、Fps11、Glut2、Gpcr2、Gria2、Hsd3b-1、Hsd3b-2、Hsd3b-3、Hsd3b-4、Hsp86-ps2、Idd3、I12、I17、Mpvmv9、Mpmv20、Mtv4.8、Ngfb、Npra、Nras、Nras、Ntrk、Otf3-rs3、Otf3-rs4、Rap1a、Tshb、Xmmv22、Xmmv65、Mos、Ras12-7、Lyr、Ifa、Ifb、Jun、azh、db、Ipp、Mp1、Do1、Ak2、Ccnb1-rs4、Cdc211、Cga、Fgr、Foc1、Fps12、Gabrr1、Gabrr2、Gdf6、Glut1、Gnb1、Gpcr14、Grb2-ps、Grik3、Grik5、Hsp86-1ps4、Htr1da、Htr1db、Idd9、Ifa1、Ifa2、Ifa3、Ifa4、Ifa5、Ifa6、Ifa7、Ifa8、Ifa9、Ifa10、Lap18、Lmyc1、Mpmv19、Mpmv44、Mtv13、Mtv14、Mtv17、Nppb、Otf6、Otf7、Ri12、Ski、Tnfr2、Wnt4、Xmmv8、Xmmv23、Xmmv62、Xmv1、Xmv2、Xmv8、Xmv9、Xmv14、Xmv44、Xpa、Tec、Fgf5、Nos1、Tcf1、Epo、Gnb2、Flt1、Flt3、Ache、Adra2c、Adrbk2、Afp、Alb1、Ccnb1-rs1、Clock、Cyp3、Cyp3a11、Cyp3a13、Drd1b、Drd5、Fgfr3、Flk1、Gc、Gnrhr、Gpcr1、Hcs5、Hnfl、Htr5a、I15r、I16、Kit、Ltrm3、Mgsa、Mpmv7、Mpmv13、Mpmv23、Mtv32、Mtv41、Pdgfa、Pdgfra、Por、Txk、Xmmv3、Xmmv5、Xmmv52、Xmv17、Xmv28、Xmv34、Xmv38、Xmv45、Zp3、Trh、Raf1、Fth-rs2、Ntf3、Kras2、Pthlh、Mov1、Alox5、Braf2、Cftr、Egr4、Fpsl10、Fgf6、Gdf3、Ghrfr、Glut3、Grin2a、Hior3、Hoxa10、hop、Ica1、I15r、Int41、Itpr1、Krag、Mad、Met、Mi、Mtv8、Mtv23、Mtv29、Mtv33、Mtv34、Nkna、Npy、ob、Otf3-rs5、Tgfa、Tnfr1、Wnt2、Wnt5B、Wnt7A、Xmmv27、Xmv24、Xmv61、Fosb、Ryr1、Ngfa、Ufo、Xrcc1、Abpa、Abpga、Gabra4、Gas2、Acra7、Ccnb1-rs7、Egfbp3、Xmv30、Zp2、Fes、Pcsk3、Calc、Ccnb1-rs10、Pth、Ad、Bc13、Cea、Cea2、Cea3、Cea4、Cea5、Cea6、Cebp、Dm9、Dm15、Drd4、Egfbp1、Egfbp2、Ercc2、Fgf3、Fgfr2、Gabra5、Gabrb3、Gtx、Hcs1、Igf1r、Igf2、I14r、Ins2、Int40、Lhb、Mpmv1、Mtv1、Mtv35、Ngfg、Ntf5、Otf2、2、Pkcc、Ras14、Rras、Ryr、Svp2、Tcf3g、Tgfb1、tub、Xmmv31、Xmmv35、Xmmv73、Xmv33、Xmv53、Taz83、Adrb3、Junb、Jund1、Me1、Gpcr19-rs2、Agt、Cadp、Ccnb1-rs9、E、Fgfr1、Gas6、Gnb-rs1、Hcs2、Insr、Maf、Mov34、Mpmv21、Mpmv41、Mtv21、Mtnr1a、Plat、Ras15-2、Ras16、Sntb2、Xmmv29、Xmv12、Xmv26、Xmv62、Epor、Gpcr13、Otf11、Pthr、Acra3、Acra5、Acrb4、Camk1、Cdc25Mm、Crbp、Crbp2、Csk、Cyp11a、Cyp19、Drd2、Ets1、Fli1、Gnai2、Gnat1、Gpcr6、Gria4、Hgf1、Hior1、Hpx、Hsp86-1ps3、Hst2、Idd2、I11bc、Lag-rs1、Lap18-rs1、M11、Mpmv27、Penk、Pgr、Ras12-2、Tp11、Trf、Xmmv2、Xmmv67、Xmv15、Xmv16、Xmv25、Xmv60、Mgf、Amh、Braf、Cdc2a、Dmd1、Estr、Fps13、Fps14、Fps15、Gli、Gpcr17、Grik2、Ifgr、Igf1、Mpmv5、Mpmv12、Mpmv40、Myb、Oprm、Pg、Pmch、Ros1、Xmv31、Xmv51、Xmv54、Camk2b、Egfr、Int6、Lif、Mtv44、Ews、Csfgm、Flt4、I13、I14、I15、Irf1、Gria1、Glut4、Crhr、Csfg、Mov9、Xmv20、Acrb、Mpmv4、Mpmv15、Ngfr、Nos2、Rara、Taz4、Tcf2、Xmv42、Mtv3、Adra1、Crko、df、Erbb2、Gabra1、Gabra6、Gabrg2、Gh、Glra1、Grb2、Hnf1b、Hsp86-ps1、Idd4、Igfbp1、Igfbp3、I113、Int4、Mpmv2、Mpmv8、Mpmv18、Mtv45、nu、Pkca、Rab1、Re1、Shbg、Tcf7、Thra、Tnz1、Trp53、Wnt3、Wnt3A、Xmv4、Xmv5、Xmv47、Xmv49、Xmv63、Akt、Amh-rs4、Ccs1、Fps16、Fos、Gdf7、Hcs3、Hsp70-2、Hsp84-3、Hsp86-1、hyt、Ltrm1、Max、Mpmv11、Mpmv24、Mtv9、Mtv30、Pomc1、Tcf3a、Tda2、Tgfb3、Tpo、Tshr、Xmmv21、Xmmv25、Xmmv34、Xmmv50、Gli3、Xmv55、Ryr2、Inhba、Gas1、Pcsk1、Amh-rs2、Ccnb1-rs6、Ccnb1-rs13、Crhpb、Dat1、Drd1a、Fgfr4、Fps17、Fim1、Gpcr15、Gpcr18、Hbvi、Hi1da、Htr1a、Idd11、I19、Ltrm4、Mak、mes、P11、P12、Pr1、Ra1、Rasa、Srd5a1、Tpbp、Xmv13、Xmv27、Rarb、Rbp3、Htr2、Rb1、Acra2、Camkg、Cch11a2、Ccnb1-rs5、Ccnb1-rs12、Gnrh、Mtv11、Nras-ps、Otf3-rs6、Plau、Ptprg、Trp53-ps、Wnt5A、Xmv19、Ghr、I17r、Lifr、Mlvi2、Prlr、Myc、Rill、cog、Amh-rs7、I12rb、Pdgfb、Acr、CP2、Rarg、Sp1-1、Wnt1、Afr1、Atf4、Bzrp、Ccnb1-rs11、Cypllb、I13rb1、I13rb2、Ins3、Itga、Mlvi1、Mlvi3、Mtv36、Pdgfec、Svp5、Tef、Trhr、Wnt7B、Xmmv55、Xmmv72、Xmv37、Tnp2、Ets2、Casr、Chuck-rs1、din、Drd3、Erg、G22p1、Gap43、Gas4、Grik1、Htr1f、Ifgt、Int53、Ltrm2、Mpmv17、Mtv6、Mtvrl、Pit1、Xmv3、Xmv35、Xmv50、Igf2r、Mas、Tcd3、Glp1r、Idd1、Tla、Aeg1、Ccnb1-rs3、Cdc2b、Csi、Cyp21、Cyp21-ps1、Fps18、Gna-rs1、Gpcrl9-rs1、Grr1、Grr2、Hom1、Hsc70t、Hsp70、Hsp70-1、Hsp70-3、Hsp84-1、Hst1、Hst4、Hst5、Hst6、Hye、Int3、Itpr3、Lap18-rs2、Otf3、Ptprs、Rab11b、Ras12-1、Ras12-3、Ras13、Rrs、Rxrb、Tas、Tcd1、Tcd2、Tera1、Tla-rs、Tnfa、Tnfb、Tpx1、Tpx2、Xmmv15、Xmv36、Xmv57、Csfmr、Pdgfrb、Adrb2、Apc、Camk2a、Camk4、Dcc、Fgf1、Gna1、Gpcr7、Gr11、Grp、Hsp74、Mcc、Mtv2、Mtv38、Ptpn2、Tp12、Xmv22、Xmv23、Xmv29、Fth、Csfgmra、Mxi1、Adra2a、Adrb1、Adrbk1、Chuck、Cyp17、Gna14、Gnb-ps1、Hcs6、Htr7、Ide、Ins1、Lpc1、Pomc2、Seao、Tlx1、Xmmv42、Xmv18、Tcfe3、Araf、Avpr2、mdx、Ar、Zfx、Otf9、Ccg1、Ccnb1-rs8、Fps19、Gabra3、Glra2、Glra4、Gria3、Grpr、Hsp74-ps1、Hst3、Htrlc、I12rg、Mov14、Mov15、Mtv28、Otf3-rs8、Sts、Sxa、Sxr、Xta、Tdy、Hya、Zfy1、Zfy2、Mov15、Mov24、Mtv31、Mtv42、Sdma、Spy、Sts、Sxa、Sxr、XmmvY、Xmv7、Xmv11、及Xmv40。
菜豆(Phaseolus vulgaris)基因的非限制性实例包括Acc、ace、Adk、Am、Amv-1、Amv-2、Ane、aph、Arc、Are、arg、Ar1(Arc)、asp、B、bc-u、bc-1.sup.1、bc-1.sup.2、bc-2.sup.1、bc-2.sup.2、bc-3、Bcm、Beg、Bip、blu、Bpm、Bsm、By-1、By-2、C、C/c、c.sup.cr、C.sup.cir、C.sup.ma(M、R.sup.ma)、C.sup.r、C.sup.res、C.sup.rho、C.sup.st、[C.sup.st R Acc](Aeq)、c.sup.u(inh、i.sub.e)、[c.sup.u Prp.sup.i](Prp、c.sup.ui、Nud)、[c.sup.uprp.sup.st](prp.sup.st)、[C Prp](Prp)、c.sup.v、[CR](R)、[Cr](r)、Ca、Cam、Cav、cc、ch1、c1、cm1、Co-1(A)、Co-2(Are)、Co-3(Mexique 1)、Co-3.sup.2、Co-4(Mexique2)、Co-5(Mexique 3)、Co-6、Co-7、cr-1 cr-2、cry、cs、Ct、ctv-1 ctv-2、cyv(by-3)、D(Can、Ins)、Da、Db、def、dgs(g1、le)、dia、Diap-1、Diap-2、diff、dis、D1-1 D1-2(DL.sub.1 DL.sub.2)、do、ds(te)、dt-1.sup.adt-2.sup.a、dt-1.sup.b dt-2.sup.b、dw-1 dw-2、Ea Eb、ers(restr)、ers-2、Est-1、Est-2、exp、F、Fa、fast、Fb Fc、fa fb fc、Fcr、Fcr-2、fd、Fe-1 Fe-2、Fin(in)、Fop-1、Fop-2、Fr、Fr-2、G(Flav、Ca、Och)、Ga、gas、glb、Gpi-c1、Gr、Hb1(L.sub.HB-1)、Hbnc(SC.sub.HB-1)、Hbp(PD.sub.HB-1)、hmb、Hss、Hsw、Ht-1 Ht-2(L-1 L-2)、I、Ia Ib、ian-1 ian-2(ia)、lbd、ico、Igr(Ih)、ilo、ip、iter、iv、iw、J(Sh)、Ke、L、la、Lan、Ld、Lds(Ds)、Lec、Li(L)、lo、Ir-1 lr-2、mar、Me、Mel(Me)、Mel-2(Me-2)、mel-3(me-3)、Mf、mi、mia、Mic(Mip)、miv、Mrf、Mrf.sup.2、mrf、ms-1、Mue、mu mutator、Nag、Nd-l Nd-2(D-1 D-2)、nie、nnd(sym-1)、nnd-2、No、nts(nod)、Nudus、ol、P、p.sup.gri(Gri、v.sup.Pal)、pa、pc、pg(pa.sub.1)、Pha、Pmv、ppd(neu)、Pr、prc(pc)、Prx、punc、ram、Rbcs(rbcS)、rf-1、rf-2、rf-3、rfi(i)、Rfs(m)、Rk、rk、rk.sup.d(lin)、rn-1 rn-2(r r)、rnd、Ro、Sal、sb、sb.sup.ms、sb-2、sb-3、si1、Skdh、s1、Smv、St、Sur、sw-1 sw-2、T、t(z-1)、Th-1 Th-2、Tm、To、Tor(T)、Tr、tri、trv、Ts、tw、uni、Uni-2、uni.sup.nde、uni.sup.nie、Ur-1、Ur-2、Ur-2.sup.2、Ur-3(Ur-3、Ur-4)、Ur-3.sup.2、Ur-4、(Up-2、Ur-C)、Ur-5、(B-190)、Ur-6(Ur.sub.a、Ur-G)、Ur-7(R.sub.B11)、Ur-8(Up-1)、Ur-9(Ur.sub.p)、us、V(B1)、v.sup.lae(Cor)、v、var、vi(vir.sub.f)、wb、Wmv、X.sup.su、y、和Z。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因的非限制性实例包括PRE3、PUP1、PUP3、PRE2、PRE10、PRE1、PRE8、SCL1、PUP2、PRE5、PRE7、PRE4、RPT2、RPT3、RPN3、RPN11、RPN12、RPT6、RPN1、RPN2、RPT1、RPT5、RPT4、SKI6、RRP4、DIS3、TSC10、RAT1、GND1、EXO70、ERG10、ACC1、RPP0、ACT1、ARP100、ARP3、PAN1、ARP2、ARP4、ARP9、SPE2、CYR1、ALA1、TPS1、TUB1、ABF1、DED81、NIP1、YHC1、SNU71、ATM1、MAK5、ROK1、DED1、SPB4、AUR1、PSE1、ALG1、TUB2、BPL1、MSL5、ERG24、ERG26、ERG25、CMD1、HCA4、SHE9、SHE10、CAK1、PIS1、CHO1、CDS1、ESR1、NUD1、CDC47、CDC13、CDC37、CDC1、CDC4、CDC20、CDC6、CDC46、CDC3、KAR1、BBP1、HRP1、CCT2、CCT3、HSP10、SMC1、SMC2、CHC1、CFT2、CLP1、COP1、SEC26、SEC27、RET2、SEC21、COF1、CCT4、CCT1、CCT6、SEC24、SEC7、PCF11、RNA15、RNA14、FIP1、YSH1、TFB4、TSM1、APC2、APC5、SEC31、TAF47、TAP42、MPP10、CDC53、CKS1、CDC28、KIN28、CNS1、ERG11、DBP10、DBP8、PRO3、DYS1、ALR1、TID3、DNA2、SSL2、RAD3、REA3、RFA2、RFA1、RFC4、RFC5、RFC3、RFC2、RFC1、TOP2、RAP1、RPC25、PRI2、PRI1、POL1、POL12、HUS2、CDC2、POL2、DPB2、RPB10、RPA135、RPA190、RPA43、RPB8、RPO26、RPB5、RPC40、RPC19、SRB7、SRB4、RGR1、RPB11、SRB6、RPB2、RPB7、RPO21、RET1、RPO31、RPC31、RPC34、RPC53、RPC82、RPB12、RPB3、DPM1、DIP2、RNT1、CDC8、CDC14、DUT1、UBA2、UBA1、UBC9、CDC34、ENP1、ERD2、SSS1、SEC61、SEC63、SEC62、GNA1、GPI8、DAM1、DUO1、IRR1、PRP3、TIM9、HSH49、SUP35、EXM2、MEX67、ERG9、ERG20、FAS2、FAS1、NOP1、FAD1、AOS1、FBA1、NCB2、BRN1、TUB4、GDI1、GOG5、SRM1、CDC25、SPT16、YIF2、BET4、CDC43、MRS6、BET2、PRO1、GLN1、GLN4、GRS1、YIP1、FOL2、GPA1、CDC42、SAR1、YPT1、SEC4、GSP1、TEM1、RHO1、CDC24、RNA1、GUK1、VMA16、PMA1、HKR1、SIS1、MGE1、HSP60、HSF1、HAS1、MOT3、HTS1、ESA1、HSL7、HOM6、RIB7、SLY1、CSL4、PUR5、CSE1、IPP1、MDM1、USO1、SOF1、MAK11、LAS1、TEL2、DPB11、SGD1、FAL1、MTR3、MTR4、SPP2、SIK1、RRP7、POP4、RRP1、POP3、BFR2、CDC5、NRD1、MET30、MCM6、RRP46、SAS10、SCC2、ECO1、PRP43、BET3、BET5、STN1、NFS1、IDI1、SRP1、KAP95、CBF2、SKP1、CEP3、CTF13、ERG7、KRS1、PSA1、PMI40、ALG2、SSF1、MED7、RSC4、CDC54、MCM2、AFG2、ERG12、MVD1、CDC48、MHP1、ERV1、SSC1、TIM44、TIM17、TIM23、TOM22、TOM40、MAS1、MCD1、MMC1、STU1、JAC1、ABD1、CEG1、PAB1、MTR2、SEC16、ROT1、INO1、MLC1、MYO2、GPI2、SPT14、NAT2、NMT1、TRM1、NCP1、NBP1、ACF2、SPP41、NUT2、LCP5、PRP19、NMD3、RFT1、NNF1、NDC1、CRM1、KAR2、NIP29、NAB2、NIC96、NUP145、NUP49、NUP57、NUP159、NSP1、NUP82、CDC39、NPL4、POP7、NTF2、MAK16、NPL3、NOP2、NOP4、NHP2、NOP10、GAR1、NBP35、WBP1、STT3、SWP1、OST2、OST1、ORC1、ORC6、ORC5、ORC4、ORC3、RRR1、SAT2、PWP2、PEX3、TOR2、PIK1、SEC14、STT4、MSS4、PCM1、GPM1、SEC53、ERG8、YPD1、PAP1、NAB3、RRN7、SEN1、CFT1、PRP11、PRP21、PRP39、PRP24、PRP9、SLU7、PRP28、PRP31、IFH1、PTA1、SUB2、FMI1、MAS2、ESS1、PFY1、POL30、POP1、PDI1、RAM2、CDC7、SMP3、CDC15、YTH1、QRI2、YAE1、SFI1、SEC1、BET1、SEC6、SEC13、SEC2、SEC8、CBF5、CDC19、YRB1、RHC18、DBF4、SDS22、MCM3、CEF1、ALG11、GAA1、MOB1、NIP7、TIP20、SEC5、SEC10、GPI10、RRP3、CDC45、DIB1、MIF2、HOP2、PBN1、NOP5、RPP1、POP5、POP8、POP6、ERO1、MPT1、DNA43、ESP1、SMC3、LST8、STS1、RPM2、RNR1、RNR2、RNR4、RPS20、RPL25、RPL3、RPL30、RPL32、RPL37A、RPL43A、RPL5、RPL10、RPS3、CET1、YRA1、SNM1、GLE1、DBP5、DRS1、DBP6、BRR2、RRN3、RRN6、RRN11、M[ED6、PRP16、RPR2、DIM1、RRP43、RRP42、RRP45、SEC20、BOS1、CDC12、GLC7、PKC1、IPL1、SGV1、NRK1、RAD53、LCB2、LCB1、MPS1、SES1、SPC3、SEC11、RIO1、ARP7、NEO1、YJU2、POB3、ARH1、IQG1、HRT1、HYM1、MAK21、FUN20、FUN9、NBN1、STB5、YIF1、SMX4、YKT6、SFT1、SMD1、PRP6、LSM2、NUF1、SPC97、SPC42、SPC98、CDC31、SPC19、SPC25、SPC34、SPC24、NUF2、PRP40、MCD4、ERG1、SMC4、CSE4、KRR1、SME1、TRA1、RLP7、SCH9、SMD3、SNP2、SSF2、SPC72、CDC27、CDC23、CDC16、APC1、APC11、APC4、ARC19、RPN6、RpN5、RSC6、RSC8、STH1、SFH1、TIM12、TIM22、TIM10、SQT1、SLS1、JSN1、STU2、SCD5、SSU72、ASM4、SED5、UFE1、SYF1、SYF2、CCT5、TBF1、TOA2、TOA1、SUA7、TAF90、TAF61、TAF25、TAF60、TAF17、TAF145、TAF19、TAF40、TAF67、TFA2、TFA1、FCP1、TFG1、TFG2、TFB1、CCL1、SSL1、TFB3、TFB2、PZF1、BRF1、TFC5、TFC4、TFC3、TFC7、TFC6、TFC1、SPT15、THI80、THS1、SPT6、SPT5、ROX3、REB1、MCM1、MED4、MOT1、MED8、EFB1、YEF3、SUI1、CDC95、TIF11、SUI3、GCD11、SUI2、GCD6、GCD7、GCD2、GCD1、RPG1、GCD10、PRT1、TIF34、CDC33、TIF5、SUP45、GCD14、TIM54、SEC17、TPT1、TRL1、CCA1、SEN54、SEN2、SEN15、SEN34、WRS1、SLN1、TYS1、SNU56、PRP42、CUS1、PRP4、PRP8、SNU114、USS1、UFD1、SMT3、RSP5、QRI1、ALG7、UGP1、VTI1、VAS1、SEC18、CTR86、和ZPR1。
2.病毒本发明提供的微生物包括病毒。这些病毒典型地具有本发明提供的一或多种微生物特性。例如，本发明提供的病毒可以具有减毒的致病性、降低的毒性、优先积聚在免疫豁免细胞和组织如肿瘤中、具有激活针对肿瘤细胞的免疫应答能力、免疫原性、复制能力，并且能表达外源蛋白质，及这些性质的组合。在一些实施方案中，所述病毒具有激活针对肿瘤细胞的免疫应答而不攻击性地杀死所述肿瘤细胞的能力。
本发明提供的病毒可以是胞质病毒如痘病毒，或者可以是核病毒如腺病毒。本发明提供的病毒作为其生活周期的一部分可以溶解宿主细胞质膜。或者，本发明提供的病毒作为其生活周期的一部分可以通过非溶解途径如芽殖或胞吐退出所述宿主细胞。本发明提供的病毒可以由于作为病毒生活周期的一部分诱导的溶解或细胞凋亡的结果而导致宿主生物体产生对病毒感染的肿瘤细胞的免疫应答。本发明提供的病毒也可以遗传工程化为由于溶解或细胞凋亡的结果而导致宿主生物体产生针对病毒感染的肿瘤细胞的免疫应答，无论所述溶解或细胞凋亡是否是作为病毒生活周期的一部分而诱导。在一些实施方案中，本发明提供的病毒可以导致宿主生物体激发针对肿瘤细胞的免疫应答，而不溶解肿瘤细胞或导致肿瘤细胞死亡。
本领域技术人员可以从任何多种病毒中进行选择，根据许多因素包括但非限于病毒的指定用途(例如外源蛋白质产生、抗体产生或肿瘤治疗)、宿主生物体及肿瘤类型。
a.胞质病毒本发明提供的病毒可以是胞质病毒，其中病毒的生活周期不需要病毒核酸分子进入宿主细胞的细胞核中。已知许多胞质病毒，包括但非限于痘病毒、非洲猪流感病毒科，及各种RNA病毒如细小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、冠状病毒和弹状病毒。在一些实施方案中，病毒核酸分子在整个病毒生活周期不进入宿主细胞核。在其他实施方案中，所述病毒生活周期可以不使用宿主细胞核蛋白而进行。在其他实施方案中，病毒的毒性或致病性可以通过调节参与病毒复制的一或多种病毒蛋白的活性而调节。
i.痘病毒在一个实施方案中，本发明提供的病毒选自痘病毒科。痘病毒包括脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)如正痘病毒属(orthopoxvirus)、副痘病毒属(parapoxvirus)、禽痘病毒属(avipoxvirus)、山羊痘病毒属(capripoxvirus)、野兔痘病毒属(leporipoxvirus)、猪痘病毒属(suipoxvirus)、软疣痘病毒属(molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(yatapoxvirus)，以及昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)如昆虫痘病毒A属、昆虫痘病毒B属和昆虫痘病毒A属。脊椎动物痘病毒亚科是脊椎动物痘病毒，具有相似的抗原性、形态和宿主范围；因此本发明可以使用任何这种痘病毒。本领域技术人员根据病毒属或各个病毒的已知性质、根据选择的病毒特性(例如致病性、激发免疫应答的能力、优先的肿瘤定位)、病毒的指定用途、肿瘤类型和宿主生物体，而选择特定的脊椎动物痘病毒亚科各属或个体病毒。脊椎动物痘病毒亚科的属例如是正痘病毒属(orthopoxvirus)和禽痘病毒属(avipoxvirus)。
已知禽痘病毒感染许多不同的鸟类并已经被给予人体。禽痘病毒例如包括金丝雀痘病毒(canarypox virus)、鸟痘病毒(fowlpox virus)、灯草鹀痘病毒(juncopox virus)、八哥痘病毒(mynahpox virus)、鸽痘病毒(pigeonpox virus)、鹦鹉痘病毒(psittacinepox virus)、鹌鹑痘病毒(quailpox virus)、孔雀痘病毒(peacockpox virus)、企鹅痘病毒(penguinpox virus)、麻雀痘病毒(sparrowpox virus)、椋鸟痘病毒(starlingpox virus)和火鸡痘病毒(turkeypox virus)。
已知正痘病毒感染许多不同的哺乳动物，包括啮齿类动物、驯养动物、灵长类动物和人。一些正痘病毒具有广泛的宿主范围，而另外一些则具有较窄的宿主范围。正痘病毒例如包括水牛痘病毒(buffalopox virus)、骆驼痘病毒(camelpox virus)、牛痘病毒(cowpoxvirus)、鼠痘病毒(ectromelia virus)、猴痘病毒(monkeypox virus)、浣熊痘病毒(raccoon pox virus)、臭鼬痘病毒(skunk pox virus)、裸蹠沙鼠痘病毒(tatera pox virus)、uasin gishu病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)、类天花病毒(variola virus)和田鼠痘病毒(volepox virus)。在一些实施方案中，选择的正痘病毒可以是已知感染人的正痘病毒，如牛痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒或类天花病毒。任选地，已知感染人的正痘病毒可选自具有广泛宿主范围的正痘病毒类群，如牛痘病毒、猴痘病毒或痘苗病毒。
a.痘苗病毒一个正痘病毒实例是痘苗病毒。可获得许多痘苗病毒毒株，包括Western Reserve(WR)、Copenhagen、Tashkent、Tian Tan、Lister、Wyeth、IHD-J和IHD-W、Brighton、Ankara、MVA、Dairen I、L-IPV、LC16M8、LC16MO、LIVP、WR 65-16、Connaught，New York City Board ofHealth。举例性痘苗病毒是Lister或LIVP痘苗病毒。已知痘苗病毒，或相应于本发明提供的或为本领域技术人员所已知的降低痘苗病毒的毒性的修饰。然而，所述突变通常是一个多重突变体，并且进一步选择所述病毒以降低毒性。
痘苗病毒的线性dsDNA病毒基因组大小为大约200kb，编码共大约200个潜在的基因。病毒基因表达可以分为三个阶段。在早期阶段，基因表达主要是针对病毒复制及针对宿主免疫系统的防御。在中期阶段，在早期阶段不可表达的基因被表达，包括晚期阶段反式激活物。在晚期阶段，活性转录主要针对用于构建成熟病毒的病毒结构成分。
痘苗病毒具有许多用于癌症基因治疗和疫苗接种的特征。其具有广泛的宿主和细胞类型范围。痘苗病毒是一种胞质病毒，因此其在生活周期期间其基因组不插入宿主基因组中。与许多需要宿主转录系统的其他病毒不同，痘苗病毒可使用在病毒基因组中编码的酶支持其自身基因在宿主细胞质中表达。痘苗病毒基因组具有巨大的携带外源基因的能力，其中可以插入直至25kb的外源DNA片段(痘苗病毒基因组大小的大约12％)。对一些痘苗病毒毒株的基因组已经完全测序，鉴别了许多必要基因和非必需基因。由于不同毒株之间的高度序列同源，可使用来自一个痘苗病毒毒株的基因组信息在其他毒株中设计并产生修饰的病毒。最后，通过遗传工程产生修饰的痘苗病毒毒株的技术已经充分建立(Moss，Curr.Opin.Genet.Dev.3(1993)，86-90；Broderand Earl，Mol.Biotechnol.13(1999)，223-245；Timiryasova et al.，Biotechniques 31(2001)，534-540)。
在历史上，痘苗病毒用于针对天花感染进行免疫。近年来，揭示了修饰的痘苗病毒作为疫苗去抗击许多疾病。减毒的痘苗病毒可触发细胞介导的免疫应答。如引发/加强免疫、用不复制的痘苗病毒免疫的策略或这些策略的组合已经示出有希望开发出安全而有效的疫苗接种方案。先前研究中的突变的痘苗病毒呈现许多缺点，包括缺乏有效的输送病毒的载体以仅输送至所希望的组织(例如特异性积聚在肿瘤中)、由于可能的严重并发症而缺乏安全性(例如如果个体是严重免疫缺陷，则可以导致幼儿湿疹痘和脑炎，及成人播散性或进展性牛痘)。
b.修饰的痘苗病毒本发明提供了具有插入、突变或缺失的痘苗病毒，如在本文别处更详细的描述。修饰或选择所述痘苗病毒以具有低毒性并积聚在靶组织中。这种病毒例如来自LIVP毒株。
插入、突变或缺失例如是产生相对于野生型毒株减毒的痘苗病毒的那些插入、突变或缺失。例如，痘苗病毒插入、突变或缺失可以降低痘苗病毒的致病性，例如通过降低毒性、降低感染性、降低复制能力、或者降低痘苗病毒可积聚的非肿瘤器官或组织的数目而进行。插入、突变或缺失的其他实例包括但非限于增加所述微生物的抗原性、使得可以检测或成像、增加所述微生物毒性(任选地通过可诱导启动子控制)的插入、突变或缺失。例如，可以在参与核苷酸代谢、宿主相互作用和病毒形成的基因中产生修饰。本领域已知的痘苗病毒的任何插入、突变或缺失在本发明均可以使用，包括以下的插入、突变或缺失胸苷激酶(TK)基因、血凝素(HA)基因、VGF基因(如美国专利出版物No.20030031681所教导)；出血性区域或A型包涵体区域(如美国专利No.6,596,279所教导)；Hind III F、F13L或Hind III M(如美国专利No.6,548,068所教导)；A33R、A34R、A36R或B5R基因(见例如Katz et al.，J.Virology 7712266-12275(2003))；SalF7L(见例如Moore et al.，EMBO J.1992 111973-1980)；N1L(见例如Kotwal et al.，Virology 1989 171579-587)；M1λ(见例如Child et al.，Virology.1990174625-629)；HR、HindIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR或BamF(见例如Lee et al.，J Virol.1992 662617-2630)；或者C21L(见例如Isaacs et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1992 89628-632)。
c.F3基因除了本领域已知的突变之外，本发明提供的痘苗病毒可具有F3基因(SEQ ID No1；F3基因例如在GenBank中提供，登记号为No.M57977，其含有LIVP毒株F3的核苷酸及推定的氨基酸序列；也见于Mikryukov et al.，Biotekhnologiya 4442-449(1988))的插入、突变或缺失。例如，所述F3基因已经在位于痘苗病毒LIVP毒株DNA的F3基因内第35位或HindIII-F片段内第1475位的独特的单一NotI限制位点通过将一个外源DNA序列插入NotI消化的病毒DNA中而修饰(Mikryukov et al.，Biotekhnologiy 4(1988)，442-449)。如本发明所提供，将含有lacZ或萤光素酶/GFP的核酸分子插入LIVP毒株的F3基因的NotI位点(M57977中第1473-1480位核苷酸，或者SEQ IDNO1的第33-40位核苷酸)可以导致痘苗病毒相对于野生型痘苗病毒减少在裸鼠非肿瘤器官包括脑和心脏中的积聚。因此为了在本发明提供的方法中使用，痘苗病毒可含有F3基因的插入、突变或缺失或者相应基因座的突变。例如，如本发明所提供，中断的F3修饰的LIVP痘苗病毒可以在体内在肿瘤细胞中选择性复制。因此，具有中断的F3基因的修饰的痘苗病毒(例如修饰的LIVP毒株)可用于本发明提供的方法中，如肿瘤定向基因疗法及检测肿瘤和转移瘤的方法。
因此，本发明提供了具有F3基因修饰的痘苗病毒。例如，本发明提供的痘苗病毒可含有外源DNA插入F3基因中。外源DNA插入例如是插入在等同于痘苗病毒毒株LIVP的F3基因内NotI位点的位点或者在SEQ ID No1的第35位。本发明提供的F3修饰的痘苗病毒可以在肿瘤内特异性定位，并因此可用于肿瘤特异治疗性基因输送。使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)对痘苗病毒不同毒株的核苷酸序列进行GenBank数据分析。基于这项分析，发现在痘苗病毒Copenhagen毒株(Goebel et al.，Virology 179(1990)，247-266)中，所述NotI限制位点位于编码F14L和F15L基因的两个开放读框(ORF)之间。因此将外源基因插入VV Copenhagen毒株基因组的NotI位点不中断任何重要基因。在VV LIVP毒株中，所述NotI限制位点位于未知功能的编码F3基因的ORF中(Mikryukov et al.，Biotekhnologiya 4(1988)，442-449)。因此，将外源基因插入F3基因的NotI位点中断F3基因。F3基因修饰的能力提示其对病毒复制也许不必需。尽管F3基因对于病毒复制可能不必需，但动物实验的结果提示F3基因的中断与病毒毒性降低、病毒不能在脑或卵巢内复制、及优先在肿瘤组织中复制的能力相关。
F3基因在多种不同的痘苗病毒毒株中是保守的，所述毒株包括WR(GenBank登记号No.AY243312.1的第42238-42387位核苷酸)、Ankara(GenBank登记号No.U94848.1的第37155-37304位核苷酸)、Tian Tan(GenBank登记号No.AF095689的第41808-41954位核苷酸)、Acambis 3000(GenBank登记号No.AY603355.1的第31365-31514位核苷酸)及Copenhagen(GenBank登记号No.M35027.1的第45368-45517位核苷酸)毒株。F3基因在较大的痘病毒科中是保守的，特别是正痘病毒属如牛痘病毒(GenBank登记号No.X94355.2的第58498-58647位核苷酸)、兔痘病毒(GenBank登记号No.AY484669.1的第46969-47118位核苷酸)、骆驼痘病毒(GenBank登记号No.AY009089.1的第43331-43480位)、鼠痘病毒(GenBank登记号No.AF012825.2的第51008-51157位核苷酸)、猴痘病毒(GenBank登记号No.AF380138.1的第42515-42660位核苷酸)及类天花病毒(GenBank登记号No.X69198.1的第33100-33249位核苷酸)。因此，本发明还提供了所述F3基因在痘病毒中的等价物的修饰，如正痘病毒，包括许多痘苗病毒毒株。本领域技术人员可以鉴别等价的F3基因在各种痘病毒、正痘病毒和痘苗病毒中的位置。例如，痘病毒，正痘病毒和痘苗病毒中F3基因的等价物可包括含有与SEQ ID No1所示F3基因的核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的核苷酸序列的基因。在另一个实例中，在痘病毒、正痘病毒和痘苗病毒中F3基因的等价物可包括含有与SEQ ID No2所示F3基因的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性氨基酸序列的基因。在另一个实例中，LIVP中的F3基因等价物可以通过其在病毒基因组中的结构位置而确定所述F3基因位于痘苗病毒的HindIII-F片段上的开放读框F14L与F15L之间，如Goebel et al.，Virology(1990)179247-266所述，并且与ORFs F14L和F15L方向相反；本领域技术人员可易于鉴别位于大量各种相关病毒如大量各种痘病毒中结构等同区域中的基因。
蛋白质序列对比分析揭示了对蛋白质功能的一些洞察。与所述F3基因(LIVP毒株)编码的蛋白质最接近的匹配是来自线虫类Caenorhabditis elegans的脯氨酰4-羟化酶α亚基前体(4-PHα)(Veijolaet al.，J.Biol.Chem.269(1994)，26746-26753)。这个α亚基与人蛋白质二硫化物异构酶β亚基形成活性α-β二聚体。脯氨酰4-羟化酶(EC1.14.11.2)催化胶原蛋白中4-羟基脯氨酸形成。脊椎动物酶是一种α2-β2四聚体，其β亚基等同于蛋白质二硫化物异构酶(PDI)。这种蛋白质对于痘苗病毒复制的重要性还未知，但是这种蛋白质的缺乏可导致痘苗病毒再靶向于肿瘤组织。
d.多重修饰本发明提供的痘苗病毒也可以含有两或多个插入、突变或缺失。因此，本发明包括在本发明提供的基因座或本领域已知的其他基因座中含有两或多个插入、突变或缺失的痘苗病毒。在一个实施方案中，痘苗病毒在F3基因中含有一个插入、突变或缺失，及一或多个额外的插入、突变或缺失。在修饰的痘苗病毒的一个实施方案中，至少F3基因已经通过插入外源核苷酸序列而修饰。修饰如F3基因的修饰典型地导致基因或基因产物至少部分失活。在一个实例中，F3基因和TK基因通过插入外源核苷酸序列而修饰。在另一个实例中，F3基因和HA基因通过插入一个外源核苷酸序列而修饰。在另一个实例中，F3基因和TK及HA基因通过插入一个外源核苷酸序列而修饰。在另一个实例中，HA基因和TK基因通过插入一个外源核苷酸序列而修饰。因此，本发明的组合物和方法包括一种修饰的痘苗病毒，其中两或多个(a)F3基因、(b)TK基因及(c)HA基因已经被修饰。在一个实施方案中，F3基因、TK基因和HA基因中的至少两个基因已经失活，例如通过插入、缺失和/或置换编码区内的核苷酸而失活，或者两或多个这些基因的调节序列已经通过插入、缺失或突变而失活。
e.Lister毒株在另一个实施方案中，本发明提供的病毒和方法可基于对痘苗病毒的Lister毒株的修饰。Lister(也称作Elstree)痘苗病毒可得自各种来源。例如，Elstree痘苗病毒可在ATCC中获得，登记号VR-1549。Lister痘苗病毒毒株在具有高水平基因表达的肿瘤细胞中具有高度转导效率。
在一个实施方案中，所述Lister毒株可以是减毒的Lister毒株，如LIVP毒株(来自Institute of Viral Preparations，Moscow，Russia的Lister病毒)，其通过Lister毒株的进一步减毒而产生。LIVP毒株用于世界范围内的疫苗接种，特别是在印度和俄罗斯，并且是可广泛获得的。
LIVP毒株具有降低的致病性，同时保留高度的转导效率。例如，如本发明所提供，F3中断的修饰的LIVP痘苗病毒可选择性在体内在肿瘤细胞中复制。在一个实施方案中，本发明提供了修饰的LIVP病毒，包括具有修饰的TK基因的病毒、具有修饰的HA基因的病毒、具有修饰的F3基因的病毒、及具有修饰的HA基因、修饰的TK基因及修饰的F3基因中两或多个的病毒。
ii.其他胞质病毒本发明还提供了不是痘病毒的胞质病毒。胞质病毒可以复制而不将病毒核酸分子导入宿主细胞核中。本领域已知许多这种胞质病毒，包括非洲猪流感病毒科及各种RNA病毒如沙粒病毒(arenaviruses)、小核糖核酸病毒(picornaviruses)、杯状病毒(caliciviruses)、披膜病毒(togaviruses)、冠状病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxoviruses)、黄病毒(flaviviruses)、呼肠孤病毒(reoviruses)和弹状病毒(rhaboviruses)。披膜病毒例如包括新培斯(Sindbis)病毒。沙粒病毒例如包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus)。弹状病毒包括疱疹性口炎病毒。副粘病毒例如包括新城疫病毒和麻疹病毒。小核糖核酸病毒例如包括脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒和鼻病毒。黄病毒例如包括黄热病病毒，本领域已知减毒的黄热病病毒，如Barrett et al.，Biologicals 2517-25(1997)和McAllister et al.，J.Virol.749197-9205(2000)所例证。
本发明还提供了对上述病毒的修饰以相对于野生型病毒增强一或多种特性。这些特性可包括但非限于减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、及能表达外源蛋白质，及这些特性的组合。在一些实施方案中，所述修饰的病毒具有激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力，而不攻击性杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，所述病毒可以修饰为表达一或多个可监测的基因，包括可用于成像的基因。在其他实施方案中，所述病毒可以修饰为表达一或多个基因以收获基因产物和/或收获针对所述基因产物的抗体。
b.腺病毒、疱疹病毒、反转录病毒本发明进一步提供了包括在其生活周期中使得核酸分子进入宿主细胞核的病毒。本领域已知许多这种病毒，包括疱疹病毒(herpesviruses)、乳多空病毒(papovaviruses)、反转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)、细小病毒(parvoviruses)和正粘病毒(orthomyxoviruses)。疱疹病毒例如包括I型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒。乳多空病毒例如包括人乳头瘤病毒(papillomaviruses)和SV40病毒。反转录病毒例如包括慢病毒。正粘病毒例如包括流感病毒。细小病毒例如包括腺伴随病毒。
本发明还提供了对上述病毒的修饰，以相对于野生型病毒增强一或多种特性。这些特性可包括但非限于减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、及能表达外源蛋白质，及这些特性的组合。在一些实施方案中，所述修饰的病毒具有激活针对肿瘤细胞的免疫应答能力，而不攻击性杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，所述病毒可以修饰为表达一或多种可检测的基因，包括可用于成像的基因。在其他实施方案中，所述病毒可以修饰为表达用于收获基因产物和/或收获针对所述基因产物的抗体的一或多种基因3.细菌细菌也可以用于本发明提供的方法中。具有希望特性的任何细菌均可以使用。在一个实施方案中，可以使用需氧菌。在另一个实施方案中，可以使用厌氧菌。在另一个实施方案中，可以使用胞外细菌。在另一个实施方案中，可以使用胞内细菌。
在一些实施方案中，本发明提供的细菌可以是胞外细菌。本领域已知许多胞外细菌，包括弧菌、乳酸菌、链球菌、埃希氏菌。细菌例如包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。在其他实施方案中，本发明提供的细菌可以是胞内细菌。本领域已知许多胞内细菌，包括李斯特氏菌(listeria)、沙门氏菌(salmonella)、梭菌(clostridium)和双歧杆菌(bifodobacterium)。胞内细菌例如包括单核李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、长双歧杆菌(Bifodobacterium longum)和青春双歧杆菌(Bifodobacteriumadolescentis)。另外的细菌包括植物细菌如密歇根棍状杆菌密歇根亚种(Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris)。
本发明提供的细菌的另外例如是磁性细菌。这种细菌使得可以通过基于铁的造影剂的积聚而可以检测肿瘤。磁性细菌可以分离自淡水和海底沉积物。磁性细菌可以产生磁性粒子(Fe3O4)(Blakemore，Annu.Rev.Microbiol.36(1982)，217-238)。为此，磁性细菌具有有效的铁摄取系统，使得其可以利用不可溶的和可溶修饰的铁。Magnetospirillummagnetic AMB-1是这种磁性细菌的一个实例，其已经被分离并培养以产生磁性粒子(Yang et al.，Enzyme Microb.Technol.29(2001)，13-19)。如本发明所提供，这些磁性细菌(天然发生的或遗传修饰的)当静脉内注射时，可以选择性积聚在肿瘤内。因此，这些细菌可用于在肿瘤内积聚基于铁的造影剂，并接下来使得可以通过MRI检测肿瘤。相似地，其他天然分离的积聚金属的细菌菌株可用于肿瘤靶向、从造影剂中吸收金属，及肿瘤成像。
本发明还提供了对细菌修饰以相对于野生型细菌增强一或多种特性。这些特性可包括但非限于减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活抗肿瘤免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、及能表达外源蛋白质，以及这些特性的组合。在一些实施方案中，所述修饰的细菌具有激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力，而不攻击性杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，所述细菌可以修饰为表达一或多种可检测的基因，包括可用于成像的基因。在其他实施方案中，所述细菌可以修饰为表达用于收获基因产物和/或用于收获针对所述基因产物的抗体的一或多种基因。
a.需氧菌先前的研究主张优选给予肿瘤厌氧菌(Lemmon et al.，1997 GeneTherapy 4791-796)。如本发明所提供，已经确定需氧菌可以在肿瘤内存活并生长。因此，用于本发明提供的方法中的细菌可包括在充氧环境中可以存活并生长的细菌。在一些实施方案中，细菌必须在充氧环境中以存活并生长。本领域已知许多需氧菌，包括乳酸杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌、弧菌、李斯特氏菌和埃希氏菌。细菌例如包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、单核李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、副酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、生胞乳酸菌(Lactobacillus sporogenes)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、耻垢分枝杆菌(Myobacterium smegmatis)、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、哈瓦那分枝杆菌(Mycobacteriumhabana)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
b.厌氧菌本发明提供的方法中使用的细菌可包括不需要氧以存活和生长的细菌。在一些实施方案中，细菌必须在无氧环境中以存活并生长。本领域已知许多需氧菌，包括梭菌、双歧杆菌。细菌例如包括溶组织梭菌(Clostridium histolyticus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、不同梭菌(Clostridium absonum)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、Bifidobacterium laterosporus、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobis)、普氏消化球菌(Peptococcus prevotti)及发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)。
4.真核细胞本发明提供的微生物及生产和使用这些微生物的方法还涵盖了真核细胞，包括来自多细胞真核生物的细胞，所述真核生物包括哺乳动物如灵长类动物，其中示例性细胞是人细胞。典型地，所述细胞是分离的细胞。例如，真核细胞可以是肿瘤细胞，包括哺乳动物肿瘤细胞如灵长类动物肿瘤细胞，其中所述灵长类动物肿瘤细胞例如是人肿瘤细胞，如人乳腺癌细胞。在另一个实例中，真核细胞可以包括纤维肉瘤细胞如人纤维肉瘤细胞。示例性人纤维肉瘤细胞包括HT1080(ATCC登记号No.CCL-121，CRL-12011或CRL-12012)。在另一个实例中，真核细胞可包括干细胞，包括哺乳动物干细胞如灵长类动物干细胞，其中所述灵长类动物干细胞例如是人干细胞。
本发明还提供了对真核细胞的修饰以相对于野生型细胞增强一或多种特性。这些特性可包括但非限于减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活抗肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、及能表达外源蛋白质，及这些特性的组合。在一些实施方案中，所述修饰的真核细胞具有激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力，而不攻击性杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，所述真核细胞可以修饰为表达一或多种可检测的基因，包括可用于成像的基因。在其他实施方案中，所述真核细胞可以修饰为表达用于收获基因产物和/或用于收获针对所述基因产物的抗体的一或多种基因。
C.制造修饰的微生物的方法本发明提供的微生物可以通过本领域熟知的修饰微生物如病毒、细菌和真核细胞的标准方法形成。简而言之，所述方法包括在微生物中导入一或多种遗传修饰，随后针对反映所述修饰的性质或其他所希望性质筛选微生物。
1.遗传修饰可以使用分子生物学中的标准技术产生本发明提供的修饰的微生物。这些技术包括各种核酸操纵技术、核酸转移方案、核酸扩增方案，及本领域已知的其他分子生物学技术。例如，可以通过使用寡核苷酸介导的定点诱变将点突变导入感兴趣的基因。或者，可以使用同源重组向感兴趣的靶序列中导入突变或外源序列。核酸转移方案包括氯化钙转化/转染、电穿孔、脂质体介导的核酸转移、N-[1-(2，3-Dioloyloxy)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐介导的转化、以及其他方案。在另一种诱变方案中，可以使用正选择压力选择特定基因中的点突变。见例如Current Techniques in Molecular Biology，(Ausubel等编辑)所述。核酸扩增方案包括但非限于聚合酶链反应(PCR)。本领域熟知对于大量病毒和细胞生物体的核酸工具如质粒、载体、启动子及其他调节序列的应用。另外的大量核酸工具可得自许多不同的来源，包括ATCC及各种商业来源。本领域技术人员能根据本领域的知识和设计选择而易于选择用于遗传修饰任何特殊的病毒或细胞生物体的合适的工具和方法。
任何修饰均可使用本领域已知的标准分子生物学方法而易于完成。所述修饰典型地是微生物基因组的一或多个截短、缺失、突变或插入。在一个实施方案中，所述修饰可以特异性针对特定的序列。所述修饰可以针对所述微生物基因组的任何区域，包括但非限于调节序列、基因编码序列或者未知作用的序列。可进行修饰的微生物基因组的任何区域对于许多微生物包括本文特别列出的微生物是为本领域所易于知晓的。非限制性例如本发明提供的多种痘苗病毒基因的基因座例证了本发明提供的微生物中可以被靶向修饰的不同区域的数目。在另一个实施方案中，所述修饰可以是完全或部分随机的，对任何特定修饰的微生物的选择可以根据修饰的微生物的所希望的性质确定。
在一些实施方案中，所述微生物可以修饰为表达一种外源基因。外源基因产物例如包括蛋白质和RNA分子。所述修饰的微生物可以表达一种可检测的基因产物、治疗性基因产物、为了生产或收获的基因产物、或者为了收获抗体的抗原基因产物。这种基因产物的特性在本文别处描述。在修饰生物体以表达一种外源基因的一些实施方案中，所述修饰也可以含有一或多个调节序列以调节外源基因的表达。如本领域所已知，调节序列可以使得外源基因组成型表达或者可以使得外源基因可诱导表达。另外，所述调节序列可以控制外源基因的表达水平。在一些实例中，可诱导表达可以在肿瘤细胞中或者微生物感染的肿瘤细胞中存在的细胞或其他因子的控制之下。在其他实例中，可诱导表达可以在一种可给予的物质的控制下，所述物质包括IPTG、RU486或其他已知诱导化合物。本领域技术人员根据已知因素和设计偏好可获得任何调节序列。在一些实施方案中，如基因产物的生产和收获中，所述调节序列可以导致组成型高水平的基因表达。在一些实施方案中，如为了收获抗基因产物抗体，所述调节序列可导致组成型低水平的基因表达。在肿瘤治疗实施方案中，治疗性蛋白质可以在内在可诱导启动子或外在可诱导启动子的控制之下。
在其他实施方案中，器官或组织特异性表达可以通过调节序列控制。为了达到仅在靶器官例如待治疗的肿瘤中表达，外源核酸序列可以与组织特异性启动子连接及用于基因治疗。这些启动子为本领域技术人员所熟知(见例如Zimmermann et al.，(1994)Neuron12，11-24；Vidal et al.；(1990)EMBO J.9，833-840；Mayford et al.，(1995)，Cell81，891-904；Pinkert et al.，(1987)Genes & Dev.1，268-76)。
在一些实施方案中，所述微生物可以修饰为表达两或多种蛋白质，其中所述两或多种蛋白质的任意组合可以是更可检测的基因产物、治疗性基因产物、用于生产或收获的基因产物、或者用于收获抗体的抗原性基因产物。在一个实施方案中，微生物可以修饰为表达一种可检测的蛋白质和一种治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，微生物可以修饰为表达两或多种用于检测的基因产物或者表达两或多种治疗性基因产物。例如，参与萤光素酶底物生物合成的一或多种蛋白质可以与萤光素酶一起表达。当导入两或多个外源基因时，所述基因可以在相同或不同的调节序列下调节，并且所述基因可以在遗传操纵的一或多个步骤插入微生物基因组的相同或不同区域中。在一些实施方案中，一个基因如编码可检测的基因产物的基因可以在组成型启动子的控制下，而另一个基因如编码治疗性基因产物的基因可以在可诱导启动子的控制下。将两或多个基因插入微生物中的方法为本领域所已知，并可易于针对众多的微生物使用众多的外源基因、调节序列和/或其他核酸序列而进行。
在进行微生物修饰方法的一个实例中，痘苗病毒LIVP毒株修饰为在病毒基因组的三个不同位置含有外源DNA插入。使用本领域已知的一般方法、已知的分子生物学工具及本领域已知或本发明公开的序列，可以产生修饰的痘苗病毒毒株，包括F3基因、TK基因和/或HA基因中含有插入的病毒。见例如Mikryukov，et al.，Biotekhnologya4(1998)，442-449；Goebel et al.，Virology179(1990)，247-266；Antoineet al.，Virology244(1998)，365-396；Mayr et al.，Zentbl.Bakteriol.Hyg.Abt 1 Orig.B167(1978)，375-390；Ando and Matumoto，Jpn.J.Microbial.14(1979)，181-186；Sugimoto et al.，Microbial.Immuol.29(1985)，421-428；Takahashi-Nishimaki et al.，J.Gen.Virol.68(1987)，2705-2710)。这些方法包括例如体外重组技术、合成方法及体内重组方法，例如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，cold Spring HarborNY(1989)及本发明实施例中所述方法。本领域技术人员可以从任何痘苗病毒毒株中分离编码F3基因产物(或相关基因产物)的基因，使用例如SEQ ID No1或SEQ ID NO10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示F3基因的核苷酸序列或者其片段作为探针筛选文库而进行产生重组微生物的方法为本领域所已知。本发明举例提供的方法是产生重组痘苗病毒的方法。在F3基因中有插入体的重组痘苗病毒可以通过如下步骤制备(a)产生(i)含有插入在限制位点X的修饰的F3基因的痘苗病毒穿梭质粒及(ii)去磷酸化的在限制位点X消化的wtVV(VGL)DNA；(b)用步骤(a)的构建体(i)和(ii)的混合物转染PUV失活的辅助VV(VGL)感染的宿主细胞；(c)从所述转染体中分离重组痘苗病毒。本领域技术人员已知怎样进行这种方法，例如通过如下实施例1所述及图1所示进行，也见于Timiryasova et al.，Biotechniques31(2001)，534-540所述。在一个实施方案中，限制位点X是一个独特的限制位点。本领域技术人员已知各种合适的宿主细胞，包括对痘苗病毒感染易感的许多哺乳动物、禽类和昆虫细胞和组织，包括鸡胚、兔、仓鼠和猴肾细胞，例如HeLa细胞、RK13、CV-1、Vero、BSC40和BSC-1猴肾细胞。
2.针对上述特性进行筛选修饰的微生物可以针对任何希望的特性筛选，包括本发明所述特性如减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、及能表达外源蛋白质，及这些特性的组合。例如，所述修饰的微生物可以针对激活针对肿瘤细胞免疫应答而不攻击性杀死肿瘤细胞的能力进行筛选。在另一个实例中，所述微生物可以针对一或多个可检测的基因包括可用于成像的基因的表达进行选择，或者针对用于生产或收获基因产物和/或收获针对所述抗基因产物的抗体的一或多个基因的表达进行选择。
可以进行任何已知方法以筛选这种特性，如本发明实施例所述。筛选所希望的特性的一种方法例如包括但非限于监测生长、复制和/或在细胞培养物或其他体外培养基中的基因表达(包括外源基因的表达)。所述细胞培养物可来自任何生物体及来自任何组织来源，并且可包括肿瘤组织。筛选所希望特性的其他示例性方法包括但非限于给予动物包括非人动物如小鼠、猴或猿任选地也包括人一种微生物，并监测所述微生物、肿瘤或动物；监测可以通过所述微生物和/或肿瘤的体内成像(例如微生物基因表达的弱光成像或超声肿瘤成像)，外部监测所述肿瘤(例如肿瘤大小的外部测定)，监测所述动物(例如监测动物体重、血样、抗体效价、脾大小或肝大小)而进行。筛选所希望特性的其他示例性方法例如包括但非限于针对微生物的作用和定位及微生物表达收获非人动物，包括如收获各种器官包括肿瘤以确定所述器官或肿瘤中所述微生物和/或微生物的基因表达的存在，收获与免疫应答或微生物清除相关的器官如脾或肝，收获所述肿瘤以确定肿瘤大小及肿瘤细胞存活力，收获抗体或产生抗体的细胞。这些筛选和监测方法可以各种组合应用，这些组合为本领域所已知。在一个实施方案中，微生物可以通过给予动物如非人动物或人所述微生物，随后通过体内成像监测而筛选。在另一个实施方案中，微生物可以通过给予动物如非人动物所述微生物，通过体内成像及随后收获所述动物而筛选。因此，本发明提供了根据所希望的特性筛选微生物的方法，所述方法通过给予动物如具有肿瘤的动物所述微生物，监测所述动物、肿瘤(如果存在的话)和/或动物中的微生物的一或多种特性进行。本发明还提供了根据所希望的特性筛选微生物的方法，所述方法通过给予非人动物如具有肿瘤的非人动物所述微生物、收获所述动物并针对一或多种特性测定所述动物的器官、抗体效价和/或肿瘤(如果存在的话)进行。
本发明提供了针对减弱的致病性或降低的毒性筛选微生物的方法，其中所述致病性或毒性可以通过各种技术确定，包括但非限于评估对象的健康状况，测定对象的体重，进行对象的血液或尿液分析，及监测对象体内所述微生物的组织分布；这些技术可以对活的对象在体内进行或者死后进行。所述方法还包括所述微生物溶解细胞或导致细胞死亡的能力，这可以在体内或体外确定。
当对象的体重下降至阈值体重之下时，可认为所述微生物对对象是致病性的。示例性阈值可以是相对于参考体重下降大约5％或更多，下降大约10％或更多，或者下降大约15％或更多。体重参考可选自本领域使用的任何参考；例如，体重参考可以是在给予所述微生物之前所述对象的体重，所述体重参考可以是具有与受试对象(例如正常或注射肿瘤的对象)相同条件的对照对象，其中在给予所述微生物后的一定时间将对照体重的改变与受试对象体重的改变进行对比。
所述对象的血液或尿液分析可表明其免疫应答的水平、体内毒素的水平或者其细胞、组织或器官如肾、胰、肝和脾的其他应激水平。水平增加至高于确定的阈值水平可表明所述微生物对所述对象的致病性。表明微生物致病性的血液或尿液成分的阈值水平为本领域所熟知，可以根据对所述微生物所希望的致病性或毒性耐受力选择任何这种阈值。
所述对象中微生物的组织分布可表明所述微生物的致病性或毒性。在一个实施方案中，非致病性或毒性的微生物的组织分布可以是相对于其他组织或器官而主要分布在肿瘤中。主要积聚在肿瘤中的微生物可以比积聚在任何其他特殊器官或组织中的多例如至少大约2倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约100倍、至少大约1,000倍、至少大约10,000倍、至少大约100,000倍或者至少大约1,000,000倍。
本发明提供了针对组织分布或积聚筛选微生物的方法，其中所述组织分布可以通过多种技术确定，包括但非限于收获非人对象，在对象体内对可检测的基因产物成像。收获可以通过对非人对象行安乐死进行，确定微生物在肿瘤内的积聚，及任选地确定微生物在一或多个额外的组织或器官中的积聚。所述积聚可以通过任何多种确定，包括但非限于检测基因产物如可检测的基因产物(例如gfp或β半乳糖苷酶)，对组织、器官或肿瘤样品进行组织学评价或显微镜检，或者测定组织、器官或肿瘤样品中存在的噬斑或集落形成单位数目。在一个实施方案中，微生物可以所希望量相对于其他组织或器官主要分布于肿瘤中。主要积聚在肿瘤中的微生物可以比积聚在任何其他特殊器官或组织中的多例如至少大约2倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约100倍、至少大约1,000倍、至少大约10,000倍、至少大约100,000倍或者至少大约1,000,000倍。
本发明还提供了筛选可激发免疫应答的微生物的方法，其中所述免疫应答可以是针对所述肿瘤细胞或所述微生物。本领域已知各种测定激发免疫应答能力的方法，包括测定对象中免疫活性全面提高、测定对象抗微生物或抗肿瘤抗体增加、测试经微生物处理的对象(典型为非人受试对象)预防后期感染/肿瘤形成或者快速消除微生物或肿瘤细胞的能力。所述方法还可包括确定所述微生物溶解细胞或导致细胞死亡的能力，这可以在体内或体外确定。
本发明还提供了确定复制能力增加或降低的方法，通过监测所述微生物复制的速度而进行。这种测定可以在体内或体外进行。例如，在细胞培养物中的复制速度可用于确定微生物的复制能力。在另一个实例中，在对象的组织、器官或肿瘤中的复制速度可用于确定复制能力。在一些实施方案中，在非肿瘤组织和器官中复制能力降低可以是在筛选中选择的特性。在其他实施方案中，在肿瘤中复制能力增加可以是筛选中选择的特性。
本发明还提供了确定微生物表达基因如外源基因的能力的方法。这些方法可以在体内或体外进行。例如，所述微生物可以在选择平板上针对表达允许所述微生物存活或者允许所述微生物提供可检测信号如变成X-gal蓝色的基因的能力而筛选。这些方法也可以在体内进行，其中表达可以例如通过收获非人对象的组织、器官或肿瘤或者通过对象的体内成像而确定。
本发明还提供了确定微生物表达一些基因的能力的方法，对象针对所述基因可以产生抗体，包括对象针对其可以产生抗体的外源基因。这些方法可以使用任何非人对象在体内进行。例如，确定基因表达可以例如通过引流已经给予微生物的非人对象的血液，并测定该血液(或血清)中针对微生物表达的基因的抗体的存在情况而进行，或者通过通常用于多克隆抗体收获的任何其他方法进行，如产生出血和终止出血。
本发明还提供了筛选具有本发明提供的两或多种特性的微生物的方法，包括筛选减弱的致病性、降低的毒性、优先积聚在肿瘤中、增加的激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、增加的免疫原性、增加或降低的复制能力、表达外源蛋白质的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。一种单一监测技术如体内成像可用于证实两或多种特性，或者可使用各种不同的监测技术，这可以由本领域技术人员根据所选择的特性及根据所使用的监测技术加以确定。
D.治疗方法本发明提供了治疗方法，包括治疗或预防免疫豁免的细胞或组织包括癌细胞、肿瘤和转移瘤的方法。本发明提供的方法包括给予具有肿瘤和/或转移瘤的对象一种微生物。本发明提供的方法不需要所述微生物杀死肿瘤细胞或降低肿瘤大小。相反，本发明提供的方法包括给予对象能导致或增强对象抗肿瘤免疫应答的一种微生物。在一些实施方案中，本发明提供的微生物可给予对象而不产生微生物诱导的疾病。在一些实施方案中，所述微生物可积聚在肿瘤或转移瘤中。在一些实施方案中，所述微生物可激发对象抗肿瘤免疫应答，其中典型地所述微生物介导的抗肿瘤免疫应答可在几天之后产生，如一周或更长时间、10天或更长时间、两周或更长时间、一个月或更长时间，结果是很少或没有微生物导致肿瘤细胞死亡。在一些示例的方法中，所述微生物可以存在于肿瘤中并导致抗肿瘤免疫应答以阻止肿瘤生长，而微生物自身不导致肿瘤细胞死亡。
在一些实施方案中，本发明提供了激发或增强对象针对所选择的抗原或选择的抗原类型的抗体产生的方法，其中所述方法包括给予对象能在肿瘤和/或转移瘤中积聚的一种微生物，并可以导致所选择的抗原或所选择的抗原类型从肿瘤中释放，导致针对所选择的抗原或所选择的抗原类型的抗体产生。给予的微生物可以具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。
任何抗原在本发明提供的方法中均可以被靶向，包括所选择的抗原如微生物表达的外源基因产物，或者所选择的抗原类型如由于微生物感染肿瘤所致的(例如通过溶解、细胞凋亡、分泌或导致抗原从肿瘤释放的其他机制)从肿瘤中释放的一或多种肿瘤抗原。在至少一些实施方案中，希望在一段时间保持选择的抗原或选择的抗原类型释放，例如至少1周、至少10天、至少两周或至少一个月。
本发明还提供了对象持续释放抗原的方法，其中所述方法包括给予对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中的一种微生物，并且可导致抗原的持续释放，导致针对所述抗原的抗体产生。抗原的持续释放可持续几天，例如至少1周、至少10天、至少两周或至少1个月。给予的微生物可具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。抗原的持续释放可引起微生物感染的宿主产生免疫应答，其中所述宿主可以产生针对所述抗原的抗体，和/或所述宿主可激发针对表达所述抗原的细胞的免疫应答，包括针对肿瘤细胞的免疫应答。因此，抗原的持续释放可产生针对肿瘤的免疫。在一些实施方案中，所述微生物介导的持续抗原释放诱导的针对肿瘤细胞的免疫应答可导致完全除去或杀死所有的肿瘤细胞。
本发明还提供了抑制受试对象肿瘤生长的方法，其中所述方法包括给予受试对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中的一种微生物，并且可导致或增强抗肿瘤免疫应答。由于肿瘤或转移瘤积聚的微生物所致的抗肿瘤免疫应答可导致肿瘤生长的抑制。给予的微生物可具有一或多种特性，包括减毒的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活抗肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发抗微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。
本发明还提供了抑制对象中转移瘤生长或形成的方法，其中所述方法包括给予对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中并可导致或增强抗肿瘤免疫应答的一种微生物。由于肿瘤或转移瘤积聚的微生物所致的抗肿瘤免疫应答可导致肿瘤生长的抑制。给予的微生物可具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。
本发明还提供了缩小对象肿瘤和/或转移瘤的大小的方法，其中所述方法包括给予对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中并可导致或增强抗肿瘤免疫应答的一种微生物。由于肿瘤或转移瘤积聚的微生物所致的抗肿瘤免疫应答可导致肿瘤和/或转移瘤的大小缩小。给予的微生物可具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。
本发明还提供了消除对象的肿瘤和/或转移瘤的方法，所述方法包括给予对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中并可引起或增强抗肿瘤免疫应答的一种微生物。由于肿瘤或转移瘤积聚的微生物所致的抗肿瘤免疫应答可导致对象的肿瘤和/或转移瘤的消除。给予的微生物可具有一或多种特性，包括减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源基因的能力、及激发针对微生物表达的基因产物的抗体产生的能力。
本发明提供的降低或抑制肿瘤生长、抑制转移瘤生长和/或形成、降低肿瘤或转移瘤的大小、消除肿瘤或转移瘤、或者其他肿瘤治疗方法包括引起或增强宿主的抗肿瘤免疫应答。宿主的抗肿瘤免疫应答可以针对其中微生物积聚的肿瘤和/或转移瘤，并且也可以针对其中微生物未积聚的肿瘤和/或转移瘤，包括给予对象所述微生物之后形成的肿瘤和/或转移瘤。因此，生长或形成受到抑制的肿瘤或者其大小缩小或消除的肿瘤可以是其中积聚所述微生物的肿瘤和/或转移瘤，或者也可以是其中未积聚所述微生物的肿瘤和/或转移瘤。因此，本发明提供了降低或抑制肿瘤生长、抑制转移瘤生长和/或形成、降低肿瘤或转移瘤的大小、消除肿瘤或转移瘤、或者其他肿瘤治疗方法，其中所述方法包括给予对象一种微生物，其中所述微生物积聚在至少一个肿瘤或转移瘤中并引起或增强抗肿瘤免疫应答，所述免疫应答也可以针对其中未积聚微生物细胞的肿瘤和/或转移瘤。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制或预防肿瘤疾病复发或者抑制或预防新的肿瘤生长的复发，所述方法包括给予对象可积聚在肿瘤和/或转移瘤中并可以引起或增强抗肿瘤免疫应答的一种微生物，所述抗肿瘤免疫应答可抑制或预防肿瘤疾病的复发或者抑制或预防新的肿瘤生长。
本发明提供的肿瘤或肿瘤疾病的治疗方法如降低或抑制肿瘤生长、抑制转移瘤生长和/或形成、降低肿瘤或转移瘤的大小、消除肿瘤或转移瘤、或者其他肿瘤治疗方法，还可以包括给予对象可引起肿瘤细胞溶解或肿瘤细胞死亡的一种微生物。这种微生物可以是与引起或增强所述对象抗肿瘤免疫应答的微生物相同的微生物。微生物如本发明提供的微生物可由于内源基因的表达或者外源基因的结果而引起细胞溶解或肿瘤细胞死亡。内源或外源基因可由于本领域已知的直接或间接作用导致肿瘤细胞溶解或抑制细胞生长，包括细胞溶解通道形成或者细胞凋亡途径激活。基因产物如外源基因产物可以发挥激活前体药物成为活性的胞毒性形式的功能，导致表达这种基因的细胞死亡。
抗原产生或肿瘤和/或转移瘤治疗的这些方法可包括给予本发明所述修饰的微生物或者功能与本发明提供的痘苗病毒相等同的含有修饰的F3基因和TK基因和/或HA基因的修饰的微生物，以用于治疗如基因治疗、癌症基因治疗或者疫苗治疗。这种微生物可用于在对象中刺激体液和/或细胞免疫应答，诱导强烈的胞毒性T淋巴细胞应答，对象可由这些应答中获益。例如，所述微生物可提供针对所述微生物感染的肿瘤或者其他感染性疾病的预防性和治疗性作用，所述作用通过使用微生物使得排斥肿瘤或损害细胞，所述微生物表达免疫反应性抗原(Earl et al.(1986)，Science234，728-831；Lathe et al.(1987)，Nature(London)326.，878-880)、细胞肿瘤相关抗原(Bernards et al.，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，6854-6858；Estin et al.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，1052-1056；Kantor et al.(1992)，J.Natl.Cancer Inst.84，1084-1091；Roth et al.(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，4781-4786)和/或细胞因子(例如IL-2、IL-12)、共同刺激分子(B7-1，B7-2)(Rao et al.(1996)，J.Immunol.156，3357-3365；Chamberlain et al.(1996)，Cancer Res.56，2832-2836；Oertli et al.(1996)，J.Gen.Virol.77，3121-3125；Qin and Chatterjee(1996)，Human GeneTher.7，1853-1860；McAneny et al.(1996)，Ann.Surg.Oncol.3，495-500)、或者其他治疗性蛋白质。
本发明提供了实体瘤可以用微生物如痘苗病毒进行治疗，引起巨大的肿瘤特异性微生物复制，这可以导致在肿瘤内肿瘤蛋白抗原和病毒蛋白产生。如本发明所提供，痘苗病毒给予小鼠引起感染的肿瘤细胞溶解并导致肿瘤细胞特异性抗原释放。这些抗原持续渗漏进机体中导致在小鼠中针对肿瘤蛋白、病毒蛋白及病毒编码的工程化蛋白质的非常高水平的抗体效价(大约7-14天内)。新合成的抗肿瘤抗体和增强的巨噬细胞、中性粒细胞计数通过脉管系统持续输送至肿瘤，从而为针对所述肿瘤激活的免疫系统提供。激活的免疫系统然后消除肿瘤的外源化合物包括病毒颗粒。外源抗原的这种互相连接的释放增强了抗体产生及针对肿瘤蛋白的抗体的持续应答，发挥类似痘苗病毒感染和复制引起的自身疫苗接种系统的功能，随后细胞溶解，蛋白质漏出并增强抗体产生。因此，本发明的方法可提供一个完全的方法，可用于具有免疫豁免肿瘤位点如豁免的病毒、细菌和哺乳动物细胞生长位点的所有肿瘤系统，可引起通过宿主自身的免疫系统消除肿瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了用于免疫对象的方法，所述方法包括给予所述对象表达一或多个抗原的微生物，针对该抗原所述对象将产生免疫应答。免疫的抗原对于微生物可以是内源的，如用于针对天花免疫接种的痘苗病毒上的痘苗病毒抗原。或者免疫抗原可以是所述微生物表达的外源抗原，如在病毒衣壳或细菌细胞表面上表达的流感或HIV抗原。因此，本发明提供的微生物包括修饰的痘苗病毒可以用作疫苗。
1.给予在进行本发明提供的方法中，微生物可以给予对象，包括具有肿瘤或具有致瘤性细胞的对象，或者被免疫的对象。给予的微生物可以是本发明提供的微生物或者已知用于给予对象的任何其他微生物，例如已知用于治疗性给予对象的任何已知的微生物，包括抗原性微生物如已知用于疫苗接种的任何微生物。在一些实施方案中，给予的微生物是具有一种特性的微生物，所述特性如减弱的致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力、及表达外源蛋白质的能力，及这些特性的组合。
a.给予所述微生物之前的步骤在一些实施方案中，在给予所述对象所述微生物之前可进行一或多个步骤。可以进行任何前期步骤，包括但非限于诊断具有适于微生物给予的条件的对象，确定对象的免疫活性，使所述对象免疫，用化疗剂处理所述对象，用放射线处理所述对象或者对对象进行手术。
对于包括将微生物给予荷瘤对象以进行治疗的实施方案而言，所述对象典型先前已经诊断为患有致瘤性病变。诊断方法也可包括确定致瘤性病变的类型，确定致瘤性病变的阶段，确定所述对象中一或多个肿瘤的大小，确定所述对象淋巴结中转移的或致瘤性细胞的存在与否，或者确定所述对象中转移瘤的存在与否。给予对象一种微生物的治疗方法的一些实施方案可包括确定原发肿瘤的大小或肿瘤疾病的阶段的步骤，并且如果原发肿瘤的大小等于或超过阈体积或者如果肿瘤疾病的阶段处于或超过阈阶段之上，则将微生物给予所述对象。在一个相似的实施方案中，如果原发肿瘤的大小低于阈体积或者如果肿瘤疾病的阶段处于或低于阈阶段，则还不用将所述微生物给予所述对象；这些方法可包括监测所述对象直至肿瘤大小或肿瘤疾病阶段达到阈值，然后给予所述对象所述微生物。大小阈值可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速度，微生物感染肿瘤的能力及所述对象的免疫活性。通常大小阈值是这样的大小，其足以使得微生物在肿瘤内或附近积聚及复制并且不被宿主的免疫系统完全除去，而且典型地还是足以维持微生物感染足够长的时间以使得宿主激发针对所述肿瘤细胞的免疫应答，典型为大约1周或更长时间，大约10天或更长时间，或者大约两周或更长时间。对于病毒如痘苗病毒而言肿瘤大小的阈值例如至少大约100mm3、至少大约200mm3、至少大约300mm3、至少大约400mm3、至少大约500mm3、至少大约750mm3、至少大约1000mm3或者至少大约1500mm3。肿瘤疾病的阈阶段也可以根据一些因素变化，包括对特定肿瘤疾病分阶段的特殊需要，肿瘤疾病生长的迅速蔓延，所述微生物感染肿瘤或转移瘤的能力，及至少大约对象的免疫活性。通常地，所述阈值阶段是这样的阶段，其足以使得微生物在肿瘤或转移瘤中积聚并复制，而不被宿主的免疫系统完全除去，并且典型地还足以维持微生物感染足够长的时间以使得宿主激发针对致瘤性细胞的免疫应答，典型地为大约1周或更长时间，大约10天或更长时间，或者大约2周或更长时间。阈阶段例如是超过最低阶段的任何阶段(例如阶段I或等同阶段)，或者是其中原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或者其中检测到转移瘤细胞的任何阶段。
在其他实施方案中，在给予对象微生物之前，可以确定所述对象的免疫活性。本发明提供的给予对象微生物的方法可包括引起或增强对象的免疫应答。因此，在给予对象微生物之前，可以确定对象激发免疫应答的能力。在本发明提供的方法中可进行任何本领域已知的免疫活性测试。免疫活性测试例如可检测ABO血细胞凝集效价(IgM)，白细胞粘着缺陷(LAD)，粒细胞功能(NBT)，T和B细胞定量，破伤风抗体效价，唾液IgA，皮肤测试，扁桃体测试，补体C3水平，B因子水平，及淋巴细胞计数。本领域技术人员可以确定给予对象微生物的需要性，根据所述对象的免疫活性水平、根据所述微生物的免疫原性、及任选地根据待治疗的肿瘤疾病的免疫原性而确定。典型地，如果技术人员可以确定对象具有足够的激发针对所述微生物的免疫应答能力，则可以认为所述对象是免疫活性的。
在一些实施方案中，所述对象可以在根据本发明提供的方法给予微生物之前进行免疫。免疫可以增加对象激发针对所述微生物的免疫应答的能力，或者增加所述对象激发针对微生物的免疫应答的速度。免疫还可以降低所述微生物对所述对象的致病性危险。在一些实施方案中，可以使用与待给予的治疗性微生物相似的免疫微生物进行免疫。例如，所述免疫微生物可以是所述治疗性微生物的无复制能力的变体。在其他实施方案中，所述免疫物可以是所述待给予的治疗性微生物的消化物。本发明可以使用本领域已知的用已知的微生物免疫对象的任何方法。在一个实例中，用例如1μg补骨脂素处理的及用紫外线在365nm处理4分钟的痘苗病毒可以导致不能复制。在另一个实施方案中，可以选择应用与已经先前用于免疫对象的微生物(例如在儿童疫苗接种中)相同或相似的微生物。
在另一个实施方案中，所述对象可以给予微生物而无先前的癌症治疗步骤，如化疗、放疗或手术切除肿瘤和/或转移瘤。本发明提供的方法利用所述微生物进入或局限于肿瘤附近的能力，其中所述肿瘤细胞可以被保护免于所述对象的免疫系统攻击；然后所述微生物在这个免疫保护区域内增殖，并且也可以导致肿瘤抗原从所述肿瘤中释放(典型持续释放)进所述对象的免疫系统可以识别所述肿瘤抗原并激发免疫应答的部位。在这种方法中，存在足够大小的肿瘤或者充分发生的免疫保护阶段对于成功给予所述肿瘤以所述微生物及充分的肿瘤抗原产生是有利的。如果肿瘤经手术切除，则所述微生物也许不能定位于其他致瘤性细胞(例如小的转移瘤)，因为这种细胞也许还未足够成熟以产生所述微生物可以存活并增殖的免疫保护性环境，或者即使所述微生物可以定位于致瘤性细胞，细胞的数目或者体积的大小太小以致于所述微生物不能持续释放肿瘤抗原以使得宿主激发抗肿瘤免疫应答。因此，例如，本发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中给予具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以微生物而不除去原发瘤，或者给予具有肿瘤或肿瘤疾病的对象以微生物，其中至少一些肿瘤或致瘤性细胞有意保留在所述对象中。在其他典型的癌症治疗方法如化疗或放疗中，这些方法典型地具有削弱患者免疫系统的副作用。通过化疗或放疗对对象进行的治疗可以降低对象激发抗肿瘤免疫应答的能力。因此，例如，本发明提供的是治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中微生物给予具有肿瘤或肿瘤疾病的对象，而对所述对象不进行削弱免疫系统的治疗如化疗或放疗。
在另一个实施方案中，在给予所述对象微生物之前，所述对象可以进行不除去原发肿瘤或者不削弱免疫系统的一或多个癌症治疗步骤。各种更成熟的癌症治疗方法正不断开发出来，其中可以不经手术切除肿瘤或削弱免疫系统而治疗肿瘤。所述方法例如包括给予降低肿瘤或致瘤性细胞增殖速度而不削弱免疫系统的一种化合物(例如通过给予肿瘤抑制化合物或者通过给予肿瘤细胞特异性化合物)或者给予一种抑制血管发生的化合物。因此，包括给予对象一种微生物的组合方法可进一步改善癌症治疗。因此，本发明提供的是给予对象一种微生物，伴随之前或之后例如给予一种减缓肿瘤生长而不削弱所述对象免疫系统的化合物或者一种抑制所述肿瘤血管形成的化合物。
b.给予模式可以使用给予对象一种微生物的任何模式，条件是给予模式使得微生物进入肿瘤或转移瘤中。给予模式可包括但非限于经静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、肿瘤内、多穿孔(例如针对天花疫苗使用的)、吸入、鼻内、口服、腔内(例如通过导管给予膀胱，通过栓剂或灌肠剂给予肠道)、耳或眼睛给予。本领域技术人员可以选择与所述对象和所述微生物相容，并且很可能导致微生物到达肿瘤和/或转移瘤的任何给予模式。本领域技术人员可根据任何因素选择给予途径，所述因素包括疾病的性质、肿瘤的种类、及药物组合物中包含的特定微生物。可以例如作为胶状分散系统通过弹道输送(ballistic delivery)进行靶部位给予，或者可以通过注入动脉内而进行全身性给予。
c.剂量剂量方案可以是任何方法和数量，并且可以通过本领域技术人员根据已知临床因素确定。如医学领域所已知，对于任一患者的剂量可以依赖于许多因素，包括所述对象的物种、大小、体表面积、年龄、性别、免疫活性及一般健康状况、待给予的特殊微生物、给予的持续时间和途径、疾病的种类和阶段，例如肿瘤大小、及同时给予的其他化合物如药物。除了上述因素之外，这些水平也可以受到微生物的感染性及微生物的性质影响，这可以由本领域技术人员确定。本发明提供的方法中使用的至少一些病毒比本发明使用的细菌更具感染性。因此，在本发明方法的一些实施方案中，病毒与细菌相比可以较低水平给予。在本发明的方法中，合适的微生物的最小剂量水平可以是足以使得所述微生物在肿瘤或转移瘤中存活、生长和复制的水平。给予体重为65kg的人体的病毒的最小水平例如可包括至少大约5×105噬斑形成单位(pfu)、至少大约1×106pfu、至少大约5×106pfu、至少大约1×107pfu者至少大约1×108pfu。给予体重为65kg的人体的细菌的最小水平例如是至少大约5×106集落形成单位(cfu)、至少大约1×107cfu、至少大约5×107cfu、至少大约1×108cfu、或者至少大约1×109cfu。在本发明的方法中，合适的微生物的最大剂量水平可以是对宿主无毒性的水平，不引起脾肿大3倍或更多的水平，在大约1天或3天或7天后在正常组织或器官中不产生集落或噬斑的水平。给予体重65kg的人体的病毒的最大水平例如可包括不超过大约5×1010pfu、不超过大约1×1010pfu、不超过大约5×109pfu、不超过大约1×109pfu，或者不超过大约1×108pfu。给予体重65kg的人体的细菌的最大水平例如可包括不超过大约5×1011pfu、不超过大约1×1011pfu、不超过大约5×1010pfu、不超过大约1×1010pfu，或者不超过大约1×109pfu。
d.给予次数本发明提供的方法可包括单一给予对象一种微生物或者多次给予一种微生物。在一些实施方案中，单一给予足以使得微生物在肿瘤内定居，其中所述微生物可以增殖并可以引起或增强所述对象的抗肿瘤免疫应答；这些方法不需要另外给予微生物以引起或增强对象抗肿瘤免疫应答，抗肿瘤免疫应答可例如导致肿瘤生长抑制、转移瘤生长或形成抑制、肿瘤或转移瘤大小降低、肿瘤或转移瘤消除、抑制或防止肿瘤疾病的复发或新肿瘤形成、或者其他的癌症治疗作用。在其他实施方案中，微生物可以在不同的时机给予，典型地至少间隔1天给予。间隔给予可增加微生物输送至肿瘤或转移瘤的可能性，其中先前的给予在微生物输送至肿瘤或转移瘤中也许是无效的。间隔给予可增加肿瘤或转移瘤上微生物增殖可以发生的位置，或者可以另外增加积聚在肿瘤中的微生物的效价，这可以增加抗原或其他微生物从肿瘤中释放的比例，激发或增强宿主的抗肿瘤免疫应答，并且也可以任选地增加基于微生物的肿瘤溶解或肿瘤细胞死亡的水平。间隔给予微生物可进一步扩充对象针对微生物抗原的免疫应答，这可以扩充宿主对其中积聚了所述微生物的肿瘤或转移瘤的免疫应答，并且可以增加宿主激发抗肿瘤免疫应答的可能性。
当进行间隔给予时，每次给予可以是与其他给予剂量相同或不同的剂。在一个实施方案中，所有的给予剂量均是相同的。在其他实施方案中，首次剂量与一或多次随后剂量相比可以较高，例如至少高出10倍、至少高出100倍、或者至少高出1000倍。在间隔给予方法的一个实例中，其中首次剂量高于一或多次随后的剂量，所有随后的剂量与首次给予剂量相比可以相同、较小。
间隔给予可包括两或多次给予的任何次数，包括给予2、3、4、5、或6次给予。本领域技术人员可根据已知的监测治疗方法及本发明提供的其他监测方法而易于确定进行给予的次数或进行一或多次额外的给予的需要性。因此，本发明提供的方法包括给予所述对象一或多次微生物，其中给予的次数可以通过监测所述对象而确定，并且基于监测的结果确定是否提供一或多次额外的给予。决定是否提供一或多次额外的给予可以基于各种监测结果，包括但非限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的指征、新转移瘤出现或者转移受抑制、对象抗微生物抗体效价、对象抗肿瘤抗体效价、对象的整体健康状况、对象的体重、只在肿瘤和/或转移瘤中微生物的存在、正常组织或器官中微生物的存在。
两次给予之间的时间可以是任何时间。两次给予之间的时间可以是任何因素的函数，包括如关于给予次数所描述的监测步骤，对象激发免疫应答的时间、对象从正常组织中清除微生物的时间、或者微生物在肿瘤或转移瘤中的增殖时间。在一个实例中，所述时间可以是对象激发免疫应答的时间的函数；例如，所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于大约1周、多于大约10天、多于大约2周、或者多于大约1个月；在另一个实例中，所述时间可以少于对象激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周、或者少于大约1个月。在另一个实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除微生物的时间的函数；例如所述时间可以多于对象从正常组织中清除微生物的时间，如多于大约1天、多于大约2天、多于大约3天、多于大约5天、或者多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是微生物在肿瘤或转移瘤中增殖的时间的函数；例如所述时间可以多于给予表达可检测的标记的微生物后在肿瘤或转移瘤中产生可检测信号的时间，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10天、大约2周、或者大约1个月。
e.共同给予本发明还提供了给予额外的治疗物质如不同的治疗性微生物或治疗性化合物的方法。这些可以与第一种微生物同时、相继或间歇给予。所述额外的治疗性物质可以与所述微生物或其基因产物相互作用，或者所述额外的治疗性物质可以不依赖于所述微生物而起作用。
i.给予多种微生物本发明提供了给予对象两或多种微生物的方法。给予可以是同时、相继或间歇完成的。所述多种微生物可以作为单一的组合物或者作为两或多种组合物而给予。所述两或多种微生物可包括至少两种细菌、至少两种病毒、至少两种真核细胞，或者选自细菌、病毒或真核细胞的两或多种细胞。所述多种微生物可以包含组合物的组合和/或试剂盒形式提供，所述试剂盒包括包装的用于给予的微生物及任选地包括其说明书。所述组合物可含有配制的以单一剂量给予(即直接给予)的微生物，可需要稀释剂或其他添加剂。
在一个实施方案中，所述微生物的至少一种是一种修饰的微生物，如本发明提供的那些微生物，具有特性如低致病性、低毒性、优先积聚在肿瘤中、激活针对肿瘤细胞免疫应答的能力、免疫原性、复制能力、表达外源蛋白质的能力，及这些特性的组合。所述微生物可以大约同时给予或者在不同时间给予。所述微生物可以在同一组合物中给予，或者以相同的给予方法给予，或者可以在单独的组合物中或者通过不同的给予方法给予。
在一个实例中，可以给予对象一种细菌和一种病毒。所述细菌和病毒可以同时给予或者在不同时间给予。例如，所述病毒可以在给予所述细菌之前给予，或者所述细菌可以在给予所述病毒之前给予；典型地所述病毒在给予所述细菌之前给予。如本发明所提供，相对于单独给予细菌的方法，在给予对象一种细菌之前给予病毒可以增加在肿瘤内积聚和/或增殖的细菌的量。
因此，本发明提供的方法包括在给予细菌之前给予病毒与单独给予细菌的方法或者与给予病毒同时或之前给予细菌的方法相比可以较低剂量给予细菌。例如，在一些实施方案中，待给予的细菌可具有限制所用细菌能力的一或多种性质，这些性质可包括但非限于毒性、低肿瘤特异性积聚及受限的增殖能力。具有一或多种受限性质的给予的细菌可需要以较低剂量给予，或者在肿瘤特异性积聚和/或增殖中可需要协助。本发明提供了给予具有受限性质的这种细菌的方法，其中在给予细菌之前给予病毒，由此受限的细菌可以较小量给予，可在肿瘤中具有增高的特异性积聚，和/或可具有增加的在肿瘤中增殖的能力。
两次给予之间的时间可以是达到所希望效果的任何时间，这可以通过本领域技术人员确定。给予不同的微生物之间的时间的选择可以根据与选择给予相同微生物之间的相似的时间参数进行，包括得自监测步骤的结果、对象激发免疫应答的时间、对象从正常组织中清除微生物的时间、或者肿瘤或转移瘤中微生物增殖的时间。在一个实例中，所述时间可以是对象激发免疫应答的时间的函数，例如所述时间可以多于对象激发免疫应答的时间，如多于大约1周、多于大约10天、多于大约2周或多于大约1个月；在另一个实例中，所述时间可少于对象激发免疫应答的时间，如少于大约1周、少于大约10天、少于大约2周或少于大约1个月。在另一个实例中，所述时间可以是对象从正常组织中清除微生物的时间的函数，例如所述时间可以多于对象从正常组织中清除微生物的时间，如多于大约1天、多于大约2天、多于大约3天、多于大约5天或多于大约1周。在另一个实例中，所述时间可以是微生物在肿瘤或转移瘤中增殖的时间，例如所述时间可以多于在给予表达可检测的标记的微生物后在肿瘤或转移瘤中产生可检测信号的时间量，如大约3天、大约5天、大约1周、大约10天、大约2周或大约1个月。在一个实例中，可以首先给予病毒，5天后给予细菌。在另一个实例中，可以首先给予病毒，根据对象肿瘤中病毒编码的可检测基因产物的检测给予细菌，任选地当病毒编码的可检测的基因产物仅在对象的肿瘤中检测出时给予细菌。
ii.治疗性化合物本发明的方法可包括除了给予所述对象一或多种微生物之外，还给予对象一或多种治疗性化合物。治疗性化合物可单独起肿瘤治疗作用，或者与所述微生物联合起作用。可单独起作用的治疗性化合物包括任何已知的化疗化合物，其可抑制肿瘤生长、抑制转移瘤生长和/或形成、降低肿瘤或转移瘤的大小、消除肿瘤或转移瘤，而不降低微生物在肿瘤中积聚、在所述肿瘤中复制并引起或增强所述对象抗肿瘤免疫应答的的能力。
与所述微生物联合起作用的治疗性化合物包括例如改变微生物表达的化合物或者与微生物表达的基因相互作用的化合物，或者可抑制微生物增殖的化合物，包括对所述微生物有毒性的化合物。与所述微生物联合起作用的治疗性化合物包括例如增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物，并且还可包括例如降低微生物的增殖、毒性或杀死细胞性质的治疗性化合物。因此，本发明提供了给予对象一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质。本发明还提供了给予对象一或多种治疗性化合物的方法，所述化合物可与所述微生物联合起作用以降低微生物的增殖、毒性或杀死肿瘤细胞的性质。
在一个实施方案中，可与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物是可改变基因表达的化合物，其中改变的基因表达可引起所述对象中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。改变基因表达的化合物可例如导致一或多种微生物基因包括内源微生物基因和/或外源微生物基因的表达增加或降低。例如，改变基因表达的化合物可诱导或增加微生物中基因的转录，如可导致细胞溶解或细胞死亡、可激发免疫应答、可催化前体药物样化合物转变、或者可抑制肿瘤细胞基因表达的外源基因。本领域已知可改变基因表达的各种化合物，包括IPTG和RU486。其表达可以被增量调节的基因例如包括蛋白质和RNA分子，包括毒素、可将前体药物转变为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调节蛋白、siRNA及核酶。在另一个实例中，改变基因表达的化合物可抑制或降低微生物中基因的转录，所述基因如可降低微生物毒性或降低微生物增殖的外源基因。可降低或抑制基因表达的任何各种化合物均可用于本发明提供的方法中，包括siRNA化合物、转录抑制剂或转录激活物抑制剂。其表达可以被减量调节的基因例如包括蛋白质和RNA分子，包括微生物蛋白或抑制细胞溶解、核苷酸合成或增殖的RNA，及抑制细胞死亡、免疫反应性、细胞溶解或微生物复制的细胞蛋白或RNA分子。
在另一个实施方案中，可以与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质的治疗性化合物是可以与微生物表达基因产物相互作用的化合物，而且这种相互作用可导致所述对象中肿瘤细胞杀死增加或者抗肿瘤免疫应答增加。可以与微生物表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可包括例如前体药物或其他化合物，其在给予对象的形式具有较小的毒性或者无毒性或者其他生物学活性，但在与微生物表达的基因产物相互作用后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但非限于胞毒性、诱导细胞凋亡的能力、或者触发免疫应答的能力。本领域已知各种前体药物样物质，这些化合物例如在本文另处揭示，这些化合物可包括更昔洛韦、5-氟尿嘧啶、6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷、头孢菌素-阿霉素、4-[(2-氯乙基)(2-mesuloxyethyl)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、扑热息痛、吲哚-3-乙酸、CB1954、7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基氧基喜树碱、双-(2-氯乙基)氨基-4-羟苯基氨基甲酮28、1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯基吲哚、表柔比星-葡糖苷酸、5’-脱氧5-氟尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、及亚麻苦苷。在另一个实施方案中，可以与所述微生物联合起作用以降低微生物的增殖、毒性或杀死细胞性质的治疗性化合物是可抑制微生物复制、抑制微生物毒素或者导致微生物死亡的化合物。可以抑制微生物复制、抑制微生物毒素或导致微生物死亡的治疗性化合物一般可包括可阻断微生物生活周期中的一或多个步骤的化合物，包括但非限于可抑制微生物DNA复制、微生物RNA转录、病毒外壳蛋白装配、外膜或多糖装配的化合物。本领域已知可阻断微生物生活周期中一或多个步骤的任何化合物，包括任何已知的抗生素、微生物DNA聚合酶抑制剂、微生物RNA聚合酶抑制剂、调节微生物DNA复制或RNA转录的蛋白质的抑制剂。在一个实例中，当微生物是一种细菌时，化合物可以是抗生素。在另一个实例中，微生物可以含有编码微生物生活周期蛋白的基因，所述蛋白如可通过对宿主生物体无毒性的化合物抑制的DNA聚合酶或RNA聚合酶。
f.对象状态在另一个实施方案中，本发明提供的给予对象一种微生物的方法可以对任何状况的对象进行，包括麻醉的对象、警觉的对象、体温升高的对象、体温降低的对象、或者已知影响微生物在肿瘤中积聚的其他状态的对象。如本发明所提供，已经确定麻醉的对象相对于未麻醉的对象而言，肿瘤中微生物的积聚速度降低。如本发明所进一步提供，已经确定体温降低的对象相对于正常体温的对象而言，肿瘤中微生物的积聚速度降低。因此，本发明提供了给予对象一种微生物的方法，其中所述方法可包括给予对象一种微生物，其中所述对象不是在麻醉如全身麻醉之下；例如，所述对象可以在局部麻醉之下或者可以是未麻醉的。本发明还提供了给予对象一种微生物的方法，其中所述方法可包括给予体温改变的对象一种微生物，其中所述体温的改变可影响微生物在肿瘤中积聚的能力；典型地，体温降低可降低微生物在肿瘤内的积聚能力。因此，在一个示例性实施方案中，本发明提供了给予所述对象一种微生物的方法，其中所述方法包括使所述对象的体温升高至正常体温之上，并且给予所述对象一种微生物，其中所述微生物相对在正常体温的对象可更易于积聚在较高体温的对象肿瘤中。
2.监测本发明提供的方法可进一步包括监测所述对象、监测所述肿瘤和/或监测给予对象的微生物的一或多个步骤。本发明提供的方法可包括任何监测步骤，包括但非限于监测肿瘤大小、监测抗肿瘤抗原的抗体效价、监测转移瘤的存在和/或大小、监测所述对象的淋巴结、监测所述对象的体重或者其他健康指征，包括血液或尿液指征，监测抗微生物抗原的抗体效价，监测可检测基因产物的微生物表达及直接检测对象的肿瘤、组织或器官中微生物效价。
监测目的可以是简单地评价所述对象的健康状况或者治疗性处理的进展，或者可以是为了确定是否进一步给予相同或不同的微生物，或者确定何时或是否给予所述对象以化合物，其中所述化合物可以增加治疗方法的效力或者所述化合物可降低给予对象的微生物的致病性。
a.监测微生物基因表达在一些实施方案中，本发明提供的方法可包括监测一或多种微生物表达的基因。微生物，如本发明提供的那些或本领域已知的另外的微生物，可以表达一或多种可检测的基因产物，包括但非限于可检测的蛋白质。
如本发明所提供，在微生物中表达的可检测的基因产物的测定可以对所述对象中存在的微生物水平提供精确的确定。如本发明进一步所提供，可检测的基因产物位置的测定，例如通过成像方法包括X线断层成像方法测定，可确定所述对象中所述微生物的定位。因此，包括监测可监测的微生物基因产物的本发明提供的方法可用于确定对象的一或多个器官或组织中所述微生物的存在与否，和/或确定对象的肿瘤或转移瘤中所述微生物的存在与否。另外，包括监测可检测的微生物基因产物的本发明提供的方法可用于确定一或多个器官、组织、肿瘤或转移瘤中存在的微生物的效价。包括监测对象中微生物的定位和/或效价的方法可用于确定微生物的致病性；因为正常组织和器官的微生物感染特别是感染水平可以表明探针的致病性，监测对象中微生物的定位和/或数量的方法可用于确定微生物的致病性。因为本发明提供的方法可用于监测对象中任何特定部位的微生物的量，所以包括监测对象中微生物的定位和/或效价的方法可以在多个时间点进行，并因此可确定微生物在对象中的复制速度，包括微生物在对象的一或多个器官或组织中的复制速度；因此，监测微生物基因产物的方法可用于确定微生物的复制能力。本发明提供的方法还可以用于量化各种器官或组织及肿瘤或转移瘤中存在的微生物的量，并从而可以表明在对象中所述微生物的优先积聚程度；因此，本发明提供的微生物基因产物监测方法可用于确定微生物与积聚在正常组织或器官中相比优先积聚在肿瘤或转移瘤中的能力。因为本发明提供的方法中使用的微生物可积聚在全部的肿瘤中或者可以积聚在肿瘤的多个部位，并且也可以积聚在转移瘤中，因此本发明提供的监测微生物基因产物的方法可用于确定对象中存在的肿瘤大小或转移瘤数目。在一定时间内这种监测肿瘤或转移瘤中微生物基因产物的存在可用于估计肿瘤或转移瘤中的改变，包括肿瘤的生长或皱缩，或者新转移瘤的发展或转移瘤的消失，并且也可以用于确定肿瘤的生长或皱缩的速度，或者新转移瘤的发展或消失，或者肿瘤的生长或皱缩速度的改变，或者新转移瘤的发展或消失的速度的改变。因此，监测微生物基因产物的方法可用于监测对象中的肿瘤疾病，或者用于确定肿瘤疾病的治疗效力，通过确定肿瘤的生长或皱缩速度，或者新转移瘤的发展或消失，或者肿瘤的生长或皱缩的速度的改变，或者新转移瘤的发展或转移瘤的消失的速度的改变而进行。
在本发明提供的监测方法中可以检测任何可检测的蛋白质；例如这些可检测的蛋白质非限制性例如包括任何荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)，任何萤光素酶、转移或其他铁结合蛋白；或者受体、结合蛋白及抗体，其中特异性结合所述受体的化合物、结合蛋白或抗体可以是一种可检测的活性物质或者可以是用可检测的物质(例如放射性核素或成像剂)标记的。
b.监测肿瘤大小本发明还提供了监测肿瘤和/或转移瘤大小和位置的方法。肿瘤或转移瘤的大小可以通过本领域已知的任何方法监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁性成像方法。除了本领域已知的方法外，本发明提供的方法如监测微生物基因表达可以用于监测肿瘤和/或转移瘤大小。
在一些时间点监测大小可提供关于肿瘤或转移瘤大小增加或缩小的信息，并且还可以提供关于对象体内另外的肿瘤和/或转移瘤存在与否的信息。在一些时间点监测肿瘤大小可提供关于对象体内肿瘤疾病发生的信息，包括对对象肿瘤疾病的治疗效力。
c.监测抗体效价本发明提供的方法还可包括监测对象中抗体效价，包括应答给予对象一种微生物而产生的抗体。在本发明提供的方法中给予的微生物可激发对内源微生物抗原的免疫应答。本发明提供的方法中给予的微生物还可激发对微生物表达的外源基因的免疫应答。本发明提供的方法中给予的微生物也可以激发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对微生物抗原、微生物表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体效价可用于监测微生物毒性、监测治疗方法的效力或者监测生产和/或收集的基因产物或抗体的水平。
在一个实施方案中，监测抗体效价可用于监测微生物的毒性。针对微生物的抗体效价在给予所述对象所述微生物后随着时间而变化，其中在一些特定的时间点，低抗微生物抗原抗体效价可表示较高的毒性，而在其他时间点高抗微生物抗原抗体效价可表示较高的毒性。本发明提供的方法中使用的微生物可以是免疫原性的，并因此可以在给予所述对象所述微生物后不久即激发免疫应答。通常地，对象免疫系统所针对的可迅速激发强的免疫应答的微生物可以是当所述对象免疫系统可以从所有正常器官或组织中除去所述微生物时低毒性的微生物。因此，在一些实施方案中，在给予对象所述微生物后不久针对微生物抗原的高抗体效价可以提示微生物的低毒性。相反，非高免疫原性的微生物可感染宿主机体而不激发强的免疫应答，这可导致所述微生物对宿主的较高毒性。因此，在一些实施方案中，在给予对象所述微生物后不久针对微生物抗原的高抗体效价可表示微生物的低毒性。
在其他实施方案中，监测抗体效价可用于监测治疗方法的效力。在本发明提供的方法中，抗体效价如抗肿瘤抗原抗体效价可提示治疗方法如治疗肿瘤疾病的治疗方法的效力。本发明提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移瘤的免疫应答。因此，通过监测抗肿瘤抗原抗体效价，可以监测引起或增强针对肿瘤和/或转移瘤的免疫应答的治疗方法的效力。本发明提供的治疗方法还可以包括给予对象可积聚在肿瘤中并可引起或增强抗肿瘤免疫应答的一种微生物。因此，可以监测宿主激发针对积聚在肿瘤或转移瘤中的微生物的免疫应答的能力，这可以提示对象也已经激发了抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对象可能激发抗肿瘤免疫应答，或者可以提示对象能激发抗肿瘤免疫应答。
在其他实施方案中，监测抗体效价可用于监测生产和/或收集的基因产物或抗体的水平。本发明提供的方法可用于通过表达已经积聚在肿瘤内的微生物中的外源基因而产生蛋白质、RNA分子或其他化合物。本发明进一步提供了通过针对已经积聚在肿瘤内的微生物中的外源基因的表达产生的蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体的生产方法。监测针对所述蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体效价可提示由肿瘤积聚的微生物产生的蛋白质、RNA分子或其他化合物的水平，并且也可直接提示特异于这种蛋白质、RNA分子或其他化合物的抗体的水平。
d.监测一般健康诊断本发明提供的方法还可以包括监测对象健康状况的方法。本发明提供的一些方法是治疗性方法，包括肿瘤疾病的治疗方法。监测对象的健康状况如本领域所已知可用于确定治疗方法的效力。本发明提供的方法还可以包括给予对象一种微生物的步骤。监测对象的健康状况可用于确定给予对象的微生物的致病性。本领域已知的监测疾病如肿瘤疾病、感染性疾病或免疫相关的疾病的任何健康诊断方法均可以监测。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、面色、体温或其他可观测的状态可表示对象的健康状况。另外，对象的样品中一或多种成分的存在与否或水平可以表示对象的健康状况。典型的样品可包括血液和尿液样品，其中一或多种成分的存在与否或水平可以通过进行例如血液或尿液诊断测试而确定。表示对象健康状况的成分例如包括但非限于白细胞计数、血细胞比容、C反应蛋白浓度。
e.监测协同治疗本发明提供了监测治疗的方法，其中治疗决定可基于监测的结果。本发明提供的治疗方法可包括给予对象一种微生物，所述微生物可优先积聚在肿瘤和/或转移瘤中，所述微生物可引起或增强抗肿瘤免疫应答。这些治疗方法可包括多个步骤，包括多次给予一种特定的微生物，给予第二种微生物，或者给予治疗性化合物。确定给予所述对象的微生物或化合物的数量、时间或类型可基于监测所述对象的一或多个结果。例如，对象中的抗体效价可用于确定是否需要给予一种微生物或化合物，给予的微生物或化合物的数量，给予的微生物或化合物的类型，其中例如低抗体效价可表示需要给予额外的微生物、不同的微生物或者治疗性化合物如诱导微生物基因表达的化合物。在另一个实例中，对象的整体健康状况可用于确定是否需要给予一种微生物或化合物、给予的微生物或化合物的数量、及给予的微生物或化合物的类型，其中例如确定所述对象是健康的可表示需要给予额外的微生物、不同的微生物或治疗性化合物如诱导微生物基因表达的化合物。在另一个实例中，监测可检测的微生物表达的基因产物可用于确定是否需要给予一种微生物或化合物、给予的微生物或化合物的数量、及给予的微生物或化合物的类型。这些监测方法可用于确定治疗方法是否是有效的、治疗方法对对象是否是致病性的、所述微生物是否已经积聚在肿瘤或转移瘤中、及所述微生物是否已经积聚在正常组织或器官中。基于这些确定，可以推导出进一步治疗方法的需要性和形式。
在一个实施方案中，确定一种治疗方法是否是有效的可用于推导出进一步的治疗方法。任何监测方法均可用于确定如本发明提供的或本领域另外已知的治疗方法是否是有效的。如果监测方法表示治疗方法是有效的，则可以决定保持目前的治疗进程，这可以包括进一步给予微生物或化合物，或者可以决定不需要进一步给予。如果监测方法表示治疗方法是无效的，则所述监测结果可表示是否应停止治疗进程(例如当微生物对所述对象是致病性的时候)，或者改变治疗进程(例如当微生物积聚在肿瘤内而不损害宿主机体，但不激发抗肿瘤免疫应答的时候)，或者增加给予频率或数量(例如当微生物很少积聚或不积聚在肿瘤中时)。
在一个实例中，监测可表示微生物对对象是致病性的。在这些情况中，可决定终止给予所述对象以所述微生物、给予所述对象较低水平的所述微生物、给予对象不同的微生物、或者给予对象降低所述微生物致病性的化合物。在一个实例中，可以终止给予确定是致病性的微生物。在另一个实例中，确定是致病性的微生物的剂量可以在随后的给予中降低，在这种实例的一种形式中，所述对象可预先用可增加致病性微生物在肿瘤内积聚的能力的另一种微生物处理，之后再给予所述对象所述致病性微生物。在另一个实例中，对象可以已经给予了对所述对象是致病性的一种细菌或病毒，给予这种致病性微生物可以伴随给予例如一种抗生素、抗微生物化合物、致病性减毒化合物(例如减量调节溶解细胞的或引起细胞凋亡的基因产物表达的化合物)、或者可降低微生物的增殖、毒性或杀死细胞性质的其他化合物，如本文其他地方所描述的。在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测所述微生物的定位，并且基于确定所述微生物积聚在肿瘤和/或转移瘤内而不积聚在正常组织或器官内，可以终止给予抗生素、抗微生物化合物或致病性减毒化合物，并且所述微生物的致病性活性可以激活或增加，但仅限于对肿瘤和转移瘤。在这种实例的另一种变化的形式中，在终止给予抗生素、抗微生物化合物或致病性减弱化合物之后，可以进一步监测所述微生物的存在和/或微生物的致病性，如果确定所述微生物通过例如波及至正常器官或组织、释放毒素进入脉管系统或者另外对肿瘤或转移瘤之外的区域具有致病性作用而对宿主造成威胁，则可以再开始给予这种化合物。
在另一个实例中，监测可以确定微生物是否积聚在对象的肿瘤或转移瘤内。基于这种确定，可以决定进一步给予对象额外的微生物、一种不同的微生物或一种化合物。在一个实例中，监测肿瘤或转移瘤中存在病毒可用于决定给予对象一种细菌，其中例如给予的细菌的数量可以根据肿瘤或转移瘤中病毒的存在和/或数量而减少。在一个相似的实例中，监测肿瘤或转移瘤中病毒的存在可用于决定何时给予对象一种细菌，其中例如所述细菌可以基于检测到肿瘤或转移瘤中病毒的存在和/或选择的病毒的数量而给予。在另一个实例中，检测肿瘤内微生物的存在可用于决定给予所述对象一种化合物，其中所述化合物可增加微生物的致病性、增殖或免疫原性，或者所述化合物可另外与所述微生物联合起作用以增加微生物的增殖、毒性、杀死肿瘤细胞或免疫应答激发性质；在这种实例的一种变化的形式中，所述微生物可例如在没有这种化合物的情况中具有很小的或不具有杀死细胞的能力；在这种实例的另一种变化的形式中，监测肿瘤或转移瘤中所述微生物的存在可以与监测正常组织或器官中不存在所述微生物联合，其中如果所述微生物存在于肿瘤或转移瘤内而在正常器官或组织中一点也不存在，则给予所述化合物；在这种实例的另一种变化的形式中，可以监测肿瘤或转移瘤内微生物的量，如果所述微生物以足够的水平存在于肿瘤或转移瘤内，则给予所述化合物。
E.产生基因产物和抗体的方法本发明提供了微生物、产生和使用这些微生物以生产外源基因产物和/或产生特异于外源基因产物的抗体的方法。本发明提供的方法可以有效地重组产生生物活性蛋白质。在EP A1 1 281 772中公开了当携带发光融合基因构建体rVV-ruc-gfp的痘苗病毒(LIVP毒株)经静脉内注入裸鼠体内时，发现该病毒颗粒在4天内从所有内脏中清除，这通过光发射消失而确定。相反，当注射的痘苗病毒在携带由于皮下植入的C6大鼠神经胶质瘤细胞而生长的肿瘤的裸鼠内的命运相似时，发现病毒颗粒随着时间的过去而保留在肿瘤组织中，产生持续的光发射。在活的动物中监测相同肿瘤中病毒编码的融合蛋白的存在和扩增，通过在立体显微镜下观测GFP荧光及通过在弱光可视图像照相机下检测萤光素酶催化的光发射而监测。在病毒注入携带皮下C6神经胶质瘤植入体的裸鼠体内后4天检测到肿瘤特异性光发射。rVV-ruc-gfp病毒颗粒的肿瘤积聚也在携带从植入的PC-3人前列腺细胞中产生的皮下肿瘤的裸鼠中可见，及在具有同位植入的MCF-7人乳腺肿瘤的小鼠中可见。另外，免疫活性大鼠的颅内C6大鼠神经胶质瘤细胞植入体和C57小鼠的MB-49人膀胱肿瘤细胞植入体也由所述痘苗病毒靶向。除了原发乳腺肿瘤之外，在对侧乳腺区域以及暴露的肺表面上淋巴结中也在外部检测到小的转移瘤，提示对侧乳腺和肺转移。概括而言，显示了发光细胞或微生物例如痘苗病毒可用于检测和治疗转移瘤。
使用发光细菌获得相似的结果，所述细菌(沙门氏菌、弧菌、李斯特氏菌、大肠杆菌)是经静脉内注入小鼠并可以立即在弱光成像仪下在整个动物中观测到。在细菌注入无胸腺(nu/nu)小鼠和无免疫活性的C57小鼠中后24小时由于被免疫系统清除而检测不到光发射。在携带从植入的C6神经胶质瘤细胞中产生的肿瘤的裸鼠中，光发射在给予细菌24小时后完全消除，与无肿瘤的小鼠相似。然而，注射48小时后，观测到仅发源于肿瘤区域的强烈的迅速增加的光发射。这个观测结果表明肿瘤组织中的持续细菌复制。光发射的程度依赖于所用的细菌菌株。在携带前列腺、膀胱和乳腺肿瘤的裸鼠内也表明了归巢(homing-in)程序及持续的光发射。除了原发肿瘤之外，转移瘤也可以如在乳腺肿瘤模型中所示例的观察。肿瘤特异性光发射在无免疫活性的具有膀胱肿瘤的C57小鼠以及具有脑神经胶质瘤植入体的Lewis大鼠中也观测到。一旦在肿瘤中，则在相同的动物中观测不到发光细菌释放进入循环及在随后植入的肿瘤中再建群。另外，发现表达Ruc-GFP融合蛋白的哺乳动物细胞在注入到血流的基础上也归巢于神经胶质瘤并在其中增殖。这些发现开启了设计多功能病毒载体之门，所述载体用于基于信号如光发射而检测肿瘤，也开启了抑制肿瘤发生和血管发生之门，可见于例如光消失及基于细菌和哺乳动物细胞的肿瘤靶向系统和组合的用于的治疗癌症的治疗性基因构建体的发展。这些系统具有如下优势(a)其特异性靶向肿瘤而不影响正常组织；(b)所述治疗性基因构建体的表达和分泌可以任选地在可诱导启动子的控制下使得分泌开始或停止；(c)在激活基因表达和蛋白质输送之前，肿瘤内输送系统的定位可以通过直接观测而核实。
如本发明所提供，上述基于细菌、病毒和真核细胞在肿瘤内积聚的系统可用于简便、快速并廉价地产生源自克隆的核苷酸序列的蛋白质及其他生物化合物。这个系统也用于在相同的动物中伴随多肽、RNA或其他生物化合物(在肿瘤组织中)和针对那些化合物的抗体(在血清中)的过量产生。如本发明所提供，在静脉内注射后，微生物如痘苗病毒可进入动物的肿瘤中，并且由于肿瘤的免疫豁免状态而可以优先在肿瘤组织中复制，从而在肿瘤内可以过量产生插入的基因编码的蛋白质。在收集所述肿瘤组织之后，定位和过表达的蛋白质可以通过简便的程序从肿瘤匀浆中分离。另外，基于在同一动物的血流中仅发现0.2-0.3％的在肿瘤中产生的所希望的蛋白质，因此达到了同时接种的小鼠及有效的针对过量生产的蛋白质的抗体。因此，同一小鼠(或任何其他动物)的血清可以收集并用作针对在肿瘤内过量产生的蛋白质或其他产物的小鼠衍生的抗体。
因此，本发明提供了通过给予具有肿瘤的对象一种微生物而在非人对象中产生基因产物和/或抗体的方法，其中所述微生物表达要产生的选择的蛋白质或RNA、其表达可导致要产生的化合物的形成的蛋白质或RNA、或者产生针对其的抗体的选择的蛋白质或RNA。本发明提供的方法进一步包括给予具有肿瘤的对象一种表达外源基因的微生物，所述外源基因编码要产生的选择的蛋白质或RNA、其表达可导致要产生的化合物的形成的蛋白质或RNA、或者产生针对其的抗体的选择的蛋白质或RNA。本发明提供的方法可进一步包括给予具有肿瘤的对象一种表达基因的微生物，所述基因编码要产生的选择的蛋白质或RNA、其表达可导致要产生的化合物的形成的蛋白质或RNA、或者产生针对其的抗体的选择的蛋白质或RNA，其中这种基因表达可以例如通过转录激活物或诱导剂或者转录抑制剂而调节。本发明提供的产生蛋白质、RNA、化合物或抗体的方法可进一步包括通过检测可检测的蛋白质而监测所述微生物在所述对象中的定位和/或水平，其中可检测的蛋白质可表示所选择的基因的表达，或者可以表示待诱导的微生物准备就绪以表达选择的基因或者待终止或暂停的表达抑制。本发明还提供了在非人对象中通过给予具有肿瘤的对象一种微生物而产生基因产物和/或抗体的方法，其中所述微生物表达要产生的选择的蛋白质或RNA、其表达可导致要产生的化合物形成的蛋白质或RNA、或者产生针对其的抗体的选择的蛋白质或RNA，其中给予所述微生物的所述对象不是转基因动物。本发明还提供了在非人对象中通过给予具有肿瘤的对象一种微生物而产生基因产物和/或抗体的方法，其中所述微生物表达要产生的选择的蛋白质，其中所述对象内的肿瘤根据其在翻译后处理选择的蛋白质的能力而选择。
所述系统的优势包括(a)不需要产生携带新的多肽编码盒的转基因动物；(b)肿瘤系统比组织培养物更有效；(c)妨碍动物发育的蛋白质及其他毒性蛋白质可以在肿瘤内过量产生而对宿主动物无负面作用；(d)该系统是快速的在4-6周内完成从cDNA克隆至蛋白质及抗血清纯化；(e)该系统相对廉价并且可易于按比例扩大；(f)可以达到正确的蛋白质折叠和修饰；(g)可以达到高度抗原性，这有益于更好的抗体产生；(h)可以达到在动物如小鼠中基于物种特异性细胞产生蛋白质，肿瘤作为发酵器。
产生基因产物和/或针对基因产物的抗体的示例性方法如图2所示。
在一个实施方案中，本发明提供了产生所希望的多肽、RNA或化合物的方法，所述方法包括如下步骤(a)将含有编码所希望的多肽或RNA的核苷酸序列的微生物注入携带肿瘤的动物中；(b)从所述动物中收集肿瘤组织；(c)从所述肿瘤组织中分离所希望的多肽、RNA或化合物。
所述示例性方法的步骤可概括如下(为特定的实施方案中示出，即另外含有编码发光蛋白的基因的痘苗病毒)(1)将所希望的DNA或cDNA插入痘苗病毒基因组中；(2)用发光蛋白构建体作为表达标记修饰所述痘苗病毒基因组；(3)在细胞培养物中重组及装配病毒；(4)筛选携带插入体的各个病毒颗粒，随后进行大规模病毒产生和浓缩；
(5)将所述病毒颗粒给予携带人、非人灵长类动物或其他哺乳动物源的肿瘤的小鼠或其他动物；(6)基于光发射确证动物中病毒的复制和蛋白质的过量产生；(7)收集肿瘤组织及任选地(单独)收集血液；(8)使用常规方法从肿瘤中纯化过表达的蛋白质，及任选地从血液中纯化抗血清。
本发明提供的方法中可使用任何微生物，条件是它们在动物中复制，对动物无致病性，例如是减毒的，并且由动物的免疫系统识别。在一些实施方案中，这些微生物也可以表达外源基因。合适的微生物和细胞例如EP A1 1 281 772和EP A1 1 281 767所公开的。本领域技术人员也已知怎样产生携带所希望的肿瘤的动物(见例如EP A1 1281 767或EP A1 1 281 777所述)。
本发明还提供了同时产生所希望的多肽、RNA或化合物及针对所述多肽、RNA或化合物的抗体的方法，所述方法包括如下步骤(a)给予携带肿瘤的动物一种含有编码所希望的多肽或RNA的核苷酸序列的微生物；(b)从该动物收集所述肿瘤组织；(c)从该肿瘤组织中分离所希望的多肽、RNA或化合物；(d)从得自该动物的血清中分离针对所述多肽、RNA或化合物的抗体。这种方法可用于产生多肽和/或针对所述多肽的抗体，所述多肽是毒性或不稳定的，或者其需要物种特异性细胞环境以正确折叠或修饰。
在另一个实施方案中，所述微生物可进一步含有编码可检测蛋白的核苷酸序列，所述蛋白如发光蛋白或荧光蛋白，或者能诱导可检测信号的蛋白质。
典型地在用编码所希望的多肽或RNA的核苷酸序列及任选地用编码可检测的蛋白如发光蛋白或荧光蛋白或者能诱导可检测的信号的蛋白质的核苷酸序列转染所述微生物或细胞的方法中，所述核苷酸序列存在于载体或表达载体中。本领域技术人员熟知各种表达载体，所述表达载体可以根据用于感染所述肿瘤的微生物、所述肿瘤的细胞类型、待感染的生物体及本领域已知的其他因素加以选择。在一些实施方案中，所述微生物可以是病毒，包括本发明公开的病毒。因此，所述核苷酸序列可以被包含于含有合适的表达盒(expression cassette)的重组病毒内。适合本发明使用的病毒包括但非限于杆状病毒、痘苗病毒、新培斯病毒、仙台病毒、腺病毒、AAV病毒或细小病毒如MVM或H-1。所述载体也可以是反转录病毒，如MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSV或GaLV。为在哺乳动物细胞中表达，合适的启动子是例如人巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)。另外，可以使用组织和/或器官特异性启动子。例如，所述核苷酸序列可以与启动子可操纵地连接以高度表达。这些启动子可包括例如可诱导的启动子，本领域技术人员已知各种这样的启动子。
为产生编码蛋白质或RNA的核苷酸序列或者为构建含有所述核苷酸序列的表达载体或病毒，可以使用本领域已知的一般方法。这些方法包括例如本领域已知的体外重组技术、合成方法及体内重组方法，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY所述。转染细胞、根据表型选择转染的细胞、根据表型选择转染子及使用含有编码蛋白质或RNA的DNA的载体表达所述核苷酸序列的方法为本领域所已知。
在一些实施方案中，要在肿瘤内产生的蛋白质或RNA可以与一个可诱导的启动子连接，所述启动子例如是可以由所述对象内源的物质或者给予对象的物质诱导的启动子。因此，本发明提供了在肿瘤内产生蛋白质或RNA的方法，其中所述产生可以通过给予对象一种物质而诱导，及任选地收集所述肿瘤并从所述肿瘤中分离所述蛋白质或RNA。这些诱导方法可以与监测对象中的微生物的方法联合。例如，可以通过检测可检测的蛋白质而监测微生物。在包括监测的方法中，检测所述对象中微生物的所希望定位和/或水平可以与诱导微生物基因表达一起进行。例如，当微生物表达的可检测的蛋白质在肿瘤内检测到但在正常器官或组织中不明显时，可给予所述对象一种诱导剂。在另一个实例中，当微生物表达的可检测的蛋白质在肿瘤内检测到，在正常器官或组织中也检测到时，可以暂停或延缓给予诱导剂直至在正常器官或组织中不再检测到可检测的蛋白质。在另一个实例中，当微生物表达的可检测的蛋白质在肿瘤内以足够水平检测到时，可以给予所述对象一种诱导剂。在另一个实例中，当微生物表达的可检测的蛋白质在肿瘤内检测不到足够水平时，可以暂停或延缓给予诱导剂直至在肿瘤内检测到足够水平的蛋白质。
本发明还提供了在肿瘤内产生蛋白质或RNA的方法，通过给予编码所述蛋白质或RNA的一种微生物及一种基因表达的抑制剂而产生。所述基因表达的抑制剂可以在预定时间给予，或者直至所述微生物积聚在肿瘤内但不积聚在正常器官或组织中时给予，或者直至足够水平的微生物积聚在所述肿瘤内时给予，在此时可以停止或暂停给予所述抑制剂，这样可引起蛋白质或RNA的表达。如本领域技术人员所公认，与本发明提供的关于监测可检测的蛋白质及给予诱导剂的那些方法相似的方法，也可以用于停止或暂停给予抑制剂。
在一个实施方案中，所述微生物是细菌，例如减毒的细菌，如本发明所提供的那些细菌。细菌例如包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌、减毒的霍乱弧菌、减毒的单核李斯特氏菌或大肠杆菌。或者，病毒如痘苗病毒、AAV、反转录病毒可用于本发明提供的方法中。在例证的方法中，所述病毒是痘苗病毒。可用于本发明方法中的其他细胞包括哺乳动物细胞，如纤维瘤细胞，包括人细胞如人纤维瘤细胞。
可以使用任何动物，包括实验动物或家畜，包括例如小鼠、大鼠及其他啮齿类动物、兔、豚鼠、猪、绵羊、山羊、牛和马。所用动物例如是小鼠。所述肿瘤可以通过在所述动物体内植入肿瘤细胞而产生。通常为产生所希望的多肽、RNA或化合物，可以使用任何类型实体瘤，如快速生长类型的肿瘤。快速生长类型的肿瘤例如包括C6大鼠神经胶质瘤和HCTl16人结肠癌。通常为产生所希望的抗体，可以使用相对缓慢生长类型的肿瘤。缓慢生长类型的肿瘤例如包括HT1080人纤维肉瘤和GI-101A人乳腺癌。为产生不依赖于T细胞的抗体，可以使用携带同种异体(allogenic)肿瘤或异种移植物(xenograft)的nu-/nu-小鼠；而为产生依赖于T细胞的抗体，可以使用具有同源肿瘤的免疫活性小鼠。在一些实施方案中，如其中产生的化合物是一种蛋白质的实施方案中，所选择的微生物可以是使用肿瘤细胞的翻译成分(如蛋白质、小泡、底物)的微生物，如使用肿瘤细胞翻译成分的病毒。在这些情况中，肿瘤细胞类型可以根据对所述蛋白质进行所希望的翻译后处理进行选择，所述翻译后处理包括蛋白酶解、糖基化、酯化、二硫化物形成及可需要细胞成分以完善的任何再折叠或多聚体装配。在一些实例中，所选择的肿瘤细胞类型可以是与待表达的蛋白质相同物种的，因此导致蛋白质的物种特异性翻译后处理，肿瘤细胞类型表达的蛋白质物种例如是人。
1.重组蛋白质和RNA分子的产生所述肿瘤组织可以通过手术从动物切除。在所述肿瘤组织匀浆后，可根据已建立的方法纯化所希望的多肽、RNA或其他生物化合物。例如，在重组多肽的情况中，所述多肽可含有一个可结合标记如his-标记物，并且可以例如通过柱层析而纯化。动物肿瘤中积聚足够量的多肽或RNA所需要的时间依赖于许多因素，例如动物的种类或肿瘤的种类，可以由本领域技术人员通过常规实验确定。一般地，所希望的多肽的表达可以在注入病毒两天后检测。在注射后大约两周达到表达峰值并持续直至两个月。在一些实施方案中，肿瘤内的所希望的多肽或RNA的量可以通过监测微生物表达的可监测的物质而确定，其中可监测的物质的浓度可以反映所述肿瘤内所希望的多肽或RNA的量。
在另一个实施方案中，所希望的多肽、RNA或其他化合物可以在所述对象中产生，并对所述对象提供有益作用。在一个实例中，微生物可以编码一种蛋白质或RNA，或者产生不由所述对象产生的化合物的蛋白质。在一个实例中，微生物可编码一种肽激素或细胞因子，如胰岛素，其可以释放进入缺乏产生胰岛素能力或者需要增加脉管系统中胰岛素浓度的对象的脉管中。在另一个实例中，可以患有凝血缺陷如血友病对象中产生凝血因子。在一些实施方案中，在肿瘤中产生的蛋白质或RNA可以与一种可诱导的启动子连接，如可通过增加葡萄糖浓度而诱导的启动子。在这些情况中，所述蛋白质或RNA的产生可以应答对象中的一或多种物质而控制，或者通过可给予对象的一或多种物质如可诱导转录的化合物例如RU486而控制。因此，在一些实施方案中，本发明提供的方法可包括给予具有肿瘤的对象一种微生物，所述微生物可表达编码有益的基因产物或者可产生有益的化合物的基因产物的一或多个基因。
2.抗体的产生本发明还提供了产生所希望的抗体的方法，所述方法包括如下步骤(a)给予携带肿瘤的动物一种含有编码一种抗原的核苷酸序列的微生物；(b)从得自该动物的血清中分离针对所述抗原的抗体。所述针对所述抗原的抗体可以根据本领域熟知的方法分离及纯化。针对特异性污染抗原(例如细菌抗原)的抗体可以通过吸附除去，针对靶抗原的抗体可以通过亲和纯化而与污染抗体分离，例如通过本领域已知方法使用重组抗原作为柱的配体通过免疫亲和层析进行分离。如本领域所已知，抗体可以从动物中一次收集，也可以通过收集血液在一段时间内收集。
F.药物组合物、组合及试剂盒本发明提供了含有本发明提供的微生物和一或多种成分的药物组合物、组合和试剂盒。药物组合物可包括一种微生物和一种药物载体。组合可包括两或多种微生物、一种微生物和一种可检测的化合物、一种微生物和一种微生物表达调节化合物、一种微生物和一种治疗性化合物。试剂盒可包括本发明提供的药物组合物和/或组合，及一或多种成分如使用说明书、一种检测对象中微生物的设备，及一种给予对象化合物的设备。
1.药物组合物本发明还提供了含有一种修饰的微生物及一种合适的药物载体的药物组合物。合适的药物载体为本领域所已知，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液如油/水乳状液、各种类型的增湿剂、无菌溶液，等等。这些载体可以通过常规方法配制并可以合适的剂量给予所述对象。可用于输送微生物的胶体分散系包括高分子复合物、纳米微囊(nanocapsule)、微球体、珠和基于脂质的系统包括水包油乳状液(混和的)、微团、脂质体和脂质-核酸复合物(lipoplex)。胶体分散系例如是脂质体。可使用器官特异性或细胞特异性脂质体以达到仅输送至所希望的组织。脂质体的靶向可以通过本领域技术人员已知的方法进行。这种靶向包括被动靶向(利用脂质体倾向分布于含有窦状小管的器官中RES的细胞的自然倾向)或主动靶向(例如通过熟知的方法将脂质体与特异性配体的偶联，所述配体如抗体、受体、糖、糖脂、蛋白质等)。在本发明的方法中，可以使用单克隆抗体通过特异性细胞表面配体将脂质体靶向于特异组织例如肿瘤组织。
2.宿主细胞本发明还提供了含有本发明提供的微生物如修饰的痘苗病毒的宿主细胞。这些宿主细胞可包括对微生物如痘苗病毒感染易感的任何哺乳动物、禽类和昆虫细胞和组织，包括鸡胚、兔、仓鼠和猴肾细胞，例如CV-1、BSC40、Vero、BSC40和BSC-1及人HeLa细胞。本领域已知转化这些宿主细胞的方法及根据表型选择转化体的方法。
3.组合组合可包括一种微生物及一或多种成分。本发明的代替微生物的任何组合也可以含有一种药物组合物和/或含有一种微生物及一或多种成分的宿主细胞。
组合例如可包含两或多种微生物、一种微生物和一种可检测的化合物、一种微生物和一种微生物表达调节化合物、或者一种微生物和一种治疗性化合物。含有两或多种微生物的组合可含有例如在进行本发明的方法中均可给予对象的两或多种微生物，包括相继给予这两种微生物。在一个实例中，组合可含有一种病毒和一种细菌，其中例如首先给予所述对象所述病毒，随后给予所述对象所述细菌。
本发明提供的组合可含有一种微生物和一种可检测的化合物。可检测的化合物可包括配体或底物或者可与微生物表达蛋白的或RNA分子相互作用和/或特异性结合，并且可提供一种可检测的信号如可通过X线断层摄影、光谱或磁共振技术检测的信号的其他化合物。可检测的化合物例如可以是或者可以含有一种显影剂如磁共振、超声或X线断层摄影的显影剂，包括放射性核素。可检测的化合物可包括本发明提供的及本领域已知的其他任何化合物。典型地，与微生物一起包含于本发明提供的组合中的可检测的化合物是这样的化合物，其是一种底物、配体，或者可以另外与所述微生物编码的一种蛋白质或RNA特异性相互作用；在一些实例中，所述蛋白质或RNA是一种外源蛋白质或RNA。微生物/可检测的化合物例如包括编码萤光素酶/萤光素，β-半乳糖苷酶/(4，7，10-三(乙酸-1-(2-β-吡喃半乳糖苷酰乙氧基(galactopyranosylethoxy))-1，4，7，10-四氮杂环十二烷tetraazacyclododecane)钆(Egad)及本领域已知的其他组合的微生物。
本发明提供的组合可含有一种微生物和一种微生物基因表达调节化合物。调节基因表达的化合物为本领域所已知，包括但非限于转录激活物、诱导剂、转录抑制剂、RNA聚合酶抑制剂，及RNA结合化合物如siRNA或核酶。本领域已知的任何基因表达调节化合物均可以包含在本发明提供的组合中。典型地，与微生物一起包含在本发明提供的组合中的基因表达调节化合物是这样的化合物，其可结合、抑制或者与所述组合中微生物的在基因表达中是活性的一或多种化合物反应的化合物，如转录因子或RNA。微生物/表达调节剂可以是编码嵌合的转录因子复合物的微生物，所述复合物具有与酵母GAL4DNA结合结构域和单纯疱疹病毒蛋白VP16的一个激活结构域融合的一个突变的人孕酮受体，还含有一个含有腺病毒主要晚期E1BTATA box上游的一系列GAL4识别序列的合成的启动子，其中所述化合物可以是RU486(见例如Yu et al.，Mol Genet Genomics 2002268169-178)。本领域已知的各种其他微生物/表达调节剂组合也可以包括在本发明提供的组合中。
本发明提供的组合可含有一种微生物和一种治疗性化合物。治疗性化合物可包括是微生物表达的酶的底物的化合物，可杀死或抑制微生物生长或毒性的化合物，或者本发明提供的或本领域已知的其他治疗性化合物以与微生物协同起作用。典型地，与微生物一起包含在本发明提供的组合中的治疗性化合物是与微生物协同起作用的化合物，如所述微生物编码的酶的底物，或者已知有效针对所述组合中的微生物的抗微生物活性物质。微生物/治疗性化合物组合例如可包括编码单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦，及化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)/青霉素的一种微生物。本发明提供的或者本领域已知的任何已知组合均可包括在本发明提供的组合中。
4.试剂盒试剂盒是组合包装，其任选地包括其他试剂或设备，或者使用说明书。本发明提供的代替微生物的任何试剂盒也可以含有一种药物组合物、含有微生物的宿主细胞、和/或一种组合，及一或多种成分。
试剂盒例如可包括本发明提供的微生物，并任选地可包括一或多种成分如使用说明书，检测对象中的微生物的设备，及给予对象化合物的设备。
在一个实例中，试剂盒可含有说明书。说明书典型地包括描述所述微生物及任选地试剂盒中包括的其他成分的说明，及给予方法的说明，包括为给予所述微生物确定所述对象的适当状态、适当的剂量及适当的给予方法的说明。说明书还可以包括在处理持续时期监测所述对象的指导。
在另一个实例中，试剂盒可含有检测对象中微生物的一种设备。检测对象中微生物的设备可包括弱光成像设备以检测例如萤光素酶发出的光或者绿色荧光蛋白发出的荧光，包括一种磁共振测量设备如MRI或NMR设备、X线断层扫描仪如PET、CT、CAT、SPECT或者其他相关扫描仪、超声设备、或者可用于检测对象体内微生物表达的蛋白质的其他设备。典型地，所述试剂盒的设备能检测试剂盒中微生物表达的一或多种蛋白质。含有微生物和检测设备的任何试剂盒可包括在本发明提供的试剂盒中，例如表达萤光素酶的微生物和弱光成像仪、或者表达绿色荧光蛋白的微生物和弱光成像仪。
本发明提供的试剂盒还可以包括给予对象一种微生物的设备。本领域已知的给予药物或疫苗的任何设备均可包括在本发明提供的试剂盒中。设备例如包括皮下注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器、液体分配器如点眼药器。典型地，给予所述试剂盒的微生物的设备与所述试剂盒的微生物相适合，例如无针注射器如高压注射器可以包括在微生物不被高压注射损害的试剂盒中，但在微生物被高压注射损害的试剂盒中典型地不包括这种高压注射器。
本发明提供的试剂盒也可包括给予对象一种化合物的设备。本领域已知的给予对象药物的任何各种设备均可以包括在本发明提供的试剂盒中。设备例如包括皮下注射器针头、静脉内注射针、导管、无针注射器、吸入器和液体分配器。典型地给予所述试剂盒的化合物的设备与所希望的给予所述化合物的方法相适合，例如皮下给予的化合物可包括在具有皮下注射器针头和注射器的试剂盒中。
F.实施例如下实施例仅是例证了本发明而无限制本发明之意。
实施例1重组病毒的产生称为VGL的野生型痘苗病毒(VV)毒株LIVP(熟知的病毒毒株，最初通过ATCC登记号VR-1549的Lister毒株(Lister Institute of ViralPreparations，Moscow，Russia)的减毒而产生；见Al’tshtein et al.，(1983)Dokl.Akad.Nauk USSR 285696-699所述)用作构建称作RVGLX的重组病毒的亲代病毒。所有痘苗病毒均使用蔗糖梯度纯化(Yoklik)。增殖VV并使用CV-1细胞(ATCC No.CCL-70)通过噬斑分析确定效价。构建重组痘苗病毒的方法为本领域技术人员所已知(见例如Chakrabarti et al.，(1985 Mol.Cell Biol.53403及美国专利No.4,722,848所述)。表1概括了这个实施例中描述的重组VV毒株。通过PUV处理失活VVLIVP VV(3×108pfu/ml)与1μg/ml补骨脂素(Calbiochem，LaJolla，CA)温育，在室温悬浮于Hank’s缓冲液中10分钟，然后在装备有5个365nm长波UV灯泡的Stratalinker 1800UV交联装置(Stratagent，La Jolla CA)中照射5分钟以产生PUV-VV。
RVGL8LacZ插入LIVP的F3中含有插入NotI位点的lacZ基因的重组痘苗病毒RVGL8的构建如Timiryasova et al.(2001)，BioTechniques31，534-540所述进行。简而言之，如下制备。含有在痘苗病毒p7.5启动子和强合成痘苗病毒pE/L启动子控制下的1acZ基因的pSC65的BamHI/SmaI片段(3293bp)(见Chakrabarti et al.(1997)，BioTechniques23，1094-1097，也见Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing andWiley-Interscience Supplement 1516.17.2(1992)所述；也见本发明的SEQ ID No.5及PCT国际申请No.WO 99/32646的SEQ ID No.57所述)，通过用限制酶消化而分离，用Klenow酶平端化并克隆进pNT8质粒的SmaI位点(Timiryasova et al.(2001)，BioTechniques 31534-540)以产生pNZ2穿梭质粒。
为构建pNT8，使用如下引物以VV作为模板扩增野生型VVLIVP毒株的NotI区域正向5’-GGGAATTCTTATACATCCTGTTCTATC-3’(SEQ IDNo.3)；反向5’-CCAAGCTTATGAGGAGTATTGCGGGGCTAC-3’(SEDID No.4)。
所得972bp片段在5’和3’末端分别含有侧翼EcoRI和HindIII位点。PCR产物用EcoRI和HindIII切割并插入pUC28(Benes et al.，(1993)Gene 130151)中。从pUC18(可得自ATCC，保藏号37253)中通过使用如下引物在pUC18的EcoRI和SstI位点导入一个合成的寡接头而制备质粒pUC28pUC28 I5′AATTCAGATCTCCATGGATCGATGAGCT 3′(SEQID NO.6)；pUC28 II3′GTCTAGAGGTACCTAGCTAC 5′(SEQ ID No.7)。
这样将BglII、ClaI和NcoI位点导入pUC18的多接头中。
质粒pNZ2含有编码在痘苗病毒早期/晚期启动子p7.5及衍生自质粒pSC65的合成早期/晚期痘苗病毒pE/L启动子控制下的大肠杆菌lacZ基因的cDNA(见Chakrabarti et al.(1997)，Bio Techniques 23，10941097；也见于Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishingand Wiley-Interscience Supplement 1516.17.2(1992)；也见本发明的SEQ ID No.5及PCT国际申请No.WO 99/32646的SEQ ID No.57所述)。质粒pNZ2提供了用于lacZ进入VGL病毒(ATCC VR-1549)的NotI位点的同源重组，产生称为RVGL8的重组痘苗病毒。为了在体内重组，转染用NotI消化的野生型痘苗病毒DNA与未消化的质粒DNA pNZ2的复合物进入PUV VV感染的细胞中以产生RVGL8(见图1A和图1B)。RVGL8及本发明所述其他重组痘苗病毒列于下表1。
突变病毒形成/转染将在60mm培养皿(Corning，Corning，NY，USA)上生长的CV-1非洲绿猴肾成纤维细胞(ATCC No.CCL-70)用PUV-VV(用补骨脂素和UV处理的LIVP株；见例如Tsung et al..(1996)，J.Virol.70，165-171；Timiryasova et al.(2001)，BioTechniques31，534-540；Timiryasova et al.(2001)，J.Gene 3 Med.3，468-477)以感染复数(MOI)为1进行感染。
感染后2小时，将细胞用NotI-消化的病毒DNA(4μg)和完整的质粒DNA(4μg)的混合物转染。根据厂商指导使用5μl GenePORTER试剂(Gene Therapy Systems，San Diego，CA，USA)/μg DNA进行脂质介导的细胞转染。将细胞在转染混合物中温育4小时，然后补加含有20％胎牛血清的培养基。每天通过光学显微镜监测致细胞病变(cytopathic effect)。将细胞温育5-7天直至病毒噬斑形成及完全的致细胞病变。然后，收集感染的细胞，再悬浮于0.5ml培养基中，冷冻和解冻三次以释放病毒。选择单个病毒噬斑以制备小和大的重组病毒原种，并分析所述基因的插入和表达情况。
确认突变通过Southern印迹分析病毒DNA。简而言之，为分离病毒DNA，将在10cm平板上生长的铺满的单层CV-1细胞用野生型VV(LIVP毒株)或得自单个重组噬斑的病毒原种的VV感染。当致细胞病变完成时，收集细胞并将沉淀再悬浮于3ml的10mM Tris-HCl，pH9.0中。将病毒颗粒溶解，用蛋白酶K处理并通过苯酚/氯仿提取分离病毒DNA，随后用乙醇沉淀。将所述DNA再悬浮于100μl无菌水中。病毒DNA样品在37℃通过NotI消化过夜，随后通过苯酚-氯仿处理，沉淀并通过0.8％琼脂糖凝胶分离10μg DNA。将该DNA移至正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)上，并使用GS基因接头(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)固定在该膜上。使用非放射性DNA标记和检测试剂盒(Roche DiagnosticsCorporation)并在37℃温育60分钟进行DNA的DIG标记。将所述膜与变性的DIG标记的编码lacZ基因的质粒pNZ2的3357bp NotI-NotIDNA片段杂交。根据厂商指导执行杂交条件和产生印迹。
条带的预测大小为3357bp。NotI消化的病毒DNA与3357bpDNA探针的杂交证实1acZ基因整合入病毒基因组的NotI位点。
具有单TK基因突变的RVGL2和RVGL23病毒的构建痘苗病毒LIVP用于构建重组病毒RVGL2。痘苗病毒WesternReserve(WR)用于构建重组病毒RVGL23。海肾萤光素酶和水母GFP融合体(ruc-gfp；1788bp；见Wang et al.，(1996)BioluminescenceChemiluminescence 9419-422；Wang et al.，(2002)Mol.Genet.Genomics 268160-168；Wang et al.(1997)pp 419-422 inBioluminescence and Chemiluminescencemolecular reporting withphotons，Hastings et al.，，eds.，Wiley，Chicheser UK；也见美国专利No.5,976,796；见本发明SEQ ID No.8所示，列出了ruc-gfp构建体的序列)的cDNA通过限制性核酸内切酶PmeI从质粒pcDNA-ruc-gfp(RG)切下，这在Wang et al.，(1996)BioluminescenceChemiluminescence 9419-422和Wang et al.，(2002)Mol.Genet.Genomics 268160-168中描述并在下文简要描述，并插入pSC65质粒(见本发明SEQ ID No.5；及PCT国际申请No.WO 99/32646中SEQID No.57所示)的SmaI位点，产生pSC65-RG-1质粒DNA。
简而言之，为制备pcDNA-ruc-gfp，将编码修饰的海肾萤光素酶末端DNA(见Wang et al.(1997)pp 419-422 in Bioluminescence andChemiluminescencemolecular reporting with photons，Hastings et al.，，eds.，Wiley，Chicheser UK)的EcoRI-NotI片段克隆进pcDNA3.1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，海肾萤光素酶在CMV启动子的控制下表达。除去在海肾萤光素酶ORF末端的终止密码子，所得质粒用NotI消化。含有编码人源化的水母GFP(Zolotukhin et al.，(1996)J.Virol.704646-4654)的ORF的NotI片段从pTR-β-肌动蛋白质粒中切下并插入编码海肾萤光素酶的质粒的NotI位点。所得质粒称为pcDNA-ruc-the ruc-gfp。
含有在痘苗病毒PE/L启动子控制下的ruc-gfp融合体及在VV的p7.5启动子控制下的大肠杆菌β-半乳糖苷酶的新质粒pSC65-RG-1用于构建LIVP毒株的单一TK基因中断的病毒RVGL2和WR毒株的单一TK基因中断的病毒RVGL23。CV-1细胞用野生型LIVP或野生型WR病毒感染，感染复数MOI为0.1，2小时后，将pSC65-RG-1质粒DNA使用FuGene6转染试剂(Roche)转染。温育24小时，将细胞进行3次冷冻和解冻以释放病毒。重组病毒在存在底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal，Stratagene，Cedar Creek，TX，USA)的情况中在CV细胞上筛选。病毒纯化4个周期后，所有病毒噬斑对于β-半乳糖苷酶表达均是阳性的。ruc-gfp融合蛋白的表达分别通过发光测定和荧光显微镜证实。病毒的示意图在图1B中列出。
具有单基因突变的RVGL5和RVGL9病毒的构建重组痘苗病毒RVGL5含有插入在痘苗病毒基因组HA基因中的在痘苗病毒晚期p11启动子控制下的lacZ基因(Timiryasova et al.(1993)Mol Biol 27392-402；也见Timiryasova et al.，(1992)Oncol.Res 11133-144所述)。重组痘苗病毒RVGL9含有插入VV基因组的F3基因中的在合成的早期/晚期痘苗病毒启动子(PE/L)控制下的海肾萤光素酶基因(ruc)与绿色荧光蛋白(gfp)的cDNA的融合体(Timiryasova et al.，(2000))pp.457-459 in Proceedings of the 11thInternational Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，Case et al.，eds)。RVGP5和RVGLP9如针对RVGLP2和RVGLP23所述的那样构建。
具有TK和F3基因双重突变的RVGL20病毒的构建具有多聚A(poyA)序列的人运铁蛋白受体(hTR)(2800bp)的cDNA通过BamHI消化分离自pCDTR1质粒(ATCC登记号No.59324和59325)，用Klenow处理并插入pSC65质粒(本发明的SEQ ID No.5及PCT国际申请No.WO 99/32646中的SEQ ID No.57)的SalI位点，产生pSC-TfR和pSC-rTfR。质粒pSC-rTfR含有与痘苗病毒PE/L启动子方向相反的cDNA hTR和在早期/晚期痘苗病毒p7.5启动子控制下的大肠杆菌β-半乳糖苷酶，，它们的两侧为痘苗病毒序列用以插入痘苗病毒TK基因中。pSC-rTfR用于构建RVGL20病毒。RVGL9，在F3基因座中携带ruc-gfp融合体的具有单缺失的重组病毒，其在LIVP毒株中含有一个唯一的NotI位点(如上所述，也见Timiryasova etal.，(2000)pp.457-459 in Proceedings of the 11tnInternationalSymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，Case et al.，eds所述)，其用作通过上述同源重组方法产生RVGL20病毒的亲代病毒。RVGL20的示意图示于图1B。
具有TK、F3和HA基因三重突变的RVGL21病毒的构建将大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶(gus)的cDNA(1879bp)用XbaI(用Klenow片段平端)和HindIII从pLacGus质粒(Invitrogen；见本发明SEQ ID No.9所示)中释放，并克隆进用XhoI(Klenow处理)和HindIII消化的pSCl1质粒pSC65(Chakrabarti et al.(1985)Mol.Cell Biol.53403-3409；本发明的SEQ ID 5及PCT国际申请No.WO 99/32646中SEQ ID No.57所示)中，并在痘苗病毒p11晚期启动子控制下，产生质粒pSC-GUS。将pSC-GUS质粒的SmaI-HindIII片段插入用SmaI和BamHI消化的pVY6质粒(这是将抗原基因插入痘苗病毒血凝素基因中的载体(见例如Flexner et al.，(1988)Nature 355259-262；Flexneret al.，(1988)Virology 166339-349；也见美国专利No.5,718,902)所述)中，产生pVY-GUS质粒。称为pVY-GUS质粒的所得质粒，含有侧翼是痘苗病毒序列的在痘苗病毒晚期启动子p11控制下的编码gus的cDNA，以插入血凝素(HA)基因中。具有双重缺失的重组病毒RVGL20用作构建RVGL21病毒的亲代病毒。CV-1细胞用RVGL20病毒感染，MOI为0.1。感染后2小时，使用FuGene6转染试剂(Roche)用pVY-GUS质粒DNA转染细胞。向琼脂培养基中加入β-葡糖苷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-GlcA)(Research Products Int.Co.，Mt.Prospect，IL，USA)，在CV-1细胞中通过颜色选择重组病毒噬斑。在存在X-GlcA的条件下在琼脂培养基中进行8次纯化循环后，选择纯的重组病毒RVGL21。RVGL21病毒具有TK、F3和HA基因的中断，如图1B所示。
体外病毒生长将CV-1、C6(ATCC No.CCL-107)、B16-F10(ATCC No.CRL-6475)和GI-101A(Rumbaugh-Goodwin Institute for Cancer Research Inc.Plantation，FL；U.S.Pat.No.5,693,533)细胞接种在24孔平板中，密度分别为1×105、2×105、4×105和2×105个细胞/孔。第二天，将细胞同时用0.001或0.01PFU/细胞的野生型LIVP及其突变体感染。将所述病毒悬浮液加入细胞单层(0.15ml/孔)中，在37℃温育1小时，每10分钟简短搅动一次。然后，除去病毒，加入合适的完全生长培养基(1ml/孔)，然后将所述细胞在病毒感染后在37℃温育24、48、72和96小时。为建立静息(resting)细胞培养物，将铺满单层的CV-1细胞在具有5％FBS的DMEM中在37℃温育6天。感染这些静息细胞并在感染后同一时间点如上所述收集这些静息细胞。来自感染的细胞的病毒通过一次冷冻和解冻循环而释放。病毒效价通过对CV-1细胞的噬斑分析一式两份确定并以PFU/ml表示。
表1重组痘苗病毒(VV)表
实施例2病毒水平的体外分析LacZ如前所述进行重组痘苗病毒诱导的lacZ表达的分析(Timiryasovaet al.(2001)，BioTechniques31，534-540)。简而言之，将在6孔平板(Corning，Corning，NY，USA)中生长的CV-1细胞用病毒原种的10倍稀释液感染。在37℃不时摇动使得该病毒吸附1小时。然后将该病毒接种体用含有1％琼脂的完全培养基置换，并温育48小时。为观测病毒噬斑，将300μg的X-Gal(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)/ml和0.1％中性红(Sigma，St.Louis，MO，USA)加入第二个琼脂中并覆盖，在37℃温育12小时后计数并分离噬斑。体外细胞中痘苗病毒的水平也可以通过测定细胞中噬斑形成单位(PFU)而确定。通过噬斑形成单位测定的VV的体外感染性野生型LIVP病毒及其突变体感染及复制的能力在分裂的和静息的CV-1细胞以及在三个肿瘤细胞系(C6、GI-101A、B16-F10)中分析。结果表明在MOI为0.001，痘苗病毒突变体可有效感染分裂的CV-1细胞并在其中复制。痘苗病毒的显著产量得自分裂的CV-1细胞。野生型VV及其突变体在分裂的CV-1细胞中的产量是在静息的细胞中的大约10倍。在体外研究中痘苗病毒突变体和野生型病毒之间回收的病毒无显著差异。TK、F3和HA基因的中断在分裂的CV-1细胞中对VV突变体复制无差异。测试了三个肿瘤细胞。在MOI为0.001时对致细胞病变的相对敏感性如下CV-1(分裂的，最高)、CV-1(静息的)、C6、GI-101A、B16-F10(最低)。小鼠B16-F10黑素瘤细胞对病毒感染(MOI为0.001)不敏感。从MOI为0.01感染的黑素瘤中获得非常低的病毒效价。还观测到野生型WR毒株与LIVP毒株相比能更有效地在体外感染黑素瘤细胞，并且与LIVP毒株相比获得较高的病毒回收率。
实施例3动物模型和测定动物模型6-8周龄的无胸腺裸鼠(nu/nu)和C57BL/6小鼠(Harlan AnimalRes.，Inc.，Wilmington，MA)用于动物研究。将5或4只一组的小鼠经静脉内用0.1ml体积的107PFU的VV感染。小鼠通过弱光成像仪(针对ruc表达)和荧光成像仪(针对gfp表达)成像。该研究在开始前经Animal Research Committee of LAB Research International Inc.(SanDiego，CA，USA)许可。所有动物均在LAB Research International Inc.(San Diego，CA，USA)许可的兽医的指导下饲养。
神经胶质瘤模型为建立皮下神经胶质瘤，通过胰蛋白酶消化收集大鼠神经胶质瘤C6细胞(ATCC No.CCL-107)，并将5×105个细胞/0.1ml/小鼠皮下注射(s.c.)进6-8周龄的雄性无胸腺小鼠的右后肢。在植入C6细胞后第7天当肿瘤大小中位数为大约150mm3时，以107PFU/0.1ml/小鼠剂量静脉内注射(i.v.)病毒。注射病毒后14天处死小鼠。在使用RVGL9病毒的动力学研究中，在注射病毒后20分钟、1小时、4小时、18小时、36小时、3天、5天、7天和14天处死小鼠。
乳腺肿瘤模型为产生皮下(s.c)乳腺肿瘤，将人乳腺癌GI-101 A细胞(Rumbaugh-Goodwin Institute for Cancer Research Inc.Plantation，FL；U.S.Pat.No.5,693,533)以5×106个细胞/0.1ml/小鼠的剂量皮下注射进6-8肿瘤雌性无胸腺小鼠的右后肢。在植入GI-101A细胞后的第30天当肿瘤大小中位数为大约500mm3时，以107PFU/小鼠的剂量静脉内注射病毒。在注射病毒后第14天处死小鼠。小鼠的存活实验和乳腺肿瘤治疗研究长时期保持(注射病毒后100天以上)。处死产生大小为大约4000mm3的肿瘤和/或丧失50％体重的小鼠。
黑素瘤模型对于黑素瘤模型，将小鼠黑素瘤B16-F10细胞(ATCC No.CRL-6475)以2×105个细胞/0.04ml/小鼠的剂量注射进6-8肿瘤雄性C57BL/6小鼠的足趾中。在植入细胞后第18天当肿瘤建立时(肿瘤大小中位数为大约100mm3)，以107/小鼠的剂量静脉内注射病毒。注射病毒后10天处死小鼠。
动物模型中痘苗病毒从裸鼠的肿瘤和器官中收集痘苗病毒从处死的动物中收集血液，及收集器官(肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢、膀胱、脑、心)和肿瘤并在含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS中匀浆。在切割每个器官后更换剪刀和镊子以避免组织的交叉污染。将样品冷冻及解冻，在1,000g离心5分钟。通过噬斑测定在用无血清培养基稀释上清后在CV-1细胞上确定病毒效价，并在温育48小时后将其用1％(wt/vol)结晶紫染色。每个样品均一式两份分析，病毒效价以组织的平均PFU/g表示。
测定对携带皮下人乳腺肿瘤的6-8周龄的裸鼠进行存活研究。小鼠经静脉内注射107的痘苗病毒，随后进行存活研究。每周测定两次个体体重。在注射病毒后体重的增加/丧失以百分比计算注射病毒当天体重(g)-肿瘤重量(g)/监测当天体重(g)-肿瘤重量(g)×100％。从安乐死的动物中切下脾并称重。RSW如下计算RSW＝脾的重量(g)×104/动物体重(g)-肿瘤重量(g)。当平均肿瘤体积达到3000mm3或产生疾病迹象时，对小鼠行安乐死。根据NIH Guide for the Care andUse of Laboratory Animals进行快速CO2安乐死术。
报道基因分析LacZ小鼠组织样品和血清中大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性使用化学发光Galacto-Light PlusTMAssay系统(Applied Biosystems，Bedford，MA，USA)根据该试剂盒的厂商指导进行确定。简而言之，将1-20μl样品移至具有200μl的1∶100稀释的反应缓冲稀释液的试管中，在室温温育30分钟。将300μl加速剂(-II)等分小份加入具有样品的试管中，迅速混和并使用光度计读出信号。β-半乳糖苷酶活性以每克组织的相对发光单位(RLU)表示。纯化的大肠杆菌β-半乳糖苷酶(Sigma)用作阳性对照并产生标准曲线。
萤光素酶海肾萤光素酶活性如前所述(Yu and Szalay，2002)加以一些修改在已经匀浆的组织样品的上清中使用Turner TD 20e光度计(TurnerDesigns，Sunnyvale，CA，USA)测定。简而言之，将20μl样品加入含有底物腔肠素的500μl萤光素酶测定缓冲液(0.5M NaCl，1mMEDTA，0.1M磷酸钾，pH7.4)中。在10秒间隔期间测定萤光素酶活性，以每克组织的RLU表示。
测定结果痘苗病毒RVGL8的肿瘤选择性复制从6只小鼠的肿瘤样品和不同器官及正常器官中收集野生型LIVP(VGL)和RVGL8。从肿瘤、睾丸、膀胱和肝以及从脑中收集VGL。然而，发现重组病毒RVGL8通常只在肿瘤中(在#24小鼠中发现病毒在睾丸、膀胱和肝中，在#22小鼠发现在睾丸中)，在6个测试的动物中从脑组织未收集到病毒。这个发现表明具有NotI位点中断的RVGL8的安全性。
RVGL9随着时间的存在情况具有单一F3基因突变并携带ruc-gfp的痘苗病毒RVGL9用于在静脉内给予免疫缺陷的携带皮下神经胶质瘤的无胸腺小鼠之后评价载体组织分布模式。使用这种重组病毒的组织分布数据示出病毒分布和这个VV毒株的肿瘤靶向。基于ruc和gfp表达，通过在小鼠中病毒复制的非侵入性成像进行动力学研究。将携带皮下大鼠神经胶质瘤C6的每组4-5只动物通过尾静脉注射107的RVGL9病毒。在注射病毒后20分钟，1、4、18和36小时，3、5和14天处死动物。在静脉内注射病毒后的任何时间点从脑、膀胱或睾丸中均收集不到存活的病毒颗粒。在注射病毒后早期时间点从脾、心和肺中收集到一些病毒颗粒。在感染后18小时，这些器官中RVGL9病毒的效价降低。在18小时后在心脏组织中收集不到病毒；与在病毒注射后20分钟分别为3221.0和3521.9PFU/g组织相对比，在第14天分别从脾和肺收集大约156.5和44PFU/g组织。从肝和肾中收集病毒的模式与在脾、心或肺中的模式不同。在注射病毒后早期在肾中无病毒，从肝中收集174.9PFU/g组织的病毒。在注射病毒后第5天，这些器官中的病毒效价增加并在注射病毒后第14天降低。在肿瘤组织中，在给予病毒(1.6×103PFU/g组织)后18小时开始检测到病毒，并随着观测时间的过去而显著增加(在第7天为1.8×108PFU/g组织)。肿瘤组织中的病毒在单一静脉内注射病毒后60天以上仍可检测到。结果表明这些痘苗病毒突变体的肿瘤特异性复制。在肿瘤和器官中病毒收集与转基因表达之间观测到相关性。基于RVGL9病毒动力学数据，第10天或第14天用不同痘苗病毒突变体分别在黑素瘤、神经胶质瘤和乳腺肿瘤中进行组织分布研究。
各种VV在携带神经胶质瘤的小鼠中的存在情况为检测痘苗病毒在携带皮下神经胶质瘤的免疫缺陷的小鼠中的组织分布，在植入C6大鼠神经胶质瘤细胞后第7天将病毒以1×107PFU/0.1ml/小鼠的剂量静脉内注射。注射病毒后14天，处死小鼠并确定不同组织中的病毒效价。注射野生型WR病毒的小鼠是病态的并由于病毒的致病性而死亡。因此，在注射病毒后第7天处死注射WR的小鼠。从所有分析的组织以及从脑中均可收集到野生型LIVP病毒。从用野生型LIVP注射的小鼠中收集的病毒颗粒的量远低于VV的野生型WR毒株。结果示于表lA。
表lA神经胶质瘤模型中从裸鼠组织中收集的病毒a
结果表明在用WR毒株与用野生型LIVP毒株注射的小鼠相比在脑中收集到的病毒高10000倍。野生型WR毒株病毒在注射病毒后第7天从小鼠的血清中收集到(600PFU/20μl)。在用LIVP注射的小鼠的血清中在第14天未收集到病毒。在第7天在血清中未测试到野生型LIVP水平。在脑组织中发现大约1.9×106PFU/g组织的WR毒株(RVGL23)的TK突变体，相比之下在用LIVP毒株(RVGL2)的TK突变体注射的小鼠中为1.4×103PFU/g组织。
VV毒株LIVP的所有其他突变体均主要仅在肿瘤中发现，在用双重或三重突变体注射的小鼠的脑组织中未收集到病毒(表1A)。与注射野生型LIVP相比，从用WR注射的小鼠的肿瘤中收集到多三倍的病毒颗粒。在注射LIVP毒株突变体的肿瘤组织中收集的病毒的平均值与注射野生型LIVP的相似及与注射WR毒株的TK突变体相等。携带乳腺肿瘤的小鼠中各种VV的存在情况携带皮下GI-101A人乳腺肿瘤的免疫缺陷的小鼠中组织分布数据示于表1B。
表1B从乳腺癌模型中的裸鼠组织中收集的病毒
与神经胶质瘤组织相比，从乳腺肿瘤组织中收集到大约多10倍的病毒颗粒。从用野生型LIVP或其突变体注射的小鼠的脑组织中未收集到病毒。从用野生型WR和WR毒株VV的TK病毒注射的小鼠的脑组织中分别收集到7.2×106和1.6×104PFU/g的病毒颗粒(表1B)。在从安乐死的小鼠切下器官的期间，发现与所有其他组的小鼠相比，用野生型WR和WR的TK突变体注射的小鼠的卵巢显著增大。对从卵巢中收集的病毒加以分析表明野生型WR和TK-WR毒株在卵巢中较高的效价，例如分别为8.0×107和2.7×107PFU/g。从用野生型LIVP病毒注射的小鼠的卵巢中收集到大约1.6×103PFU/g的病毒颗粒，然而从用衍生自LIVP毒株的突变体注射的小鼠的任一卵巢或脑中根本收集不到病毒颗粒(表1B)。
携带黑素瘤的小鼠中各种VV的存在情况对在足趾上携带黑素瘤的免疫活性小鼠中VV的组织分布也进行了研究。在植入B16F10黑素瘤细胞后第17天，为BL/6小鼠通过尾静脉经静脉内注射107PFU/小鼠剂量的病毒。所有组的小鼠均在注射病毒后第10天处死，因为注射PBS的对照组中肿瘤巨大。结果示于表1C。
表1C在黑素瘤模型中从C57BL/6小鼠组织中收集的病毒
a从3-5只小鼠/组的组织中收集的病毒的平均值PFU/gb注射病毒后第7天处死小鼠.
cPFU/20μl血清d注射病毒9天后处死小鼠e在所有测试的组织中均未收集到病毒从注射病毒的免疫活性小鼠的肾、肺、脾、脑、睾丸、膀胱、肝、心和血清中均未收集到病毒。仅从肿瘤组织中收集到病毒。与其他组相比，从用野生型LIVP、TK-LIVP、野生型WR和TK-WR注射的小鼠的肿瘤中收集到多10倍的病毒颗粒。
实施例5通过重组痘苗病毒RVGL7、RVGL9和RVGL21缩小植入裸鼠内的人乳腺肿瘤RVGL7和RVGL9图1B示出了用于这些实验的重组痘苗病毒的示意图。RVGL7如同对于制备RVGL9所述同样制备。RVGL7含有编码EGFP和lacZ的核酸，并包括插入TK基因中的pE/L和p7.5调节区域。
裸鼠中肿瘤的发光和荧光成像将人乳腺GI-101A癌细胞(5×106个细胞/小鼠)皮下植入小鼠的右腿。植入细胞后30天，以1×107PFU/小鼠的剂量通过尾静脉经静脉内注射RVGL9，这是表达海肾萤光素酶和绿色荧光蛋白融合体的NotI(F3)-中断的病毒(RVGL9＝rVV-RG＝rVVruc-gfp)。注射病毒9天后(即植入细胞39天后)进行GFP荧光成像及萤光素酶表达的弱光成像示出病毒的播散。
痘苗病毒RVGL7或RVGL9对植入裸鼠内的人乳腺肿瘤的缩小将人乳腺GI-101A癌细胞(5×106个细胞/小鼠)皮下植入小鼠的右腿。在植入细胞30天后，为小鼠静脉内注射RVGL7＝rVV-GFT＝TK-或RVGL9-rVV-ruc-gfp＝NotI(F3)-中断的病毒(于0.1ml中1×107PFU/小鼠)及PBS对照。在植入GI-101A细胞后第65天及注射病毒或PBS后第35天，进行成像。结果表明与注射PBS的小鼠中的肿瘤相比，注射TK-或NotI(F3)-中断的痘苗病毒的小鼠中肿瘤体积明显缩小。
给予病毒后人乳腺肿瘤中的GFP将人乳腺GI-101A癌细胞(5×106个细胞/小鼠)皮下植入小鼠的右腿。植入细胞后第30天，为小鼠静脉内注射RVGL7＝rVV-GFP＝TK-或RVGL9＝rVV-RG-rVV-ruc-gfp-NotI(F3)-中断的病毒(于0.1ml中1×107PFU/小鼠)。数据表明在注射TK-或NotI(F3)-中断的痘苗病毒的小鼠的肿瘤区域中GFP表达。在小鼠机体的其他部分无GFP信号。结果还示出在通过尾静脉注射病毒后48小时即可观测到GFP表达。在注射病毒后第16天观测到非常强的GFP信号，相应于大约1300-1620mm3的肿瘤体积(分别对于TK-或NotI(F3)-中断的病毒)。由于肿瘤体积的缩小，在第25天(对于TK-或NotI(F3)-中断的病毒分别为1218-1277mm3)和第32天(对于TK-或NotI(F3)-中断的病毒分别为514-887mm3)观测到降低的GFP信号。
乳腺肿瘤体积随着时间的时程将G1-101A乳腺癌细胞以5×106个细胞/小鼠的剂量皮下植入4-5周龄雌性无胸腺(nu/nu)小鼠的右腿。植入肿瘤后30天，当肿瘤体积达到大约500mm3时，通过尾静脉经静脉内注射单一剂量的(于0.1ml中的1×107PFU/小鼠)的RVGL7＝rVV-GFP＝TK-或RVGL9＝rVV-RG＝rVV-ruc-gfp＝NotI(F3)-中断的痘苗病毒或者PBS对照。肿瘤尺寸用游标卡尺每周测定两次并计算体积(L×H×W)/2，其中L、H和W分别代表肿瘤的长度、宽度和高度，以mm3表示。数据表明注射TK-、NotI(F3)-中断的痘苗病毒的小鼠中肿瘤明显缩小(在第65天缩小60-80％)。相反，注射PBS的小鼠中肿瘤非常快速地生长。通过光的消失监测肿瘤消退在用单次静脉内注射野生型LIVP，LIVP毒株的单一F3-、单一TK-及双重F3-、TK-突变体处理的100％免疫缺陷的小鼠中出现皮下GI-101A乳腺肿瘤缩小。在用上述病毒处理的小鼠中观测到一定程度的毒性。具有三重缺失TK、F3和HA基因的RVGL21病毒示出在裸鼠内无毒性，因此这个病毒用于长期研究。使用三重突变的RVGL21病毒在高剂量和低剂量处理之间抗肿瘤活性和存活力无显著差异。在注射RVGL21的小鼠的肿瘤区域中监测GFP表达。在小鼠机体的其他部分中未观测到GFP信号。在通过尾静脉注射病毒后48小时即可观测到GFP表达。在注射病毒后第16天观测到非常强的GFP信号，相应于大约1300-1620mm3的肿瘤体积，及在第25天(1218-1277mm3)和第32天(514-887mm3)观测到由于肿瘤体积缩小而降低的GFP信号。肿瘤体积缩小通过对小鼠进行目测也显而易见。
实施例6痘苗病毒毒性和毒力的降低通过监测小鼠体重和存活力示出痘苗病毒致病性降低检测静脉内给予病毒后携带不同的皮下肿瘤的无胸腺小鼠和免疫活性的小鼠中体重变化的百分比。通过尾静脉注射107pfu/小鼠的剂量的野生型LIVP和野生型WR及一些突变体导致在两周的观测期间内渐进的痘苗病毒感染。在攻击后一周，小鼠示出在尾部和足趾形成典型的水泡。随后体重下降，有时伴随口唇肿胀，在一些情况中导致小鼠死亡。在VV的野生型WR毒株的情况中，小鼠在静脉内注射病毒后第7天开始死亡。而接受重组LIVP病毒的小鼠体重增加或者在观测期间保持相同的体重。
神经胶质瘤模型裸鼠的体重将大鼠神经胶质瘤C6细胞以5×105/0.1ml/小鼠的剂量在第0天皮下植入裸鼠(5-6周龄的雄性小鼠)的右腿。在第7天通过尾静脉经静脉内注射1×107PFU/0.1ml/小鼠剂量的痘苗病毒。每周对动物称重两次。感染后14天体重的增加/降低以百分比计算注射病毒当天的体重—肿瘤重量(g)/第14天的体重—肿瘤重量(g)×100％。注射VGL(野生型痘苗病毒，LIVP毒株)和RVGL5(HindIII-N-中断的)在裸鼠内产生毒性小鼠体重持续降低。重组痘苗病毒RVGL5(HA-中断的)、RVGL7(TK-中断的)、RVGL8(NotI(F3)-中断的)、RVGL19(双重TK-和NotI(F3)-中断的)在裸鼠内毒性较低在丧失一些体重之后，在感染后10天小鼠体重开始增加。
具有神经胶质瘤的裸鼠在注射VV的野生型WR毒株后第7天体重降低31.9％。注射WR毒株的TK病毒的小鼠在注射后第14天体重降低22.4％，相比之下注射VV的LIVP毒株的TK病毒的小鼠组体重降低1.5％。注射野生型LIVP毒株的所有小鼠均存活至少14天(实验的持续时间)。无肿瘤的小鼠注射VGL(野生型VV，LIVP毒株)体重降低11.23％。具有肿瘤的小鼠注射VGL(野生型VV)或RVGL1(HindIII-N-中断的)体重分别降低15.79％和10.18％。注射野生型LIVP的小鼠组体重降低15.8％，注射PBS的小鼠组体重降低9.4％。荷瘤小鼠注射RVGL2(TK-)、RVGL5(HA-)、RVGL7(TK-)、RVGL8(F3-)、RVGL9(F3-)、RVGL20(TK-，F3-)、RVGL21(TK-，F3-，HA-)后第14天，体重分别仅降低1.5％、0.4％、2.1％、5.0％、7.3％、2.4％和3.2％。荷瘤小鼠注射携带双重基因中断的病毒RVGL19(TK-和F3-)与第0天的体重相比增加0.73％。基于体重的结果，痘苗病毒基因组中单一中断的HA、TK、F3(NotI位点)和双重中断的TK、F3(NotI位点)基因降低了痘苗病毒毒株LIVP的毒力和毒性。
然而，注射野生型VV毒株WR对裸鼠具有极大毒性，小鼠在注射病毒后第7天死亡。LIVP毒株的野生型和突变VV在裸鼠中是较低毒性的。尽管用各种LIVP毒株注射的裸鼠丧失一些体重，但在感染后10天体重开始增加。
乳腺肿瘤模型无胸腺小鼠的体重监测静脉内注射痘苗病毒后具有皮下GI-101A人乳腺肿瘤的无胸腺小鼠的体重变化。注射野生型WR毒株的小鼠由于病毒的毒性丧失25.6％的体重并死亡。尽管注射野生型LIVP的小鼠存活较长时间，但小鼠丧失26.4％的体重。注射TK-WR的小鼠丧失17.8％的体重，而注射TK-LIVP病毒的小鼠体重增加1.9％。具有LIVP毒株其他突变体的所有小鼠均是稳定的，在这些小鼠中未观测到病毒相关的毒性。
黑素瘤模型免疫活性小鼠的体重研究在其足趾上具有小鼠B16-F10黑素瘤的免疫活性C57BL/6小鼠中痘苗病毒的毒性。尽管所有组中的小鼠在实验期间均存活，但野生型WR毒株与野生型LIVP和重组毒株相比在免疫活性小鼠中的毒性更强。注射野生型WR毒株的小鼠在静脉内注射病毒后第10天体重降低大约11.4％，而注射野生型LIVP毒株及其双重(RVGL20)和三重(RVGL21)突变体的小鼠体重分别仅降低2.2％、1.3％和0.6％，而注射PBS的对照小鼠体重降低7.1％。静脉内给予RVGL2(TK-)、RVGL5(HA-)、RVGL9(F3-)和RVGL23(TK-WR毒株)的小鼠在这个期间体重持续增加。
携带乳腺肿瘤的小鼠在病毒感染后的长期存活为检测不同的突变对长期存活的作用，携带皮下GI-101A人乳腺肿瘤的小鼠经静脉内接受107剂量的病毒，监测病毒感染后的存活力。结果示出存活力根据注射的病毒而有所不同。携带皮下乳腺肿瘤的裸鼠注射(静脉内，1×107/小鼠)野生型WR毒株后产生100％死亡率5只小鼠中有4只在注射病毒后第9天死亡，1只在注射病毒后第11天死亡。注射LIVP毒株的小鼠存活35天。注射单一突变的病毒RVGL9(F3-)的小鼠出现毒性，25％的小鼠在注射病毒后第34天死亡，然而注射缺失F3基因的LIVP毒株的小鼠存活直至57天。注射双重突变病毒RVGL20(F3-，TK-)的小鼠在注射病毒后第34天开始死亡，但是比注射F3的小鼠存活时间长。注射RVGL20病毒的小鼠在第65天达到50％存活率，并示出显著较长的存活时间，达到116天。LIVP病毒的单一突变的TK病毒与单一突变的F3或双重突变的F3、TK病毒相比致病性较低；在用TK病毒注射后所有小鼠在第80天均存活，并且有14.3％的小鼠存活130天。与其他组的小鼠相比，注射三重突变TK-、F3-和HA-的病毒(RVGL21)的所有小鼠均存活130天(实验的持续时间)并持续存活而无任何病毒毒性迹象。
不同小鼠中的脾肿大免疫活性C57BL/6小鼠有几组的动物示出脾增大，因此计算相对的脾重量(RSW)。结果示于下表2。
表2有或无肿瘤的小鼠的相对脾重量(RSW)
所示数据是每组4-8只小鼠的平均值±SDRSW＝脾的重量(g)×104/(动物体重(g)-肿瘤重量(g)).
ap≤02.02vs.所有组，除了无肿瘤LIVP，WR，RVGL23bp≤0.039vs.无肿瘤PBS，无肿瘤LIVP，RVGL5，WR，RVGL23
cp≤0.046vs.所有组，除了PBS，RVGL2，RVGL20，RVGL21dp≤0.006vs.所有组除了无肿瘤LIVP，PBS，WR，RVGL23ep≤0.048vs.所有组，除了无肿瘤PBS，LIVP，RVGL2，WR，RVGL23fp≤0.045vs.所有组，除了PBS，RVGL2，RVGL21gp≤0.035vs.PBS，LIVP，RVGL20，WR，RVGL23hp≤0.049vs.所有其他组，除了无肿瘤LIVP，RVGL20，WR，RVGL23ip≤0.049vs.所有其他组如上表2所示，在小鼠中观测到一定程度的脾肿大。对于免疫活性C57BL/6小鼠，在用PBS、LIVP、RVGL20、WR和RVG123注射的肿瘤小鼠与无肿瘤小鼠相比中发现统计学显著的差异(p＜0.035)。与所有其他组相比，在用野生型VV毒株LIVP注射的小鼠中脾显著增大(p＜0.049)。相反，在无肿瘤的小鼠中发现最小的脾。
具有神经胶质瘤的裸鼠在有或无皮下神经胶质瘤的裸鼠中，注射野生型WR或WR的TK-病毒的小鼠分别具有最低的RSW(37.3或46.9)，这与无肿瘤的小鼠及注射PBS的小鼠的RSW(43.6)的相似。在注射RVGL5(HA-)和RVGL21(TK-，F3-，HA-)的组中观测到最大的RSW(分别为143.8和14.4)。在注射野生型LIVP、RVGL2、RVGL9、RVGL20的小鼠组与注射PBS的小鼠组之间无统计学差异。
具有乳腺肿瘤的裸鼠携带皮下人乳腺肿瘤的免疫缺失的小鼠中RSW的结果表明注射野生型LIVP及其突变体的所有小鼠与注射野生型WR或TK-WR病毒的小鼠相比具有增大的脾(p＜0.045)。在注射LIVP毒株的单一HA-，单一F3-，双重F3-、TK-突变体的小鼠中发现最大的脾。
注射RVGL21的其他结果在注射RVGL21之后(分别静脉内注射107和4×105)，有两只小鼠#437和#458存活190天以上，而无任何疾病迹象或病毒相关的毒性。
在植入GI-101A细胞后第30天(肿瘤体积＝594.9mm3)，为#437小鼠经静脉内注射107的RVGL21。在注射病毒后第101天(皮下肿瘤大小＝220.4mm3)，在皮下观测到胸部的转移瘤(硬组织)。肿瘤大小为1223.6mm3，第148天消失。皮下肿瘤不消失，其开始变小，但小鼠保持不转移。
将#458小鼠首先在其右后肢1/4处植入第一个皮下肿瘤(GI-101A)。当第一个肿瘤开始收缩时(注射RVGL21病毒后第29天，肿瘤大小＝1924.3mm3)，在左后肢1/4处皮下植入第二个同源肿瘤。第二个肿瘤生长缓慢，大小达到1205.7mm3并开始收缩。在病毒注射后第127天小鼠不再具有第一个肿瘤；第二个肿瘤大小为439.6mm3。肿瘤持续收缩并且细胞死亡。机体逐渐吸收宿主贡献的剩余的肿瘤组织(如来自宿主的肿瘤血管骨架)。由于这些剩余组织不被认为是外来的，因此免疫系统不摧毁它们。另一方面，肿瘤细胞被免疫系统和病毒长期驱除和清除。第二个同源肿瘤的缩小表明这一小鼠产生了针对所述肿瘤细胞的抗体。所述抗体导致第二个同源肿瘤的缩小。
实施例7使用微生物或细胞诱导生物体针对肿瘤的自身免疫本实施例表明本文和名称为“在肿瘤组织中生产多肽、RNA或其他化合物”的在先申请EP 03 018 478.2中提供的方法也可以用于产生针对肿瘤组织的抗体。这些抗体提供了携带肿瘤的生物体的自身免疫。另外，这些抗体可被分离并用于在其他生物体中治疗肿瘤。
本发明提供了可以含有编码所需多肽或RNA的DNA的微生物包括细胞以诱导生物体针对肿瘤的自身免疫的方法和用途。还提供了如下生产针对肿瘤的抗体的方法(a)将任选地含有编码所需多肽或RNA的DNA的微生物如病毒或细胞注射进携带肿瘤的生物体中，和(b)分离针对所述肿瘤的抗体。
本实施例还证实给予在肿瘤中积累的微生物如本文提供的三联突变痘苗病毒毒株，使它们释放肿瘤抗原一段足够的时间，以使得宿主产生抗体。这一点通过在nu-/nu-小鼠(T细胞缺陷小鼠)中异种GI-101A实体乳腺肿瘤及其转移瘤的缩小和消除而表明。.
步骤#1选择5周龄雌性nu-/nu-小鼠，GI-101A细胞在补加雌激素和孕酮的RPMI1640培养基中生长。达到细胞铺满，收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤。然后将细胞(5×106细胞/小鼠)皮下注射进小鼠中。每两天仔细监测肿瘤生长。
步骤#2在肿瘤生长的两个阶段(肿瘤大小400-600mm3，和肿瘤大小～1700mm3)，通过尾静脉的静脉内注射将纯化的痘苗病毒颗粒(RVGL12)输送给每一肿瘤小鼠中。集落纯化的病毒在CV-1细胞系中扩增，在蔗糖梯度中离心纯化胞内病毒颗粒。注射两种浓度的病毒(106pfu/100μl和107pfu/100μl，重悬于PBS溶液中)。通过观察病毒介导的绿色荧光蛋白表达而外部监测病毒复制。肿瘤发展用数字测径器确定肿瘤体积而监测。
在GI-101A细胞植入后67天注射痘苗病毒RVGL12+GCV(更昔洛韦)和RVGL12(RVGL12与RVGL7相同，只是编码gfp的核酸被单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK；见，SEQ ID No.35和36)置换)。第二次给予是指RVGL12a在细胞植入后30天注射。
步骤#3给予病毒后，测得首先肿瘤持续生长至大小约900mm3(从病毒注射时的400-600mm3生长)，和生长至大小约2400mm3(从1700mm3生长)。然后生长速率下降约6-8天。
步骤#4病毒注射后约14天，肿瘤体积开始快速下降。病毒注射后40天，所有处理的动物均显示超过60％的肿瘤消退。病毒处理后65天，大多数动物的肿瘤完全消退。
步骤#5一些动物在几周内均完全无肿瘤并且它们的体重恢复正常。RVGL-12+GCV处理导致肿瘤大小从第13天的峰值下降86.3％(病毒注射后第52天)，RVGL-12处理导致肿瘤大小从其峰值(第13天)下降84.5％(第52天)。RVGL-12a处理导致肿瘤大小从其峰值(第12天)下降98.3％(第89天)。PBS+GCV对照处理后，在38天中肿瘤平均体积增加了91.8％。
步骤#6测定免疫激活水平。从具有消退的肿瘤的动物获得血清，确定针对外来蛋白质(例如绿色荧光蛋白)、痘苗病毒蛋白和GI-101A癌症细胞蛋白的免疫效价。使用得自下列来源的下列抗血清分析下列样品。
样品1).小鼠细胞裂解物(对照)；2).纯化并变性的痘苗病毒颗粒；3).GI-101A肿瘤细胞裂解物；4).纯化的绿色荧光蛋白；5).纯化的萤光素酶蛋白；6).纯化的β-半乳糖苷酶蛋白。
抗血清a).来自无瘤小鼠的抗血清；b).来自GI-101A肿瘤小鼠的抗血清；c).来自静脉内注射痘苗病毒后14天的GI-101A肿瘤小鼠的抗血清；d).来自静脉内注射痘苗病毒后65天的GI-101A肿瘤小鼠的抗血清；e).来自静脉内注射痘苗病毒后80天的无肿瘤小鼠(消除了抗血清GI-101A肿瘤之后)的抗血清。
结果表明在肿瘤中有非常多的肿瘤特异性痘苗病毒复制，导致在肿瘤中产生肿瘤蛋白抗原和病毒蛋白。另外，痘苗病毒确实溶解感染的肿瘤细胞，由此释放肿瘤细胞特异性抗原。这些抗原持续漏出至机体中导致在小鼠身体中有针对外来细胞蛋白质(肿瘤蛋白)、病毒蛋白和病毒编码的工程化的蛋白的非常高的抗体效价(在约7-14天内)。这些新合成的针对肿瘤抗体和增加的巨噬细胞、嗜中性粒细胞计数被持续经血管输送到肿瘤中，由此用于肿瘤内部激活的免疫系统的募集。激活的免疫系统然后消除包括病毒颗粒的肿瘤。外来抗原的这种互连的释放加强了抗体生成和针对肿瘤所含蛋白的抗体的连续返回，其作为自身疫苗接种系统，由痘苗病毒复制起始，随后为细胞裂解、蛋白质漏出和增强的抗体产生。
实施例8在荷瘤小鼠中经痘苗病毒输送的lacZ产生β-半乳糖苷酶和抗β-半乳糖苷酶抗体使用35只无胸腺nu/nu小鼠(5周龄，25g，雄性)证实在基因组中具有不同缺失的痘苗病毒(LIVP菌株)的生物分布和肿瘤靶向作用。小鼠分成7组，每组5只，如表1所示。
在第2-7组中皮下产生C6胶质瘤。植入肿瘤细胞(5×105细胞/小鼠)5天后，每一动物用0.1ml感染复数(MOI)为1×107的病毒经尾静脉注射而处理。病毒注射2周后，处死所有小鼠，收集血样。还从动物中取各种器官和肿瘤以测定病毒效价和进行β-半乳糖苷酶分析。
β-半乳糖苷酶分析用Galacto-Light Plus系统(Applied Biosystems)根据生产商指导进行，该系统是一种检测β-半乳糖苷酶的化学发光报道基因测定系统。
β-半乳糖苷酶表达测量在用野生型痘苗病毒(不含报道基因且不含β-半乳糖苷酶基因)注射的无肿瘤小鼠以及肿瘤小鼠中，在各种器官、血样和肿瘤样品中未检测到β-半乳糖苷酶表达。相反，在用表达β-半乳糖苷酶的病毒感染的小鼠肿瘤中，表达了高水平的β-半乳糖苷酶。如表2所示，β-半乳糖苷酶还在血样中检测到，但从血样中未回收到病毒。
表2荷瘤小鼠肿瘤及血液中痘苗病毒产生的β-半乳糖苷酶(病毒注射后第14天)
抗-β-半乳糖苷酶抗体产生为确定小鼠血液中存在的β-半乳糖苷酶的量是否足以引起抗体产生，收集取自两只小鼠(第5组的小鼠#116和第6组的小鼠#119)的血清并在Western分析中测试针对β-半乳糖苷酶的初级抗体。来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(Roche，567779)用作抗原标准，来自大肠杆菌的小鼠单克隆抗β-半乳糖苷酶抗体(Sigma，G6282)用作抗体阳性对照。作为β-半乳糖苷酶的额外来源，从用RVGL7以MOI为1pfu/细胞感染后24小时的CV-1细胞获得总蛋白，从称为#143(用RVGL7处理)的小鼠获得肿瘤蛋白样品。
蛋白样品制备成3份，每系列包括一β-半乳糖苷酶抗原对照、一来自RVGL7感染的CV-1细胞的细胞裂解物和来自小鼠#143的肿瘤裂解物。所有蛋白样品均用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并用BioRad半干印迹系统转移至NitroBind硝酸纤维素膜(MSI)。用1∶3000小鼠单克隆抗β-半乳糖苷酶抗体或1∶3000取自小鼠#116或#119的血清，和1∶3000山羊抗小鼠IgG-HRP(BioRad)进行免疫印迹。用扩增的Opti-4CN检测试剂盒(BioRad)进行检测。
结果显示取自小鼠#116和#119的血清呈现与市售小鼠抗β-半乳糖苷酶抗体标准相比类似的抗体水平，并且证实荷瘤小鼠#116和#119产生针对β-半乳糖苷酶的抗体。
实施例9用于肿瘤治疗的哺乳动物细胞如本文所示，某些细菌、病毒和哺乳动物细胞(BVMC)当被全身给予时，会进入肿瘤并在肿瘤中选择性复制。因此，全身性注射的哺乳动物细胞和某些细菌(厌氧菌如沙门氏菌、梭菌、弧菌、大肠杆菌)细胞能进入实体瘤中并在携带肿瘤的生物体中复制。遗传标记的细胞可被用于肿瘤检测和治疗。除了通过BVMC靶向在肿瘤中进行基因表达之外，肿瘤特异性基因表达也可以通过将转基因与组织/肿瘤特异性启动子相连而实现。为了获得肿瘤特异性基因表达，可以采用各种全身性靶向方案。这些策略包括使用仅在特异器官激活基因表达的组织/肿瘤特异性启动子，如前列腺特异性启动子控制的病毒基因表达；使用胞外基质(即胶原蛋白)靶向的病毒载体；和使用抗体控制的病毒载体。条件复制型病毒也被开发用作用于标记基因或治疗性基因的肿瘤特异性输送载体，这些病毒如肿瘤消解性腺病毒载体颗粒、复制选择性HSV、痘苗病毒和其他这类病毒。
当编码发光蛋白的BVMC被全身性注射进啮齿动物中时，实现了肿瘤特异性标记基因表达并且可以基于光发射实时检测。由此，动物中原发肿瘤的位置和以前未知的转移的位置得以在体内揭示。因此，诊断可以和治疗以及治疗的监控相结合。肿瘤中被削弱的淋巴系统可能导致细菌在从血管系统逃逸后不被宿主免疫监视而不从肿瘤中清除。
实施例10在给予化脓链球菌后肿瘤发展被抑制本实施例及随后的各实施例证实细菌细胞在肿瘤中建群的用途，细胞中的报道基因在量化建群中的用途，建群的减毒细菌细胞在肿瘤抑制中的用途。共给予或相继给予细菌和病毒。在给予细菌之前给予病毒增加细菌在肿瘤中的建群。给予表达激活前药的酶的细菌，由此靶向建群的细胞。
细菌菌株化脓链球菌M-type 1T-type 1(ATCC目录号700294)用含有细菌萤光素酶表达盒(expression cassette)的pDC123-luxF质粒转化(Lamberton GR，Pereau MJ，Illes K，Kelly IL，Chrisler J，Childers BJ，Oberg KC，Szalay AA.2002.Construction and characterization of abioluminescent Streptococcus pyogenes.Proceedings of the 12thInternational Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，Case JF，Herring PJ，Robison BH，Haddock SHD，Kricka LJ，Stanley PE(eds).ChichesterWiley，pp 85-88)。萤光素酶可在外源性癸醛存在下被检测。
转化的化脓链球菌在20μg/ml氯霉素存在下于BH1培养基中在37℃生长过夜。过夜生长后，在OD600计数所述细菌，并将细菌以指定密度在BH1培养基中重悬以用于注射。
肿瘤发展和细菌注射在20只5周龄小鼠右侧大腿进行皮下注射。每只小鼠用5×105经pLEIN-衍生的反转录病毒转化的C6胶质瘤细胞(Clontech；还参见WO 03/14380)注射。在植入之后7天、细菌注射之前产生皮下肿瘤。
为进行细菌注射，用异氟烷麻醉荷瘤小鼠。用配有29_-规格针的1-cc胰岛素注射器经手术暴露的股静脉静脉内注射悬液。注射后，缝合切口。
在细菌注射后每周两次用数字测径器监控肿瘤生长。另外，在结束时间点对动物进行荧光成象和光学成象。通过给动物静脉内注射30μl癸醛分析发光细菌的存在。根据类似于Yu et al.(2004)NatureBiotechnology 22(3)313-20的方法分析整个动物的细菌萤光素酶活性。简而言之，将麻醉动物置暗箱内进行光子计数(ARGUS 100lowlight Imager，Hamamatsu)。从动物的腹部和背部收集光子1分钟，并用Image Pro Plus 3.1软件(Media Cybernetics)和/或Lighttools_低倍放大影像(macroimaging)系统记录图像。还记录了光图像。将发光图像叠加到光图像上以定位动物上的发光活性。还记录了定位的区域例如肿瘤区域中光子发射的总强度。将从切下的肿瘤和基本组织中分离的化脓链球菌涂布在LB-氯霉素(20μg/ml)平板上。在癸醛蒸气存在下计数发光细菌。
结果测试了4组小鼠，每组含有5只小鼠。
在肿瘤产生并注射化脓链球菌7天后直至肿瘤产生后21天测量肿瘤体积。
在2周期间内未注射化脓链球菌的对照组小鼠有持续且加速的肿瘤生长。用化脓链球菌注射的小鼠的肿瘤生长较慢。第3组和第4组具有最慢的肿瘤生长速率。在监控期间两组均保持较慢的线性速率，而没有注射细菌的对照组的肿瘤生长在较后时间期间加速。
在细菌注射后所有时间点，第3组和第4组的肿瘤体积均比对照组小鼠(第1组)小。在第21天，对照组的平均肿瘤体积比第3组和第4组的平均肿瘤体积约大2.5-3倍。用最低效价的细菌注射的第2组的肿瘤体积在较后的时间点也相对于对照组降低，但是其肿瘤体积比第3组和第4组大。
细菌建群和肿瘤抑制也在纤维肉瘤模型中进行了测定。用pLEIN反转录病毒转化的HT1080纤维肉瘤细胞被皮下注射进5周龄雄性裸鼠的右侧大腿内(5×105细胞/小鼠)。在肿瘤生长8或14天后将用pDC123-luxF转化的化脓链球菌注射进动物的股静脉(每天5只动物)。一组5只动物未被注射，用作对照组。在随后的时间点监测肿瘤生长和萤光素酶活性。从肿瘤中分离化脓链球菌，并涂布在BH1+氯霉素(20μg/ml)平板上。在癸醛蒸气存在下计数发光细菌菌落。
实施例11霍乱弧菌定位于肿瘤质粒和细菌菌株减毒的霍乱弧菌菌株Bengal 2血清型0139，M010DattRS1用含有luxCDABE盒的pLITE201转化(Voisey et al.(1998)Biotechniques2456-58)。转化的菌株由于萤光素酶基因的表达而是发光菌株。
肿瘤发展和细菌注射如本文实施例所述将C6胶质瘤(500mm3)植入各组裸鼠(n＞20)。1×108转化的细菌(霍乱弧菌)在100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中悬浮。将此细菌悬液注射进每只小鼠的右后肢。然后如实施例A所述，在注射后在一弱光成像仪(low light imager)中监控动物。
在一独立的实验中，为进行对比，如本文实施例所述将C6胶质瘤(500mm3)植入各组裸鼠(n＞20)。这些小鼠用rVV-RUC-GFP病毒(见实施例1和4)以1×108pfu/小鼠进行注射。
结果效价和萤光素酶活性在注射后各时间点处死来自两个注射组的小鼠。切下肿瘤进行匀浆。如本文实施例所述测量细菌和病毒效价以及萤光素酶活性。
在注射后细菌和病毒效价均增加。细菌生长随时间的增加与肿瘤中萤光素酶水平成比例。在用霍乱弧菌注射的小鼠中，细菌效价对肿瘤中的萤光素酶活性的log-log作图证实细菌效价和萤光素酶活性之间的线性关系。用rVV-RUC-GFP病毒注射的各组小鼠也证实病毒效价和萤光素酶活性之间的线性关系。
实验表明效价与萤光素酶活性之间的线性关系。因此，注射的细菌和/或病毒的萤光素酶活性可用作相关效价测定。
定位如本发明实施例对于病毒所述的方法进行霍乱弧菌定位。简而言之，器官和血样均分离自用CO2气体安乐死的动物。研磨器官并铺板于用氯霉素药物选择的琼脂平板上以分析细菌效价。
在注射的小鼠的肿瘤、肝、睾丸、脾、肾、肺、心、膀胱、和脑中测定细菌效价。样品取自在零小时及随后在霍乱弧菌注射后直至150小时的处死的小鼠。
就在注射后结束时间点(t＝0)，霍乱弧菌存在于所有样品中，在肝和脾中水平最高。在注射后50小时，除了肿瘤组织外所有组织中霍乱弧菌的效价均降低。相反，与零时刻相对比霍乱弧菌的效价增加大约4个数量级。在实验剩余的时间内，这个水平略微增加然后保持恒定。在感染后150小时，除了肿瘤之外所有样品中的效价均降低。例如，肝中效价从零时刻降低大约5个数量级。在第150小时，肿瘤组织中的霍乱弧菌效价高出任何其他组织样品中效价的大约6个数量级。
实施例12共同给予及相继给予细菌和病毒一起或相继给予霍乱弧菌/pLITE(见实施例B)和痘苗病毒VV-TK--gfp-lacZ(见实施例4)。如下表所示，具有C6神经胶质瘤的裸鼠组注射细菌和/或病毒。每组注射3只雄性小鼠。在植入肿瘤后第11天和第16天注射细菌和/或病毒。如本发明实施例所述监测肿瘤生长状况、萤光素酶和GFP活性。
结果在第21天(植入肿瘤后第21天)处死动物。从每只动物切除肿瘤并研磨。分析第3、4和5组的病毒效价。分析第1、2和5组的细菌效价。如前述实施例所述进行滴定(集落形成单位和噬斑形成单位)。
组1、2和5中肿瘤内细菌效价对比表明在第1组中细菌效价最高，第1组是首先在第11天注射痘苗病毒，随后在第16天注射霍乱弧菌。在第16天共同注射细菌和病毒(第5组)提供中等的细菌效价。仅在第16天注射霍乱弧菌的第2组与第1或第5组相比在肿瘤组织中的细菌效价均较低。因此，当VV-TK--gfp-lacZ病毒首先建群时，肿瘤更易于细菌建群。
组3、4和5中病毒效价的对比表明仅在第16天注射病毒的第4组具有最高的病毒效价，随后是第5组和第3组。第5组的病毒效价略高于第3组，但没有明显显著差异。第4组中1只小鼠与其他2只小鼠的病毒效价相比是极端异常值。当无这只小鼠再评估数目时，一般的倾向保持相同。第4组的平均病毒效价更接近于第3组和第5组的病毒效价。这项分析中三组的数据没有显著差异。因此，预先给予细菌随后给予病毒与单独给予病毒相比不显著改变肿瘤中的病毒建群。
实施例13通过给予PNP表达细菌和前体药物对肿瘤的抑制质粒pSOD-DeoD含有细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(PNP)(Sorcher et al.(1994)GeneTher.1(4)223-238)，在组成型SOD(过氧化物歧化酶)启动子的控制下。质粒pSOD-DeoD-lux含有插入到pSOD-DeoD中的luxCDABE表达盒(Voisey et al.(1998)Biotechniques 2456-58)。
PNP将非毒性前体药物6-甲基嘌呤脱氧核糖(6-MPDR)转变为6-甲基嘌呤，其抑制DNA复制、转录和翻译(Sorcher et al.(1994)GeneTher.1(4)223-238)。
肿瘤生长抑制为裸鼠注射pLEIN反转录病毒转化的C6神经胶质瘤细胞。pLEIN反转录病毒在病毒启动子LTR的控制下表达EGFP(Clontech，也见WO 03/14380所述)。在肿瘤植入后8天与或不与前体药物(6-甲基嘌呤脱氧核糖(6-MPDR))一起注射表达细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的大肠杆菌DH5α。在随后的时间点监测肿瘤体积(如前文实施例所述进行)。
第2组和第3组在肿瘤植入后8-21天，随着时间的过去而呈现相同的肿瘤生长状况。接受大肠杆菌表达的PNP和前体药物的第1组与对照组2和3相比在结束时间点呈现肿瘤大小降低～20％。
为进一步测试细菌建群及前体药物对肿瘤生长的作用，选择人乳腺癌模型裸鼠中的GI-101A腺癌。GI-101A衍生自GI-101。GI-101源自Rumbaugh-Goodwin Institute for Cancer Research的研究人员发现的57岁女性患者中浸润性导管腺癌的局部首次复发(IIIa期，T3N2MX)。在皮下异种移植裸鼠模型中，所述肿瘤一致性转移至肺。GI-101A与C6神经胶质瘤模型相比是一种生长较为缓慢的肿瘤模型。
将15只4周龄的雌性裸鼠均在右侧大腿皮下注射GI-101A细胞。在肿瘤产生后30天，注射细菌。将大肠杆菌DH5α用pSOD-DeoD或pSOD-DeoD-lux转化。将所述细菌在37℃在含有20μg/ml氯霉素的LB培养基中生长过夜。过夜生长后，在OD600计数所述细菌并将细菌以指定密度再悬浮于BH1培养基中。使用备有29_号针头的1-cc胰岛素注射器将该悬浮液通过手术暴露的静脉或另外指定的静脉经静脉内注入动物体内。注射后缝合切口。
在注射细菌后每4天给予小鼠组前体药物。使用数字测径器每周监测两次肿瘤生长情况。如本发明实施例所述进行萤光素酶成像。在结束时间点，处死动物并如实施例B所述测定器官。进行组织学分析以确定由于细菌建群和/或药物处理所致的肿瘤坏死程度。
由于对本发明进行修改对本领域技术人员是显而易见的，因此本发明仅受所附权利要求书的范围限制。
序列表<110>吉恩勒克斯公司<120>修饰的重组痘苗病毒及其他微生物，其应用<130>17248-002W01<140>Unassigned<141>Herewith<150>EP03013826.7<151>2003-06-18<150>EP03018478.2<151>2003-08-14<150>EP03024283.8<151>2003-10-22<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>148<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Translation LIVP F3<400>2Met Val Ile Gly Leu Val Ile Phe Val Ser Val Ala Ala Ala Ile Val1 5 10 15Gly Val Leu Ser Asn Val Leu Asp Met Phe Met Tyr Val Glu Glu Asn20 25 30Asn Glu Glu Asp Ala Arg Ile Lys Glu Glu Gln Glu Leu Leu Leu Leu35 40 45Tyr
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<223>pLacGus Plasmid<400>9aagcttgcat gcctgcagca attcccgagg ctgtagccga cgatggtgcg ccaggagagt 60tgttgattca ttgtttgcct ccctgctgcg gtttttcacc gaagttcatg ccagtccagc 120
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<223>LIVP Complete Genome<400>34ttccactatc tgtggtacga acggtttcat cttctttgat gccatcaccc agatgttcta 60taaacttggt atcctcgtcc gatttcatat cctttgccaa ccaatacata tagctaaact 120caggcatatg ttccacacat cctgaacaat gaaattctcc agaagatgtt acaatgtcta 180gatttggaca tttggtttca accgcgttaa catatgagtg aacacaccca tacatgaaag 240cgatgagaaa taggattctc atcttgccaa aatatcacta gaaaaaattt atttatcaat 300tttaaaggta taaaaaatac ttattgttgc tcgaatattt tgtatttgat ggtatacgga 360agattagaaa tgtaggtatt atcatcaact gattctatgg ttttatgtat tctatcatgt 420ttcactattg cgttggaaat aatatcatat gcttccacat atattttatt ttgttttaac 480tcataatact cacgtaattc tggattattg gcatatctat gaataatttt agctccatga 540tcagtaaata ttaatgagaa catagtatta ccacctacca ttattttttt catctcattc 600aattcttaat tgcaaagatc tatataatca ttatagcgtt gacttatgga ctctggaatc 660ttagacgatg tacagtcatc tataatcatg gcatatttaa tacattgttt tatagcatag 720tcgttatcta cgatgttaga tatttctctc aatgaatcaa tcacacaatc taatgtaggt 780ttatgacata atagcatttt cagcagttca atgtttttag attcgttgat ggcaatggct 840atacatgtat atccgttatt tgatctaatg ttgacatctg aaccggattc tagcagtaaa 900gatactagag attgtttatt atatctaaca gccttgtgaa gaagtgtttc tcctcgtttg 960
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<308>GenBank No.NP_04462<309>2004-01-13<400>36Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala1 5 10 15Ala Arg Ser Arg Gly His Asn Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg20 25 30Arg Gln Gln Lys Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr35 40 45Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr50 55 60Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr65 70 75 80Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr85 90 95Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile100 105 110Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met115 120 125Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly130 135 140Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile145 150 155 160Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg165 170 175Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala180 185 190Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu195 200 205Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly210 215 220Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly225 230 235 240Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg245 250 255Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Ala Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala260 265 270Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu275 280 285Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu290 295 300Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg305 310 315 320Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys325 330 335Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val340 345 350Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe355 360 365Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn370 375□
权利要求
1.一种重组痘苗病毒，其包含修饰的TK和HA基因及任选地包含修饰的F3基因或基因座，其中所述病毒在非靶向器官中不积聚至毒性水平。
2.权利要求1的重组痘苗病毒，其中(a)所述F3基因和(b)所述TK基因和/或HA基因是修饰的。
3.权利要求1的重组痘苗病毒，其中(a)所述F3基因和(b)所述TK基因和/或HA基因是失活的。
4.权利要求1或2的重组痘苗病毒，其中至少所述F3基因通过在其中插入异源核酸而失活。
5.权利要求3的重组痘苗病毒，其中所述F3基因和所述TK基因通过插入异源核酸而失活。
6.权利要求1的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒是Lister毒株。
7.权利要求6的重组病毒，其中所述毒株是LIVP毒株。
8.权利要求1-7任一项的重组痘苗病毒，其中所述F3基因的修饰在F3基因或相应的基因座内的NotI位点。
9.权利要求8的重组痘苗病毒，其中所述修饰是在所述F3基因的第35位或者在痘苗病毒LIVP毒株DNA的HindIII-F片段内的第1475位。
10.权利要求1-9任一项的重组痘苗病毒，其中所述TK、HA和/或F3基因包含插入编码一种蛋白质的异源核酸。
11.权利要求9的重组痘苗病毒，其中所述异源核酸包含与编码所述蛋白质的核酸可操纵地连接的调节序列。
12.权利要求11的重组痘苗病毒，其中所述调节序列包含痘苗病毒早期/晚期启动子p7.5。
13.权利要求11或12的重组痘苗病毒，其中所述调节序列包含早期/晚期痘苗pE/L启动子。
14.权利要求10-13任一项的重组痘苗病毒，其中所述异源核酸编码一种可检测的蛋白质或者能诱导可检测信号的蛋白质。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求1-14任一项的重组痘苗病毒。
16.一种肿瘤细胞，其包含权利要求1-14任一项的重组痘苗病毒。
17.一种药物组合物，其含有在一种药物可接受的载体中的权利要求1-14任一项的重组痘苗病毒。
18.权利要求17的药物组合物，其是针对全身应用而配制的。
19.权利要求12的药物组合物，其是针对静脉内给药而配制的或者是在输送载体中配制的。
20.一种消除动物中免疫豁免细胞的方法，包括给予动物权利要求18或19的药物组合物，从而所述病毒在免疫豁免细胞中积聚，由此介导自身免疫，导致所述细胞消除或数目减少。
21.权利要求20的方法，其中所述免疫豁免细胞包括肿瘤细胞。
22.权利要求20的方法，其中所述药物组合物包含痘苗病毒的Lister毒株，所述Lister毒株包含修饰的TK和HA基因及任选地包含修饰的F3基因或基因座；以及所得病毒在非靶向器官中不积聚至毒性水平。
23.一种消除动物中免疫豁免细胞或组织的治疗方法，包括给予动物一种微生物，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚；所述微生物在动物的未受影响的器官和组织中不积聚并且具有低毒性；所述微生物导致免疫豁免细胞的细胞膜渗漏，从而所述动物产生针对所述细胞或细胞产物的自身抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述未受影响的器官包括卵巢或睾丸。
25.权利要求23或24的方法，其中所述免疫豁免细胞或组织包括肿瘤细胞。
26.权利要求21-25任一项的方法，其中所述微生物是减毒的细菌、减毒的病毒或哺乳动物细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述微生物包含或表达一种治疗性产物。
28.权利要求26或27的方法，其中所述微生物包含编码一种治疗性产物的核酸。
29.权利要求23-29任一项的方法，其中所述自身抗体包括抗肿瘤抗体。
30.一种微生物在配制用于消除动物中免疫豁免细胞或组织的药物中的应用，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚；所述微生物在不包含免疫豁免细胞或组织的器官和组织中不积聚至毒性水平。
31.权利要求18或19的药物组合物在消除免疫豁免细胞或组织中的应用。
32.一种重组痘病毒，其包含修饰的TK和HA基因及修饰的F3基因或相应于痘苗病毒中F3基因的基因座。
33.(a)权利要求1-14和32任一项的重组病毒或者(b)具有修饰的F3基因、TK基因或HA基因的重组痘苗病毒在制备用于基因疗法或疫苗接种疗法的药物组合物中的应用。
34.权利要求33的应用，其中所述F3基因、TK基因和/或HA基因是失活的。
35.权利要求34的应用，其中所述F3基因、TK基因和/或HA基因是通过插入异源核酸而失活的。
36.权利要求33-3任一项的应用，其中所述基因疗法是癌症基因疗法。
37.一种生产权利要求1-14任一项的重组痘苗病毒的方法，包括(a)产生(i)含有插入在限制位点x的修饰的F3基因的痘苗穿梭质粒和(ii)去磷酸化的在一个限制位点消化的wt VV(VGL)DNA；(b)用步骤a的构建体(i)和(ii)的混合物转染被补骨脂素-UV(PUV)-失活的辅助病毒VV(VGL)感染的宿主细胞；(c)从所述转染子中分离所述重组痘苗病毒。
38.权利要求37的方法，其中所述宿主细胞是CV-1细胞。
39.一种生产多肽或RNA或化合物的方法，包括(a)将一种含有编码所述多肽或RNA的核酸或产生所述产物化合物的微生物给予携带肿瘤的动物，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚；所述微生物在不包含免疫豁免细胞或组织的器官和组织中不积聚至毒性水平；(b)从所述动物中收集所述肿瘤组织；(c)从所述肿瘤中分离所述多肽或RNA或化合物。
40.权利要求39的方法，其中所述微生物是真核细胞、原核细胞或病毒。
41.权利要求39或40的方法，其中所述微生物是胞质病毒或减毒的细菌。
42.权利要求41的方法，其中所述细菌选自减毒的弧菌(vibro)、大肠杆菌(E.coli)、李斯特氏菌(listeria)、沙门氏菌(salmonella)和链球菌(streptococcus)菌株。
43.权利要求39-43任一项的方法，其中所述动物是非人动物。
44.一种同时产生多肽、RNA分子或细胞化合物和与所述多肽、RNA分子或化合物特异性反应的抗体的方法，包括a)将一种微生物给予携带肿瘤的动物，其中所述微生物表达或产生所述化合物、多肽或RNA分子；b)从所述动物血清中分离所述抗体。
45.权利要求44的方法，其在步骤a)之后进一步包括从所述动物中收集所述肿瘤组织；从所述肿瘤组织中分离所述多肽、RNA分子或细胞化合物。
46.权利要求44或45的方法，其中所述动物是非人动物。
47.权利要求44-46任一项的方法，其中所述微生物是细菌、哺乳动物细胞或病毒。
48.权利要求44-47任一项的方法，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚；所述微生物在不包含免疫豁免细胞或组织的器官和组织中不积聚至毒性水平。
49.权利要求44-47任一项的方法，其中所述微生物是一种选自痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和新培斯病毒的病毒。
50.权利要求44-47任一项的方法，其中所述微生物是一种胞质病毒。
51.权利要求44-47任一项的方法，其中所述微生物是一种真核细胞。
52.权利要求41的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞是干细胞。
54.权利要求39-53任一项的方法，其中所述微生物包含一种编码报道基因构建体的DNA分子。
55.权利要求54的方法，其中所述报道基因构建体编码可检测的蛋白质或者诱导或产生可检测信号的蛋白质。
56.权利要求55的方法，其中所述蛋白质是萤光素酶或荧光蛋白。
57.权利要求54的方法，其中所述报道基因构建体编码生物发光系统及任选地编码荧光蛋白。
58.权利要求39-57任一项的方法，其中所述微生物是哺乳动物细胞。
59.权利要求39-57任一项的方法，其中所述微生物是细菌细胞。
60.权利要求39-57任一项的方法，其中所述微生物是病毒。
61.权利要求60的方法，其中所述病毒是痘苗病毒。
62.权利要求61的方法，其中所述病毒是LIVP毒株。
63.权利要求59的方法，其中所述细菌是减毒的霍乱弧菌(Vibrocholerae)。
64.权利要求39-63任一项的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
65.一种消除动物中免疫豁免细胞或组织的方法，包括给予至少两种微生物，其中所述微生物是同时、相继或间隔给予的，其中所述微生物在免疫豁免细胞中积聚，从而所述动物针对所述免疫豁免细胞或组织自身免疫。
66.权利要求65的方法，其中所述免疫豁免细胞或组织包括肿瘤细胞。
67.至少两种微生物在配制消除免疫豁免细胞或组织的药物中的应用，其中所述微生物在所述免疫豁免细胞中积聚，从而所述动物针对所述免疫豁免细胞或组织自身免疫。
68.权利要求67的应用，其中所述免疫豁免细胞或组织包括肿瘤细胞。
69.一种组合，包含配制用于给予动物以消除免疫豁免细胞或组织的至少两种微生物。
70.权利要求69的组合，其中所述免疫豁免细胞或组织包括肿瘤细胞。
71.权利要求69的组合，其中所述微生物以单独的组合物形式配制。
72.一种包含权利要求69-71任一项组合的试剂盒，其中每种微生物均针对单剂量给予而配制和包装。
73.一种编码异源核酸的微生物在诱导针对在免疫豁免细胞中产生的产物的自身免疫中的应用，其中当被给予时，所述微生物在免疫豁免组织中积聚，在其他组织或器官中不积聚或者积聚水平足够低从而对于含有所述免疫豁免组织的动物是无毒性的。
74.权利要求73的应用，其中所述免疫豁免组织或细胞包括肿瘤细胞。
75.权利要求74的应用，其中在所述免疫豁免细胞中产生的产物包括肿瘤抗原。
76.权利要求73-75任一项的应用，其中所述微生物是真核细胞、细菌或病毒。
77.权利要求73-75任一项的应用，其中所述微生物是哺乳动物细胞。
78.权利要求73-75任一项的应用，其中所述微生物是减毒的痘病毒。
79.权利要求73-75任一项的应用，其中所述微生物是痘苗病毒。
80.权利要求79的应用，其中所述病毒是Lister毒株。
81.权利要求80的应用，其中所述病毒是LIVP毒株。
82.权利要求79-81任一项的应用，其中所述病毒在F3基因或者在相应于LIVP的F3基因座(SEQ ID No.34)的基因座中含有一个插入。
83.一种产生抗在免疫豁免组织或细胞中产生的产物的抗体的方法，包括(a)将一种含有编码选择的蛋白质或RNA的核酸的微生物给予含有所述免疫豁免组织或细胞的动物；(b)从所述动物的血液或血清中分离抗所述蛋白质或RNA的抗体。
84.权利要求83的方法，其中所述动物是非人动物。
85.权利要求83的方法，其中所述动物是人。
86.权利要求83-85任一项的方法，其中所述免疫豁免组织或细胞包括肿瘤细胞。
87.权利要求83-86任一项的方法，其中在所述免疫豁免细胞中产生的产物包括肿瘤抗原。
88.权利要求83-87任一项的方法，其中所述微生物是真核细胞、细菌或病毒。
89.权利要求83-87任一项的方法，其中所述微生物是哺乳动物细胞。
90.权利要求83-87任一项的方法，其中所述微生物是减毒的胞质病毒。
91.权利要求83-87任一项的方法，其中所述微生物是减毒的痘病毒。
92.权利要求83-87任一项的方法，其中所述微生物是痘苗病毒。
93.权利要求92的方法，其中所述病毒是Lister毒株。
94.权利要求93的方法，其中所述病毒是LIVP毒株。
95.权利要求90-94任一项的方法，其中所述病毒在F3基因或相应于LIVP的F3基因座(SEQ ID No.34)的基因座含有一个插入。
96.一种抑制对象中免疫豁免细胞或组织的生长的方法，包括如下步骤(a)给予对象一种修饰的微生物，其中所述修饰的微生物编码可检测的基因产物；(b)监测对象中可检测的基因产物的存在情况，直至所述可检测的基因产物基本上仅存在于对象的免疫豁免组织或细胞中；(c)给予对象一种治疗性化合物，该化合物与所述微生物联合起作用抑制免疫豁免细胞或组织的生长。
97.权利要求96的方法，其中所述免疫豁免细胞或组织的生长通过诱导或增强针对所述免疫豁免细胞的免疫应答而抑制。
98.权利要求96的方法，其中所述治疗性化合物增加由所述导致细胞裂解或细胞凋亡的微生物编码的一或多个基因的表达。
99.权利要求96的方法，其中所述治疗性化合物是一种前体药物，其通过由所述微生物表达的蛋白质激活。
100.一种抑制对象中免疫豁免细胞或组织的生长的方法，包括如下步骤(a)给予对象一种编码可检测的基因产物的修饰的微生物；(b)给予对象一种降低所述微生物致病性的治疗性物质；(c)监测对象中可检测的基因产物的存在情况，直至所述可检测的基因产物基本上仅存在于对象的免疫豁免组织或细胞中；(d)停止或暂停给予所述治疗性化合物，从而所述微生物致病性增加及在免疫豁免细胞或组织中的生长被抑制。
101.权利要求100的方法，其中免疫豁免细胞或组织的生长通过诱导或增强针对免疫豁免细胞的免疫应答而抑制。
102.权利要求100的方法，其中所述治疗性化合物降低由所述导致细胞裂解或细胞凋亡的微生物编码的一或多个基因的表达。
全文摘要
重组痘苗病毒可用作肿瘤特异性输送载体以进行癌症基因治疗和疫苗接种。本发明因此提供了治疗方法和微生物。所述微生物设计为在免疫豁免组织和细胞中积聚，如在肿瘤及其他增生性组织和炎症组织中积聚，但在其他组织、细胞和器官中不积聚，由此它们呈现对宿主生物体的相对低的毒性。所述微生物还设计或修饰为导致它们所积聚其中的细胞的细胞膜渗漏，导致产生具有针对蛋白质及其他细胞产物的反应性的抗体，还使得能利用增生的组织特别是肿瘤产生选择的蛋白质及其他产物。本发明还提供了产生肿瘤特异性抗体的方法及产生由所述微生物编码的基因产物及与其反应的抗体的方法。
文档编号A61K35/76GK1839201SQ200480023610
公开日2006年9月27日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者阿拉达尔·A·绍洛伊, 塔季扬娜·季米尔亚索娃, 余勇, 张谦 申请人:吉恩勒克斯公司