eIF4E表达的调节的制作方法

专利名称：eIF4E表达的调节的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于调节eIF4E表达的组合物和方法。具体而言，本发明涉及与编码eIF4E的核酸分子杂交的单链或双链反义化合物，特别是寡核苷酸化合物。本文表明此类化合物能够调节eIF4E的表达。
背景技术：
真核基因表达必须受到调节以致于使细胞能够快速地对广范围的不同条件作出反应。mRNA翻译过程是基因表达受到高度调节的一个步骤。作为对激素、生长因子、细胞因子和营养物的反应，动物细胞通常激活翻译为增殖反应作准备。在应激条件下例如氧化应激或渗透性应激、DNA损伤或营养物撤除，蛋白质合成速度典型降低。mRNA翻译的活化或抑制在几分钟内发生，并且认为对该过程的控制施加于蛋白质合成的起始阶段(Rosenwald等，Oncogene，1999，18，2507-2517；Strudwick和Borden，Differentiation，2002，70，10-22)。
翻译起始需要几种真核起始因子(eIF)的协同活性，所述的真核起始因子是通过其细胞质定位和调节蛋白质合成起始阶段的能力进行分类定义的蛋白质。作为这些因子之一的真核起始因子4E(eIF4E)(也称作真核翻译起始因子4E、真核翻译起始因子4E样1(eIF4EL1)、帽结合蛋白(CBP)和信使RNA帽结合蛋白)最初是作为一个涉及翻译的25kDa的mRNA帽结合蛋白分离得到的(Rychlik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84，945-949)并且因此已经成为最充分表征的eIF之一。相对于其它起始因子而言以有限量存在的eIF4E是eIF4F起始复合物的一种成份，该起始复合物还包括支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A。在细胞质中，eIF4E通过特异性结合至几乎全部成熟细胞mRNA上都存在的7-甲基GpppX帽结构的5’末端而催化帽依赖蛋白质合成的限速步骤，其中帽结构行使将mRNA递送至eIF4F复合物的功能。一旦结合，eIF4F复合物从帽的5’向3’端扫描，这允许eIF4A的RNA解旋酶活性解开5’非翻译区(UTR)中存在的任何二级结构，从而暴露出翻译起始密码子并促进核糖体装配于mRNA(Graff等，Clin.Exp.Metastasis，2003，20，265-273；Strudwick等，Differentiation，2002，70，10-22)。
掺入到eIF4E复合物的eIF4E可用性受到磷酸化作用以及抑制蛋白质结合的调节。eIF4E是磷蛋白，其丝氨酸209由促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶Mnk1磷酸化(Flynn等，J.Biol.Chem.，1995，270，21684-21688；Wang等，J.Biol.Chem.，1998，273，9373-9377和Waskiewicz等，Embo J.，1997，16，1909-1920)。eIF4E的磷酸化作用增加其对mRNA帽子的亲和力，从而提高翻译速度(Waskiewicz等，Mol.Cell Biol.，1999，19，1871-1880)。通过佛波酯、细胞应激和细胞因子增加eIF4E的磷酸化涉及p38促分裂原活化(MAP)激酶和/或Erk信号转导通路，其依次刺激Mnk1活性。其它应激如热休克、山梨醇和过氧化氢可刺激p38 MAP激酶并增加Mnk1活性，然而这些刺激会增加eIF4E与eIF4E结合蛋白质1(4E-BP1)的结合(Wang等，J.Biol.Chem.，1998，273，9373-9377)。4E-BP1与eIF4E的结合阻断了Mnk1对eIF4E的磷酸化作用(Wang等，J.Biol.Chem.，1998，273，9373-9377)。4E结合蛋白质1和2通过与eIF4G竞争结合至eIF4E背侧表面而担当有效的翻译抑制剂功能(Ptushkina等，Embo J.，1999，18，4068-4075)。MTOR对结合蛋白质的磷酸化作用引起结合蛋白质从eIF4E上解离，使eIF4E恢复活性。
越来越多的观察表明翻译因子定位于细胞核和细胞质中并在那里行使功能。传统上认为在真核生物中转录和翻译在空间上是分离的；然而，在哺乳动物细胞核中观察了结合进行的转录和翻译(Iborra等，Science，2001，293，1139-1142)。一部分eIF4E定位于细胞核，表明该翻译因子可以对细胞核中的翻译呈现一些控制作用(Lejbkowicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，9612-9616)。eIF4E由核质穿梭蛋白质eIF4E转运蛋白(4E-T)经过输入蛋白α/β通道，输入至细胞核(Dostie等，Embo J.，2000，19，3142-3156)。在细胞核中，早幼粒细胞白血病蛋白质(PML)是一种重要的哺乳动物细胞生长和细胞凋亡调节物，其能够直接结合eIF4E(Cohen等，Embo J.，2001，20，4547-4559)。PML通过其RING结构域极大降低eIF4E对mRNA 5’帽子结构的亲和力而调节eIF4E活性(Cohen等，Embo J.，2001，20，4547-4559)。
过量的eIF4E不导致翻译速度的整体提高，而是选择性增加eIF4E敏感类mRNA所编码蛋白质的合成，包括生长刺激性蛋白质如血管内皮生长因子(VEGF)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和细胞周期蛋白D1(Kevil等，Int.J.Cancer，1996，65，785-790；Rosenwald，Cancer Lett.，1995，98，77-82和Shantz等，Cancer Res.，1994，54，2313-2316)。通过增加翻译起始提高ODC和VEGF蛋白质水平，而由于细胞周期蛋白D1 mRNA向细胞质的转运更多使得细胞周期蛋白D1水平提高(Kevil等，Int.J.Cancer，1996，65，785-790；Rosenwald，Cancer Lett.，1995，98，77-82；Rousseau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，1065-1070)。因此，eIF4E除了在翻译起始中起作用外还可以影响mRNA的核质运输。
eIF4E功能是总体细胞蛋白质合成和生长的基本决定因素(DeBenedetti等，Mol.Cell.Biol.，1991，11，5435-5445)。在正常细胞中，eIF4E以有限数量存在，这可限制翻译。编码细胞生长和存活必需蛋白质的mRNA典型地包含复杂的、高度结构化的5’UTR，其给予这些mRNA较差的翻译基础。然而，当存在过量eIF4E时许多这种mRNA仍可以进行很好地翻译并且还通过肿瘤上调(Graff和Zimmer，Clin.Exp.Metastasis，2003，20，265-273)。通过eIF4E还可以增强与细胞分化相关的mRNA的翻译，如在包括上皮肺肿瘤细胞系在内的一些正在分化的细胞系中发现eIF4E水平增加(Walsh等，Differentiation，2003，71，126-134)。
已经报道在许多人类癌症和癌症来源的细胞系中eIF4E过表达并且其过表达还导致了细胞的致癌性转化和在动物模型中出现侵袭/转移表型。与非转化的培养细胞不同，转化的细胞系不依赖于血清生长因子的存在而表达eIF4E(Rosenwald，Cancer Lett.，1995，98，77-82)。过量eIF4E导致HeLa细胞异常生长和瘤形态并且在NIH 3T3和Rat2成纤维细胞中引起致瘤性转化，如通过非贴壁依赖性生长、培养转化灶形成和裸鼠中肿瘤形成所判断的那样(De Benedetti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8212-8216和Lazaris-Karatzas等，Nature，1990，345，544-547)。而且，通过过表达eIF4E所呈现出的瘤转化还与增加的ODC翻译相关(Lazaris-Karatzas等，Nature，1990，345，544-547)。另外，与eIF4E表达增加相关的细胞周期蛋白D1核输出的增加与转化活性直接相联系(Cohen等，Embo J.，2001，20，4547-4559)。这些发现证明，当eIF4E过量时能够增加生长调节性mRNA的表达或核输出。结果，所影响细胞能够不依赖于正常生长控制机制而增殖。在用src酪氨酸激酶癌蛋白转化的细胞中观察到增强的eIF4E磷酸化作用，表明除了过表达外eIF4E活性的提高也有助于转化细胞中生长调节的丧失(Frederickson等，Mol.Cell.Biol.，1991，11，2896-2900)。
在几种人癌症中观察到eIF4E提高，其中所书癌症包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、结肠腺瘤和癌以及喉癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌(Crew等，Br.J.Cancer，2000，82，161-166；Graff等，Clin.Exp.Metastasis，2003，20，265-273；Haydon等，Cancer，2000，88，2803-2810；Kerekatte等，Int.J.Cancer，1995，64，27-31；Rosenwald等，Oncogene，1999，18，2507-2517；Wang等，Am.J.Pathol.，1999，155，247-255)。eIF4E上调是结肠癌发生中的早期事件并且通常伴随着细胞周期蛋白D1水平的增加(Rosenwald等，Oncogene，1999，18，2507-2517)。过量eIF4E还是头颈癌肿瘤复发的可靠预示，它还在侵袭性膀胱癌中选择性上调并且在喉鳞状细胞癌中与较差的组织学分级和转移的更晚期状态关联(Crew等，Br.J.Cancer，2000，82，161-166；Liang等，Laryngoscope，2003，113，1238-1243和Nathan等，Oncogene，1997，15，579-584)。这些发现表明eIF4E水平提高参与癌症的进展和起始。
通过使用反义机制已经实现了对eIF4E表达和活性的抑制。安装有3’-悬突核苷酸的反义寡核苷酸能够调节eIF4E与具有5’帽子的寡核糖核苷酸的结合(Baker等，J.Biol.Chem.，1992，267，11495-11499)。将工程化表达与eIF4E翻译起始区内20个核苷酸互补的寡核苷酸的附加型载体导入HeLa细胞会降低eIF4E水平并且伴随着降低细胞生长和蛋白质合成速度，这证明eIF4E是细胞增殖所必需的(Bommer等，Cell.Mol.Biol.Res.，1994，40，633-641；De Benedetti等，Mol.Cell.Biol.，1991，11，5435-5445)。eIF4F复合物的支架蛋白成份eIF4G的水平也降低了。尽管抑制eIF4E后翻译水平降低，但某些蛋白质仍继续合成，并且许多这些蛋白质已经鉴定为应激诱导或热休克蛋白质(Joshi-Barve等，J.Biol.Chem.，1992，267，21038-21043)。在大鼠胚胎成纤维细胞中相同的载体使eIF4E降低50-60％，这足以抑制ras介导的这些细胞的转化和肿瘤发生(Graff等，Int.J.Cancer，1995，60，255-263；Rinker-Schaeffer等，Int.J.Cancer，1993，55，841-847)。而且，ODC翻译和多胺转运也降低了，该观察提供了ras诱导的恶性肿瘤、eIF4E活性和多胺代谢之间的联系(Graff等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，240，15-20)。使用eIF4E反义载体稳定转化乳癌细胞系和头部与颈部鳞状细胞癌细胞系导致成纤维细胞生长因子2(FGF-2)表达降低并且导致细胞在小鼠内致瘤能力和血管发生能力的抑制，这表明eIF4E在肿瘤血管化中的诱因作用(DeFatta等，Laryngoscope，2000，110，928-933；Nathan等，Oncogene，1997，15，1087-1094)。
通过将小干扰RNA注射入秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)年轻成虫靶向失活人eIF4E同系物IFE-3，导致后代中100％的胚胎致死率(Keiper等，J.Biol.Chem.，2000，275，10590-10596)。靶向eIF4E的小干扰双链RNA还揭示出eIF4E调节的缺乏参与细胞转化。使用靶向人eIF4E部分编码区的基因特异性21-核苷酸小干扰RNA使eIF4E功能性失活导致恶性胆管细胞非锚定依赖性生长显著降低，非锚定依赖性生长是与转化细胞相关的表型。此外，恶性胆管细胞中eIF4E的磷酸化依赖于p38 MAP激酶信号转导通路，这证明在胆管癌生长过程中p38 MAP激酶信号与蛋白质合成的调节之间存在联系(Yamagiwa等，Hepatology，2003，38，158-166)。
在表达组成型活性形式eIF4E抑制剂4EBP-1的乳腺癌细胞中发现了eIF4E活性的抑制降低细胞肿瘤发生潜能的进一步证据，这导致与细胞周期蛋白D1下调和细胞周期蛋白依赖激酶p27Kipl上调相关的细胞周期阻滞(Jiang等，Cancer Cell Int.，2003，3，2)。在eIF4E水平显著高于正常组织的胃肠癌中，4E-BP1的过表达与远端转移降低相关(Martin等，Int.J.Biochem.Cell.Biol.，2000，32，633-642)。
美国专利5,646,009要求并公开了杂合载体，其中一段DNA片段编码由eIF4E、eIF4E因子或其突变体组成的帽结合蛋白。该专利还公开了编码人eIF4E的核酸序列。
在美国专利6,171,798中公开了通过向癌细胞施用反义构建体来治疗患者中癌症的方法，该构建体包含选自人eIF4E基因编码序列中的至少12个核苷酸，其相对控制其表达的启动子而言为3’-5’方向。
美国专利6,596,854要求并公开了编码人eIF4E变体的分离核酸分子，其中所述变体在氨基酸112和114-121区域内，或位置118，或位置119，或位置115或位置121发生氨基酸取代。
欧洲专利申请1033401和日本专利申请2001269182要求纯化的核酸，其包含选自包括编码人eIF4E的部分核酸分子的EST相关序列中序列的至少10个连续核苷酸。这些公布还公开了用于基因治疗的反义构建体和寡核苷酸的制备和用途。
PCT公布WO 01/96388和WO 01/96389公开并要求了所分离多聚核苷酸，其包含选自以下序列的序列序列表中提供的序列、序列的互补序列、由序列中至少20个相连残基组成的序列、与序列杂交的序列或者与序列具有至少75％或至少95％同一性的序列，其包含编码人eIF4E的核酸分子。该公布还要求了治疗患者癌症的方法，其包括向患者施用所要求的多聚核苷酸组合物。
PCT公布WO 03/039443要求并公开了用于治疗白血病的药物组合物的制备方法，其特征在于将与编码相应标记物蛋白质的选自人eIF4E核酸分子的多聚核苷酸互补的反义寡核苷酸与药物化合物相混合。
在美国专利早期公开20030087852中公开了编码eIF4E反义mRNA的质粒和用该质粒转染的培养小鼠细胞。
在美国专利早期公开20030144190中公开了用于降低或消除本发明核酸序列或蛋白质(包括eIF4E)表达的反义分子。还公开了编码eIF4E反义mRNA的质粒和持续表达该质粒的大鼠成纤维细胞。
由于eIF4E参与许多疾病，所以仍然长期需要能够有效调节eIF4E的其它制剂。如此，考虑到eIF4E表达上调与许多不同类型的癌症相关，所以在癌症治疗中抑制作用特别重要。
反义技术是降低特异基因产物表达的有效方法并且已经证明在许多治疗、诊断和研究应用中具有独特的用途。本发明提供了调节eIF4E表达的组合物和方法。
发明概述本发明针对靶向编码eIF4E的核酸分子的并抑制eIF4E表达的寡聚化合物，例如反义化合物及其可药用盐。寡聚化合物可以是RNA样或DNA样寡聚化合物，包括寡核苷酸。寡聚化合物可以是单链寡聚化合物或者部分或全部双链寡聚化合物，并且可以是化学修饰的或未修饰的。还提供了包含这些化合物的药物及其它组合物。
还提供了筛选eIF4E调节物的方法和在细胞、组织或动物中调节eIF4E表达的方法，其包括将所述细胞、组织或动物与一种或多种本发明化合物或组合物相接触。文中还提出了治疗动物(特别是人)的方法。此类方法包括施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明化合物或组合物。
发明详述A.发明总述本发明将寡聚化合物如反义化合物、单链或双链寡核苷酸及相似种类化合物用于调节编码eIF4E的核酸分子的功能或效应。这是通过提供与编码eIF4E的一种或多种核酸分子特异性杂交的寡聚化合物实现的。如文中所使用，术语“靶核酸”和“编码eIF4E的核酸分子”已经方便使用用来包括编码eIF4E的DNA、从此种DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA或其部分)以及从此种RNA衍生的cDNA。这种通过与其杂交的化合物对靶核酸功能进行的调节通常称为“反义”。
受到干扰的DNA功能可以包括复制和转录。复制和转录可以从例如内源性细胞模板、载体、质粒构建体或其它上面进行。受到干扰的RNA功能可以包括功能例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、RNA向距离RNA合成位点较远的细胞内位点的易位、蛋白质从RNA上的翻译以及由RNA参与或促进的涉及RNA的催化活性或复合物形成。此种对靶核酸功能干扰的一种结果是对eIF4E表达的调节。在本发明的上下文中，“调节”和“表达调节”意思是编码基因的核酸分子如DNA或RNA的数量或水平增加(刺激)或降低(抑制)。抑制是调节表达的一种形式并且mRNA通常是靶核酸。
在本发明的上下文中，“杂交”意思是指基本上互补的寡聚化合物链的配对。在本发明中，配对的一种机制涉及氢键，氢键可以是寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，它们通过形成氢键配对。杂交可以在多种条件下发生。
如果反义化合物与靶核酸的结合干扰了靶核酸的正常功能而引起活性丧失，并且存在足够程度的互补性以避免在期望特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗处理情况下的生理条件和在体外测定情况下开展测定所用的条件)反义化合物与非靶核酸序列非特异性结合，则反义化合物是“可特异性杂交的”。
在本发明中，短语“严格杂交条件”或者“严格条件”是指本发明化合物除了与最低数量其它序列杂交外将与其靶序列杂交的条件。严格条件是序列依赖的并且在不同情况下是不同的，并且在本发明情况下，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”可以通过寡聚化合物的性质和组成以及研究这些寡聚化合物的测定方法来确定。通常，严格杂交条件包括低浓度(＜0.15M)的无机阳离子如Na++或K++的盐(即低离子强度)、比低于寡聚化合物靶序列复合物Tm值20-25℃的温度更高的温度以及变性剂如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的存在。例如，甲酰胺每增加1％则杂交率降低1.1％。高严格杂交条件的实例为0.1×氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1％(w/v)SDS，于60℃杂交30分钟。
如文中所使用，“互补的”指在一条或两条寡聚链上两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果反义化合物某一位置的核碱基能够与靶核酸(该靶核酸可以是DNA、RNA或寡核苷酸分子)某个位置的核碱基形成氢键，则寡核苷酸和靶核酸之间形成氢键的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被彼此能够形成氢键的核碱基占据时，则寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示在足够数量核碱基间精确配对或互补以致于在寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定并特异结合的足够程度的术语。
在本领域中应该理解，寡聚化合物的序列不必要同能够与其可特异性杂交的靶核酸序列100％互补。而且，寡核苷酸可以在一个或多个片段上杂交从而使间隔或相邻片段不参与杂交事件(例如环结构、错配或者发夹结构)。本发明的寡聚化合物与其所靶向靶核酸序列内的靶区域具有至少大约70％、或至少大约75％、或至少大约80％、或至少大约85％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约99％的序列互补性。例如，在反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补并因此可特异性杂交的反义化合物代表90％的互补性。在该例子中，剩余非互补核碱基可以是成簇的或者散布于非互补核碱基间，并且不必彼此相邻或者与互补核碱基相邻。照这样，具有4(四)个非互补核碱基(其两侧为两个与靶核酸完全互补区域)的长度为18个核碱基的反义化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性并且因此也处于本发明的范围之内。使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656)能够常规确定反义化合物与靶核酸区域的互补性百分数。例如通过Gap程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的版本8，Genetics ComputerGroup，University Research Park，Madison WI)并且使用采用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)的缺省设置能够确定同源性、序列同一性或互补性百分数。
本发明的寡聚化合物还包括在化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同碱基的变体。例如，如果第一个核苷酸是腺苷，则可以产生在该位置上为胸腺嘧啶核苷、鸟苷或胞苷的变体。在反义化合物的任意位置上都可以进行此种变化。然后使用文中所描述的方法对这些化合物进行测试以确定其对eIF4E mRNA表达的抑制能力。
在一些实施方案中，反义化合物和靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为大约50％至大约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为大约60％至大约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为大约70％至大约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为大约80％至大约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为大约90％、大约92％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％。
B.本发明的化合物在本发明的上下文中，术语“寡聚化合物”指能够与核酸分子区域杂交的多聚体结构。该术语包括寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物及其它们的嵌合组合。寡聚化合物常规制备成线性的，但是也可以连接成或另外制备成环状的并且还可以包含分支。寡聚化合物可以包含双链构建体，例如能够杂交形成双链化合物的两条链或者具有足够自身互补性以允许完全或部分双链化合物杂交和形成的单链。在本发明的一个实施方案中，双链反义化合物包括短干扰RNA(siRNA)。如文中所使用，术语“siRNA”定义为具有第一链和第二链的双链化合物，并且其包含在所述第一链和第二链之间互补的中央部分和末端部分，其任选地在所述第一链和第二链或靶mRNA之间互补。每条链可以为从大约8至大约80核碱基长度、从10至50个核碱基长度、从12或13至30个核碱基长度、从12或13至24个核碱基长度或者从19至23个核碱基长度。中央互补部分可以为从大约8至大约80个核碱基长度、从10至50个核碱基长度、从12或13至30个核碱基长度、从12或13至24个核碱基长度或者从19至23个核碱基长度。末端部分可以为1-6个核碱基长度。siRNA还可以不含末端部分。siRNA的两条链可以在内部连接从而保留游离3’或5’末端，或者可以连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在5’或3’末端包含能够产生单链特征延伸的悬突。
在本发明的一个实施方案中，双链反义化合物为规范的siRNA。如文中所使用，术语“规范siRNA”定义为具有第一链和第二链的双链寡聚化合物，其中每一链长度为21个核碱基，并且链中19个核碱基是互补的且在每条链的3’末端具有在双链化合物中担当3’悬突的脱氧胸腺嘧啶二聚体(dTdT)。
在另一个实施方案中，双链反义化合物为平端siRNA。如文中所使用，术语“平端siRNA”定义为不具有末端悬突的siRNA。即双链化合物的至少一个末端是平端。不管是规范的siRNA还是平端siRNA均能引出dsRNA酶并引起RNAi反义机制的募集或活化。在另一个实施方案中，关注了通过RNAi反义机制起作用的单链RNAi(ssRNAi)化合物。
可以对双链化合物进行进一步的修饰并且这些修饰包括将缀合基团连接到一个末端、所选核碱基位置、糖位置上或者连接到一个核苷间键上。备选地，两条链可以通过非核酸部分或接头基团进行连接。当dsRNA仅从一条链形成时，其可以采取自身向后折拢以便形成双链体的自身互补发夹型分子形式。因此，dsRNA可以是完全或部分双链的。当从两条链形成时或者从采用自身向后折拢以形成双链体的自身互补发夹型分子的单链形成时，两条链(或者单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式碱基配对的互补RNA链。
根据本发明，“反义化合物”包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物如siRNA化合物，以及与至少部分靶核酸杂交并调节其功能的其它寡聚化合物。照这样，反义化合物可以是DNA、RNA、DNA样、RNA样或其混合物，或者可以是一种或多种这些化合物的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹状寡聚化合物并且可以包含结构元件例如内部或末端凸出、错配或环。常规情况下将寡聚化合物制备成线性的，但是也可以连接成或另外制备成环状和/或分支状。寡聚化合物可以包含构建体，例如杂交形成完全或部分双链化合物的两条链或者具有足够自身互补性以允许完全或部分双链化合物杂交和形成的单链。两条链可以在内部连接而保留游离的3’或5’末端或者连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在5’或3’末端包含产生单链特征延伸的悬突。双链化合物任选地在末端包括悬突。进一步的修饰包括将缀合基团连接到一个末端、所选核碱基位置、糖位置上或者连接到一个核苷间键上。备选地，两条链可以通过非核酸部分或接头基团连接。当dsRNA仅从一条链形成时，其可以采取自身向后折拢以形成双链体的自身互补发夹型分子形式。因此，dsRNA是完全或部分双链的。通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹可以实现基因表达的特异性抑制(Hammond等，Nat.Rev.Genet.，1991，2，110-119；Matzke等，Curr.Opin.Genet.Dev.，2001，11，221-227；Sharp，Genes Dev.，2001，15，485-490)。当从两条链形成时或者从采取自身向后折拢以形成双链体的自身互补发夹型分子的单链形成时，两条链(或者单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式碱基配对的互补RNA链。
本发明化合物一旦被导入体系中，其可以引起一种或多种酶或结构蛋白质的作用以影响靶核酸的断裂或其它修饰，或者可以通过基于占用的机制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可以描述为“DNA样”(即一般具有一个或多个2’-脱氧糖并且一般具有T而不是U碱基)或者“RNA样”(一般具有一个或多个2’-羟基或2’-修饰糖并且一般具有U而不是T碱基)。核酸螺旋能够采用一种以上结构类型，最通常地为A型和B型。通常，据认为具有B型样结构的寡核苷酸为“DNA样”而那些具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可以包含A和B型区域。
修饰靶核酸的酶的一个实例为RNA酶H，它是一种断裂RNA:DNA双链体中RNA链的细胞内切核酸酶。在本领域中已知，包含长于大约3或4个连续核碱基的“DNA样”区域(例如2’-脱氧区域)的单链反义化合物能够招募RNA酶H。因此，RNA酶H的活化导致RNA靶的断裂，从而极大地增强寡核苷酸介导的基因表达抑制作用的效率。最近，推测dsRNA酶参与RNA干扰(RNAi)过程中所观察到的RNA:RNA双链体中RNA链的断裂。
虽然一种被广泛接受的反义化合物形式是单链反义寡核苷酸，但在其它情况下双链RNA或其类似物也是有用的。在许多物种中，双链结构如双链RNA(dsRNA)分子的导入已经显出出能够诱导基因或其相关基因产物功能被有效且特异性反义介导降低。这种现象在植物和动物中都有发生并且认为与病毒防御和转座子沉默具有进化上的联系(Guo等，Cell，1995，81，611-620；Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507)。在秀丽隐杆线虫中所阐明的源自双链RNA(dsRNA)暴露的转录后反义机制后来被命名为RNA干扰(RNAi)。该术语已经概括成意思是指涉及能够导致所靶向内源性mRNA水平产生序列特异性降低的dsRNA导入的反义介导基因沉默(Fire等，Nature，1998，391，806-811)。RNAi化合物常常称作短干扰RNA或者siRNA。最近，已经表明它实际上是RNAi有效诱导物dsRNA反义极性的单链RNA寡聚物(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。RNAi化合物(即单链或双链RNA或者RNA样化合物)和单链RNA酶H依赖反义化合物都能够通过碱基配对(即杂交)与其RNA靶结合并且通过特异性RNA酶诱导靶RNA的位点特异性断裂；即两个都是通过反义机制起作用。Vickers等，J.Biol.Chem.，2003，278，7108-7118。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或多聚物，或者其模拟物、嵌合体、类似物或同系物。该术语包括天然存在核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸以及功能相似的具有非天然存在部分的寡核苷酸。比天然形式相比，此类修饰的或替代的寡核苷酸常常是所期望的，这是因为其具有令人期望的特性例如增强的细胞摄入、增强的靶核酸亲和力和在核酸酶存在情况下提高的稳定性。
根据本发明的反义化合物可以包含大约8至大约80个核碱基(即大约8至大约80个连接核苷)长度的反义部分。该长度指反义化合物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链反义化合物包含从8至大约80个核碱基，并且本发明的双链反义化合物(例如dsRNA)包含长度为从8至大约80个核碱基的反义链或部分。本领域的每个普通技术人员将意识到这包括长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个或者其内的任意范围的核碱基反义部分。
在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为10-50个核碱基的反义部分。本领域中的普通技术人员将意识到这体现了反义化合物具有长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或者其内的任意范围的核碱基反义部分。
在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为12或13至30个核碱基的反义部分。本领域中的普通技术人员将意识到这体现了反义化合物具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或者其内的任意范围的核碱基反义部分。
在一些实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为12或13至24个核碱基的反义部分。本领域中的普通技术人员将意识到这体现了反义化合物具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个或者其内的任意范围的核碱基反义部分。
在一些实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为19至23个核碱基的反义部分。本领域中的普通技术人员将意识到这体现了反义化合物具有长度为19、20、21、22或23个或者其内的任意范围的核碱基反义部分。
包含选自说明性反义化合物的一段至少8个连续核碱基的长度为8-80个核碱基的反义化合物被认为同样也是适宜的反义化合物。
代表性化合物可以包括包含说明性反义化合物之一的5’末端至少8个连续核碱基的寡核苷酸序列(剩余核碱基是在与靶核酸特异杂交的反义化合物5’末端上游即刻开始的同一寡核苷酸的连续一段，并持续直到寡核苷酸包含大约8至大约80个核碱基)。其它化合物还可以包括包含说明性反义化合物之一的3’末端至少8个连续核碱基的寡核苷酸序列(剩余核碱基是在与靶核酸特异杂交的反义化合物3’末端下游即刻开始的同一寡核苷酸的连续一段，并持续直到寡核苷酸包含大约8至大约80个核碱基)。还应该理解，化合物可以为这样的寡核苷酸序列，即其包含来自说明性化合物序列内部部分的至少8个连续核碱基并且向任一方向或两个方向延伸直到寡核苷酸包含大约8至大约80个核碱基。
应该注意到本发明的寡聚化合物或其可药用盐不包括核碱基序列5’-AGTCGCCATCTTAGATCGAT-3’(SEQ ID NO454)或5’-AGUCGCCAUCUUAGAUCGAU-3’(SEQ ID NO455)。此外，本发明所包括的寡聚化合物或其可药用盐可以由或基本上由本文所公开的特异核苷酸序列组成、或者包含本文所公开的特异核苷酸序列。当短语“基本上由它组成”、“基本上由它们组成”、“基本上由它组成的”等应用于本发明所包括的寡聚化合物或其可药用盐时是指如文中所公开的那些核苷酸序列，除此之外本发明所包括的寡聚化合物或其可药用盐还包含另外的核苷酸(如文中所论述的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者其类似物或衍生物)。然而，与文中所公开的相应寡聚化合物或其可药用盐的相应参数相比，此类另外核苷酸本质上并不影响这些寡聚化合物或其可药用盐在调节、减弱或抑制eIF4E基因表达或RNA功能方面的基本特性或新特性，所述特性包括这些分子的特异性定量效应。
在本领域中掌握了文中所说明反义化合物的技术人员能够在无需进行过多实验的条件下鉴定其它反义化合物。
C.本发明的靶标在本发明的上下文中，将寡聚化合物“靶向”特定核酸分子可能是多步骤的过程。该过程通常起始于其功能将要受到调节的靶核酸的鉴定。该靶核酸可以是例如其表达与特定失调或疾病状态相关的细胞基因(或自该基因转录的mRNA)或者来自传染介质的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码eIF4E。
靶向过程通常还包括确定靶核酸内用于发生反义相互作用以致于产生预期效应(如表达受到调节)的至少一个靶区域、片段或位点。在本发明的上下文中，术语“区域”定义为具有至少一种可以确认的结构、功能或特性的靶核酸部分。在靶核酸区域内为片段。“片段”定义为靶核酸内区域的更小部分或亚部分。如本发明中所使用的“位点”定义为靶核酸内的位置。
既然如本领域中已知翻译起始密码子典型地为5’-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中为5’-ATG)，翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有RNA序列为5’-GUG、5’-UUG或5’-CUG的翻译起始密码子，并且已经显示5’-AUA、5’-ACG和5’-CUG在体内具有功能。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包括许多密码子序列，尽管在每种情况下起始氨基酸典型地为蛋氨酸(在真核生物中)或甲酰蛋氨酸(在原核生物中)。在本领域中还已知真核或原核基因可以具有两个或多个可选择的起始密码子，它们中的任意一个可以在特定细胞类型或组织中或者在一组特定条件下优选地用于翻译起始。在本发明的上下文中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指体内使用以便从编码eIF4E基因所转录的mRNA进行起始翻译的一个密码子或多个密码子，而不管此类密码子序列如何。在本领域中还已知基因的终止翻译密码子(或“终止密码子”)具有以下三个序列之一，即5’-UAA、5”-UAG和5’-UGA(相应DNA序列分别为5’-TAA、5’-TAG和5’-TGA)。
术语“起始密码子区域”和“翻译起始密码子区域”是指mRNA或基因的一部分，其包含从翻译起始密码子的任一方向(即5’或3’)上的大约25至大约50个相邻核苷酸。同样，术语“终止密码子区域”和“翻译终止密码子区域”是指mRNA或基因的一部分，其包含从翻译终止密码子的任一方向(即5’或3’)上的大约25至大约50个相邻核苷酸。因此，“起始密码子区域”(或“翻译起始密码子区域”)和“终止密码子区域”(或“翻译终止密码子区域”)是可以用本发明反义化合物有效靶向的全部区域。
在本领域中已知指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域的可读框(ORF)或“编码区”也是可以有效靶向的区域。在本发明的上下文中，一个区域是包含基因可读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区域。
其它靶区域包括5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)，其中在本领域已知5’非翻译区是指翻译起始密码子5’方向的mRNA部分并且因此包括mRNA 5’帽子位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)，并且在本领域中已知3’非翻译区指翻译终止密码子3’方向上的mRNA部分并且因此包括mRNA翻译终止密码子和3’末端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5’帽子位点包括通过5’-5’三磷酸键连接至mRNA最5’端残基的N7-甲基化鸟苷残基。mRNA的5’帽子区域被认为包括5’帽子结构自身以及与帽子位点相邻的最开始的50个核苷酸。5’帽子区域也是靶标。
尽管一些真核mRNA转录本是直接翻译的，但是多数转录本包含一个或多个被称作“内含子”的区域，在翻译之前将这些内含子从转录本上剪切掉。剩余(且因此翻译)的区域已知为被称为“外显子”并且被剪接到一起形成连续的mRNA序列。在异常剪接涉及疾病或者特定剪接产物生产过剩涉及疾病的情况下，靶向剪接位点即靶向内含子-外显子接点或外显子-内含子接点也是特别有用的。由于重排或缺失产生的异常融合接点也是适宜的靶位点。通过来自不同基因来源的两个(或多个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录本被称作“融合转录本”。还已知使用靶向如DNA或前mRNA的反义化合物能够有效地靶向内含子。单链反义化合物如通过RNA酶H机制起作用的寡核苷酸化合物可有效地用于靶向前mRNA。
在本领域中还已知从DNA的同一基因组区域能够产生选择性RNA转录本。这些选择性转录本通常称作“变体”。更加具体而言，“前mRNA变体”是从同一基因组DNA产生的、在起始或终止位置上不同于从同一基因组DNA产生的其它转录本并且包含内含子和外显子序列的转录本。
在剪接过程中，一旦一个或多个外显子或内含子区域或其部分被剪切，则前mRNA变体产生较小的“mRNA变体”。结果，mRNA变体被加工成前mRNA变体并且作为剪接的结果每个独特前mRNA变体必须无例外地产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称作“选择性剪接变体”。如果前mRNA变体不发生剪接，那么前mRNA变体与mRNA变体是相同的。
在本领域中还已知可以通过使用选择性起始或终止转录的信号产生变体并且前mRNA和mRNA可以拥有一个以上起始密码子或终止密码子。来源于使用选择性起始密码子的前mRNA或mRNA的变体被称作该前mRNA或mRNA的“选择性起始变体”。那些使用选择性终止密码子的转录本被称为该前mRNA或mRNA的“选择性终止变体”。一种特殊类型选择性终止变体是“polyA变体”，其中多重转录本产生于转录装置对“polyA终止信号”之一的可变选择，由此产生了终止于独特polyA位点的转录本。在本发明的上下文中，文中所描述的变体类型也是适宜的靶核酸。
靶核酸上的能够被适宜寡聚化合物杂交的位置在下文中称作“适宜靶片段”。如文中所使用的术语“适宜靶片段”被定义为活性寡聚化合物所靶向的靶区域中的至少8-核碱基部分。虽然不希望受到理论的束缚，但目前应该相信这些靶片段代表了杂交可接近的靶核酸部分。
虽然文中提出的是某些适宜靶片段的特定部分，但本领域的技术人员应该认识到，它们是用来举例说明和描述本发明范围内的特定实施方案。本领域的普通技术人员可以鉴定另外的适宜靶片段。如果有的话，则“适宜靶片段”没有必要通过该术语来识别或者包括于“适宜靶片段”表中。
包含选自说明性适宜靶片段内至少8个连续核碱基的长度为8-80个核碱基的靶片段认为也适于用于靶向。
靶片段可以包括包含选自说明性适宜靶片段之一的5’末端的至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列(剩余核碱基是在靶片段5’末端上游即刻开始的同一DNA或RNA的连续一段，并持续直到DNA或RNA包含大约8至大约80个核碱基)。相似地，适宜靶片段可以是包含选自说明性适宜靶片段之一的3’末端的至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列(剩余核碱基是在靶片段3’末端下游即刻开始的同一DNA或RNA的连续一段，并持续直到DNA或RNA包含大约8至大约80个核碱基)。还应该理解，适宜寡聚靶片段可以为这样的DNA或RNA序列，即其包含来自说明性适宜靶片段序列内部部分的至少8个连续核碱基并且向任一方向或两个方向延伸直到寡核苷酸包含大约8至大约80个核碱基。了解了本文举例说明的适宜靶片段的本领域技术人员能够在无需进行过多实验的情况下鉴定另外的适宜靶片段。
一旦鉴定出一个或多个靶区域、片段或位点，则选择与靶标充分互补(即足够好地杂交且具有足够特异性)的寡聚化合物以得出预期效应。
寡聚化合物还可以靶向靶核碱基序列的区域(例如下面实施例中所公开的那些区域)，其包含核碱基1-80、81-160、161-240、241-320、321-400、401-480、481-560、561-640、641-720、721-800、801-880、881-960、961-1040、1041-1120、1121-1200、1201-1280、1281-1360、1361-1440、1441-1520、1521-1600、1601-1680、1681-1760或1761-1842或其任意组合。
D.筛选和靶标确认在另一个实施方案中，文中所鉴定的“适宜靶片段”可以应用于筛选调节eIF4E表达的另外的化合物。“调节物”是那些降低或增加编码eIF4E的核酸分子表达的化合物并且其包含与适宜靶片段互补(即反义)的至少8-核碱基部分。筛选方法包括将编码eIF4E的核酸分子的适宜靶片段与一种或多种候选调节物相接触的步骤，和选择降低或增加编码eIF4E的核酸分子表达的一种或多种候选调节物的步骤。一旦显示某种候选调节物或几种调节物能够调节(例如降低或增加)编码eIF4E的核酸分子的表达，则采用该调节物可以用于eIF4E功能的进一步调查研究或者用作根据本发明的研究试剂、诊断剂或治疗剂。
一般而言，dsRNA构建体活性与靶向同一位点的RNA酶H依赖单链反义化合物的活性相关。Vickers等，J.Biol.Chem.，2003，278，7108。因此，作为任一单链反义化合物(例如RNA酶H依赖化合物)有活性的序列能够用于设计双链(例如siRNA)反义化合物，并且反之亦然。本发明的适宜靶片段可以与其分别互补的反义化合物相结合形成稳定的双链(双链体)化合物。本领域中已经显示此类双链寡聚化合物部分可以调节靶标表达并且通过反义机制调控翻译及RNA加工。而且，双链部分还可以进行化学修饰(Fire等，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature 1998，395，854；Timmons等，Gene，2001，263，103-112；Tabara等，Science，1998，282，430-431；Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等，Genes Dev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等，Genes Dev.2001，15，188-200)。例如，已经显示此类双链部分通过双链体反义链与靶标的典型杂交而抑制靶标，从而触发靶标的酶降解(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。基于RNA酶H的反义(通常使用单链化合物)和siRNA(通常使用双链化合物)都是反义机制，一般导致靶RNA功能丧失。最佳siRNA和RNA酶H依赖寡聚化合物在效能、最大效应、特异性和作用持续期间以及效率方面的行为相似。而且已经显示，dsRNA构建体的活性通常与靶向同一位点的RNA酶H依赖单链反义化合物的活性相关。一个主要的例外是RNA酶H依赖反义化合物的活性通常针对前mRNA中的靶位点，而siRNA不是。Vickers等，J.Biol.Chem.，203，278，7108。
本发明的寡聚化合物还能够应用于药物发现和靶标验证领域。本发明包括将文中所鉴定的化合物和适宜靶片段用于药物发现尝试的用途以阐明eIF4E和疾病状态、表型或状况之间存在的关系。这些方法包括检测或调节eIF4E，其包括将样品、组织、细胞或有机体与一种或多种本发明反义化合物相接触、在治疗后某个时间测量eIF4E核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学药品的终末点、和任选地将测量值与非处理样品或用本发明另外化合物处理样品相比较。这些方法还能够平行或与其它实验联合进行，以便确定用于靶标确认过程的未知基因的功能或者确定特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、状况或表型的靶标的有效性。
E.试剂盒、研究试剂、诊断剂和治疗剂本发明的寡聚化合物能够用于诊断、治疗、预防和作为研究试剂和试剂盒。而且，那些普通技术人员通常将能够以精确特异性抑制基因表达的寡聚化合物用于阐明特定基因的功能或者用于区别生物学途径多个成员的功能。
对于用于试剂盒和诊断剂，本发明化合物单独或者与其它化合物或治疗剂联合用作差别分析和/或组合分析中的工具，以阐明细胞和组织内所表达基因的部分或全部互补体的表达模式。
作为一个非限定性实施例，将用一种或多种化合物处理的细胞或组织内的表达模式与不用化合物处理的对照细胞和组织进行比较，并将所产生的模式用于分析基因表达的差异水平，这些差异水平与例如所检测基因的疾病相关性、信号转导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能相关。这些分析能够在刺激或非刺激细胞中以及在影响表达模式的其它化合物存在或缺乏条件下进行。
本领域已知的基因表达分析方法的例子包括DNA阵列或微阵列(Brazma等，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)、READS(消化cDNA的限制性内切酶扩增)(Prashar等，MethodsEnzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)、蛋白质阵列和蛋白质组(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(EST)序列测定(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹法(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等，Cytometry，2000，41，203-208)、消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic等，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going等，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)和质谱分析法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。
本领域的技术人员还将反义的特异性和敏感性用于治疗用途。反义化合物已经作为治疗部分应用于动物(包括人)疾病情况的治疗。包括核酶在内的反义药物已经安全并有效地施用于人类并且很多临床试验目前正在进行中。因此已确定反义化合物是有用的治疗方法，可以配置(configure)用于治疗细胞、组织和动物特别是动物的治疗方案。本发明也期望对选自伴侣动物、动物园动物和农业动物(包括但不限于猫、狗、啮齿类、马、母牛、绵羊、猪、山羊等)的治疗。
对于治疗剂，通过施用本发明的化合物治疗怀疑患有通过调节eIF4E表达能够治疗的疾病或失调的动物，例如人。例如，在一个非限定性实施方案中，方法包括将治疗有效量的抑制eIF4E的寡聚化合物施用于需要治疗的动物的步骤。本发明eIF4E化合物有效地抑制了编码eIF4E RNA核酸的活性和表达。由于eIF4E RNA水平的降低同样导致eIF4E蛋白质水平的降低，所以也可以测量蛋白质表达或水平的降低。在一些实施方案中，在治疗之前动物已经被诊断患有疾病或失调。在一个实施方案中，寡聚化合物调节eIF4E mRNA的活性或表达至少大约10％、至少大约20％、至少大约25％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、至少大约98％、至少大约99％或100％。
例如，在动物的血清、脂肪组织、肝脏或任何其它体液、组织或器官中可以测量到eIF4E表达的降低。在所分析的所述体液、组织或器官内包含的细胞可能含有编码eIF4E蛋白质的核酸分子和/或eIF4E蛋白质本身。
通过将有效量化合物加入到适宜的可药用或生理可接受赋形剂、稀释剂或载体，可以将本发明化合物用于药物组合物。本发明的化合物和方法在预防上也是有用的。因此，本发明包括文中所公开的化合物用于药物的用途，以及目前所公开的化合物用于制备治疗如文中所公开失调的药物的用途。
本发明的化合物能够抑制eIF4E的表达。因为这些化合物抑制eIF4E活化的效应，所以这些化合物可用于治疗与eIF4E表达相关的失调。因此，本发明的化合物是抗肿瘤剂。
相信本发明化合物在治疗癌症方面是有用的，所述癌症例如中枢神经系统肿瘤多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体肿瘤、神经元肿瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤；眼部肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤；内分泌腺肿瘤垂体瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠胰腺内分泌系统肿瘤、生殖腺肿瘤；头部和颈部肿瘤头和颈癌、口腔、咽、喉、牙源性肿瘤。胸部肿瘤大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸肿瘤、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸原始胚细胞肿瘤；消化道肿瘤食道肿瘤、胃部肿瘤、肝脏肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺外分泌部肿瘤、小肠、不同型阑尾和腹膜肿瘤、结肠和直肠腺癌、肛门肿瘤；生殖泌尿道肿瘤肾细胞癌、肾盂和输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、前列腺肿瘤、阴茎肿瘤、睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤外阴和阴道肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫体腺癌、卵巢癌、妇科肉瘤；乳房肿瘤；皮肤肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞瘤；恶性黑色素瘤；骨和软组织肿瘤成骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、原始神经外胚层瘤、血管肉瘤；造血系统肿瘤骨髓增生异常综合症、急性粒细胞白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、HTLV-1和T-细胞白血病和淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肥大细胞白血病；以及儿童肿瘤急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、成神经细胞瘤、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾脏肿瘤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗易感肿瘤的方法，其包括将有效量的靶向eIF4E的分离单链RNA或双链RNA寡核苷酸施用于所需要的病人。ssRNA或dsRNA寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的。就是说，本发明提供了靶向eIF4E的分离双链RNA寡核苷酸或者其药物组合物用于治疗易感肿瘤的用途。
另一方面，本发明提供了分离双链RNA寡核苷酸的化合物在制造用于抑制eIF4E表达或过表达的药物中的用途。因此，本发明提供了靶向eIF4E的分离双链RNA寡核苷酸在制造用于通过上述方法治疗易感肿瘤的药物中的用途。
本发明化合物可用于过度增殖疾病的治疗。具体而言，本发明化合物用于治疗癌症。本发明化合物在实体瘤治疗方面特别有用。因此，本发明化合物在治疗乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌和成胶质细胞瘤方面是特别有用的。本发明反义化合物在治疗实体瘤方面是特别有用的。
F.修饰如本领域中已知，核苷是碱基-糖组合体。核苷的碱基部分通常是杂环碱基(有时称为“核碱基”或简单地称为“碱基”)。此类杂环碱基最常见的两类为嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸基团的核苷。对于包含呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸基团能够连接至糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻的核苷彼此共价连接形成线性多聚体化合物。反过来，该线性化合物的各个末端能够进一步连接形成环状化合物，然而，线性化合物通常是所期望的。另外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性并因此可以以一定方式折叠产生完全或部分双链化合物。在寡核苷酸内，通常认为磷酸基团形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常键或主链是从3’至5’的磷酸二酯键。
修饰的糖和核苷间键用于本发明的寡聚反义化合物的特殊例子包括包含修饰如非天然存在核苷间键的寡核苷酸。如在本说明书中所定义，具有修饰的核苷间键的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键和不具有磷原子的核苷间键。为了本说明书的目的并且如有时候在本领域中所提到，在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰核苷酸也可以认为是寡核苷。
本发明的寡聚化合物可能具有一个或多个修饰的核苷间键。一种含磷的修饰的核苷间键是硫代磷酯核苷间键。其它其内包含磷原子的修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酯、手性硫代磷酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯包括3’-亚烷基磷酸酯、5’-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫代羰基氨基磷酸酯、硫代羰基烷基氨基磷酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、磷酰基乙酸酯(phosphonoacetate)和硫代磷酰基乙酸酯(thio phosphonoacetate)(参见Sheehan等，Nucleic Acids Research，2003，31(14)，4109-4118和Dellinger等，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，940-950)、具有正常3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、其2’-5’键连接类似物以及那些具有颠倒极性(其中一个或多个核苷间键为3’-3’、5’-5’或2’-2’键)的类似物。具有颠倒极性的寡核苷酸在最3’端核苷间键包含单一3’-3’键，即可以是无碱基单一颠倒核苷残基(核碱基丢失或者在其位置上为羟基)。各种盐、混合盐和游离酸形式可包括在内。
已经报道了N3’-P5’-氨基磷酸酯呈现出对互补RNA链的高亲和性和核酸酶抗性(Gryaznov等，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。已经成功地研究了N3’-P5’-氨基磷酸酯在体内能够特异性下调c-myc基因的表达(Skorski等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，3966-3971和Faira等，Nat.Biotechnol.，2001，19，40-44)。
教授上述含磷键制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其中每一个在本文引用作为参考。
在本发明的一些实施方案中，寡聚化合物可以具有一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，具体而言为-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称作亚甲基(甲基亚氨)或者MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。MMI型核苷间键公开于上面引用的美国专利5,489,677。酰胺核苷间键公开于上面引用的美国专利5,602,240。
一些其中不包含磷原子的核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括那些具有吗啉代键(部分从核苷糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；riboacetyl主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯主链；methyleneimino和methylenehydrazino主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链；以及其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的主链。
教授上述寡核苷制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中每一个在本文引用作为参考。
符合本发明的另一组寡聚化合物包括寡核苷酸模拟物。当用于寡核苷酸时，术语模拟物旨在包括呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键由新的基团所替代的寡聚化合物，在本领域中仅呋喃糖环的替换物也称为糖替代物。保留杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分以便与适宜靶核酸杂交。
已经显示具有出色的杂交特性的寡核苷酸模拟物的一种此类寡聚化合物称为肽核酸(PNA)。Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。PNA具有良好的杂交特性、高度生物学稳定性并且在静电学上是中性分子。在最近的一项研究中，PNA化合物用于在转基因小鼠模型中校正异常剪接(Sazani等，Nat.Biotechnol.，2002，20，1228-1233)。在PNA寡聚化合物中，寡核苷酸的糖主链由含酰胺的主链所替代，具体而言是氨乙基甘氨酸主链。核碱基直接或间接(-C(＝O)-CH2-如下所示)结合至主链酰胺部分的氮杂氮原子。教授PNA寡聚化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262，每个专利在本文引用作为参考。PNA化合物能够从Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)商业性获得。对碱基PNA主链的大量修饰在本领域中是已知的；具有缀合至一个或两个末端的一个或多个氨基酸的PNA化合物是特别有用的。具体而言，当缀合至PNA分子末端时，1-8个赖氨酸或精氨酸残基是有用的。
已经研究的另一类寡核苷酸模拟物是基于所连接的具有连接于吗啉代环的杂环碱基的吗啉代单位(吗啉代核酸)。已经报道了大量连接基团在吗啉代核酸中连接吗啉代单体单元。已经选择了一类连接基团以产生非离子寡聚化合物。非离子基于吗啉代寡聚化合物与细胞蛋白质具有非预期相互作用的可能性较小。基于吗啉代寡聚化合物是寡核苷酸的非离子模拟物，它们与细胞蛋白质形成非预期相互作用的可能性较小(Braasch等，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)。已经在斑马鱼胚胎中研究了基于吗啉代寡聚化合物(见Genesis，第30卷，第3期，2001和Heasman，J.，Dev.Biol.，2002，243，209-214)。还已经报道了基于吗啉代寡聚化合物的其它研究(见Nasevicius等，Nat.Genet.，2000，26，216-220和Lacerra等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，9591-9596)。基于吗啉代寡聚化合物公开于1991年7月23日发布的美国专利5,034,506。已经制备了吗啉代类寡聚化合物，它们具有多种不同连接单体亚单位的连接基团。连接基团可以从手性到非手性变化，并且能够从带电荷到中性变化。美国专利5,166,315公开了包括-O-P(＝O)(N(CH3)2)-O-的键；美国专利5,034,506公开了非手性吗啉代间键；并且美国专利5,185,444公开了含磷手性吗啉代间键。
另一类寡核苷酸模拟物称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于DNA或RNA分子的呋喃糖环被环己基环代替。按照经典亚磷酰胺化学已经制备了CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。已经制备并研究了充分修饰的CeNA寡聚化合物和寡核苷酸，它们具有用CeNA修饰的特定位置(见Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。一般而言，CeNA单体掺入DNA链可以增加其DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺嘌呤核苷酸与RNA和DNA互补体形成的复合物具有与天然复合物相似的稳定性。将CeNA结构掺入天然核酸结构的研究显示通过NMR和圆二色性可容易地进行构象改变。此外，CeNA掺入靶向RNA的序列对于血清是稳定的并且能够活化大肠杆菌(E.coli)RNA酶最终导致靶RNA链的断裂。
进一步的修饰包括二环糖部分如“锁核酸(Locked Nucleic Acids)”(LNA)，其中核糖基糖环的2’-羟基基团连接至糖环的4’碳原子，从而形成2’-C，4’-C-甲醛键以形成二环糖部分(综述于Elayadi等，Curr.OpinionInvens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch等，Chem.Biol.，2001，8 1-7和orum等，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；还见美国专利6,268,490和6,670,461)。该键可以是亚甲基(-CH2-)基团，其连接2’氧原子和4’碳原子，对此使用术语LNA用于二环部分；在该位置为乙烯基的情况下，使用术语ENATM(Singh等，Chem.Commun.，1998，4，455-456；ENATMMorita等，Bioorganic Medicinal Chemistry，2003，11，2211-2226)。LNA和其它二环糖类似物显示了与互补的DNA和RNA非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3-+10℃)、对3’-核酸外切降解作用的稳定性和良好的溶解特性。LNA可以从ProLigo(Paris，法国和Boulder，CO，美国)商业性获得。
已经研究的LNA异构体是_-L-LNA，其已经显示对3’-核酸外切酶具有较高的稳定性(Frieden等，Nucleic Acids Research，2003，21，6365-6372)。_-L-LNA被掺入了显示出有效反义活性的反义gapmer和嵌合体。
另一个已经制备并研究的相似二环糖部分具有通过单一亚甲基将3’-羟基与糖环的4’碳原子连接的桥，从而形成3’-C，4’-C-甲醛键(见美国专利6,043,060)。
通过2D NMR光谱法确定的LNA的构象显示，在单链LNA和双链体中LNA核苷酸的锁定方向，以产生更高数量N型构象的方式束缚磷酸酯主链(Petersen等，J.Mol.Recognit.，2000，13，44-53)。这些构象与改善的核碱基堆积相关(Wengel等，nucleosides Nucleotides，1999，18，1365-1370)。
已经显示LNA能够形成极端稳定的LNA:LNA双链体(Koshkin等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252-13253)。LNA:LNA杂交显示为最热稳定的核酸类型双链体系统，并且LNA的模拟RNA特性是在双链体水平确立的。导入3个LNA单体(T或A)显著增加对DNA互补体的解链温度(Tm＝+15/+11)。通过形成极端稳定的LNA:LNA双链体强调了LNA介导杂交作用的通用性。单体N型构象限制和LNA:RNA双链体的二级结构反映出了LNA的RNA模拟性。
LNA还与互补的DNA、RNA或具有高度热亲和力LNA形成双链体。圆二色性(CD)光谱显示包括充分修饰的LNA的双链体(特别是LNA:RNA)在结构上类似于A型RNA:RNA双链体。LNA:DNA双链体的核磁共振(NMR)检测证实了LNA单体的3’内构象。对双链DNA的认识还已经证明了通过LNA进行链侵入。对错配序列的研究表明LNA服从Watson-Crick碱基配对规则，与相应未修饰的参照链相比通常具有改进的选择性。已经显示当DNALNA嵌合体靶向荧光素酶mRNA内多种区域(5’非翻译区、起始密码子区域或编码区)时，其能够有效抑制基因表达(Braasch等，Nucleic Acids Research，2002，30，5160-5167)。
已经描述了包含LNA的有效且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638)。作者已经证明了LNA赋予反义试剂几种预期特性。LNA/DNA共聚物在血清和细胞提取物中不容易降解。在与活大鼠脑中G蛋白偶联受体信号和大肠杆菌(Escherichiacoli)中报告基因检测不同的测定系统中，LNA/DNA共聚物展示出有效的反义活性。还已经实现了LNA通过Lipofectin介导向活的人乳腺癌细胞的有效递送。涉及LNA的更加成功的体内研究已经显示了敲低大鼠δ阿片受体而无毒性(Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，5633-5638)并且在另一个研究中显示了RNA聚合酶II大亚基翻译的阻断(Fluiter等，Nucleic Acids Res.，2003，31，953-962)。
已经描述了LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，以及其寡聚化作用和核酸识别特性(Koshkin等，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。LNA及其制备还描述于WO98/39352和WO 99/14226。
已经制备了最初的LNA类似物，硫代磷酸酯-LNA和2’-硫代-LNA(Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。还已经描述了包含寡脱氧核糖核苷酸双链体的锁核苷类似物的制备，它们用作核酸聚合酶的底物(Wengel等，WO 99/14226)。此外，在本领域中已经描述了2’-氨基-LNA(一个新的构象限制的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成(Singh等，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。另外，已经制备了2’-氨基-和2’-甲氨基-LNA并且先前已经报道了具有互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
已经制备并研究了的另一个根据本发明的寡核苷酸模拟物是苏糖核酸。该寡核苷酸模拟物是基于苏糖核苷而不是核糖核苷。对(3’，2’)-_-L-苏糖核酸(TNA)的最初兴趣直接针对这样一个问题，即所存在的DNA聚合酶是否复制TNA。发现某些DNA聚合酶能够复制有限长度的TNA模板(报道于C&EN/2003年1月13日)。在另一个研究中，已经确定了TNA能够反向平行地与互补DNA、RNA和TNA寡核苷酸进行Watson-Crick碱基配对(Chaput等，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，856-857)。
在一个研究中，制备了(3’，2’)-_-L-苏糖核酸并将其与2’和3’酰胺类似物进行了比较(Wu等，Organic Letters，2002，4(8)，1279-1282)。已表明酰胺类似物以与RNA/DNA结合强度可比的强度结合至RNA和DNA。
已经制备了其它寡核苷酸模拟物以包括二环和三环核苷类似物(见Steffens等，Helv.Chim.Acta，1997，80，2426-2439；Steffens等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，3249-3255；Renneberg等，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5993-6002和Renneberg等，Nucleic Acids Res.，2002，30，2751-2757)。这些修饰的核苷类似物已经使用亚磷酰胺方法进行了寡聚化并且所得到的包含三环核苷类似物的寡聚化合物已经显示出与DNA、RNA和其自身杂交时增加的热稳定性(Tm)。已经证明包含二环核苷类似物的寡聚化合物的热稳定性接近于DNA双链体的热稳定性。
另一类寡核苷酸模拟物称为磷酸单酯核酸，其在主链中掺入了磷基团。已报道该类寡核苷酸模拟物(反义寡核苷酸、核酶、有意寡核苷酸和三联体形成寡核苷酸)在抑制基因表达领域具有有用的物理特性和生物特性和药理学特性，该类寡核苷酸模拟物可以作为探针用于核酸检测并且作为辅助物用于分子生物学。已经制备了依据本发明的其它寡核苷酸模拟物，其中环丁基环代替了天然存在的呋喃基环。
寡聚化合物还可以包含一个或多个替代的糖部分。适宜化合物可以在2’位置包含以下基团之一OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或非取代的C1-C10烷基或者C2-C10烯基和炔基。特别适合的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)，其中n和m为从1至大约10。其它寡核苷酸在2’位置包含以下基团之一C1-C10低烷基、取代低烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环芳烷基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA断裂基团、报告基团、插入剂、改善寡核苷酸药物代谢动力学的基团或者具有相似特性的其它取代基。一种修饰包括2’-甲氧乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为’-O-(2-甲氧乙基)或者2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧烷氧基。另一个修饰包括2’-二甲氨基氧乙氧基和2’-二甲氨基氧乙氧基乙氧基，其中如在下文中的实施例中所述2’-二甲氨基氧乙氧基即O(CH2)2ON(CH3)2基(也称为2’-DMAOE)，并且如在下文中的实施例中所述2’-二甲氨基氧乙氧基乙氧基(本领域中也称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或者2’-DMAEOE)即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-O-CH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-丙烯基(2’-CH2-CH＝CH2)、2’-O-丙烯基(2’-O-CH2-CH＝CH2)和2’-氟代(2’-F)。2’-修饰可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。一个2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。在寡核苷酸上其它位置也可以进行相似修饰，具体而言是3’末端核苷酸上或者2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。反义化合物还可以具有糖模拟物，例如代替呋喃戊糖的环丁基部分。教授此类修饰糖结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747和5,700,920，此处其中每一个都整体引用作为参考。
在本发明的一个方面，寡聚化合物包括经合成修饰以诱导3’-内糖构象的核苷。核苷中可以掺入杂环碱基、糖部分或两者的合成修饰以诱导预期的3’-内糖构象。这些修饰的核苷用于模拟RNA样核苷从而使得能够在维持预期的3’-内构象几何形状的同时增强寡聚化合物的特殊特性。对于作为RNA干扰必要条件(例如激发)的RNA型双链体(A型螺旋，主要是3’-内)是明显优选的，由2’-脱氧-2’-F-核苷组成的双链体能有效地在秀丽隐杆线虫系统中激发RNAi反应，这一事实部分支持了以上观点。通过使用更稳定的3’-内核苷而增强的特性包括但不限于通过修饰蛋白质结合、蛋白质解离率、吸收和清除而调节药物代谢动力学特性；调节核酸酶稳定性以及化学稳定性；调节寡聚物的结合亲和力和特异性(对酶以及对互补序列的亲和力和特异性)；和增加RNA断裂效率。本发明提供了RNAi的寡聚触发物，其中寡聚触发物具有以此种方式修饰而赋予其C3’-内型构象的一个或多个核苷。
核苷构象受到各种因素的影响，包括在呋喃戊糖的2’、3’或4’-位置的取代。负电取代通常倾向于中轴位置，而空间要求取代通常倾向于赤道位置(Principles of Nucleic Acid Structure，Wolfgang Sanger，1984，Springer-Verlag)。如下面图2中举例说明，在维持2’-OH作为识别元件的同时能够实现2’位置的修饰以赋予3’-内构象(Gallo等，Tetrahedron，2001，57，5707-5713；Harry-O’kuru等，J.Org.Chem.，1997，62(6)，1754-1759和Tang等，J.Org.Chem.，1999，64，747-754)。
备选地，如以2’脱氧-2’F-核苷举例说明，优先选择通过删除2’-OH实现3’-内构象(Kawasaki等，J.Med.Chem.，1993，36，83l-841)，其通过在中轴位置放置带负电的氟原子而实现3’-内构象。核糖环的其它修饰例如在4’-位置取代以产生4’-F修饰的核苷(Guillerm等，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters，1995，5，1455-1460；和Owen等，J.Org.Chem.，1976，41，3010-3017)或者例如产生methanocarba核苷类似物的修饰(Jacobson等，J.Med.Chem.Lett.，2000，43，2196-2203；和Lee等，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，2001，11，1333-1337)也诱导优先产生3’-内构象。沿着相似的线索，RNAi反应的寡聚触发物可以由一个或多个以此种方式修饰的核苷组成从而使该构象锁定成C3’-内型构象，即锁核酸(LNA，Singh等，Chem.Commun.，1998，4，455-456)和乙烯基桥连核酸(ethylenebridged Nucleic Acids)(ENA，Morita等，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters，2002，12，73-76.)。
通过各种方法例如分子动力学计算、核磁共振波谱学和CD测量法能够评价修饰的核苷及其寡聚物的一种构象。因此，在寡聚情况下的A型双链体几何形状被选择用于本发明修饰的寡核苷酸中。符合本发明的大量修饰核苷的合成在本领域中是已知的(见例如Chemistry of Nucleosides andNucleotides 1-3卷，Leroy B.Townsend编著，1988，Plenum出版社，和下面实施例部分)。
用于描述同型双链体核酸构象几何学的术语对于RNA是“A型”并且对于DNA为“B型”。从核酸纤维的X射线衍射分析确定了RNA和DNA双链体各自的构象几何学(Arnott和Hukins，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1970，47，1504)。一般而言，RNA:RNA双链体比DNA:DNA双链体更加稳定并具有更高的解链温度(Tm)(Sanger等，Principles of NucleicAcid Structure，1984，Springer-Verlag；New York，NY.；Lesnik等，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等，Nucleic Acids Res.，1997，25，2627-2634)。增加的RNA稳定性归功于几种结构特点，最值得注意的是源自A型几何形状的改善了的碱基堆积相互作用(Searle等，Nucleic AcidsRes.，1993，21，2051-2056)。RNA中2’羟基的存在使糖偏移向C3’内折叠，即也命名为Northern折叠，这使得双链体易于形成A型几何形状。另外，RNA的2’羟基能够形成水介导的氢键网状结构，该结构有助于稳定RNA双链体(Egli等，Biochemistry，1996，35，8489-8494)。另一方面，脱氧核酸更偏向于C2’内糖折叠，即也称作Southern折叠，该结构被认为产生较小稳定性的B型几何形状(Sanger，W.(1984)Principles of Nucleic AcidStructure，Springer-Verlag，New York，NY)。如文中所使用，B型几何形状包括C2’-内折叠和O4’-内折叠。这与Berger等，Nucleic Acids Research，1998，26，2473-2480相一致，Berger等指出考虑到呋喃糖构象产生B型双链体，那么还应该考虑到呋喃糖构象也有助于产生O4’内折叠。
然而，DNA:RNA杂合体双链体通常没有纯RNA:RNA双链体稳定，并且依赖于其序列，DNA:RNA杂合体双链体可以比DNA:DNA双链体更稳定或者没有DNA:DNA双链体稳定(Searle等，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。杂合体双链体的结构是A和B型几何形状之间的中间体，这可以导致弱的堆积相互作用(Lane等，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306；Fedoroff等，J.Mol Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez等，Biochemistry，1995，34，4969-4982；Horton等，J.Mol.Biol.，1996，264，521-533)。靶RNA和合成序列之间形成的双链体的稳定性是诸如但不限于反义和RNA干扰治疗的关键，因为这些治疗机制需要合成寡聚体链结合至靶RNA链。关于反义，mRNA的有效抑制需要反义DNA与mRNA具有非常高的结合亲和力。否则合成寡聚体链与靶mRNA链之间预期的相互作用将很少发生，这使得效率降低。
一种常规使用的修饰糖折叠的方法是用影响糖几何形状的取代基代替2’-位置的糖。对环构象的影响依赖于2’位置取代基的性质。已经研究了大量不同的取代基以确定其糖折叠作用。例如，已经对2’卤代进行的研究显示2’氟代衍生物呈现最大量(65％)C3’内型，并且2’碘代呈现最少量的(7％)C3’内型。腺苷(2’-OH)对脱氧腺苷(2’-H)的总数分别为36％和19％。而且，腺苷二聚体(2’-脱氧-2’-氟腺苷-2’-脱氧-2’-氟腺苷)的2’-氟代基的作用进一步与堆积构象的稳定化作用相关。
如所期望，通过用2’-F基替换2’-OH基能够增强相对双链体稳定性，从而增加C3’-内的数量。可以假定2’-F键的高度极性特性和对于C3’内折叠的极端偏性可以稳定A型双链体中的堆积构象。来自UV减色性、园二色性和1H NMR的数据还表明堆积程度随着卤素取代基负电性的降低而降低。而且，与B型双链体相比，糖部分2’位置处的立体体积更适应于A型双链体。因此，二核苷一磷酸盐3’末端上的2’取代基认为对堆积构象产生许多效应空间排斥、呋喃糖折叠偏性、静电排斥、疏水吸引和氢键合能力。这些取代基效应被认为是由取代基的分子大小、负电性和疏水性决定的。互补链的解链温度也随着2’取代的二磷酸腺苷而增加。构象的3’内偏性或取代基的存在是否负责结合的增加还不清楚。然而，使用3’内构象能够实现相邻碱基更大的重叠(堆积)。
增加靶向RNA靶链的修饰寡核苷酸中C3’内糖的百分数将预先组织该链使其结合至RNA。在已经报道并在文献中研究的几种糖修饰中，负电取代基如2’-氟或2’-烷氧基的掺入将糖构象转化为3’内(northern)折叠构象。这将掺入此类修饰的寡核苷酸预先组织成具有A型构象几何学。该A型构象导致寡核苷酸对靶RNA链的结合亲和力增加。
符合本发明并使所得双链体具有A型构象特征(3’-内)的典型2’取代基包括2’-O-烷基、2’-O-取代烷基和2’-氟取代基。适宜的取代基为各种烷基和芳香基醚和硫醚、胺以及单烷基和二烷基取代的胺。更加期望的是，在一个或多个单体亚基(核苷是适宜的)多重位点和核苷内键上对一种和多种本发明寡聚化合物进行多重修饰，以增强特性例如(但不限于)在所选应用中的活性。
天然的和修饰的核碱基寡聚化合物还可以包括核碱基(在本领域中通常称为杂环碱基或简称为“碱基”)修饰或取代。如文中所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔(-C≡C-CH3)尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-硫羟、8-硫代烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5，4-b)(1，4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5，4-b)(1，4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹(G-clamp)例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5，4-b)(1，4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4，5-b)吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并(3’，2’:4，5)吡咯并(2，3-d)嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基还可以包括那些其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环所代替的核碱基，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-羟基吡啶。其它核碱基包括公开于美国专利号3,687,808中的那些核碱基、公开于聚合物科学与技术的简明百科全书(The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编著，John Wiley & Sons，1990)中的那些核碱基、由Englisch等(AngewandteChemie，International Edition，1991，30，613)所公开的那些核碱基，以及由Sanghvi，Y.S.(Antisense Research and Applications，第15章，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编著，CRC出版社，1993)所公开的那些核碱基。这些核碱基中的某些核碱基对于增加本发明化合物的结合亲和力是特别有用的。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代物可使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃并且是目前适宜的碱基取代物，甚至在与2’-O-甲氧乙基糖修饰相组合时更加适宜。
教授某些上面所提到修饰核碱基和其它修饰核碱基制备的代表性美国专利包括但不限于上面所提到的美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096和5,681,941，其中每一个在文中引用作为参考，并且美国专利5,750,692也在文中引用作为参考。
本发明寡聚化合物还可以包括代替一个或多个杂环碱基部分的多环杂环化合物。以前已经报道了大量三环杂环化合物。这些化合物通常用于反义应用以增加修饰链对靶链结合特性。大多数已研究的修饰靶向鸟苷，因此它们被称为G-夹或胞苷类似物。与第二链上鸟苷形成3氢键的代表性的胞嘧啶类似物包括1，3-二氮吩噁嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝H)(Kurchavov等，nucleosides and Nucleotides，1997，16，1837-1846)、1，3-二氮吩噻嗪-2-酮(R10＝S，R11-R14＝H)(Lin等，J.Am.Chem.Soc.，1995，117，3873-3874)和6，7，8，9-四氟-1，3-二氮吩噁嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝F)(Wang等，Tetrahedron Lett.，1998，39，8385-8388)。这些碱基修饰在掺入寡核苷酸后显示出能够与互补鸟嘌呤杂交，并且后者还显示出能够与腺嘌呤杂交并通过延伸堆积相互作用增强螺旋的热稳定性(还参见2002年5月24日提交的标题为“修饰的肽核酸”的序列号10/155,920的美国专利申请和2002年5月24日提交的标题为“抵抗核酸酶的嵌合体寡核苷酸”的序列号10/013,295的美国专利申请，两者在此处整体引用作为参考)。
当胞嘧啶类似物/取代物具有连接于刚性1，3-二氮吩噁嗪-2-酮支架(R10＝O，R11＝-O-(CH2)2-NH2，R12-14＝H)氨乙氧基部分时，观察到了进一步稳定螺旋的特性(Lin等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，8531-8532)。结合研究证明单一掺入能够增强模型寡核苷酸与其互补靶DNA或RNA的结合亲和力，相对5-甲基胞嘧啶(dC5me)ΔTm高达18℃，然而，对于单一修饰这是已知最高的亲和力增强作用。另一方面，螺旋稳定性的增加不影响寡核苷酸的特异性。
能够用于本发明的其它三环杂环化合物及其使用方法公开于2000年5月22日发布的美国专利序号6,028,183，和1999年12月28日发布的美国专利序列号6,007,992，它们的内容在文中整体引用作为参考。
吩噁嗪衍生物的增强结合亲和力及其未受影响的序列特异性使得它们成为用于研发基于反义的更有效药物的有价值核碱基类似物。事实上，来自体外实验的有价值的数据已经证明包含吩噁嗪取代的七核苷酸能够活化RNA酶H、增强细胞摄入并呈现增加的反义活性(Lin等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，8531-8532)。在形成G-夹情况下活性增强作用甚至更加显著，因为单一取代物显示能显著提高20mer 2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸的体外效能(Flanagan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，3513-3518)。然而，为了优化寡核苷酸设计和更好地理解这些杂环修饰对生物学活性的影响，评价它们对寡聚物核酸酶稳定性的影响是重要的。
可用作杂环碱基的其它修饰多环杂环化合物公开于但不限于上面提出的美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,434,257；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,646,269；5,750,692；5,830,653；5,763,588；6,005,096和5,681,941，以及2001年11月28日提交的美国专利申请序列号09/996,292，每项专利在文中引用作为参考。
共轭物本发明反义化合物的另一种修饰涉及将能够增强寡核苷酸活性、细胞分布或细胞摄入的一种或多种部分或共轭物化学连接至寡聚化合物。这些部分或共轭物可以包括共价结合至功能基团的共轭基团，如伯羟基或仲羟基。本发明的共轭基团包括插入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药效学特性的基团，以及增强寡聚物药物代谢动力学特性的基团。典型的共轭基团包括胆固醇、脂类、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效学特性的基团包括改善摄入、增强降解抗性和/或加强与靶核酸进行序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药物代谢动力学特性的基团包括改善本发明化合物摄入、分布、代谢或分泌的基团。代表性共轭基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请PCT/US92/09196和美国专利6,287,860，其全部公开内容在文中引用作为参考。共轭物部分包括但不限于脂类部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂肪族链例如癸二酸或十一烷基残基、磷脂例如双十六烷基-rac-丙三醇或三乙基铵1，2-双-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸酯、聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、软酯酰部分，或者十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发明反义化合物还可以与活性药物缀合，例如阿司匹林、新双豆素、苯基丁氮酮、布洛芬、噻丙芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-吡喃洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、甲酰四氢叶酸、苯噻嗪、氯噻嗪、diazepine、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药物、抗糖尿病剂、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸药物共轭物及其制备描述于美国专利申请09/334,130(1999年6月15日提交)，该申请在文中整体引用作为参考。
教授此类寡核苷酸共轭物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，每项专利在文中引用作为参考。
寡聚化合物还能够进行修饰使其具有一个或多个稳定基团，稳定基团通常附加于寡聚链的一个或两个末端以增强诸如核酸酶稳定性的特性。稳定基团包括帽子结构。“帽子结构或末端帽子部分”意思是指已经掺入寡核苷酸的任一个末端的化学修饰物(参见例如Wincott等，WO 97/26270，在本文引用作为参考)。这些末端修饰物保护具有末端核酸分子的寡聚化合物不被核酸外切酶降解，并且可能有助于细胞内递送和/或定位。帽子可以存在于5’末端(5’帽子)或者3’末端(3’-帽子)，或者可以存在于单链的两个末端或双链化合物两条链的一个或多个末端。该帽子架构不能与存在于天然mRNA分子5’端的倒转甲基鸟苷“5’帽子”相混淆。在非限定性实施例中，5’帽子包括倒转无碱性残基(部分)、4’，5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏型呋喃戊糖基核苷酸；无环3’，4’-断裂核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-倒转核苷酸部分；3’-3’-倒转无碱性部分；3’-2’-倒转核苷酸部分；3’-2’-倒转无碱性部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3’-亚磷酰胺；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3’-磷酸酯；3’-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；桥连或非桥连甲基磷酸酯部分(更多详细内容参见Wincott等，国际PCT公开号WO 97/26270，在本文引用作为参考)。对于siRNA构建体，5’端(5’帽子)通常是(但不限于)5’-羟基或5’-磷酸。
特别适宜的3’帽子结构包括例如4’，5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5’-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏型呋喃戊糖基核苷酸；无环3’，4’-断裂核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5’-5’-倒转核苷酸部分；5’-5’-倒转无碱性部分；5’-亚磷酰胺；5’-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；桥连和/或非桥连5’-亚磷酰胺、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥连非桥连甲基磷酸酯和5’-巯基部分(更详细内容参见Beaucage和Tyer，1993，Tetrahedron 49，1925；在本文引用作为参考)。
其它能够用于在寡聚化合物一个或两个末端加帽以赋予核酸酶稳定性的3’和5’稳定基团包括那些公开于2003年1月16日公布的WO 03/004602的那些稳定基团。
嵌合化合物不必在给定反义化合物的全部位置一律进行修饰，并且事实上一个以上的上述修饰可以掺入单一化合物中或者甚至掺入反义化合物内的单一核苷中。
本发明还包括为嵌合化合物的反义化合物。在本发明的上下文中，“嵌合”反义化合物或“嵌合体”是单链或双链反义化合物，例如寡核苷酸，它们包含两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元(即以寡核苷酸化合物为例单体单元是核苷酸)组成。嵌合反义寡核苷酸是反义化合物的一种形式。这些寡核苷酸一般包含至少一个修饰过的区域，以便赋予寡核苷酸增加的抗核酸酶降解抗性、增加的细胞摄入、电荷变化、增加的稳定性和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸另外区域可以作为RNA酶或其它酶的底物。作为例子，RNA酶H是断裂RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的活化导致RNA靶标的断裂，从而极大地增强寡核苷酸介导基因表达抑制的效率。RNA:RNA杂合体的断裂可以通过核糖核酸内切酶(例如断裂细胞和病毒RNA的RNA酶III或RNA酶L)的作用以相似的方式实现。可以通过本领域已知的电泳和相关核酸杂交技术(如果必要)常规检测RNA靶标的断裂产物。
本发明嵌合反义化合物可以形成如上所述的两种或多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。在本领域中此类化合物还称为杂化物或gapmer。教授此类杂化物结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922，每个专利在文中整体引用作为参考。
盐、前体药物和生物等效物本发明这些反义化合物包括任何可药用盐、酯或此类酯的盐，或者任何其它化合物，当将其施用于包括人在内的动物时，化合物能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，公开还可以延伸至本发明化合物的前体药物和可药用盐、此类前体药物的可药用盐和其它生物等效物。
术语“前体药物”指以无活性或低活性形式制备治疗剂，其在体内或其细胞内通过内源性酶或其它化学物和/或条件下可以转化为活性形式(即药物)。具体而言，按照公开于Gosselin等的WO 93/24510(1993年12月9日公布)和Imbach等的WO 94/26764中的方法，可以将本发明寡核苷酸前体药物形式制备成SATE((S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸盐)衍生物。
术语“可药用盐”是指本发明化合物的生理学上或药学上可以接受的盐即保留母体化合物的期望生物学活性且不产生不期望的毒理学效应。
可药用碱加成盐由金属或胺形成，例如碱和碱土金属或有机胺。用作阳离子的金属的例子为钠、钾、镁、钙等等。适宜的胺的例子是N，N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因(见，例如Berge等，“Pharmaceutical Salts，”J.ofPharma Sci，1977，66，1-19)。通过将游离酸形式与足量预期碱相接触以产生盐而常规方式制备了所述酸性化合物的碱加成盐。通过将盐形式与酸相接触并以常规方式分离游离酸可以再生游离酸形式。游离酸形式与其各自的盐形式在某些物理特性(如在极性溶剂中的溶解性)上稍微不同，但是为了本发明的目的这些盐在其它方面与其各自游离酸是等效的。如文中所使用，“药物加成盐”包括本发明组合物成份之一的酸形式的可药用盐。它们包括胺的有机或无机酸盐。酸性盐为盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它适宜的可药用盐对于本领域那些技术人员是已知的并且包括多种无机和有机酸的碱性盐，例如具有无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；具有有机的羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸或者N-取代氨基磺酸，例如醋酸、丙酸、羟基乙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、双羟萘酸、烟酸或异烟酸；并且具有氨基酸如自然界中参与蛋白质合成的20种α-氨基酸(例如谷氨酸或天冬氨酸)，还有苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、N-环己氨基磺酸(对于环磺酸盐的形成)，或者具有其它酸有机化合物例如抗坏血酸。化合物的可药用盐还可以用可药用阳离子进行制备。适宜的可药用阳离子对于本领域的技术人员是已知的并且包括碱性、碱土金属、铵和季铵阳离子。也可使用碳酸盐或氢碳酸盐。
对于寡核苷酸，可药用盐的例子包括但不限于(a)由阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和亚精胺等所形成的盐；(b)由无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成盐；(c)由有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等等形成的盐；和(d)由元素阴离子例如氯、溴和碘形成的盐。反义寡核苷酸的钠盐是有用的并且公认可治疗性施用于人。在另一个实施方案中，还提供了dsRNA化合物的钠盐。
G.制剂本发明化合物还可以与其它分子、分子结构或化合物混合物(例如脂质体、受体靶向分子、口腔、直肠、局部或其它制剂)相混合、封装入胶囊、缀合或联合，以辅助摄入、分布和/或吸收。教授此类摄入、分布和/或吸收辅助制剂制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，每一专利在文中引用作为参考。
本发明还包括包含本发明反义化合物的药物组合物和制剂。取决于期望局部治疗还是全身治疗以及所治疗的区域，本发明药物组合物可以以多种方式施用。施用可以是局部的(包括眼部以及包括阴道和直肠递送的粘膜)、肺部，例如通过粉剂或烟雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口腔或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或者颅内例如鞘膜内或心室内施用。具有至少一个2’-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸被认为对于口服施用特别有用。已经发现穿透促进剂可增强口服施用寡核苷酸的生物利用率。穿透促进剂包括表面活性剂、胆盐、脂肪酸、螯合剂或非螯合表面活性剂。癸酸(C10)和/或月桂酸(C12)及其盐是其中有效增强寡核苷酸生物利用率的脂肪酸；熊脱氧胆酸(UDCA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)是其中有效增强寡核苷酸生物利用率的胆盐。缓释(例如脉冲或脉动式释放)制剂和持续释放制剂对于增强生物利用率也是有用的。可以加入生物粘合材料以将药物载体颗粒粘附于粘膜以增强摄入。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠剂等等可以是必需的或期望的。涂敷的避孕套、手套等等也是有用的。
按照制药工业中熟知的常规技术可以制备本发明的药物制剂，其可以方便地为单位剂量形式。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂相联系的步骤。一般而言，通过均匀且紧密地使活性成分与液体载体或精细固体载体或两者组合并且然后(如果必要)使产物成形来制备制剂。
本发明组合物可以按配方制成多种可能剂型的任意一种，例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂和灌肠剂。本发明组合物还可以按配方制成水溶液、非水溶液或混合介质中的悬浮液。水溶液悬浮液还进一步包括增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。
本发明药物组合物包括但不限于溶液、乳剂、泡沫和含脂质体制剂。本发明药物组合物和制剂可以包含一种或多种穿透促进剂、载体、赋形剂或者其它活性或非活性成分。
乳剂一般是一种液体以微滴形式(直径通常超过0.1μm)分散于另一种液体的异质系统。除了分散相之外，乳剂可以包含另外的成分和活性药物，它们可作为存在于水相、油相或者其自身作为单独相的溶液。作为本发明的实施方案还包括微乳剂。乳剂及其使用在本领域中是众所周知的并且进一步描述于美国专利6,287,860，该专利在文中整体引用作为参考。
本发明制剂包括脂质体制剂。如本发明中所使用，术语“脂质体”意思是指由以一层球状双分子层或多层双分子层排列的两亲性脂类组成的小囊泡。脂质体可以是单层的或多层的囊泡，其具有由亲脂性物质形成的膜和包含所递送组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其可与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。pH敏感或带负电的脂质体可以诱陷DNA而不是与其形成复合物。阳离子和非阳离子脂质体都已经用于将DNA递送至细胞。
脂质体还包括“空间稳定”脂质体，如文中所使用，该术语是指包含一种或多种特化脂类的脂质体，当特化脂类掺入脂质体时导致循环寿命相对于缺乏此类特化脂类的脂质体有所增强。空间稳定脂质体的例子是那些在脂质体中的一部分的形成囊泡脂类部分包含一个或多个糖脂或者由一个或多个亲水多聚物(如聚乙二醇(PEG)部分)衍生的脂质体。脂质体及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在本文整体引用参考。
本发明的药物制剂和组合物还包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的用途在本领域是众所周知的。表面活性剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在本文整体引用参考。
在一个实施方案中，本发明采用各种穿透促进剂以影响核酸(特别是寡核苷酸)的有效递送。穿透促进剂除了辅助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜以外还增强亲脂性药物的渗透。穿透促进剂可以归类属于五大类之一，该五大类即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。穿透促进剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在本文整体引用参考。作为穿透促进剂的多种脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸(C12)、癸酸(C10)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二葵酸盐、三葵酸盐、recinleate、油酸单甘油酯(另一个名称为1-单油酰-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸(arichidonic acid)、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、单酰甘油和二酰甘油及其生理可接受盐(即油酸盐、月桂酸盐、葵酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，82，91-192；Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33；El-Hariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。一些脂肪酸的实例为以0.5-5％的浓度单独使用或组合使用的癸酸钠(C10)和月桂酸钠(C12)。
代表性的胆盐包括例如胆酸(或其可药用钠盐胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(glucholic acid)(葡糖胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘脱氧胆酸(甘脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺酸-24，25-二氢羧链孢酸钠(STDHF)、甘氨酸二氢羧链孢酸钠和聚氧化乙烯-9-月桂醚(POE)(Lee等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92页；Swinyard，第39章，在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编，Mack出版公司，Easton，PA，1990，782-783页；Muranishi，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto等，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。UDCA和CDCA已经有效地用作寡核苷酸的穿透促进剂，并且组合使用时甚至更加有效。
包含一种或多种胆盐和一种或多种脂肪酸的复合物制剂与月桂酸盐和葵酸盐组合时甚至更加有效，特别是CDCA(有或没有UDCA)(美国申请序列号09/108,673，Teng和Hardee，1998年7月1日提交)。
本领域技术人员会认识到制剂通常是根据其旨在用途即施用途径设计。
用于局部施用的制剂包括那些其中本发明寡核苷酸是与局部递送剂如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、甾类化合物、螯合剂和表面活性剂相混合的制剂。脂类和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC，二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子性的(例如二油酰四甲铵丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。
对于局部或其它施用，本发明寡核苷酸可以装入脂质体胶囊或者可以与其形成复合物，具体而言是与阳离子脂质体形成复合物。备选地，寡核苷酸还可以与脂类特别是阳离子脂类形成复合物。脂肪酸和酯、其可药用盐及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在文中整体引用作为参考。局部制剂详细描述于1999年5月20日提交的美国专利申请09/315,298，该专利在文中整体引用作为参考。
口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微颗粒、纳米颗粒、水或非水溶性介质的悬浮剂或溶液、胶囊、凝胶胶囊、冲剂、片剂或微片剂。也可使用增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。口服制剂是那些其中本发明寡核苷酸与一种或多种穿透促进剂表面活性剂和螯合剂联合施用的口服制剂。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。胆酸/盐和脂肪酸及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在文中整体引用作为参考。穿透促进剂组合也是适宜的，例如脂肪酸/盐与胆酸/盐的组合。一种组合是月桂酸钠盐、癸酸和UDCA。另外的穿透促进剂包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-十六烷醚。本发明的寡核苷酸可以以颗粒形式口服递送，颗粒形式包括喷雾干颗粒或者复合形成微小颗粒或纳米颗粒。寡核苷酸复合剂及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860，该专利在文中整体引用作为参考。寡核苷酸的口服制剂及其制备详细描述于美国专利申请09/108,673(1998年7月1日提交)、09/315,298(1999年5月20日提交)和10/071,822(2002年2月8日提交)，它们每一个在本文全部整合作为参考。
用于胃肠外、鞘膜内、心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲液、稀释剂和其它适宜添加剂例如(但不限于)穿透促进剂、载体化合物和其它可药用载体或赋形剂。
本发明的某些实施方案提供了包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种通过非反义机制起作用的其它化疗剂的药物组合物。此类化疗剂的实例包括但不限于癌症化学治疗药物例如柔红菌素、道诺酶素、更生霉素、阿霉素、表阿霉素、去甲氧柔红霉素、去羟阿霉素、博来霉素、麦磺磷芥、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、强的松、羟孕酮、睾酮、三苯氧胺、氮烯咪胺、甲基苄肼、六甲密胺、五甲密胺(pentamethylmelamine)、米托蒽醌、胺苯吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、喷司他丁、4-羟基过氧化环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲喋呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、长春花新碱、长春花碱、鬼臼亚乙苷(VP-16)、曲美沙特、伊立替康、抑拓替康、吉西他滨(gemcitabine)、表鬼臼毒噻吩糖甙、顺铂、培美曲塞(pemetrexed)和己烯雌酚(DES)。当与本发明化合物一起使用时，此类化疗剂可以单独(例如5-FU和寡核苷酸)、相继(例如5-FU和寡核苷酸使用一段时间，随后使用MTX和寡核苷酸)或者与一种或多种其它此类化疗剂组合使用(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射治疗和寡核苷酸)。抗炎药(包括但不限于非类固醇类抗炎药和糖皮质激素)和抗病毒药(包括但不限于三氮唑核苷(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦)也可以与本发明的组合物进行组合。反义化合物和其它非反义药物的组合也处于本发明的范围内。两种或多种组合的化合物可以一起使用或相继使用。
在另一个相关的实施方案中，本发明的组合物可以包含一种或多种靶向第一个核酸的反义化合物(特别是寡核苷酸)和一种或多种靶向第二个核酸靶的另外的反义化合物。备选地，本发明组合物可以包含两种或多种靶向同一核酸靶的不同区域的反义化合物。反义化合物的大量实例在本领域中是已知的。两种或多种组合化合物可以一起使用或相继使用。
H.剂量确定如文中所使用，术语“患者”是指患有一种或多种与eIF4E表达或过表达相关的疾病的哺乳动物。应当理解，最期望的患者为人。还应当理解本发明特别涉及对哺乳动物eIF4E表达或过表达的抑制作用。
应该认识到，本领域的技术人员可以通过用有效量的本发明化合物治疗目前患有该类疾病的患者来影响与eIF4E表达或过表达相关的疾病。因此，术语“治疗”旨在指全部过程，其中有本文所述疾病进展的减慢、打断、阻止、控制、延缓和停止，但是不必指所有症状的全部消除。
如文中所使用，本发明化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指有效治疗或预防文中所述疾病的量。
相信治疗组合物的制剂及其随后的施用(剂量确定)为本领域技术人员所掌握。剂量确定依赖于所治疗疾病状态的严重性和反应性，治疗过程从几天持续到几个月，或者直到痊愈或者实现疾病状态减轻。从患者体内药物积累的测量能够计算最佳剂量方案。普通技术人员能够容易地确定最适剂量、剂量确定方法和重复率。最佳剂量依赖于各个寡核苷酸的相对潜能而改变，并且通常能够基于在体外或体内动物模型中发现有效的EC50进行估计。通常，剂量为每公斤体重0.0001μg至100g，并且可以每天、每周、每月或每年一次或多次给药，或者甚至每2-20年给药一次。在一些实施方案中，剂量为每公斤体重0.0001μg至100g、每公斤体重0.001μg至10g、每公斤体重0.01μg至1g、每公斤体重0.1μg至100mg、每公斤体重1μg至10mg、每公斤体重10μg至1mg或者每公斤体重100μg至500μg，并且可以每天、每周、每月或每年一次或多次给药，或者甚至每2-20年给药一次。对于双链化合物，必须计算剂量以解决第二条链(对于包含两条链的化合物)核酸载量或者其它核酸长度(对于自身互补的化合物)的增加。本领域普通技术人员能够容易地基于所测量的体液或组织中药物滞留时间和浓度来计算剂量重复率。
对于寡核苷酸的吸收、分布、代谢和排泄(统称为ADME)已经进行了大量工作。因为给定化学性质(例如具有P＝S主链的所有2’MOEgapmer)的全部顺序具有相似的物理/化学特性如水溶解度、分子量(大约7000)和pKa，所以ADME是顺序不依赖的。通过分布至组织，主要为(但不限于)肝、肾、脾和骨髓，寡核苷酸相对快速地从血浆中去除(分布半寿期大约1小时、24小时分布完全)。已经在组织包括肾、肝、骨髓、脂肪组织、脾、淋巴结、肺(通过气溶胶)和中枢神经系统(脑室内给药)中证明了药物代谢动力学和药效学之间的强相关。对于第一代反义药物(具有硫代磷酸酯主链的2’-脱氧)组织半寿期为1-5天，而对于具有硫代磷酸酯主链的2’-MOE缺口(gap)寡核苷酸组织半寿期为10-28天。Henry等，Curr.Opin.Invest.Drugs，2001，2，1444-1449。
在成功治疗之后，可以期望对患者进行持续治疗以防止疾病状态复发，其中寡核苷酸以持续剂量施用，剂量范围为每公斤体重0.0001μg至100g，每天一次或多次施用至每20年一次施用。
虽然确信已经按照其实施方案对本发明进行了特异性描述，但是以下实施例仅用于举例说明本发明并且无意于限制本发明。在本申请中所引用的每一参考文献、GenBank登录号等等在文中整体引用作为参考。
实施例实施例1核苷亚磷酰胺的合成如美国专利6,426,220和公布的PCT WO 02/36743中所描述制备以下化合物，包括amidites及其中间体；用于5-甲基dC amidite的5’-O-二甲氧三苯甲基-胸腺嘧啶中间体、用于5-甲基dC amidite的5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-脱氧-5-甲基胞苷中间体、用于5-甲基dC amidite的5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-脱氧-N4-苯甲酰基-5-甲基胞苷前末端基中间体、(5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-脱氧-N4-苯甲酰基-5-甲基胞苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N二异丙基亚磷酰胺(5-甲基dC amidite)、2’-氟脱氧腺苷、2’-氟脱氧尿苷、2’-氟尿苷、2’-氟脱氧胞苷、2’-O-(2-甲氧乙基)修饰的amidites、2’-O-(2-甲氧乙基)-5-甲基尿苷中间体、5’-O-DMT-2’-O-(2-甲氧乙基)-5-甲基尿苷前末端基中间体、(5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧乙基)-5-甲基尿苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE T amidite)、5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-O-(2-甲氧乙基)-5-甲基胞苷中间体、5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-O-(2-甲氧乙基)-N4-苯甲酰基-5-甲基-胞苷前末端基中间体、(5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧乙基)-N4-苯甲酰基-5-甲基胞苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE 5-Me-C amidite)、(5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧乙基)-N6-苯甲酰基腺苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE A amdite)、(5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧乙基)-N4-异丁酰鸟苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE G amidite)、2’-O-(氨基乙氧基)核苷amidites和2’-O-(二甲基氨基乙氧基)核苷amidites、2’-(二甲基氨基氧基乙氧基)核苷amidites、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-O2-2’-失水-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-(2-羟乙基)-5-甲基尿苷、2’-O-((2-苯二酰亚氨基氧)乙基)-5’-叔丁基二苯基甲硅烷基-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-((2-formadoximinooxy)乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-(N，N二甲基氨基乙氧基)-5-甲基尿苷、2’-O-(二甲基氨基乙氧基)-5-甲基尿苷、5’-O-DMT-2’-O-(二甲基氨基乙氧基)-5-甲基尿苷、5’-O-DMT-2’-O-(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)-5-甲基尿苷-3’-((2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺)、2’-(氨基氧基乙氧基)核苷amidites、N2-异丁酰-6-O-二苯基氨基甲酰基-2’-O-(2-乙基乙酰基)-5’-O-(4，4’-二甲氧)鸟苷-3’-((2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺)、2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(2’-DMAEOE)核苷amidites、2’-O-(2(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-O-(2(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)-乙基))-5-甲基尿苷和5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-O-(2(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)-乙基))-5-甲基尿苷-3’-O-(氰乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺。
2’-脱氧和2’-甲氧基amidites2’-脱氧和2’-甲氧基β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺从商业来源购得(例如Chemgenes、Needham、MA或Glen Research，Inc.Sterling，VA)。其它2’-O-烷氧基取代的核苷amidites如美国专利5,506,351中所描述制备，该专利在文中引用作为参考。对于利用2’-烷氧基amidites合成的寡核苷酸，使用了用于未修饰寡核苷酸的标准循环，除了脉冲递送四唑之后的等待步骤，并且碱基(base)增加至360秒。
按照已公布的方法(Sanghvi等，Nucleic Acids Research，1993，21，3197-3203)，使用商业获得的亚磷酰胺(Glen Research，Sterling VA或ChemGenes，Needham，MA)合成了包含5-甲基-2’-脱氧胞苷(5-Me-C)核苷酸的寡核苷酸。
2’-氟代amidites如先前文献(Kawasaki等，J.Med.Chem.，1993，36，831-841)和美国专利5,670,633所描述合成了2’-氟代寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。简而言之，利用商业获得的9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤作为原料并且使用文献中的修饰方法从而通过2’-β-三苯甲基基团的SN2置换导入了2’-α-氟原子，合成了受保护的核苷N6-苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟腺苷。因此N6-苯甲酰基-9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤作为3’，5’-二四氢吡喃基(THP)中间体以适中量选择性受到保护。使用标准方法实现了THP和N6-苯甲酰基基团的脱保护，并且标准方法还用于获得5’-二甲氧三苯甲基-(DMT)和5’-DMT-3’-亚磷酰胺中间体。
使用四异丙基二硅氧烷基(TPDS)保护的9-β-D-阿糖呋喃鸟嘌呤作为原料并转化为中间体二异丁酰阿糖呋喃鸟苷合成2’-脱氧-2’-氟鸟苷。TPDS基团脱保护后用THP保护羟基基团以产生二异丁酰二-THP保护的阿糖呋喃鸟嘌呤。选择性O-脱酰基作用和三次稳定(triflation)后，用氟化物处理粗产物，然后THP基团脱保护。标准方法学用于获得5’-DMT-和5’-DMT-3’-亚磷酰胺。
通过文献中的过程进行修改合成2’-脱氧-2’-氟尿苷，其中用70％氟化氢-嘧啶处理2，2’-失水-1-β-D-阿拉伯呋喃尿嘧啶。标准过程用于获得5’-DMT和5’-DMT-3’亚磷酰胺。
通过2’-脱氧-2’-氟尿苷的氨基化作用合成2’-脱氧-2’-氟胞苷，随后选择性保护以产生N4-苯甲酰基-2，-脱氧-2’-氟胞苷。标准过程用于获得5’-DMT和5’-DMT-3’亚磷酰胺。
2’-O-(2-甲氧乙基)修饰的amidites通过Martin，Helvetica Chimica Acta，1995，78，486-504的方法制备2’-O-甲氧乙基取代的核苷amidites。
2’-(氨基乙氧基)核苷amidites和2’-(二甲基氨基乙氧基)核苷amidites通过美国专利申请号6,127,533中的方法制备氨基乙氧基和二甲基氨基乙氧基amidites，该专利在文中引用作为参考。
实施例2寡核苷酸和寡核苷合成通过众所周知的固相合成技术可以方便地且常规地制备用于本发明的寡聚化合物。几个供应商包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)出售用于此种合成的装置。另外或备选地，可以应用本领域已知的任意其它用于此种合成的方式。众所周知，可以使用相似技术制备寡核苷酸例如二硫代磷酸酯及其烷基化衍生物。
寡核苷酸利用具碘氧化作用的标准亚磷酰胺化学作用在自动化DNA合成(Applied Biosystems model 394)仪上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。
硫代磷酸酯(P＝S)合成与磷酸二酯寡核苷酸相似，以下步骤除外对于亚磷酸酯键的氧化，利用含溶于乙腈的10％w/v 3，H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1-二氧化物引起硫杂化。硫杂化反应步骤时间增加至180秒并且之前先进行正常加帽步骤。在从CPG柱断裂出来并在浓氨水中55℃去封闭(12-16小时)后，用＞3倍体积的乙醇沉淀从1M NH4OAc溶液中回收寡核苷酸。如美国专利5,508,270中所描述制备次膦酸酯寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。
如美国专利4,469,863中所描述制备了烷基膦酸酯寡核苷酸，该专利文中引用作为参考。
如美国专利5,610,289或5,625,050中所描述制备了3’-脱氧-3’-亚甲基膦酸酯寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,256,775或美国专利5,366,878中所描述制备了亚磷酰胺寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。
如公布的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别作为WO 94/17093和WO 94/02499公布)中所描述制备了烷基硫代磷酸酯寡核苷酸，PCT申请在文中引用作为参考。
如美国专利5,476,925中所描述制备了3’-脱氧-3’-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,023,243中所描述制备了磷酸三酯寡核苷酸，该专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,130,302和5,177,198中所描述制备了硼磷酸酯寡核苷酸，两项专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,639,873中所描述合成了含4’-硫代的寡核苷酸，该专利的内容在文中引用作为参考。
寡核苷如美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289中所描述制备了亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷(也鉴定为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基联亚氨基连接的寡核苷(也鉴定为MDH连接的寡核苷)和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷(也鉴定为酰胺-3连接的寡核苷)和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也鉴定为酰胺-4连接的寡核苷)以及具有例如交替MMI和P＝O或P＝S键的混合主链化合物，全部专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,264,562和5,264,564中所描述制备了甲缩醛(Formacetal)和硫代甲缩醛连接的寡核苷，两项专利在文中引用作为参考。
如美国专利5,223,618中所描述制备了环氧乙烷连接的寡核苷，该专利在文中引用作为参考。
PNA合成按照Peptide Nucleic Acids(PNA)Synthesis，Properties and PotentialApplications，Bioorganic & Medicinal Chemistry，1996，4，5-23中所提及的各种方法中的任意方法制备了肽核酸(PNA)。根据美国专利5,539,082、5,700,922和5,719,262也可以制备肽核酸，专利在文中引用作为参考。
实施例3RNA合成一般而言，RNA合成化学基于在关键中间反应中各种保护性基团的选择性掺入。本领域普通技术人员能够理解保护基团在有机合成中的用途，一类有用的保护基团包括甲硅烷基醚。具体而言，大量甲硅烷基醚用于保护与2’-羟基上的对酸敏感原酸酯保护基团相联合来保护5’-羟基。因而该套保护基团可用于标准固相合成技术。在全部其它合成步骤之后最后去除对酸敏感原酸酯保护基团是重要的。而且，在合成过程中早期使用甲硅烷基保护基团可确保在期望去除保护基团时可以容易去除，而不对2’羟基进行脱保护。
通过保护基团(被差异去除或具有不同化学不稳定性)使5’-羟基和2’羟基被相继保护之后，合成了RNA寡核苷酸。
RNA寡核苷酸以分步方式合成。每个核苷酸相继(3’至5’方向)加到固相支持物结合的寡核苷酸上。链3’末端的第一个核苷共价连接于固相支持物上。加入核苷酸前体、核糖核苷亚磷酰胺和催化剂，将第二个碱基偶联至第一个核苷的5’末端上。洗涤支持物并使用乙酸酐对任何未反应的5’-羟基基团进行加帽，以产生5’-乙酰基部分。然后将键氧化成更加稳定并最终期望的P(V)键。核苷酸加成循环结束时，使用氟化物断裂5’-甲硅烷基团。对于每一个随后的核苷酸重复该循环。
合成之后，利用溶于DMF的1M二钠-2-氨甲酰基-2-丙烯腈-1，1-二硫醇三水合物(S2Na2)断裂磷酸酯上的甲基保护基团。用水从固相支持物结合寡核苷酸上洗去脱保护溶液。然后用40％甲胺水溶液55℃处理支持物10分钟。这将RNA寡核苷酸释放入溶液中，将环外胺脱保护并修饰2’-基团。在该阶段通过阳离子交换HPLC能够合成寡核苷酸。
2’-原酸酯基团是将要去除的最后的保护基团。由Dharmacon Research公司(Lafayette，CO)研发的乙二醇单醋酸酯原酸酯保护基团是有用的原酸酯保护基团的一个实例，其具有以下重要特性。它在核苷亚磷酰胺合成和寡核苷酸合成的条件下是稳定的。然而，寡核苷酸合成后，需使用甲胺处理寡核苷酸，这不仅将寡核苷酸从固相支持物上断裂下来还从原酸酯上去除乙酰基基团。所得到的原酸酯上的2-乙基-羟基取代基比乙酰化前体吸电子差。结果，修饰的原酸酯变得对酸催化的水解作用更加不稳定。具体而言是，当乙酰基团去除后断裂的速率快了大约10倍。因此，该原酸酯拥有足够的稳定性以便与寡核苷酸合成相容并且当随后修饰时允许在与最终RNA寡核苷酸产物相容的相对温和水溶液条件下进行脱保护。
另外，RNA合成的方法在本领域中是众所周知的(Scaringe，S.A.博士论文，科罗拉多大学，1996；Scaringe等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，11820-11821；Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1981，103，3185-3191；Beaucage等，Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862；Dahl等，Acta Chem.Scand.，1990，44，639-641；Reddy等，Tetrahedrom Lett.，1994，25，4311-4314；Wincott等，Nucleic Acids Res.，1995，23，2677-2684；Griffin等，Tetrahedron，1967，23，2301-2313；Griffin等，Tetrahedron，1967，23，2315-2331)。
本发明RNA反义化合物(RNA寡核苷酸)能够通过文中的方法合成或者从Dharmacon Research公司(Lafayette，CO)购买。一旦合成，然后通过本领域已知的方法能够对互补RNA反义化合物进行退火以形成双链(双链体)反义化合物。例如，通过将30μl的RNA寡核苷酸(50μMRNA寡核苷酸溶液)每一互补的链与15μl 5×退火缓冲液(100mM醋酸钾、30mMHEPES-KOH pH 7.4，2mM醋酸镁)相混合，随后90℃加热1分钟，然后37℃1小时，能够形成双链体。所得到的双链体反义化合物能够用于试剂盒、测定、筛选或其它方法以研究靶核酸的作用，或者用于诊断或治疗。
实施例4嵌合体寡核苷酸的合成本发明的嵌合体寡核苷酸、寡核苷或混合的寡核苷酸/寡核苷可以是几种不同的类型。这些类型包括第一种类型和第二种的“开放末端”类型，其中在第一种类型中所连接的核苷的“缺刻”段位于所连接的核苷的5’和3’“翼”之间，在第二种类型中“缺刻”段位于寡聚化合物3’或5’末端。第一种类型的寡核苷酸在本领域中已知为“gapmer”或有缺刻的寡核苷酸。第二种类型的寡核苷酸在本领域中已知为“hemimer”或“wingmer”。(2’-O-Me)--(2’-脱氧)--(2’-O-Me)嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸如上，利用Applied Biosystems自动化DNA合成仪型号394合成了具有2’-O-烷基硫代磷酸酯和2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸片段的嵌合体寡核苷酸。利用自动化合成仪和对于DNA部分的2’-脱氧-5’-二甲氧三苯甲基-3’-O-亚磷酰胺和对于2’-O-烷基部分的5’-二甲氧三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亚磷酰胺合成了寡核苷酸。对标准合成循环进行了修饰，即包含了对于5’-二甲氧三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亚磷酰胺反应时间增加的偶联步骤。充分保护的寡核苷酸从支持物上断裂下来并在浓氨水(NH4OH)中55℃脱保护12-16小时。然后通过适宜的方法(沉淀、柱层析、真空减少体积)回收脱保护的寡聚物并通过分光光度方法分析产量且通过毛细管电泳和质谱法分析纯度。
(2’-O-(2-甲氧乙基))--(2’-脱氧)--(2’-O-(甲氧乙基))嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸按照如上用于2’-O-甲基嵌合体寡核苷酸的方法制备了(2’-O-(2-甲氧乙基))--(2’-脱氧)--(-2’-O-(甲氧乙基))嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸，其中2’-O-(甲氧乙基)amidites替代了2’-O-甲基amidites。(2’-O-(2-甲氧乙基)磷酸二酯)--(2’-脱氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(2-甲氧乙基)磷酸二酯)嵌合体寡核苷酸按照如上用于2’-O-甲基嵌合体寡核苷酸的方法制备了(2’-O-(2-甲氧乙基磷酸二酯)--(2’-脱氧硫代磷酸酯)--(2’-O-(甲氧乙基)磷酸二酯)嵌合体寡核苷酸，其中2’-O-(甲氧乙基)amidites替代了2’-O-甲基amidites，用碘进行氧化作用以产生嵌合体结构翼部分内的核苷酸间磷酸二酯键，并且利用3，H-1，2苯并二硫羟-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)进行硫化作用以产生中央缺刻的核苷酸间硫代磷酸酯键。
按照美国专利5,623,065合成了其它嵌合体寡核苷酸、嵌合体寡核苷和混合的嵌合体寡核苷酸/寡核苷，该专利在文中引用作为参考。
实施例5靶向eIF4E的双链体反义化合物的设计与筛选根据本发明，设计靶向eIF4E的一系列的包含本发明反义化合物及其互补体核酸双链体。双链体反义链的核碱基序列包含表1寡核苷酸中的至少8个核碱基部分。通过加入一个或多个天然或修饰核碱基以形成悬突将链末端进行修饰。然后将dsRNA的有意链作为反义链的互补体进行设计并合成并且有意链也可以在每一个末端包含修饰或添加。例如，在一个实施方案中，dsRNA双链体的两条链的中间核碱基是互补的，每一条链在一个或两个末端含有悬突。双链体的一个末端可以是平端并且另一个末端具有悬突核碱基。在一个实施方案中，在双链体每一条链的3’端上的悬突核碱基数目为1-6。在另一个实施方案中，仅在双链体的一条链的3’端悬突核碱基数目为1-6。在另外实施方案中，在双链体链的一个或两个5’端上悬突核碱基的数目为1-6。在另一个实施方案中，悬突核碱基数目为0。
作为实例，包含具有序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ IDNO456)和具有脱氧胸腺嘧啶(dT)的2核碱基悬突的反义链的双链体可能具有下列结构cgagaggcggacgggaccgTT反义链(SEQ ID NO457)|||||||||||||||||||TTgctctccgcctgccctggc有意链互补体(SEQ ID NO458)在另一个实施方案中，包含具有相同序列CGAGAGGCGGACGGGACCG的反义链的双链体可以制备成平端(无单链悬突)，如下所示cgagaggcggacgggaccg 反义链(SEQ ID NO456)|||||||||||||||||||gctctccgcctgccctggc 有意链(互补体)(SEQ ID NO459)双链体可以是单分子或双分子，即有意链和反义链可以是同一分子的一部分(其形成发夹结构或其它自身结构)或两个(或者甚至更多)分开的分子。
双链体的RNA链可以通过本文公开的方法合成或者购自DharmaconResearch Inc.，(Lafayette，CO)。一旦合成，将互补链退火。将单一链分成等份并稀释至浓度为50μM。一旦稀释，将30μL的每条链与15μL 5×退火缓冲溶液混合。该缓冲液终浓度为100mM醋酸钾、30mM HEPES-KOHpH 7.4和2mM醋酸镁。终体积为75μL。将溶液于90℃孵育1分钟，然后离心15秒。将管于37℃放置1小时，在这段时间dsRNA双链体用于实验。dsRNA双链体终浓度为20μM。该溶液可以冰冻储存(-20℃)并且可以冻融多达5次。
一旦制备完毕，双链体反义化合物用于评价其调节eIF4E表达的能力。
当细胞达到80％汇合时，用本发明的双链体反义化合物处理。对于生长于96孔板中的细胞，用200μL OPTI-MEM-1降低血清培养基(GibcoBRL)洗涤孔一次，然后用包含12μg/mL LIPOFECTIN(Gibco BRL)和终浓度200nM的目的双链体反义化合物的130μL OPTI-MEM-1处理。处理5小时后，培养基用新鲜培养基替换。处理16小时后收获细胞，在此时分离RNA并通过RT-PCR测量靶标的降低。
实施例6寡核苷酸分离从可控多孔玻璃固体支持物上断裂并在浓氨水中于55℃去封闭12-16小时之后，通过用＞3倍体积的乙醇沉淀从1M NH4OAc中回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸用电喷雾质谱(分子量确定)和毛细管凝胶电泳分析并且经判断至少70％为全长的。通过正确分子量和-16amu产物(+/-32+/-48)的比率确定合成中所获得的硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的相对量。对于一些研究，如Chiang等，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171所描述，通过HPLC纯化寡核苷酸。使用HPLC纯化材料所获得的结果与使用非HPLC纯化材料所获得的结果相似。
实施例7寡核苷酸合成-96孔板格式通过固相P(III)亚磷酰胺化学在自动合成仪上合成寡核苷酸，其中合成仪能够在96孔格式中同时合成96条序列。通过水溶性碘的氧化作用提供核苷酸间磷酸二酯键。通过利用无水乙腈中的3，H-1，2苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)的硫化作用产生核苷酸间硫代磷酸酯键。标准碱基保护的β-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺购自商品供应商(例如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA或者Pharmacia，Piscataway，NJ)。按照标准方法或具有专利权的方法合成非标准核苷。它们用作碱基保护β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺。
寡核苷酸从支持物上断裂下来并用浓NH4OH于升高的温度(55-60℃)下脱保护12-16小时，然后将释放的产物真空干燥。然后将干燥的产物重悬于无菌水得到主板(master plate)，然后利用自动移液管操纵器从主板稀释分析和测试平板样品。
实施例8寡核苷酸分析-96孔板格式通过样品稀释和UV吸收光谱估计每孔中寡核苷酸的浓度。通过毛细管电泳(CE)在96孔板格式(Beckman P/ACETMMDQ)或者对于单个制备的样品在商品化CE装置(例如Beckman P/ACETM5000，ABI270)上评价单个产品的全长完整性。通过利用电喷雾质谱对化合物进行质量分析证实碱基和主链组成。使用单一通道或多重通道自动移液管操纵器从主板稀释所有分析测试板。如果板上至少85％的化合物为至少85％全长，则判断该板为可接受的。
实施例9细胞培养和寡核苷酸处理-单一标准反义化合物反义化合物对靶核酸表达的影响可以在多种细胞类型的任意一种中进行测试，只要靶核酸以可测定水平存在即可。这可以使用例如PCR或者Northern印迹分析进行常规确定。下面提供的细胞类型用于举例说明，但是其他细胞类型也可以常规使用，只要靶标在所选择的细胞类型中表达即可。这可以通过本技术领域常规方法例如Northern印迹分析、核糖核酸酶保护分析或RT-PCR容易地确定。
T-24细胞人过渡期细胞膀胱癌细胞系T-24从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)获得。T-24细胞在添加有10％胎牛血清(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的完全McCoy’s 5A基本培养基中常规培养。当细胞达到90％汇合时，通过胰酶消化和稀释将细胞常规传代培养。细胞以7000个细胞/孔的密度接种于96孔板(Falcon-Primaria#353872)用于RT-PCR分析。
对于Northern印迹或其它分析，将细胞接种于100mm或其它标准组织培养板并且相似地使用适宜体积的培养基和寡核苷酸处理。
A549细胞人肺癌细胞系A549从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)获得。A549细胞在添加有10％胎牛血清(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的DMEM基本培养基(1nvitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中常规培养。当细胞达到90％汇合时，通过胰酶消化和稀释将细胞常规传代培养。
NHDF细胞人新生儿皮肤成纤维细胞(NHDF)从Clonetics Corporation(Walkersville，MD)获得。将NHDF在如供应商所建议添加的成纤维细胞生长培养基(Clonetics Corporation，Walkersville，MD)中常规维持。如供应商所推荐将细胞常规维持高达10代。
HEK细胞人胚胎角质化细胞(HEK)从Clonetics Corporation(Walkersville，MD)获得。将HEK常规维持于如供应商所推荐进行配制的角质化细胞生长培养基(Clonetics Corporation，Walkersville，MD)。如供应商所推荐将细胞常规维持高达10代。
b.END细胞小鼠脑内皮细胞系b.END从Max Plank Instititute(Bad Nauheim，Germany)的werner Risau博士获得。b.END细胞在添加有10％胎牛血清(Gibco/Life Technologies，Gaithersburg，MD)的高葡萄糖DMEM(Gibco/Life Technologies，Gaithersburg，MD)中常规培养。当细胞达到90％汇合时，通过胰酶消化和稀释将细胞常规传代培养。细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板(Falcon-Primaria #3872)用于RT-PCR分析。对于Northern印迹或其它分析，将细胞接种于100mm或其它标准组织培养板并且相似地使用适宜体积的培养基和寡核苷酸处理。
HeLa细胞人上皮样癌细胞系HeLa从从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。HeLa细胞在添加有10％胎牛血清(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中常规培养。当细胞达到大约90％汇合时，通过胰酶消化和稀释将细胞常规传代培养。将细胞以大约50,000个细胞/孔的密度接种于24孔板(Falcon-Primaria #3846)或者以大约5000个细胞/孔的密度接种于96孔板用于RT-PCR分析。对于Northern印迹或其它分析，将细胞达到大约90％汇合时收获细胞。
U-87 MG细胞人成胶质细胞瘤U-87 MG细胞系从从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。U-87 MG细胞在添加有10％胎牛血清(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)和抗生素的DMEM(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中培养。当细胞达到适当汇合时，通过胰酶消化和稀释将细胞常规传代培养。将细胞以大约10,000个细胞/孔的密度接种于96孔板(Falcon-Primaria#3872)用于RT-PCR分析。
对于Northern印迹或其它分析，将细胞接种于100mm或其它标准组织培养板并且相似地使用适宜体积的培养基和寡核苷酸处理。
MH-S细胞小鼠MH-S细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。细胞维持于包含10％热灭活胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)的RPMI 1640培养基中。将细胞以大约5000个细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。使用反义化合物处理当细胞达到65-75％汇合时，用寡核苷酸处理。对于生长于96孔板中的细胞，用100μL OPTI-MEMTM-1降低血清培养基(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)洗涤孔一次，然后用包含3.75μg/mLLIPOFECTINTM(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)和预期浓度寡核苷酸的130μL OPTI-MEMTM-1处理。三次重复处理细胞并收集数据。在37℃处理4-7小时后，将培养基用新鲜培养基替换。寡核苷酸处理16-24小时后收获细胞。
所使用寡核苷酸的浓度随细胞系而变化。为了确定对于特定细胞系的最佳寡核苷酸浓度，用浓度范围的阳性对照寡核苷酸处理细胞。对于人类细胞，阳性对照寡核苷酸选自靶向人H-ras的ISIS 13920(TCCGTCATCGCTCCTCAGGG，SEQ ID NO1)或靶向人Jun-N末端激酶2(JNK2)的ISIS 18078，(GTGCGCGCGAGCCCGAAATC，SEQ ID NO2)。两个对照都是具有硫代磷酸酯主链的2’-O-甲氧乙基gapmer(2’-O-甲氧乙基显示为粗体)。对于小鼠或大鼠细胞，阳性对照寡核苷酸是靶向小鼠和大鼠c-raf的ISIS 15770，ATGCATTCTGCCCCCAAGGA，SEQ ID NO3，其为具有硫代磷酸酯主链2’-O-甲氧乙基gapmer(2’-O-甲氧乙基显示为粗体)。然后将导致c-H-ras(对于ISIS 13920)、JNK2(对于ISIS 18078)或c-raf(对于ISIS 15770)mRNA 80％抑制的阳性对照寡核苷酸浓度用作在对于那个细胞系随后实验中新寡核苷酸的筛选浓度。如果没有达到80％抑制，导致c-H-ras、JNK2或c-raf mRNA 60％抑制的阳性对照寡核苷酸的最低浓度用作在对于那个细胞系随后实验中寡核苷酸的筛选浓度。如果没有达到60％抑制，认为特定细胞系不适于寡核苷酸转染实验。文中所使用的反义寡核苷酸的浓度为50nM-300nM。
实施例10寡核苷酸对eIF4E表达抑制的分析可以使用本领域已知的多种方法分析eIF4E表达的反义调节。例如，可以通过如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR(RT-PCR)定量eIF4E mRNA水平。实时定量PCR为目前适用的。RNA分析可以针对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行。如在本文其他实施例中所述，本发明RNA分析的一种方法是使用总细胞RNA。RNA分离的方法在本领域中是众所周知的。Northern印迹分析也是本领域的常规方法。实时定量PCR可以使用商业可得的ABI PRISMTM7600、7700或7900序列检测系统(可从PE-Applied Biosystems，Foster City，CA获得)方便地实现，并且根据制造商的说明书使用。
eIF4E蛋白质水平可以用本领域众所周知的多种方法进行定量，所述方法例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活细胞分选术(FACS)。可以鉴定出抗eIF4E的抗体并从多种来源获得，例如MSRS目录中的抗体(Aerie Corporation，Birmingham，MI)，或者通过本领域众所周知的传统单克隆或多克隆抗体产生方法制备。
实施例11用于eIF4E抑制剂的表型测定法设计一旦已经通过文中公开的方法鉴定出eIF4E抑制剂，则在一个或多个表型测定中进一步研究化合物，每个测定都具有可测量的终末点以预测在特定疾病情况或状态的治疗中的效率。
表型测定法、试剂盒和它们所使用的试剂是本领域的那些技术人员众所周知的并且文中用于研究eIF4E在健康和疾病中的作用和/或联系。典型的表型测定法可以从几个商品供应商的任意一个购得，表型测定法包括用于确定细胞生存力、细胞毒性、细胞增殖或细胞存活的那些测定法(Molecular Probes，Eugene，OR；PerkinElmer，Boston，MA)，基于蛋白质的测定包括酶学测定(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ；Oncogene Research Products，San Diego，CA)、细胞调控、信号转导、炎症反应、氧化过程和细胞凋亡(Assay Designs Inc.，AnnArbor，MI)、三酰甘油积累(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、血管发生测定、管形成测定、细胞因亍和激素测定以及代谢测定(Chemicon InternationalInc.，Temecula，CA；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
在一个非限定性实施例中，用从体外研究中所鉴定出来的eIF4E抑制剂和对照化合物以通过上述方法确定的最佳浓度处理所确定的适于特定表型测定的细胞(即对于乳腺癌研究选择MCF-7细胞，对于肥胖症研究选择脂肪细胞)。在处理期结束时，通过一种或多种特异用于测定的方法分析处理和未处理细胞以确定表型结果和终末点。
表型终末点包括细胞形态随着时间或处理剂量的变化以及细胞成分如蛋白质、脂类、核酸、激素、糖类或金属的水平变化。对细胞状态包括pH、细胞周期阶段、细胞对生物指示剂的摄入或分泌的测量也是目的终末点。
处理后细胞表型的分析(测量一种或多种细胞基因的表达)也用作eIF4E抑制剂效率或潜能的指示剂。在处理和未处理细胞中测定了标志基因或者怀疑与特定疾病状态相关的那些基因。
实施例12RNA分离Poly(A)+mRNA分离按照Miura等，(Clin.Chem.，1996，42，1758-1764)分离Poly(A)+mRNA。用于poly(A)+mRNA分离的其它方法在本领域中也是常规的。简而言之，对于生长于96孔板的细胞，从细胞撤除生长培养基并且用200μL冷PBS洗涤各孔。在各孔中加入60μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5％NP-40、20mM氧钒-核糖核苷复合物)，轻轻摇动培养板，然后在室温赋予5分钟。将55μL裂解物转移至Oligo d(T)包被的96孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)中。在室温孵育培养板60分钟并用200μL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.6、1mM EDTA、0.3MNaCl)洗涤3次。最后一次洗涤之后，将板在纸巾上拍干以去除多余的洗涤缓冲液，然后空气干燥5分钟。在各孔中加入预热至70℃的60μL洗脱缓冲液(5mM Tris-HCl pH 7.6)，将板在90℃加热板上孵育5分钟，然后将洗脱液转移至新的96孔板。
可以使用适宜体积的全部溶液对生长于100mm或其它标准培养板的细胞进行相似处理。
总RNA分离使用购自Qiagen Inc.(Valencia，CA)的RNEASY 96TM试剂盒和缓冲液按照制造商推荐的步骤分离总RNA。简而言之，对于生长于96孔板的细胞，从细胞撤除生长培养基并且用200μL冷PBS洗涤各孔。在各孔中加入150μL缓冲液RLT并剧烈振荡板20秒。然后向各孔中加入150μL70％乙醇并用吸量管上下吹吸三次混合内容物。然后将样品转移至连接有QIAVACTM多支管(固定有废液收集盘)且和真空源的RNEASY 96TM孔板上。施加真空1分钟。在RNEASY 96TM板的各孔中加入500μL缓冲液RW1并孵育15分钟，再次施加真空1分钟。再次向RNEASY 96TM板的各孔中加入500μL缓冲液RW1并施加真空2分钟。然后向RNEASY 96TM板的各孔中加入1mL缓冲液RPE并且施加真空90秒。然后重复缓冲液RPE洗涤并额外施加真空3分钟。然后将板从QIAVACTM多支管上取出并在纸巾上拍干。然后将板再次连接至配备有收集管架(包含1.2mL收集管)的QIAVACTM多支管。然后通过向各孔中吸入140μL无RNA酶水，孵育1分钟，然后施加真空3分钟洗脱RNA。
使用QIAGEN Bio-Robot 9604(Qiagen，Inc.，Valencia CA)可以自动化重复移液和洗脱步骤。基本上，在培养板上的细胞裂解之后将板转移至自动化操作台，在那里进行移液、DNA酶处理和洗脱步骤。
实施例13eIF4E mRNA水平的实时定量PCR分析利用ABI PRISMTM7600、7700或7900序列检测系统(PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)按照制造商说明书进行eIF4E mRNA水平的定量。这是不基于凝胶的闭合管荧光检测系统，其允许实时对聚合酶链式反应(PCR)产物进行高通量定量。与在PCR完成后对扩增产物进行定量的标准PCR相反，实时定量PCR中的产物随着它们的积累便可以进行定量。这是通过在PCR反应中包含寡核苷酸探针实现的，该探针在正向和反向PCR引物之间特异性退火并包含两种荧光染料。报告染料(例如FAM或JOE，从PE-Applied Biosystems，Foster City，CA、Operon TechnologiesInc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA获得)连接到探针的5’端而猝灭染料(例如TAMRA，从PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA、Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA获得)连接至探针的3’端。当探针和染料完整时，报告染料发射光被附近的3’猝灭染料猝灭。在扩增过程中，探针退火至靶序列以产生能够被Taq聚合酶5’核酸外切酶活性断裂的底物。在PCR扩增循环的延伸期过程中，通过Taq聚合酶断裂探针将报告染料从探针剩余物上释放下来(并因此从猝灭部分释放下来)并产生序列特异的荧光信号。对于每个循环，连接的报告染料分子从其各自的探针上断裂下来，并且通过内置于ABI PRISMTM序列检测系统的激光光学器以规则时间间隔监测荧光强度。在每个测定中，包含来自未处理对照样品的mRNA系列稀释液的一系列平行反应产生标准曲线，其用于在用反义寡核苷酸处理测试样品后定量抑制的百分数。
在定量PCR分析之前，评价对所测量的靶基因特异的引物-探针组与GAPDH扩增反应“多重扩增”的能力。在多重扩增中，靶基因和内标准基因GAPDH同时在单一样品中扩增。在该分析中，从未处理细胞分离的mRNA是连续稀释的。在存在仅对GAPDH特异、仅对靶基因特异(“一重扩增”)或对两者特异(多重扩增)的引物-探针组时对每种稀释液进行扩增。PCR扩增后，从一重扩增和多重扩增样品中产生GAPDH标准曲线和作为稀释的函数的靶mRNA信号。如果从多重扩增样品产生的GAPDH和靶信号的斜率和相关系数都在从一重扩增样品产生的其相应值的10％范围内，则认为对该靶特异的引物-探针组是可以多重扩增的。其它PCR方法在本领域中也是已知的。
PCR试剂从Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)获得。通过将20μL PCR混合液(2.5×不含MgCl2的PCR缓冲液、6.6mM MgCl2、375μM每种dATP、dCTP、dCTP和dGTP、375nM每种正向引物和反向引物、125nM探针、4单位RNA酶抑制剂、1.25单位PLATINUM_Taq、5单位MuLV逆转录酶和2.5×ROX染料)加入包含30μL总RNA溶液(20-200ng)的96孔板进行RT-PCR反应。通过在48℃孵育30分钟进行RT反应。在95℃孵育10分钟活化PLATINUM_Taq后，进行40轮两步法PCR程序95℃15秒(变性)，随后60℃1.5分钟(退火/延伸)。
利用GAPDH(其表达恒定的基因)的表达水平或者通过使用RiboGreenTM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA对通过实时RT-PCR获得的基因靶数量进行标准化。通过实时RT-PCR、通过与靶标同时、多重扩增或独立运行，定量GAPDH表达。使用RiboGreenTMRNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA。在Jones，L.J.等，(Analytical Biochemistry，1998，265，368-374)中教授了通过RiboGreenTM进行RNA定量的方法。
在该测定中，将170μL RiboGreenTM工作试剂(用10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH7.5以1∶350稀释RiboGreenTM试剂)用移液器加入包含30μL纯化细胞RNA的96孔板中。在CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)中以485nm激发光和530nm发射光读取板。
利用已公布的序列信息(GenBank登录号M15353.1，文中引用为SEQID NO4)，将针对人eIF4E的探针和引物设计成能够人eIF4E序列杂交。对于人eIF4E，PCR引物为正向引物TGGCGACTGTCGAACCG(SEQ ID NO5)反向引物AGATTCCGTTTTCTCCTCTTCTGTAG(SEQ IDNO6)并且PCR探针为FAM-AAACCACCCCTACTCCTAATCCCCCG-TAMRA(SEQID NO7)，其中FAM是荧光染料而TAMRA是猝灭染料。对于人GAPDH，PCR引物为正向引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO8)反向引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO9)并且PCR探针为5’JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3’(SEQ ID NO10)，其中JOE是荧光报告染料而TAMRA是猝灭染料。
利用已公布的序列信息(GenBank登录号NM_007917.1，文中引用为SEQ ID NO11)，将针对小鼠eIF4E的探针和引物设计成能够与小鼠eIF4E序列杂交。对于小鼠eIF4E，PCR引物为正向引物AGGACGGTGGCTGATCACA(SEQ ID NO12)反向引物TCTCTAGCCAGAAGCGATCGA(SEQ ID NO13)并且PCR探针为FAM-TGAACAAGCAGCAGAGACGGAGTGA-TAMRA(SEQ IDNO14)，其中FAM是荧光报告染料而TAMRA是猝灭染料。对于小鼠GAPDH，PCR引物为正向引物GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO15)反向引物GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(SEQ ID NO16)并且PCR探针为5’JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3’(SEQ ID NO17)，其中JOE是荧光报告染料而TAMRA是猝灭染料。
实施例14eIF4E mRNA水平的Northern印迹分析反义处理18小时后，用冷的PBS洗涤单层细胞两次并将细胞裂解于1mL RNAZOLTM(TEL-TEST “B”Inc.，Friendswood，TX)。按照制造商推荐的步骤制备总RNA。使用MOPS缓冲系统(AMRESCO，Inc.Solon，OH)通过电泳在包含1.1％甲醛的1.2％琼脂糖凝胶中分离20μg总RNA。使用Northern/Southern转移缓冲系统(TEL-TEST“B”Inc.，Friendswood，TX)通过毛细管转移过夜将RNA从凝胶转移至HYBONDTM-N+尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。通过UV显影证实RNA的转移。使用STRATALINKERTMUV交联仪2400(Stratagene，Inc，LaJolla，CA)通过UV交联固定膜，然后利用QUICKHYBTM杂交溶液(Stratagene，La Jolla，CA)使用制造商推荐的严格条件进行探测。
为了检测人eIF4E，使用正向引物TGGCGACTGTCGAACCG(SEQID NO5)和反向引物AGATTCCGTTTTCTCCTCTTCTGTAG(SEQ IDNO6)通过PCR制备了人eIF4E特异的探针。为了将上样量和转移效率中的变化标准化，将膜洗掉探针并探测人甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)RNA(Clontech，Palo Alto，CA)。
为了检测小鼠eIF4E，使用正向引物AGGACGGTGGCTGATCACA(SEQ ID NO12)和反向引物TCTCTAGCCAGAAGCGATCGA(SEQ IDNO13)通过PCR制备了小鼠eIF4E特异的探针。为了将上样量和转移效率中的变化标准化，将膜洗掉探针并探测小鼠甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)RNA(Clontech，Palo Alto，CA)。
使用PHOSPHORIMAGERTM和IMAGEQUANTTM软件V3.3(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)观察并定量杂交膜。将数据对未处理对照中GAPDH水平进行标准化。
实施例15通过具有2’-MOE翼和脱氧缺刻的嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸反义抑制人eIF4E表达根据本发明，利用已公布的序列(GenBank登录号M15353.1，文中引用为SEQ ID NO4)将一系列反义化合物设计成靶向人eIF4E RNA的不同区域。化合物显示于表1。“靶位点”表示化合物与其结合的特定人eIF4E靶序列的第一个(最5’)核苷酸编号。表1中的全部化合物为20个核苷酸长度的嵌合体寡核苷酸(“gapmer”)，由包含10个2’-脱氧核苷酸的中央“缺刻”区域组成，其通过5个核苷酸的“翼”搭在两侧(5’和3’方向)。翼由2’-甲氧乙基(2’-MOE)核苷酸组成。在整个寡核苷酸中核苷间(主链)键为硫代磷酸酯键(P＝S)。全部胞苷残基为5-甲基胞苷。
利用已公布的序列(GenBank登录号NM 007917.1，文中引用为SEQID NO11)将第二系列反义化合物设计成靶向小鼠eIF4E RNA的不同区域。化合物显示于表1。“靶位点”表示化合物与其结合的特定人eIF4E靶核酸的第一个(最5’)核苷酸编号。表1中的全部化合物为20个核苷酸长度的嵌合体寡核苷酸(“gapmer”)，由包含10个2’-脱氧核苷酸的中央“缺刻”区域组成，其通过5个核苷酸的“翼”搭在两侧(5’和3’方向)。翼由2’-甲氧乙基(2’-MOE)核苷酸组成。在整个寡核苷酸中核苷间(主链)键为硫代磷酸酯键(P＝S)。全部胞苷残基为5-甲基胞苷。
由于表1中的化合物与人和小鼠的eIF4E序列都互补，通过文中其它实施例中所描述的定量实时PCR分析了这些化合物对人eIF4E mRNA水平的影响。数据为来自三次实验的平均值，其中A549细胞用本发明反义寡核苷酸进行处理。每个数据点的阳性对照通过序列ID号标在表中。如果存在，“N.D.”表示“无数据”。
表1具有2’-MOE翼和脱氧缺刻的嵌合体硫代磷酸酯对人eIF4E mRNA水平的抑制作用
如表1中所示，SEQ ID NO 20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、107、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120和122在该测定中证明对人eIF4E表达具有至少50％的抑制作用并因此是适宜的。SEQ ID NO 80、65、40、97和105也是适宜的。
与这些适宜序列所互补的靶区域文中称为“适宜靶区段”并因此适用于通过本发明化合物进行靶向。这些适宜靶区段显示于表3。这些序列显示包含胸腺嘧啶(T)，但是本领域的技术人员会意识到在RNA序列中通常由尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。序列代表了表1中所示的适宜反义化合物的反向互补体。“靶位点”表示寡核苷酸与其结合的特定靶核酸上的第一个(最5’)核苷酸的编号。在表3中也显示了在其中发现了每一适宜靶片段的物种。
实施例16具有2’-MOE翼和脱氧缺刻的嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸对小鼠eIF4E表达的反义抑制作用。
根据本发明，如文中其它实施例所描述通过定量实时PCR进一步分析了与人和小鼠eIF4E(例如小鼠eIF4E GenBank登录号NM 007917.1，文中引用为SEQ ID NO11)都互补的表1中的化合物对小鼠eIF4E mRNA水平的影响。在表2中，“靶位点”表示化合物与其结合的特定小鼠eIF4E靶核酸上第一个(最5’)核苷酸的编号。显示于表2的数据是来自三次实验的平均值，其中用本发明反义寡核苷酸对b.END细胞进行处理。通过序列ID号在表中标出每个数据点的阳性对照。如果存在，“N.D.”表示“无数据”。
表2具有2’-MOE翼和脱氧缺刻的嵌合体硫代磷酸酯寡核苷酸对小鼠eIF4E表达的抑制作用
如表2中所示，SEQ ID NO 21、23、24、29、30、40、45、57、58、59、60、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、111、112、115、116、117、118、120和122在该实验中证明对小鼠eIF4E表达具有至少70％的抑制作用并因此是适宜的。SEQ ID NO 105、40、97和80也是适宜的。
与这些适宜序列所互补的靶区域在文中称为“适宜靶区段”并因此适用于通过本发明化合物进行靶向。这些适宜靶区段显示于表3。这些序列显示包含胸腺嘧啶(T)，但是本领域的技术人员会意识到在RNA序列中通常由尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。序列代表了显示于表1和2中所示适宜反义化合物的反向互补体。“靶位点”表示寡核苷酸与其结合的特定靶核酸上第一个(最5’)核苷酸的编号。在表3中也显示了在其中发现了每一适宜靶片段的物种。在表3中也显示了在其中发现了每一适宜靶片段的物种。
表3在eIF4E中所鉴定的适宜靶区段的序列和位置
由于通过实验发现这些“适宜靶片段”对于本发明反义化合物的杂交是开放的并且是可接近的，本领域技术人员使用常规实验就会识别或者能够确定包含其它化合物的本发明其它实施方案，其中所述其它化合物特异结合这些适宜靶片断并且因此抑制eIF4E的表达。
根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物以及其它与至少部分靶核酸杂交并调节其功能的寡聚化合物。
实施例17eIF4E蛋白质水平的western印迹分析使用标准方法可以进行Western印迹分析(免疫印迹分析)。寡核苷酸处理后16-20小时收获细胞，用PBS洗涤一次，重悬于Laemmli缓冲液(100μl/孔)，煮沸5分钟并上样于16％SDS-PAGE凝胶上。将凝胶以150V运行1.5小时，并将凝胶转移至膜用于Western印迹。使用适宜的抗eIF4E的一抗和具有放射性标记或荧光标记的抗一抗的二抗。使用PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics，Sunnyvale CA)观察条带。
实施例18eIF4E表达的反义抑制对细胞增殖的影响使用3.25、7.5、15和30μM寡核苷酸将1×106细胞/100μl HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)进行电穿孔。所使用的eIF4E反义抑制剂ISIS为ISIS 183750(SEQ ID NO40)和ISIS 298815(SEQ IDNO97)。所使用的对照寡核苷酸是ISIS29848(NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；SEQ ID NO207，其中N是A、C、G和T的混合物)和无关对照寡核苷酸ISIS 129688(TTCGCGGCTGGACGATTCAG；SEQ ID NO208)。也使用了mock转染的对照。使用CyQUANT细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes，Inc.，Eugene OR)测定用15μM寡核苷酸处理细胞的细胞增殖。与mock处理对照相比，人eIF4E反义寡核苷酸抑制剂ISIS 183750和ISIS 298815对72小时后的细胞增殖分别抑制31％和36％。用对照寡核苷酸处理的细胞以与mock处理对照细胞至少同样快的速度增殖。
在该实验中，还测定了eIF4A靶mRNA降低。ISIS 183750和ISIS299815的IC50均小于3μM(eIF4E mRNA水平被50％抑制所需要的浓度)并且在7.5μM或更高的寡核苷酸浓度时表现为70-80％的抑制。对照寡核苷酸29848和129688的最大抑制为20％(7.5μM 129688)，但在其它浓度通常为大约10％的抑制。
还在U87-MG人类成胶质细胞瘤细胞中测定了eIF4E反义抑制对细胞增殖的影响。用7.5μM的ISIS 183750(SEQ ID NO40)和ISIS 298815(SEQ ID NO97)和无关(对照)寡核苷酸ISIS 129699(GGATAGAACGCGAAAGCTTG；SEQ ID NO209)对1×106细胞/100μl的U87-MG细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)进行电穿孔。在96小时后，与对照(ISIS 129699)相比eIF4E的两个反义抑制剂ISIS 183750和ISIS 298815分别使U87-MG细胞增殖降低大约12％和10％。在处理开始48小时后测定EIF4E靶mRNA并且与无关对照相比ISIS 183750和ISIS 298815降低EIF4E靶mRNA分别为大约31％和36％。对照寡核苷酸ISIS 129699不能降低eIF4E mRNA水平并且实际上eIF4E mRNA水平稍微升高。
实施例19eIF4E表达的反义抑制对细胞周期的影响检查了eIF4E反义化合物对细胞周期的影响。用30μM反义寡核苷酸(ISIS 183750或299815)或对照寡核苷酸(ISIS 29848或ISIS 129688)对HeLa细胞进行电穿孔，或者HeLa细胞用mock转染。通过流式细胞术使用荧光DNA嵌入剂碘化丙锭(PI)测量48小时时的DNA含量。结果(重复两次)显示于表4。
表4反义处理后的细胞周期谱
从表4所示的结果可以看出使用两种eIF4E反义化合物(ISIS 183750或ISIS 298815)处理增加SubG1期的细胞部分，SubG1期通常预示着凋亡。在ISIS 298815处理之后G2M期细胞部分也增加了。
实施例20eIF4E表达的反义抑制对血管发生/管形成的影响通过多种能够促进内皮细胞彼此相互作用和内皮细胞与细胞外基质分子相互作用的因子刺激血管发生，从而导致毛细管的形成。通过由内皮细胞形成管样结构能够在组织培养中重现该过程。体外管形成的丧失与体内血管发生的抑制相关联(Carmeliet等，Nature，2000，407，249-257和Zhang等，Cancer Research，2002，62，2034-42)，这支持体外管形成可以用作血管发生的终末点。
使用体外血管发生分析试剂盒(Chemicon International，Temecula，CA)或者生长因子降低的Matrigel(BD Biosciences，Bedford，MA)进行管形成测定。将HUVEC以4000细胞/孔铺于96孔板。一天后，按照标准公布程序(Monia等，J.Biol.Chem.，1993，268(19)，14514-22)使用溶于lipofectin(Gibco，Grand Island，NY)中的75nM寡核苷酸将反义和对照寡核苷酸转染入细胞。转染后大约50小时，将细胞转移至用ECMatrixTM(Chemicon International)或生长因子缺乏的Matrigel包被的96孔板中。在这些条件下，未处理HUVEC形成管样结构。于37℃孵育过夜后，通过光学显微镜检查处理和未处理细胞。根据管形成程度将单个细胞指定为离散值1-5。值1指孔中没有管形成，而值5指孔中所有细胞正在形成广泛的管状网络。
当从指定离散值计算时发现用反义抑制剂ISIS 183750和ISIS 298815处理的细胞分别具有大约1.5和2.25的平均管形成值。用随机对照寡核苷酸ISIS 29848(NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；SEQ ID NO207，其中N为A、C、G和T的混合物)处理的细胞具有大约4.25的平均管形成值，并且用ISIS 334163(TGTTACAGTCTTGTACCCTT；SEQ ID NO210)处理的细胞具有大约4.5的平均管形成值，其中ISIS 334163与ISIS 183750具有6个碱基错配。因此，eIF4E反义寡核苷酸特异性抑制47-67％的管形成。因此，eIF4E的反义抑制剂能够抑制血管发生。
实施例21在小鼠中抑制eIF4E的表达使用溶于盐水的寡核苷酸以40mg/kg的寡核苷酸浓度腹膜内注射8周龄C57BL6小鼠，每周注射两次并持续注射三周(总共6剂量)。所使用化合物为eIF4E反义化合物ISIS 183750 (SEQ ID NO40)、ISIS 299815(SEQ ID NO97)、ISIS 298797(SEQ ID NO80)和ISIS 298823(SEQ IDNO105)。所有反义寡核苷酸都是针对人和小鼠eIF4E的物种交叉反义寡核苷酸。ISIS 141923是无关(对照)寡核苷酸(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；SEQ ID NO211)。还使用了盐水(介质)对照。与盐水对照相比，ISIS 183750降低小鼠肝脏eIF4E mRNA水平至小于对照的20％(超过80％抑制)。ISIS 298815还降低eIF4E mRNA水平至对照的大约20％。ISIS 298797处理降低eIF4E mRNA水平至对照的大约30％(70％抑制)并且ISIS 298823处理降低eIF4E mRNA水平至对照的大约37％(63％抑制)。相反，使用ISIS 141923处理没有降低eIF4EmRNA水平并且实际上其增加至盐水对照的大约140％。
还测量了小鼠肝脏EIF4E蛋白质水平。与盐水对照相比，使用ISIS183750、ISIS 299815、ISIS 298797和ISIS 298823处理分别使eIF4E蛋白质水平降低77％、47％、50％和47％；使用对照寡核苷酸ISIS 141923处理使eIF4E蛋白质水平降低12％。
使用任何一个eIF4E反义化合物处理的小鼠基本上不显现肝脏、脾脏或总体重的变化。肝脏酶水平(AST/ALT)没有显著变化并且肝脏组织学表现为与盐水处理对照小鼠相同。
实施例22eIF4E表达的反义抑制对小鼠中人类肿瘤异种移植物的影响使用5×106PC-3前列腺癌细胞(美国典型培养物保藏中心，ManassasVA)在侧腹部皮下注射雄性裸鼠。当肿瘤达到平均大小100mm3时(植入后大约3-3.5周)开始反义处理。在首次剂量通过静脉注射给予小鼠50mg/kg针对eIF4E的反义寡核苷酸ISIS 183750(SEQ ID NO40)或对照寡核苷酸ISIS 141923(SEQ ID NO211)，然后在此后的每个星期一、星期三或星期五给予25mg/kg。肿瘤植入后第54天，使用ISIS 183750处理的小鼠中的肿瘤大小为大约450mm3，与使用对照ISIS 141923处理的小鼠内肿瘤(大约930mm3)相比降低50％。该降低的水平一直持续到第57天研究结束时。
在雌性小鼠中使用MDA-231人乳腺癌细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)也同样进行异种移植。在该实验中，测试了ISIS 183750和ISIS 298815并且与盐水对照相比它们使肿瘤细胞生长降低几乎相等，分别降低55％和50％。通过Western印迹分析(使用来自Pharmingen，San Diego CA的抗eIF4E抗体)测定了这些MDA-231异种移植物中eIF4E蛋白质表达，并且发现与用无关对照寡核苷酸(ISIS 141923，SEQ IDNO211)处理的小鼠中异种移植物相比，用ISIS 183750(SEQ ID NO40)处理的小鼠异种移植物中eIF4E蛋白质表达降低45％且用ISIS 298815(SEQ ID NO97)处理的小鼠异种移植物中降低39％。
eIF4E可以在人类序列的丝氨酸残基209位进行体内磷酸化。磷酸化形式常常被认为是蛋白质的活性状态，其中磷酸化增加常常与蛋白质合成速率上调关联。使用特异性抗磷酸化(pS209)eIF4E的抗体(BioSource，Camarillo CA)的Western印迹证实用反义化合物ISIS 183750和298815处理后eIF4E磷酸化形式降低，而使用反义对照(ISIS 129699)处理的不降低。
细胞周期蛋白D1是eIF4E靶蛋白质并且发现在用针对eIF4E的反义寡核苷酸处理的MDA-231小鼠异种移植物中细胞周期蛋白D1蛋白质也降低了。当与使用无关对照寡核苷酸ISIS 141923处理的小鼠异种移植物中细胞周期蛋白D1相比，使用ISIS 183750处理后细胞周期蛋白D1降低40％并且使用ISIS 298815处理后细胞周期蛋白D1降低几乎50％。
在第三个相似实施的异种移植物研究中，将5×106H460人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)在侧腹部皮下注射入雌性裸鼠。一旦肿瘤达到100mm3的平均大小，开始寡核苷酸静脉给药。反义处理方案为开始为50mg/kg单一剂量的ISIS 141923或ISIS183750，接着在之后的每个星期一、星期三和星期五以25mg/kg给药，总处理时间为17天。在研究结束时，ISIS 141923对照处理组的平均肿瘤体积为大约2000mm3而ISIS 183750处理组为550mm3(p＜0.001)。
实施例23通过短双链RNA寡核苷酸对eIF-4E的抑制作用dsRNA寡核苷酸的设计和合成人类eIF-4E序列Genbank #M15353用于查询序列。所选择序列的G+C含量范围为30％-70％。对eIF-4E特异的和下面所描述的dsRNA序列中的每一个序列在RNA寡核苷酸双链体每一条链的3’末端包含两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(未显示)。基因特异siRNA的合成、双链体形成和纯化由Dharmacon Research公司完成。选择和测试了3个eIF-4E siRNA序列，其序列显示如下eIF4E_1在基因序列中的位置141-159GC含量53％5’-CAGAUGGGCACUCUGGUUU-3’SEQ ID NO2123’-GUCUACCCGUGAGACCAAA-5’SEQ ID NO213eIF4E_2在基因序列中的位置195-213GC含量63％5’-CCUGCGGCUGAUCUCCAAG-3’SEQ ID NO2143’-GGACGCCGACUAGAGGUUC-5’SEQ ID NO215eIF4E_3在基因序列中的位置1010-1028GC含量37％5’-CAACUUGGCAUUUCUAUAC-3’SEQ ID NO216
3’-GUUGAACCGUAAAGAUAUG-5’SEQ ID NO217在每一条链的3’末端也包含两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸并且与pGL3荧光素酶互补的对照dsRNA化合物购自Dharmacon Research公司并且用于下面的分析。
对照5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3’SEQ ID NO2183’-GAAUGCGACUCAUGAAGCU-5’SEQ ID NO219细胞培养LNCaP、PC3、HCT116、MDA-231、MCF-7、T24和CWR22RV1细胞系通过ATCC得到并且生长于含有L-谷氨酰胺和10％FBS(Hyclone)而不含有酚红(Gibco)的RPMI 1640培养基中。
siRNA向哺乳动物细胞内的转染在转染前24小时，将哺乳动物细胞以1×105铺于24孔板。使用Oligofectamine(Invitrogen)进行瞬时转染。简言之，用OptiMEM(Invitrogen)稀释5-500nM浓度(终体积)的各个dsRNA，而将独立的OptiMEM和Oligofectamine的溶液室温孵育5分钟。将两个溶液混合，然后室温孵育30分钟。将包含血清的培养基加入到转染复合物中，终体积为0.5ml/孔。吸掉存在的细胞培养基并且替换为转染复合物，在37℃、5％CO2下孵育48-72小时。
免疫印迹72小时后，轻轻吸掉转染混合物，将细胞在150μl包含完全片剂蛋白酶抑制剂(Roche Molecular Biochemicals)和1mM活化Na3VO5的冰冷RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，1mM EDTA)中裂解，室温孵育30分钟并且储藏于-20℃下1-24小时。将30μl冻融裂解物加至包含0.2M DTT的10μl 4×NuPage样品缓冲液(Invitrogen)中。将样品在85℃加热5分钟并上样于4-20％tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。将胶在含有20％甲醇的1×转移缓冲液中以1100mAH转移至Hybond-P PVDF膜(Amersham Pharmacia Biotech)。膜在包含5％脱脂奶的PBS中封闭1小时。在封闭缓冲液中分别以1∶500和1∶10,000稀释抗eIF4E(BD Biosciences)和抗肌动蛋白(Sigma)的初级抗体，并于4℃孵育16小时。用PBS将膜洗涤三次，接着用抗小鼠次级抗体(SantaCruz)室温孵育2小时。用PBS洗涤印迹膜三次并用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)处理1分钟。将捕捉到的信号记录在Lumi-Imager F1(Roche Molecular Biochemicals)上。使用LumiAnalyst软件将对应于eIF4E和肌动蛋白的条带定量，并且对肌动蛋白标准化(为了控制凝胶加样和转移)后确定eIF4E表达水平。
在LNCaP细胞系中，eIF4E-1、eIF4E-2和eIF4E-3中每一个在小于50nM的浓度时抑制eIF-4E蛋白质水平大于50％。在CWR22RV1细胞系中，小于5nM浓度的eIF4E-2抑制eIF-4E蛋白质水平大于50％。在LNCaP、PC3、HCT116、MDA-231和MCF-7细胞系的每一个中，小于50nM浓度的eIF4E-1和eIF4E-2降低eIF-4E蛋白质水平大于50％。
细胞增殖测定在转染前24小时将细胞以1.5-3.0×103细胞/孔的密度铺于多聚-D-赖氨酸包被的96孔板(Becton Dickinson)。eIF-4E和对照siRNA的转染重复三次，siRNA浓度范围为5nM-500nM。在3、6和8天通过加入终浓度为50μg/ml的碘化丙锭(Sigma)接着避光室温孵育30分钟收获细胞。在冷冻前和冷冻后使用Victor21420多重标记计数器(Wallac)对板进行测量。通过从冷冻后测量值中减去冷冻前测量值得到矫正后的总值。
在LNCaP、PC3和MDA-231细胞系的每一个中，小于50nM浓度的eIF4E-1和eIF4E-2降低细胞增殖大于50％。
实施例24靶向eIF4E的siRNA构建体在HeLa细胞中的活性如先前实施例中所描述制备表5所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。为了比较还测试了几个单链嵌合体反义寡核苷酸。
将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含25nM浓度的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低，对Ribogreen进行标准化。用于先前实施例的人引物/探针组为SEQ ID NO5、6和7。
结果示于表5。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下面的表5中首先显示反义链(AS)接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA(即核糖具有磷酸(P＝O)主链和5’末端羟基)并且除非另外指出为平端(无dTdT或其它悬突)。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每一个C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
表5靶向eIF4E的siRNA构建体在HeLa细胞中的活性
“％抑制”表示与未处理对照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。通过RT-PCR对RNA定量。当“％抑制”为负值时，则表示靶RNA增加。
“靶位点”是指化合物特异性杂交的Genbank登录号M15353.1上靶位点的最5’核苷酸的位置。
“物种”是指反义序列是否与人(h)、大鼠(h)、小鼠(m)和/或兔(rab)eIF4E完全互补。
在该筛选中，发现MOE gapmer比最佳siRNA(88％抑制)对eIF4E的活性稍稍增加(94％抑制)。在先前鉴定的5个MOE gapmer siRNA构建体当中有3个导致位点活化。8个eIF4E siRNA构建体表现为靶标降低70％或更多并且有7个显示降低75％或更多。这与Vickers等(J.Biol.Chem.，2003，278，7108-7118)的结论一致，即通常siRNA寡核苷酸双链体的活性与靶向同一位点的RNA酶H依赖的寡核苷酸(例如MOE gapmer)活性相关联，并且最佳siRNA和RNA酶H依赖的寡核苷酸在潜能、最大作用、特异性以及作用持续阶段和效率方面行为相似。
还测试了上表中化合物在HeLa细胞中降低PTEN RNA水平的能力。没有一个靶向eIF4E的化合物(siRNA或单链MOE gapmer)使PTEN靶RNA水平降低超过大约20％。siRNA阳性对照335449构建体使PTENRNA抑制大约85％并且单链MOE gapmer阳性对照使PTEN RNA抑制大约80％。
实施例25靶向eIF4E的siRNA构建体在MH-S细胞中的活性几乎全部的上表中siRNA化合物对小鼠和人eIF4E mRNA都完全互补。这里在小鼠MH-S鼠尘细胞系中对它们进行测试。小鼠MH-S细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。细胞维持于包含10％热灭活胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)的RPMI 1640培养基中。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibeo BRL)将细胞洗涤一次并且用包含20 nM浓度的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/ml LIPOFECTINTM(GibeoBRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表6。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下面的表6中首先显示反义链(AS)接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每一个C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
靶位点、物种、化学和序列如前表。
表6eIF4E siRNA构建体在MH-S小鼠细胞中的活性
实施例26靶向eIF4E的另外siRNA构建体在HeLa细胞中的活性开展了另外的基因步移(gene walk)以鉴定能抑制eIF4E的其它siRNA。在HeLa细胞中以50nM的浓度筛选构建体。
双链体寡RNA(dsRNA)化合物示于下面的表7，并且如先前实施例所描述进行制备并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas vA)进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。为了比较还测试了几种单链嵌合体反义寡核苷酸。
将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含50nM浓度的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表7。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下面的表7中首先显示反义链(AS)接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
表7eIF4E siRNA在HeLa细胞中的活性
“％抑制”表示与对未处理照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。当“％抑制”为负值时，则表示靶RNA增加。通过RT-PCR对RNA定量。
“靶位点”是指与化合物特异性杂交的Genbank登录号M15353.1上靶位点的最5’核苷酸的位置。
“物种”是指反义序列是否与人(h)、大鼠(h)、小鼠(m)和/或兔(rab)eIF4E完全互补。
实施例27靶向eIF4E的siRNA构建体在MH-S细胞中的活性几乎全部的前表中siRNA化合物对小鼠和人eIF4E mRNA完全互补。这里在小鼠MH-S鼠尘细胞系中对它们进行测试。小鼠MH-S细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。细胞维持于包含10％热灭活胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)的RPMI 1640培养基中。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含50nM浓度的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。结果示于表8。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。显示了反义链；有意链、靶位点、物种、化学和序列如前表。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每一个C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。显示了反义链标识。
表8eIF4E siRNA构建体在小鼠MH-S细胞中的活性
“％抑制”表示与未处理对照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。如果“％抑制”为负值时，则表示靶RNA增加。通过RT-PCR对RNA定量。
“靶位点”是指化合物特异性杂交的Genbank登录号M15353.1上靶位点的最5’核苷酸的位置。
“物种”是指反义序列是否与人(h)、大鼠(h)、小鼠(m)和/或兔(rab)eIF4E完全互补。
实施例28剂量反应实验-eIF4E siRNA构建体在HeLa细胞中的IC50使用上面的处理方法和0.1nM、1.0nM、10nM和100nM浓度的siRNA在HeLa细胞中开展了剂量反应实验，并且计算了某些上述化合物的IC50(IC50为与未处理对照相比导致eIF4E 50％抑制的化合物浓度)。结果示于表9。显示了反义链标识。有意链、靶位点、物种、化学和序列如前表。
表9siRNA化合物在HeLa细胞中的IC50
选择上面siRNA构建体中的4个用于进一步评价和SAR(结构-活性-关系)分析。此处显示了用于siRNA SAR分析的这些母体构建体。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
“338918构建体”有意链5’-UAGAGCUAAAGGUGAUAAGA-3’ISIS 338943(SEQ ID NO237)反义链3’-AUCUCGAUUUCCACUAUUCU-5’ISIS 338918(SEQ ID NO236)“338910构建体”有意链5’-AAGGAUCCAGGAAUAUGACA-3’ISIS 338935(SEQ ID NO221)反义链3’-UUCCUAGGUCCUUAUACUGU-5’ISIS 338910(SEQ ID NO220)“338927构建体”有意链5’-AGAAGACACCUUCUGAGUAU-3’ISIS 338952(SEQ ID NO255)
反义链3’-UCUUCUGUGGAAGACUCAUA-5’ISIS 338927(SEQ ID NO254)“338914构建体”有意链5’-CAUUGGUGAAGGAUCCAGGA-3’ISIS 338939(SEQ ID NO229)反义链3’-GUAACCACUUCCUAGGUCCU-5’ISIS 338914(SEQ ID NO228)实施例29具有交互2’修饰的eIF4E siRNA构建体选自先前实施例的4个siRNA构建体(“母体”构建体)与具有交互2’-O-甲基(2’-O-Me或2’OMe)和2’-氟(2’-F)修饰的siRNA构建体相比较。
如先前实施例中所描述制备了显示于下面表10的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，ManassasVA)进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。为了比较还测试了几种单链嵌合体反义寡核苷酸。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含0.2、2和20nM浓度的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表10。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。对于交互2’-OMe/2’-F修饰化合物，有意链和反义链均被修饰，在有意链的最5’核苷具有2’-F并且在反义链的最5’核苷具有2’-O-Me，以致于两种类型修饰没有记录在双链体分子中。应当指出母体化合物为20mer且2’修饰化合物为19mer，其缺乏对应于有意链(即所示双链体的有意链)最5’端配对的碱基对。它们显示于表10。2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟用下划线表示。未修饰核糖显示为纯大写文本。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
表10具有交互2’-O-Me和2’-F修饰的eIF4E siRNA构建体
“％抑制”表示与未处理对照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。
正常大写字母＝具有磷酸酯主链的未修饰RNA。
2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟用下划线表示。
对于几种构建体，交互2’-O-甲基/2’-氟(2’-OMe/2’F)构建体在降低eIF4E mRNA效率方面与母体(未修饰RNA)构建体相当或者更好。而且，所测试修饰构建体的稳定性是未修饰化合物的8倍以上(详见下面实施例)。
实施例30交互2’-O-甲基/2’-氟siRNA构建体在小鼠血浆中的稳定性使用与先前所述相似的提取和毛细管电泳方法(Leeds等，Anal.Biochem.，1996，235，36-43；Geary等，Anal.Biochem.，1999，274，241-248)自稀释的小鼠血浆分析完整双链体RNA。来自3-6月龄雌性Balb/c小鼠(Charles River Labs)的经肝素处理小鼠血浆从-80℃解冻并用磷酸缓冲盐溶液(140mM NaCl、3mM KCl、2mM磷酸钾、10mM磷酸钠)稀释至25％(v/v)。将大约10nmol预退火siRNA以100μM的浓度加到25％血浆中并于37℃孵育0、15、30、45、60、120、180、240、360和420分钟。在所指定时间，取出等份试样，用EDTA处理至终浓度为2mM，并放置于0℃冰上直到使用毛细管凝胶电泳(具有eCap DNA毛细管的BeckmanP/ACE MDQ-UV)进行分析。测量siRNA双链体峰面积并用于计算完整的剩余siRNA的存在。将腺嘌呤三磷酸(ATP)以2.5mM浓度加入到每一注射作为内部校准标准。用磷酸缓冲盐溶液稀释siRNA为零时间点，接着进行毛细管电泳。将完整siRNA的百分数对时间做图，以便计算准一级反应半寿期。结果示于表11。
表11交互2’-O-甲基/2’-氟siRNA构建体在小鼠血浆中的稳定性
母体(未修饰)构建体在30分钟后降解大约50％并且在4小时后几乎消失(在6小时完全消失)。相反，交互2’-O-甲基/2’-氟构建体相对没有变化并且甚至在6小时后仍存在75％。
实施例31eIF4E siRNA的另外修饰如先前实施例所描述制备并测试了具有各种修饰的另外siRNA构建体。
如先前实施例所描述制备在表12中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞培养方法可以从ATCC获得并且在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含一定浓度范围的目的dsRNA和对于每条寡聚化合物链2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。对于稳定性分析，将siRNA双链体在25％肝素化小鼠血浆中于37℃孵育并通过具有内部参照标准的毛细管凝胶电泳进行分析。
结果示于表12。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每一个C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟代用下划线表示，4’-硫代核苷用小写字母表示并且未修饰核糖以纯大写文本表示。
化合物338918_338943为未修饰(核糖，P＝O主链)母体构建体。349892_338943在反义链位置1-5、8、9、12-17为2’F并且在位置6、7、10、11、18-20为2’Ome；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
345847_345849为在双链上具有交互核糖和2’OMe核苷(没有记录在内)的19mer。有意链的最5’核苷为核糖且反义链的最5’核苷为2’OMe。
351831_351832为在双链上具有交互2’-F和2’OMe核苷(没有记录在内)的19mer。有意链的最5’核苷为2’-F且反义链的最5’核苷为2’OMe。
352824_342764为在反义链每一末端具有三个4’-硫代核苷的19mer(有意链未修饰)。
352827_342764为在反义链5’末端具有三个4’-硫代核苷并且在反义链3’末端具有三个2’-OMe核苷的19mer(有意链未修饰)。
349890_338935为在反义链上具有混合2’-F/2’-OMe修饰的20mer(有意链未修饰)。在反义链的位置1-5、8、9和12-17具有2’-F且在位置6、7、10、11、18-20具有2’-OMe(在5’端开始)。
349891_338939为在反义链上具有混合2’-F/2’-OMe修饰的20mer(有意链未修饰)。在反义链的位置1-5、8、9和12-17具有2’-F且在位置6、7、10、11、18-20具有2’-OMe(在5’端开始)。
351097_338952为在反义链上具有混合2’-F/2’-OMe修饰的20mer(有意链未修饰)。在反义链的位置1-5、8、9和12-17具有2’-F且在位置6、7、10、11、18-20具有2’-OMe(在5’端开始)。
应当指出母体化合物为20mer而一些2’修饰化合物显示为19mer，其缺乏对应有意链(即所显示双链体的有意链)最5’对的碱基对。它们显示于表12。2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟代用下划线表示，4’-硫代核苷用小写字母表示并且未修饰核糖以纯大写文本表示。
表12eIF4E siRNA的另外修饰和活性-总结
正常类型大写字母＝具有磷酸酯主链的未修饰RNA；粗体＝具有磷酸酯主链的2’-O-甲基RNA；下划线＝具有磷酸酯主链的2’-氟RNA；小写字母＝具有磷酸酯主链的4’-硫代RNA；“％抑制”表示与未处理对照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。
2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟代用下划线表示。
混合(封闭)2’-O-甲基/2’-氟代(2’-OMe/2’F)构建体349892_338943在eIF4E mRNA降低效率方面与母体(未修饰RNA)构建体相当或更好。
交互2’-O-甲基/未修饰构建体345847_345849构建体被检测两次，并且显示在eIF4E mRNA降低效率方面与母体(未修饰RNA)构建体相当或更好，且具有增强的稳定性。
4’-硫代封闭修饰构建体352824_342764具有比母体低的活性但具有稳定性高。
4’-硫代/2’-O-甲基构建体352827_342764在效率方面与母体相当。稳定性资料还没有得到。
实施例32缺刻修饰的siRNA构建体-在HeLa细胞中的活性在HeLa细胞中测试了另外的siRNA构建体。如先前实施例所描述制备在表13中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC获得并且在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含0.1、1、10和100 nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/ml LIPOFECTINTM(GibcoBRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
对于稳定性分析，将siRNA双链体在25％肝素化小鼠血浆中于37℃孵育并通过具有内部参照标准的毛细管凝胶电泳进行分析。结果示于表13。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。除非另外指出，单链反义分子为嵌合体缺刻寡核苷酸，在核苷酸1-5和16-20为2’-MOE并且在位置6-15为2’-脱氧核苷酸，在每一个C上为硫代磷酸酯(P＝S)主链和5-甲基胞嘧啶。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
化合物338918_338943为未修饰(核糖，P＝O主链)母体构建体。349892_338943在反义链位置1-5、8、9、12-17为2’F并且在位置6、7、10、11、18-20为2’Ome；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
349896_338943在反义链位置1-5为2’F、位置6-15为核糖并且位置16-20为2’Ome，从AS链5’端开始计数；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
349894_338935在反义链位置1-5为2’F、位置6-15为核糖并且位置16-20为2’Ome，从AS链5’端开始计数；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
349895_338939在反义链位置1-5为2’F、位置6-15为核糖并且位置16-20为2’Ome，从AS链5’端开始计数；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
349897_338952在反义链位置1-5为2’F、位置6-15为核糖并且位置16-20为2’Ome，从AS链5’端开始计数；有意链不修饰(核糖，P＝O主链)。
它们显示于表13。2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟代用下划线表示，4’-硫代核苷用小写字母表示并且未修饰核糖以纯文本表示。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
表13缺刻修饰eIF4E siRNA的活性
正常类型大写字母＝具有磷酸酯主链的未修饰RNA；粗体＝具有磷酸酯主链的2’-O-甲基RNA；下划线＝具有磷酸酯主链的2’-氟代RNA；小写字母＝具有磷酸酯主链的4’-硫代RNA；“％抑制”表示与未处理对照细胞相比在用siRNA双链体(或所显示的其它化合物)处理的细胞中eIF4ERNA降低的百分数。
2’-O-甲基核苷用粗体显示；2’-氟代用下划线表示。
实施例33交互2’-Ome修饰平端(无dT悬突)19mer siRNA在HeLa细胞中的活性—在eIF4E_1(341887)周围微步移(microwalk)如先前实施例所描述制备在表14中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次并且用包含0.2、2和20nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μLOPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表14。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表14中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。
338932为靶向eIF4E_1(341887)19mer位点的具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖20mer。
338957为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖20mer。
346658为靶向eIF4E_1(341887)位点的具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer(无dT)。
346660为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer。
346661为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
346659为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
346662为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer。
346664为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer。
346665为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
346663为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
346666为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer。
346668为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’磷酸的未修饰核糖19mer。
346669为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
346667为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
表14在eIF4E_1(341887)周围微步移的交互2’-O-Me/核糖平端19mer
实施例34交互2’-Ome修饰平端21mer siRNA在HeLa细胞中的活性-在eIF4E_1(341887)周围微步移如先前实施例所描述制备在表15中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.2、2和20 nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表15。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表15中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。
338932为靶向eIF4E_1位点的具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338957为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
346674为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖21mer。
346676为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖21mer。
346675为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe21mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21上为2’OMe。
表13
克/英寸本发明转移带的特征在于粘着可以重复若干次。
此外，测定这些转移带的透湿性，以水分蒸汽转换率(MVTR，g/m2*24小时)为准。结果示于表14。
表14
g/m2*24小时当涂布厚度增加到0.8毫米时，水分蒸汽变得难以通过粘合层且MVTR降低到1,000g/m2*24小时或以下。但是，类似于实施例1和2的医用胶粘带，这些转移带没有透水且显示出令人满意的防水性。当粘合厚度增加到约0.8毫米时，水分蒸汽透过性恶化，但是，转移带具有防水性，可以被剥离且在剥离时具有降低的皮肤刺激，可以用于重复粘着且几乎无气味。因此，所述转移带能有效用于其中固定位置应该受控的假发固定场合或者其中所述带要连续不断地固定或必须周期性更换的使用场合中。
(实施例4)
实施例354’-硫代核糖修饰19mer siRNA在HeLa细胞中的活性如先前实施例所描述制备在表16中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.02、0.2、2和20nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表16。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表16中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。未修饰核糖核苷用纯大写字母表示并且4’硫代用小写字母表示。表16中的所有序列为SEQ ID NO301(反义链)/SEQ ID NO302(有意链)的19mer。
342744为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖19mer。
342764为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖19mer。
352824在位置1、2、3、17、18和19具有4’-硫代核苷(即在每一末端具有三个)且在位置4-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352819在位置1、2、3、4、16、17、18和19具有4’-硫代核苷(即在每一末端具有四个)且在位置5-14具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352827在位置1、2、3具有4’-硫代核苷且在位置17、18和19具有2’-OMe并且在位置4-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352826在位置1、2、3、10、13和17-19具有4’-硫代核苷并且在位置4-9、11、12和14-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352825在位置1、2、3、7、10、13和17-19具有4’-硫代核苷并且在位置4、5、6、8、9、11、12和14-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
表164’-硫代核糖修饰19mer siRNA的活性
几个4’-硫代构建体显示具有皮摩尔范围内的IC50。
实施例36基于338914构建体的具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4EsiRNA的活性如先前实施例所描述制备在表17中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.0rg中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.5、5和50nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复进行两次。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表17。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表17中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。未修饰核糖核苷用纯大写字母表示。
338914为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338939为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
345840为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe 19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
345842为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe 19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
345735为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置16-20为2’O-Me核苷且位置1-15为核糖。
345843为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置2-19为2’O-Me核苷且位置1和20为核糖。
345838为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置6、12、15和18-20为2’O-Me核苷且位置1-5、7-11、13、14、16、17和20为核糖。
345839为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置6、7、10、11和18-20为2’O-Me核苷且位置1-5、8、9和12-17为核糖。
表17具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA的活性-基于338914构建体的
实施例37具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA的活性-基于338910构建体如先前实施例所描述制备在表18中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.5、5和50nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表18。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表18中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。
338910为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338935为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
345731为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
345733为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
345713为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置1-15为核糖且位置16-20为2’OMe核苷。
345734为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置1和20为核糖且位置2-19为2’OMe核苷。
345729为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置1-5、7、8、10、11、13、14、16和17为核糖且位置6、9、12、15和18-20为2’OMe核苷。
345730为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的位置1-5、8、9、12、13、14、15、16和17为核糖且位置6、7、10、11和18-20为2’OMe核苷。
表18具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA-基于338910构建体
实施例38具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA的活性-基于338927构建体的如先前实施例所描述制备在表19中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.5、5和50nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表19。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表19中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。
338927为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338952为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
345854为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
345856为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
345851为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-15为核糖且位置16-20为2’OMe核苷。
345857为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1和20为核糖且位置2-19为2’OMe核苷。
345852为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-5、7、8、10、11、13、14、16和17为核糖且位置6、9、12、15和18-20为2’OMe核苷。
345853为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-5、8、9、12、13、14、15、16和17为核糖且位置6、7、10、11和18-20为2’OMe核苷。
表19具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA-基于338927构建体
实施例39具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA-基于338918构建体如先前实施例所描述制备在表20中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.5、5和50nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表20。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表20中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。
338918为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338943为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
345847为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17和19上为2’OMe。
345849为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe的19mer。从5’端开始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16和18上为2’OMe。
345844为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-15为核糖且位置16-20为2’OMe核苷。
345850为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1和20为核糖且位置2-19为2’OMe核苷。
345845为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-5、7、8、10、11、13、14、16和17为核糖且位置6、9、12、15和18-20为2’OMe核苷。
345846为具有磷酸酯主链和5’末端磷酸的20mer，在从5’端开始的核苷1-5、8、9、12、13、14、15、16和17为核糖且位置6、7、10、11和18-20为2’OMe核苷。
表20具有2’-O-甲基修饰的另外eIF4E siRNA-基于338918构建体
实施例404’-硫代核糖修饰的和混合的19mer siRNA在HeLa细胞中的活性如先前实施例所描述制备在表21中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。用于HeLa细胞的培养方法可以从ATCC得到并且可以在例如www.atcc.org中找到。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μLOPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.02、0.2、2和20nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表21。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表21中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。全部都是SEQ ID NO301(反义链)/SEQ ID NO302(有意链)的19mer。
342744为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖19mer。
342764为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖19mer。
352824在核苷位置1、2、3、17、18和19具有4’-硫代(即在每一末端具有三个)且在位置4-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352819在位置1、2、3、4、16、17、18和19具有4’-硫代核苷(即在每一末端具有四个)且在位置5-14具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352827在位置1、2、3具有4’-硫代核苷且在位置17、18和19具有2’-OMe并且在位置4-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352826在位置1、2、3、10、13和17-19具有4’-硫代核苷并且在位置4-9、11、12和14-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
352825在位置1、2、3、7、10、13和17-19具有4’-硫代核苷并且在位置4、5、6、8、9、11、12和14-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
354604在位置1、2、3具有4’-硫代核苷且在位置17、18和19具有2’-OMe并且在位置4-16具有核糖。主链为P＝O，5’末端为磷酸。
表214’-硫代核糖修饰和混合的19mer siRNA在HeLa细胞中的活性
几个4’-硫代构建体显示具有皮摩尔范围内的IC50。
实施例41靶向eIF4E的siRNA构建体在U-87 MG成胶质细胞瘤细胞中的活性使用上面描述的方法测试了先前表中所示的修饰和未修饰siRNA构建体在U-87 MG细胞中降低人eIF4E mRNA水平的能力。U-87人成胶质细胞瘤细胞系从ATCC(Rockville Md.)获得并维持于添加有热灭活10％胎牛血清的Iscove′s DMEM培养基中。如先前实施例所描述开展剂量反应实验以获得IC50值。
实施例42靶向人eIF4E的另外siRNA设计了靶向人eIF4E mRNA(Genbank登录号M15353.1，SEQ ID NO4)的另外siRNA。所有siRNA在反义链上具有交互2’-O-甲基/2’-OH且在有意链上具有交互2’-OH/2’-O-甲基。主链为磷酸酯(P＝O)且5’末端为5’-OH，虽然应该理解文中所示的这些和其它siRNA构建体也可以合成具有5’-磷酸基团。
反义链示于表22；有意链为完全互补的因此未显示。
“靶位点”指寡核苷酸所靶向的M15353.1人eIF4E序列(SEQ ID NO4)中靶区域的最5’位置。
表22靶向人eIF4E的另外siRNA
实施例43靶向eIF4E的另外反义化合物合成了一组均匀的2’-O-甲氧乙基(2’-MOE)硫代磷酸酯寡核苷酸，全部均靶向于eIF4E mRNA的5’帽子区域，即与5’帽子邻接的极其靠近5’端的mRNA。它们示于表23。所有胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。不希望被理论所束缚，认为完全进行2’-MOE修饰的寡核苷酸不是RNA酶H的底物，并因此认为通过占位(occupancy-only)或立体位阻机制而不是通过mRNA靶标降解来干扰蛋白质翻译。“靶位点”指eIF4E mRNA(如所指出的SEQID NO4或11)上的位置。
表23靶向eIF4E mRNA 5’帽子区域的2’-O-甲氧乙基反义寡核苷酸
还合成了一系列PNA寡聚物，所述寡聚物与表23中的寡核苷酸靶向同一位点。它们示于表24。每一个寡聚物在其3’端具有赖氨酸。由于具有完全修饰的2’MOE化合物，认为PNA寡聚物不是RNA酶H的底物。
表24靶向eIF4E mRNA 5’帽子区域的PNA反义寡聚物
实施例44LNA和2’-OMe修饰的siRNA如先前实施例所描述制备在表14中所示的双链体寡聚RNA(dsRNA)化合物，并且在HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)中进行评价。将细胞以5000细胞/孔的密度铺于96孔板并且生长于含有高葡萄糖、10％FBS、1％青霉素/链霉素的DMEM中。用200μL OPTI-MEM-1TM降低血清培养基(Gibco BRL)将细胞洗涤一次然后用包含0.2、2和20nM浓度的目的dsRNA和对于每条链寡聚化合物2.5μl/ml LIPOFECTINTM(Gibco BRL)的130μL OPTI-MEM-1TM处理。处理重复两次进行。处理4或5小时后，用新鲜培养基替换培养基。dsRNA处理后16或18小时收获细胞，在此时分离RNA并且如先前实施例所描述通过RT-PCR测量靶标的降低。
结果示于表25。所显示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表25中首先显示反义链(AS)，接着在下一行显示有意链(S)。除非另外指出，所有双链构建体为非修饰RNA，即核糖具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端羟基。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。2’-O-甲基核苷用粗体显示。LNA核苷用斜体表示。
338910为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338935为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
352493为在位置6、9、12和15具有LNA(斜体)、在位置18-20具有2’-O-甲基(粗体)并且在剩余位置为核糖的20mer。
338914为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338939为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
352494为在位置6、9、12和15具有LNA(斜体)、在位置18-20具有2’-0-甲基(粗体)并且在剩余位置为核糖的20mer。
338918为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338943为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
352495为在位置6、9、12和15具有LNA(斜体)、在位置18-20具有2’-O-甲基(粗体)并且在剩余位置为核糖的20mer。
338927为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
338952为具有磷酸酯(P＝O)主链和5’末端磷酸的未修饰核糖20mer。
352496为在位置6、9、12和15具有LNA(斜体)、在位置18-20具有2’-O-甲基(粗体)并且在剩余位置为核糖的20mer。
表25LNA和2’-OMe修饰的siRNA
实施例45靶向人eIF4E的另外siRNA的活性测试了来自表22的siRNA在HeLa细胞内降低eIF4E RNA水平的能力。将这些化合物设计成针对人eIF4E mRNA(Genbank登录号M15353.1，SEQ ID NO4)。除非指出，反义链从位置1的2’-O-甲基开始为交互2’-O-甲基/核糖(即奇数位置为2’-O-甲基且偶数位置为核糖)并且有意链从位置1的核糖开始为交互核糖/2’-O-甲基(即奇数位置为核糖且偶数位置为2’-O-甲基)。主链为磷酸酯(P＝O)且5’末端为5’-OH，虽然应该理解此处所示的这些及其它siRNA构建体也可以合成为具有5’-磷酸基。应当注意ISIS351831_351832构建体与345847 345849构建体具有相同的序列但是前者为交互的2’-O-甲基/2’-氟(反义链上的奇数位置为2’-O-甲基且偶数位置为2’-氟；有意链奇数位置为2’F且偶数位置为2’-O-甲基)。
如上面实施例在HeLa细胞中测试了5nM低剂量的表26所示化合物。结果示于表26。所示siRNA构建体由一条反义链和一条有意链组成。在下表中首先显示反义链(AS)接着在下一行显示有意链。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。结果表示为表26中的eIF4E RNA的降低百分数(“％抑制”)。“靶位点”指寡核苷酸所靶向的M15353.1人eIF4E序列(SEQ ID NO4)中靶区域的最5’位置。
表26靶向人eIF4E的另外siRNA的活性
其反义链具有SEQ ID NO236、301、343、347、355、359、360、361、363、364、365、367、370、372、373、374、375、376、384、387或391的siRNA双链体在该测定中抑制eIF4E至少10％。
实施例46靶向eIF4E的单链反义RNA(asRNA)合成了一系列靶向人eIF4E(SEQ ID NO4)的单链RNA反义寡核苷酸。全部都是整个主链为硫代磷酸酯键且具有5’磷酸帽子的RNA(核糖)。人脐静脉内皮细胞系HuVEC从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。HuVEC细胞常规培养于添加了SingleQuots补充物(C1oneticsCorporation，WalkersVille，MD)的EBM中(Clonetics Corporationwalkersville，MD)。当细胞达到90％汇合时通过胰酶消化和稀释常规传代，并且维持高达15代。将细胞以10000细胞/孔的密度接种于96孔板(Falcon-Primaria#3872)用于使用RNA寡核苷酸(30nM浓度的寡核苷酸)处理。序列和处理结果(eIF4E RNA水平的降低)示于表27。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。如在上面的实施例一样，“靶位点”指寡核苷酸所靶向的M15353.1人eIF4E序列(SEQ ID NO4)中靶区域的最5’位置。“％抑制”指eIF4E RNA降低百分数(显示为±标准差)。
表27靶向eIF4E的单链反义RNA在HuVEC细胞中的活性
如上面表中所示，全部单链反义RNA化合物能够降低人eIF4E RNA水平至少10％。降低eIF4E RNA水平至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的化合物特别适宜用作eIF4E表达的抑制剂。
在本实验中ISIS 347402(SEQ ID NO228)使得eIF4E表达降低最大。使用1nM、10nM和100nM浓度的反义RNA在HeLa细胞中进行了该单链反义RNA化合物的剂量反应分析。ISIS 347402对eIF4E表达具有剂量依赖抑制，在10nM浓度时eIF4E表达降低41％并且在100nM时降低67％(在该实验中1nM剂量没有作用)。
实施例47具有对应于单链反义RNA化合物的反义链序列的双链siRNA化合物的活性如先前实施例制备了双链RNA化合物。双链体的反义链在序列上与先前实施例中所使用的单链反义RNA化合物相同，但是具有磷酸二酯(P＝O)主链。有意链与反义链完全互补(因此形成平端20mer双链体)并且也具有P＝O主链。两条链都是未修饰RNA。如先前siRNA实施例中所描述，使用25nM浓度的siRNA双链体处理HeLa细胞。处理对HeLa细胞中eIF4E RNA水平的影响如表28所示。“％抑制”是指eIF4E RNA的降低百分数(显示为±标准差)。在表28中仅显示了反义链的序列。在本领域应当理解对于RNA序列U(尿嘧啶)通常取代DNA或DNA样序列中正常存在的T(胸腺嘧啶)。
表28对应于单链反义RNA化合物的双链siRNA化合物的活性
其反义链具有SEQ ID NO220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266或268的双链RNA反义化合物对eIF4E RNA水平至少抑制10％。其反义链具有SEQ ID NO220、224、226、228、230、232、236、238、240、246、250、254、256、260、262、264或268的双链RNA反义化合物对eIF4E RNA水平至少抑制50％，并且因此是eIF4E表达的特别适宜抑制剂。
因此单链和双链反义RNA化合物都能够引起eIF4E RNA水平的抑制。其单链和双链形式都有活性的化合物(即具有或不具有互补有意链的活性反义链)认为是特别有用的。
除了文中所描述的那些之外，来自上述说明书的本发明多种修饰对本领域技术人员是显而易见的。此类修饰也旨在处于后附权力要求范围内。本申请引用的每一参考(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公开、国际专利申请公开、基因银行登录号等等)在本文整合引用作为参考。2004年9月18日提交的美国临时申请序列号60/504,110和2004年6月3日提出的美国临时申请序列号60/576,534在本文整合引用作为参考。
序列表<110>ISIS药物公司伊莱利利公司<120>eIF4E表达的调节<130>ISIS0135-500WO(RTS-0552WO)<150>60/504,110<151>2003-09-18<150>60/576,534<151>2004-06-03<160>459<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>1tccgtcatcg ctcctcaggg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>2gtgcgcgcga gcccgaaatc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>3atgcattctg cccccaagga 20
<210>4<211>1842<212>DNA<213>人类<220>
<220>
<221>CDS<222>(19)...(672)<400>4cgatcagatc gatctaag atg gcg act gte gaa ccg gaa acc acc cct act 51Met Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Thr Pro Thr1 5 10cct aat ccc ccg act aca gaa gag gag aaa acg gaa tct aat cag gag 99Pro Asn Pro Pro Thr Thr Glu Glu Glu Lys Thr Glu Ser Asn Gln Glu15 20 25gtt gct aac cca gaa cac tat att aaa cat ccc cta cag aac aga tgg 147Val Ala Asn Pro Glu His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp30 35 40gca ctc tgg ttt ttt aaa aat gat aaa agc aaa act tgg caa gca aac 195Ala Leu Trp Phe Phe Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn45 50 55ctg cgg ctg atc tcc aag ttt gat act gtt gaa gac ttt tgg gct ctg 243Leu Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu60 65 70 75tac aac cat atc cag ttg tct agt aat tta atg cct ggc tgt gac tac 291Tyr Asn His Ile Gln Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr80 85 90tca ctt ttt aag gat ggt att gag cct atg tgg gaa gat gag aaa aac 339Ser Leu Phe Lys Asp Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn95 100 105aaa cgg gga gga cga tgg cta att aca ttg aac aaa cag cag aga cga 387Lys Arg Gly Gly Arg Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg110 115 120agt gac ctc gat cgc ttt tgg cta gag aca ctt ctg tgc ctt att gga 435Ser Asp Leu Asp Arg Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly125 130 135gaa tct ttt gat gac tac agt gat gat gta tgt ggc gct gtt gtt aat 483Glu Ser Phe Asp Asp Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn140 145 150 155gtt aga gct aaa ggt gat aag ata gca ata tgg act act gaa tgt gaa 531Val Arg Ala Lys Gly Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu
160 165 170aac aga gaa gct gtt aca cat ata ggg agg gta tac aag gaa agg tta579Asn Arg Glu Ala Val Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu175 180 185gga ctt cct cca aag ata gtg att ggt tat cag tcc cac gca gac aca627Gly Leu Pro Pro Lys Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr190 195 200gct act aag agc ggc tcc acc act aaa aat agg ttt gtt gtt taa672Ala Thr Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val *205 210 215gaagacacct tctgagtatt ctcataggag actgcgtcaa gcaatcgaga tttgggagct 732gaaccaaagc ctcttcaaaa agcagagtgg actgcattta aatttgattt ccatcttaat 792gttactcaga tataagagaa gtctcattcg cctttgtctt gtacttctgt gttcattttt 852tttttttttt tttggctaga gtttccacta tcccaatcaa agaattacag tacacatccc 912cagaatccat aaatgtgttc ctggcccact ctgtaatagt tcagtagaat taccattaat 972tacatacaga ttttacctat ccacaatagt cagaaaacaa cttggcattt ctatacttta 1032caggaaaaaa aattctgttg ttccatttta tgcagaagca tattttgctg gtttgaaaga 1092ttatgatgca tacagttttc tagcaatttt ctttgtttct ttttacagca ttgtctttgc 1152tgtactcttg ctgatggctg ctagatttta atttatttgt ttccctactt gataatatta 1212gtgattctga tttcagtttt tcatttgttt tgcttaaart tttttttttt ttttcctcat 1272gtaacattgg tgaaggatcc aggaatatga cacaaaggtg gaataaacat taattttgtg 1332cattctttgg taattttttt tgttttttgt aactacaaag ctttgctaca aatttatgca 1392tttcattcaa atcagtgatc tatgtttgtg tgatttccta aacataattg tggattataa 1452aaaatgtaac atcataatta cattcctaac tagaattagt atgtctgttt ttgtatcttt 1512atgctgtatt ttaacacttt gtattactta ggttattttg ctttggttaa aaatggctca 1572agtagaaaag cagtcccatt catattaaga cagtgtacaa aactgtaaat aaaatgtgta 1632cagtgaattg tcttttagac aactagattt gtccttttat ttctccatct ttatagaagg 1692aatttgtact tcttattgca ggcaagtctc tatattatgt cctcttttgt ggtgtcttcc 1752atgtgaacag cataagtttg gagcactagt ttgattatta tgtttattac aatttttaat 1812aaattgaata ggtagtatca tatatatgga 1842<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PcR引物<400>5tggcgactgt cgaaccg 17<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6agattccgtt ttctcctctt ctgtag26<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR探针<400>7aaaccacccc tactcctaat cccccg26<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8gaaggtgaag gtcggagtc19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9gaagatggtg atgggatttc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR探针
<400>10caagcttccc gttctcagcc 20<210>11<211>2763<212>DNA<213>小家鼠<220>
<220>
<221>CDS<222>(15)...(668)<400>11gagatcgatc taag atg gcg act gtg gaa ccg gaa acc acc cct acc act 50Met Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Thr Pro Thr Thr1 5 10aat ccc cca cct gca gaa gag gaa aaa aca gag tct aat caa gag gtt 98Asn Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Lys Thr Glu Ser Asn Gln Glu Val15 20 25gct aac cca gag cac tat att aaa cac cct cta cag aac agg tgg gca 146Ala Asn Pro Glu His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp Ala30 35 40ctc tgg ttt ttt aaa aat gat aaa agc aaa act tgg caa gca aac ctt 194Leu Trp Phe Phe Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn Leu45 50 55 60cga ttg atc tct aag ttt gat act gtt gaa gac ttt tgg gct cta tac 242Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu Tyr65 70 75aac cat atc cag ttg tct agt aat tta atg cct ggc tgt gac tac tca 290Asn His Ile Gln Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr Ser80 85 90ctt ttt aag gac ggg att gag cct atg tgg gaa gat gag aaa aac aaa 338Leu Phe Lys Asp Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn Lys95 100 105cga gga gga cgg tgg ctg atc aca ctg aac aag cag cag aga cgg agt 386Arg Gly Gly Arg Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg Ser110 115 120gac ctc gat cgc ttc tgg cta gag aca ctg ctg tgc ctt att gga gaa 434Asp Leu Asp Arg Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly Glu125 130 135 140tct ttc gat gac tac agt gat gat gtg tgt gga gct gtt gtt aat gtt 482Ser Phe Asp Asp Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn Val145 150 155
aga gct aaa ggc gat aag ata gca ata tgg act act gag agt gaa aac530Arg Ala Lys Gly Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Ser Glu Asn160 165 170aga gat gca gtc aca cac ata ggg agg gta tac aag gaa agg tta gga578Arg Asp Ala Val Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu Gly175 180 185ctt cct ccg aag ata gtg att ggt tat cag tcc cac gca gac aca gct626Leu Pro Pro Lys Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr Ala190 195 200aca aag agc ggc tcc acc act aaa aat agg ttt gtt gtt taa668Thr Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val *205 210 215aaagacacct tctgagtatt ctcacaggag actgcgtcac gcaatcgaga ttgggagctg 728aaccaaagcc tcatcaaagc agagtggact gcactgaagt tgattccatc caagtgttgc 788taagatataa gagaagtctc attcgccttt gtcttgtact tctgtgttca ttctcctccc 848ccacccccaa tttttgctag tgtgtccact atcccaatca aagaattaca gtatacgtca 908ccccagaacc cgcagatgtg ttcctggccc gctctgtaac agccggttag aattaccatg 968acacacacat ttgcctttcc acagtattcg aaaaagaact tgcatttcta ttaccttagc 1028aggaaagatc tggttttgct ccactccatg caggagcgga ctttgctggt gtgagagtct 1088gagtacagct ttctagcaac cttctgtttc ctttcacagc attgtccttg ctgtcctctt 1148gctgatggct gctagattta atttatttgc ttccctcctt gataacatta gtgattctga 1208tttcagtttt tcatttgttt tgcttttgtt tttttcctcg tgtaacattg gtgaaggatc 1268caggaatatg acagaaaggt ggaataaaca ttaaatttgt gcattctttg gtaatttttt 1328tgtttcttgt aactacaaag ctttgctaca aatttatgca tttcattcaa atcagtgatc 1388tatgtctgtg tgatccctaa acataattgt ggactataaa aatgtaacac cataattaca 1448ttcctaacta gaattagtat gtctgccttt gtatctctat gctgtacttt aacactttgt 1508attcttaggt tattttgctt tggttacaat ggctcaagta gaaaagcggt cccatccata 1568ttaagacagt gtacaaaact gtaaataaaa tgtgtacagt gaattgtctt ttagacaact 1628agatttgtcc tttatttctc catctctaga aggaatctgt acttcgtatt gcaaggcagt 1688ctcttgtgtc ttcttagagt gtcttcccca tgcacagcct cagtttggag cactagttta 1748ttatgtttat tacaattttt aataaattga ctaggtagta tcacatgtaa ttacactgat 1808gtggctatct ttttaataaa gttaaggcac agttgctcag tcctaggttg agtgatggac 1868tttgactatg ttacagttga tgaggattgg ggttttggtg catcaccatt cggtaggaac 1928agcggctaga aactgattgt tgggtttaag atgtttttac ttaatggcca gaaaattagc 1988gtaaggaaag tatatagaga aacatgcgtt agggacatta gtgttactat ctgaataaaa 2048cacaataaac aagtattaag aactacttat attggtcaat tgttgcagta tggttttctg 2108taaacttgaa accttgatct attctttgta tcatttaaag caaacatgaa gacattttgt 2168ctgcagtacg taattgtata gttcagatcc tgtgagatga ggtgtggctg ttaacgccga 2228agggtaagct gaactgtggg tagcagagtg gaaaccattg gctgagagaa aaatgctctt 2288taagtggtgg ttgttatgaa ttcacactga taacttgata aagatcctta taaaatacat 2348acggaattaa tagcattgct cttattatgt acgtcaagaa tgtataaccg cctgctcttg 2408ttgtcacaga taactccctg ttcagtgctt tggaaatagc gatgctcacg atctcagcat 2468tctgtaccct acatctactg tgtggatcat tgagagatct tttgacattg caacatgata 2528tggtctatgt tgggctgcat tcctggctgt cttgtatgag accccggttg gctccctgaa 2588gctgattgat acagtgtaca ggcatgaagg tggctgatga ggctttctta ccaacatgtg 2648ggattctagt agttgtatct attagagatt aattctcata ttccttttca ttcatttgta 2708agaagtatca actttagaag tgaaaaaaga atcataaaat acagttttta aagtt 2763<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<223>反义化合物<400>112catagatcac tgatttgaat 20<210>113<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>反义化合物<400>113ctagttagga atgtaattat 20<210>114<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>114taattctagt taggaatgta 20<210>115<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>115cagacatact aattctagtt 20<210>116<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>116gcttttctac ttgagccatt 20<210>117<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物
<400>117ttgtacactg tcttaatatg 20<210>118<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>118cagttttgta cactgtctta 20<210>119<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>119atttacagtt ttgtacactg 20<210>120<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>120gtacacattt tatttacagt 20<210>121<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>121aaggacaaat ctagttgtct 20
<210>122<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>122tttcacactc agtagtccat 20<210>123<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>123atggactact gaatgtgaaa 20<210>124<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>124gattggttat cagtcccacg 20<210>125<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>125gtcagaaaac aacttggcat 20<210>126<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>126taatgttaga gctaaaggtg 20<210>127<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>127tccaccacta aaaataggtt 20<210>128<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>128actcttgctg atggctgcta 20<210>129<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>129gatggctgct agattttaat 20<210>130<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>130cagtcccatt catattaaga 20<210>131<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>131
ttgtttaaga agacaccttc 20<210>132<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>132ggttatcagt cccacgcaga 20<210>133<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>133actgcgtcaa gcaatcgaga 20<210>134<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>134gtgaaaacag agaagctgtt 20<210>135<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>135gctgatggct gctagatttt 20<210>136<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>136gaacactata ttaaacatcc 20
<210>137<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>137aagctttgct acaaatttat 20<210>138<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>138attatgatgc atacagtttt 20<210>139<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>139aagtgacctc gatcgctttt 20<210>140<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>140aaggatccag gaatatgaca 20<210>141<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>141ccattttatg cagaagcata 20
<210>142<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>142actaagagcg gctccaccac 20<210>143<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>143tatgatgcat acagttttct 20<210>144<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>144atctaagatg gcgactgtcg 20<210>145<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>145ttctatactt tacaggaaaa 20<210>146<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>146tgtcttccat gtgaacagca 20
<210>147<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>147gtttggagca ctagtttgat 20<210>148<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>148agacacagct actaagagcg 20<210>149<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>149cgatctaaga tggcgactgt 20<210>150<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>150tctaatcagg aggttgctaa 20<210>151<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>151caggaggttg ctaacccaga 20<210>152
<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>152tgataaaagc aaaacttggc 20<210>153<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>153gcaaaacttg gcaagcaaac 20<210>154<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>154gttgaagact tttgggctct 20<210>155<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>155tacaaccata tccagttgtc 20<210>156<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>156ccatatccag ttgtctagta 20<210>157
<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>157tccagttgtc tagtaattta 20<210>158<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>158ttgtctagta atttaatgcc 20<210>159<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>159atttaatgcc tggctgtgac 20<210>160<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>160atgcctggct gtgactactc 20<210>161<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>161tggctgtgac tactcacttt 20<210>162<211>20
<212>DNA<213>人类<220>
<400>162gactactcac tttttaagga 20<210>163<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>163attgagccta tgtgggaaga 20<210>164<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>164gcctatgtgg gaagatgaga 20<210>165<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>165tgtgggaaga tgagaaaaac 20<210>166<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>166tgccttattg gagaatcttt 20<210>167<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>167gatgactaca gtgatgatgt 20<210>168<211>20<212>DNA<213>A类<220>
<400>168gctgttgtta atgttagagc 20<210>169<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>169tagagctaaa ggtgataaga 20<210>170<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>170ctaaaggtga taagatagca 20<210>171<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>171gataagatag caatatggac 20<210>172<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>172atagcaatat ggactactga 20<210>173<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>173atagggaggg tatacaagga 20<210>174<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>174gagggtatac aaggaaaggt 20<210>175<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>175tatacaagga aaggttagga 20<210>176<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>176gaaaggttag gacttcctcc 20<210>177<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>177aagatagtga ttggttatca 20<210>178<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>178tcccacgcag acacagctac 20<210>179<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>179aagagcggct ccaccactaa 20<210>180<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>180ggtttgttgt ttaagaagac 20<210>181<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>181agaagacacc ttctgagtat 20<210>182<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>182acaccttctg agtattctca 20<210>183<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>183gcaatcgaga tttgggagct 20<210>184<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>184ttgggagctg aaccaaagcc 20<210>185<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>185agatataaga gaagtctcat 20<210>186<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>186taagagaagt ctcattcgcc 20<210>187<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>187agtctcattc gcctttgtct 20<210>188<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>188cattcgcctt tgtcttgtac 20<210>189<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>189tccactatcc caatcaaaga 20<210>190<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>190tcccaatcaa agaattacag 20<210>191<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>191ctcttgctga tggctgctag 20<210>192<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>192attagtgatt ctgatttcag 20<210>193<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>193tgtaacattg gtgaaggatc 20<210>194<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>194cattggtgaa ggatccagga 20<210>195<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>195gtaactacaa agctttgcta 20<210>196<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>196ttatgcattt cattcaaatc 20<210>197<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>197catttcattc aaatcagtga 20<210>198<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>198attcaaatca gtgatctatg 20<210>199<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>199tacattccta actagaatta 20<210>200<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>200aactagaatt agtatgtctg 20<210>201<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>201aatggctcaa gtagaaaagc 20<210>202<211>20<212>DNA
<213>人类<220>
<400>202catattaaga cagtgtacaa 20<210>203<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>203taagacagtg tacaaaactg 20<210>204<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>204cagtgtacaa aactgtaaat 20<210>205<211>20<212>DNA<213>人类<220>
<400>205actgtaaata aaatgtgtac 20<210>206<211>20<212>DNA<213>小家鼠<220>
<400>206atggactact gagtgtgaaa 20<210>207<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>n为任何碱基<222>位置1-20<223>反义化合物<400>207nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20<210>208<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>208ttcgcggctg gacgattcag 20<210>209<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>209ggatagaacg cgaaagcttg 20<210>210<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>210tgttacagtc ttgtaccctt 20<210>211<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>反义化合物<400>211ccttccctga aggttcctcc 20<210>212<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>212cagaugggca cucugguuu19<210>213<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>213gucuacccgu gagaccaaa19<210>214<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>214ccugcggcug aucuccaag19<210>215<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>215ggacgccgac uagagguuc19<210>216<211>19<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>216caacuuggca uuucuauac19<210>217<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>217guugaaccgu aaagauaug19<210>218<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>218cuuacgcuga guacuucga19<210>219<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>219gaaugcgacu caugaagcu19<210>220<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>220ugucauauuc cuggauccuu 20<210>221<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>221aaggauccag gaauaugaca 20<210>222<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>222ggaggaaguc cuaaccuuuc 20<210>223<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>223gaaagguuag gacuuccucc 20<210>224<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>224ggcuuugguu cagcucccaa 20<210>225<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>225uugggagcug aaccaaagcc 20<210>226<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>226ggcgaaugag acuucucuua 20<210>227<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>227uaagagaagu cucauucgcc 20<210>228<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>228uccuggaucc uucaccaaug 20<210>229<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>229cauuggugaa ggauccagga 20<210>230<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>230gcuuuucuac uugagccauu 20<210>231<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>231aauggcucaa guagaaaagc 20<210>232<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>232acaucaucac uguagucauc 20<210>233<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>233gaugacuaca gugaugaugu 20<210>234<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>234caccuuuagc ucuaacauua 20<210>235<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>235uaauguuaga gcuaaaggug 20<210>236<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>236ucuuaucacc uuuagcucua 20<210>237<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>237uagagcuaaa ggugauaaga 20<210>238<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>238ugcuaucuua ucaccuuuag 20<210>239<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>239cuaaagguga uaagauagca 20<210>240<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>240guccauauug cuaucuuauc 20<210>241<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>241gauaagauag caauauggac 20<210>242<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>242gccaaguuuu gcuuuuauca 20<210>243<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>243ugauaaaagc aaaacuuggc 20<210>244<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>244ucuucaacag uaucaaacuu 20<210>245<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>245aaguuugaua cuguugaaga 20<210>246<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>246gucacagcca ggcauuaaau 20<210>247<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>247auuuaaugcc uggcugugac 20<210>248<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>248ucucaucuuc ccacauaggc 20<210>249<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>249gccuaugugg gaagaugaga 20<210>250<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>250accuuuccuu guauacccuc 20<210>251<211>20<212>RNA
<213>人工序列<220>
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<223>反义化合物<400>381cauuuuauuu acaguuuug19<210>382<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>382uuaaaaauug uaauaaaca19<210>383<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>383uuuauuaaaa auuguaaua19<210>384<211>19<212>RNA< 213>人工序列<220>
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<223>反义化合物
<400>385aaaaaauuac caaagaaug19<210>386<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
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<223>反义化合物
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<223>反义化合物<400>442uguuuauuac aauuuuuaa19<210>443<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
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<223>反义化合物<400>449cugcccuagg cuggcagggc20<210>450<211>20<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>反义化合物<400>450uuggcaugga ggugggagag 20<210>451<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>451ggcauuccaa aacauucuuu 20<210>452<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>452ugcgcccuca ggaguuccgg 20<210>453<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>453auugucacag ggucucacag 20<210>454<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>454agtcgccatc ttagatcgat 20<210>455<211>20<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>反义化合物<400>455agucgccauc uuagaucgau 20<210>456<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>456cgagaggcgg acgggaccg19<210>457<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义化合物<400>457cgagaggcgg acgggaccgt t 21<210>458<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sense Compound<400>458cggtcccgtc cgcctctcgt t 21<210>459<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sense Compound<400>459cggtcccgtc cgcctctcg19
权利要求
1.寡聚化合物或其可药用盐，其长度为8-80个核碱基；具有长度为8-80个核碱基的反义部分；靶向编码eIF4E的核酸分子；并且其调节eIF4E的表达，其前提为所述寡聚化合物或其可药用盐不包括核碱基序列5’-AGTCGCCATCTTAGATCGAT-3’或5’-AGUCGCCAUCUUAGAUCGAU-3’，并且其中所述调节是对eIF4E表达的抑制，所述抑制程度为至少大约50％。
2.权利要求1的寡聚化合物或其可药用盐，其长度为19-23个核碱基，并且其中所述反义部分长度为19-23个核碱基。
3.权利要求1或2的寡聚化合物或其可药用盐，其包含寡核苷酸。
4.权利要求1-3中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含嵌合体寡核苷酸。
5.权利要求1-4中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其为单链。
6.权利要求1-4中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其为全部或部分双链。
7.权利要求1-6中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含与编码eIF4E的核酸分子的5’非翻译区、起始区、编码区、终止区或3’非翻译区特异性杂交的反义核酸分子。
8.权利要求1-7中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含具有至少一个化学修饰的核苷间键、糖部分或核碱基的寡核苷酸。
9.权利要求8的寡聚化合物或其可药用盐，其包含其中所述化学修饰核苷间键为硫代磷酸酯键的寡核苷酸。
10.权利要求8的寡聚化合物或其可药用盐，其包含其中所述化学修饰糖部分具有2’-O-甲氧乙基取代基的寡核苷酸。
11.权利要求8的寡聚化合物或其可药用盐，其包含其中所述化学修饰糖部分具有2’-O-甲基、2’-氟代或4’-硫代取代基的寡核苷酸。
12.权利要求8的寡聚化合物或其可药用盐，其包含其中所述化学修饰核碱基为胞嘧啶的寡核苷酸，其中所述胞嘧啶在5-位上具有甲基取代基。
13.权利要求1-5或7-12中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含单链的20个核碱基寡核苷酸，其中每个核苷间键为硫代磷酸酯键，从5’端向3’端读取的核苷酸1-5和16-20包含2’-O-甲氧乙基糖，核苷酸6-15为2’-脱氧核苷酸并且每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
14.权利要求1-12中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含至少一个肽核酸部分。
15.权利要求1-12中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含至少一个锁核酸部分。
16.权利要求1-12中任意一项的化合物，其为siRNA化合物，其中所述化合物的至少一个末端为平端。
17.权利要求1-12中任意一项的化合物，其为siRNA化合物，其中所述化合物的至少一条链包含一个或多个悬突核苷。
18.权利要求17的化合物，其中悬突核苷的数目为1-6。
19.权利要求17的化合物，其中悬突核苷或多个悬突核苷为脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷。
20.权利要求1-19中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其为钠盐形式。
21.权利要求1-20中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其与编码eIF4E的所述核酸分子具有至少大约95％的互补性。
22.权利要求1-21中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120或122的至少一个8-核碱基部分。
23.权利要求1-21中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其包含选自SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120或122的核苷酸序列。
24.权利要求22或23的寡聚化合物或其可药用盐，其中每个核苷间键为硫代磷酸酯键。
25.权利要求22或23的寡聚化合物或其可药用盐，其中从5’端向3’端读取的核苷酸1-5和16-20包含2’-O-甲氧乙基糖，且核苷酸6-15为2’-脱氧核苷酸。
26.权利要求22或23的寡聚化合物或其可药用盐，其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶残基。
27.权利要求23的寡聚化合物或其可药用盐，其包含SEQ ID NO40或SEQ ID NO97。
28.权利要求22-27中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其中每个核苷间键为硫代磷酸酯键，从5’端向3’端读取的核苷酸1-5和16-20包含2’-O-甲氧乙基糖，核苷酸6-15为2’-脱氧核苷酸，并且每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
29.权利要求1-21或24中任意一项的化合物，其中所述化合物的反义链包含SEQ ID NO213、215、217、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266、268、270、272、274、283、285、287、289、291、293、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335或337的至少一个8-核碱基部分。
30.权利要求1-21或24中任意一项的化合物，其中所述化合物的反义链包含SEQ ID NO213、215、217、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266、268、270、272、274、283、285、287、289、291、293、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335或337。
31.权利要求1-21或24中任意一项的化合物，其中所述化合物的反义链包含SEQ ID NO 339-394之一的至少一个8-核碱基部分。
32.权利要求22-31中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐，其为钠盐形式。
33.医药或兽药组合物，其包含权利要求1-32中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐和可药用或生理可接受载体、赋形剂或稀释剂。
34.抑制细胞、组织或器官中eIF4E表达的方法，其包括将所述细胞、组织或器官与有效量的权利要求1-32中任意一项的所述寡聚化合物或其可药用盐相接触从而使eIF4E表达受到抑制。
35.使在其中表达eIF4E的细胞增殖降低的方法，其包括将所述细胞与有效量的权利要求1-32中任意一项的所述寡聚化合物或其可药用盐相接触从而使所述细胞的增殖受到抑制。
36.预防或治疗与eIF4E表达或过表达相关的状况或疾病的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求1-32中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐。
37.权利要求36的方法，其中所述状况或疾病是过度增殖状况或疾病。
38.权利要求37的方法，其中所述过度增殖状况或疾病是以异常的或有害的血管发生为特征的易感癌症、肿瘤或状况。
39.权利要求37的方法，其中所述的与eIF4E表达或过表达相关的过度增殖状况或疾病选自乳腺癌、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
40.预防或降低血管发生的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求1-32中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐。
41.预防或降低患者体内肿瘤生长的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求1-32中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐。
42.权利要求36-41中任意一项的方法，其中所述患者是哺乳动物。
43.权利要求36-41中任意一项的方法，其中所述患者是人。
44.反义寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO40和SEQ ID NO97的核苷酸序列，其中每个核苷间键为硫代磷酸酯键，从5’端向3’端读取的核苷酸1-5和16-20包含2’-O-甲氧乙基糖，核苷酸6-15为2’-脱氧核苷酸，每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶，并且其为钠盐形式。
45.医药或兽药组合物，其包含权利要求44的所述反义寡核苷酸和可药用或生理可接受载体、赋形剂或稀释剂。
46.预防或治疗与eIF4E表达或过表达相关状况的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求44的寡核苷酸。
47.权利要求46的方法，其中所述的与eIF4E表达或过表达相关的状况选自乳腺癌、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
48.降低血管发生的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求44的寡聚化合物或其可药用盐。
49.抑制细胞、组织或器官中eIF4E表达的方法，其包括将所述细胞、组织或器官与有效量的权利要求44的所述寡聚化合物或其可药用盐相接触和抑制eIF4E表达。
50.权利要求1-32中任意一项的寡聚化合物或其可药用盐或者权利要求44的反义寡核苷酸的用途，其用于制造预防或治疗与eIF4E表达或过表达相关状况的药物。
51.权利要求1的化合物，其中所述化合物包含与编码eIF4E的核酸分子的5’帽子区域特异性杂交的反义核酸分子。
52.权利要求51的化合物，其为具有至少一个PNA或2’-O-甲氧乙基部分的单链化合物。
53.权利要求52的化合物，其一律为PNA或一律为2’-O-甲氧乙基。
54.权利要求51的化合物，其包含SEQ ID NO395、396、397或398的至少一个8-核碱基部分。
全文摘要
本发明提供了用于调节eIF4E表达的寡聚化合物、组合物和方法。本发明反义化合物可以是单链的或双链的并且靶向编码eIF4E的核酸。本发明提供了使用这些化合物调节eIF4E表达和诊断与治疗与eIF4E表达相关的疾病和状况的方法。
文档编号A61P35/00GK1852979SQ200480026916
公开日2006年10月25日 申请日期2004年9月17日 优先权日2003年9月18日
发明者S·M·弗赖尔, K·W·多比, E·G·马库松, E·E·斯韦茨, B·巴特, J·R·格雷夫, B·W·科尼切克 申请人:Isis 药物公司, 伊莱利利公司