专利名称：空泡毒素中和剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防、防复发或治疗与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)相关的消化器官疾病以及幽门螺杆菌所产生的空泡毒素的中和剂、药品、医药部外品及饮食品，它们含有具有将幽门螺杆菌所产生的空泡毒素无毒化的效果的原花青素类、特别优选为从苹果或啤酒花中得到的原花青素类作为有效成分。
背景技术：
啤酒花(Humulus lupuls)为大麻科多年生植物，其球花(成熟的未受精的雌花)一般称为啤酒花。啤酒花中除了该花部之外，还存在叶、蔓、根等各个部分。啤酒花的球花中存在的啤酒花苦味素部分(在球果的内苞根部形成的黄色颗粒)是啤酒花的苦味和香味的来源，在啤酒酿造中与酵母、麦芽一起为重要的啤酒原料。另外，在民间疗法中啤酒花作为镇静剂和抗催情剂而通用。啤酒花苞片是从啤酒花球花中除去了啤酒花苦味素部分而得到的，在啤酒酿造中是没用的，不同情况下在酿造啤酒时被除去，作为副产物而生成。此时，啤酒花苞片除了用作土壤改良用的肥料之外，没有其他特别有效的利用方法，因此希望开发更高附加价值的利用方法。
本申请人的申请中所涉及的专利文献1、2、3、4、5、6中，确认了啤酒花、特别是来自于啤酒花苞片的多酚类具有抗氧化作用、对发泡麦芽饮料的泡稳定化作用、抗龋齿作用、除臭作用、抑制癌细胞转移的作用、拓扑异构酶抑制作用。另外，在专利文献7中，确认了对具有RNAN-糖苷酶活性或ADP核糖基转移酶活性的蛋白质毒素具有中和效果。
但是，到目前为止，对于来自于啤酒花的原花青素类，还没有明确其对幽门螺杆菌所产生的空泡毒素的中和(无毒化)效果的例子。
幽门螺杆菌(以下仅称为“幽门菌”)为具有螺旋状形态的革兰氏阴性杆菌，自从Warren和Marshal报道(非专利文献1)其存在以来，已经明确其与急性胃炎、慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等消化器官疾病的发病具有很大关系(参照非专利文献2、3、4)。另外，由于90％或以上的胃癌患者为幽门菌的带菌者等，因此幽门菌与胃癌的发生相关的可能性较高，WHO在1994年发表了《幽门菌确实为胃癌的致癌因子》。
作为产生幽门菌的病因因子，目前为止报道了尿素酶、过氧化氢酶、脂多糖(LPS)等，但近年来明确，通过向胃的粘膜细胞单独投予引起空泡变性的空泡毒素(VacA)，可在动物模型中引发胃炎(非专利文献5)，从而迅速认识到空泡毒素为幽门菌的主要病因因子。
一直以来，在胃溃疡、十二指肠溃疡等溃疡性疾病的治疗中，使用了索法酮、普劳诺托等抗溃疡剂；奥美拉唑、兰索拉唑等质子泵抑制剂(PPI)；法莫替丁、西咪替丁等胃酸分泌抑制剂(H2阻断剂)等。但是，这些药品不具有对幽门菌的增殖抑制效果，是对溃疡性疾病的对症疗法药剂。因此，虽然可看到通过上述药剂对溃疡性疾病的治愈，但由于幽门菌残存于胃中，因此具有治疗结束后的1年以内的复发率高达80～90％的缺点。
为了克服上述缺点，除了对症疗法之外，还提出了除去幽门菌的治疗方法，对幽门菌具有抗菌效果的阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、替硝唑等抗生素已在临床上有所应用。现在，将质子泵抑制剂与抗生素的2种药剂组合、即新型3剂并用疗法成为除菌治疗的主流。
但是，在新型3剂并用疗法中，由于必须长期地服用较多量的药剂，因此药剂的副作用、细菌替换症的发病也作为临床上的问题而在现实中产生。并且，抗生素的使用被认为有可能随着菌体的破坏而将作为产生幽门菌的病因因子的空泡毒素大量地排出至胃粘膜周围。而且，抗生素的多量使用还有导致产生新型的、更强耐性菌的危险。综合考虑上述内容，很难说现在广泛使用的新型3剂并用疗法是理想的治疗方法。
在日本，幽门菌的感染率特别是在40岁或以上的一代人中较高，而且与欧美相比，溃疡性疾病和胃癌的发病率也高，如果发现了没有副作用和耐性菌问题的治疗方法，则在产业上的价值将非常大。
专利文献1日本特开平09-002917号公报专利文献2日本特开平09-163969号公报专利文献3日本特开平09-295944号公报专利文献4日本特开平10-025232号公报专利文献5日本特开2000-327582号公报专利文献6日本特开2001-039886号公报专利文献7国际公开第02/07826号公开文本非专利文献1Lancet，1273-1275(1983)非专利文献2Med.J.Aust.，142，436(1985)非专利文献3Gastroenterology，102，1575(1992)非专利文献4N.Engl.Med.，328，308(1993)非专利文献5Infect.Immun.63，4154-4160(1995)发明内容因此，本发明的目的在于提供副作用少、没有耐性菌的产生、且预防、防复发或治疗与幽门菌相关的消化器官疾病、以及对幽门菌所产生的空泡毒素具有中和效果的药品、医药部外品、饮食品。
本发明人等鉴于这些现状，尝试了通过不杀死幽门菌，而是找到将幽门菌所产生的空泡毒素无毒化的因子来解决问题。如果发现了空泡毒素的有效的无毒化因子，则在医学、产业上的意义是不可估量的。
本发明人等刻苦研究，结果发现，在啤酒花和苹果中存在的多酚的一种将幽门菌所产生的空泡毒素有效地无毒化，进而完成了本发明。该多酚特别在苹果的未成熟果实和啤酒花的苞片部分中大量地含有。
啤酒花中含有的该多酚具有以下特性即吸附于苯乙烯-二乙烯基苯树脂等与多酚表现出亲和性的树脂、通过级分分子量(fractionmolecular weight)为1000或以上的超滤膜进行处理时不透过膜。另外，在含有5％左右盐酸的醇溶液中加热时被水解生成花青素，被认为是原花青素类。另外，该原花青素类在GPC(凝胶渗透色谱)分析中显示图1所示的色谱图，而在吸光度分析中显示图2所示的吸光度分布。
另外，在苹果中含有的该多酚也吸附于苯乙烯-二乙烯基苯树脂等与多酚表现出亲和性的树脂，在含有5％左右盐酸的醇溶液中加热时被水解生成花青素，被认为是原花青素类。
即，本发明涉及含有原花青素类、特别优选为来自于啤酒花或苹果的原花青素类作为有效成分的空泡毒素中和剂。
作为中和空泡毒素的物质，Tombola等公开了5-硝基-2-(3-苯基丙胺基)苯酸、根皮素、以及一部分的多酚类抑制由空泡毒素所产生的细胞膜上的电流变化(Tombola F.et al.，FEBS Lett.543，184-189(2003))。但是在同一文献中也阐述了在这些体系中的抑制细胞膜上电流变化的物质，与空泡毒素导致的细胞内空泡化的抑制和对细胞毒性的中和没有关系。并且，这些文献中作为抑制细胞膜上电流变化的物质所公开的化合物，虽然为多酚类，但都不是原花青素类的化合物。
因此，关于使用来自于植物、特别优选来自于啤酒花或苹果中的原花青素类而将空泡毒素无毒化的技术，到目前为止还从未报道过。
图1所示为来自于啤酒花的原花青素类的GPC(凝胶渗透色谱)分析结果的图。
图2所示为来自于啤酒花的原花青素类的吸光度分布的图。
图3所示为来自于啤酒花的原花青素类的HPLC分析结果的图。
图4所示为人胃癌细胞AZ-521培养细胞中的空泡毒素的无毒化的图。(实施例13)图5所示为人肾癌细胞G401培养细胞中的空泡毒素的无毒化的图。(实施例13)
图6所示为抑制人胃癌细胞AZ-521培养细胞中的空泡毒素进入细胞的图。(实施例14)图7所示为抑制人肾癌细胞G401培养细胞中的空泡毒素进入细胞的图。(实施例14)具体实施方式
作为本发明的空泡毒素中和剂的原料，除了苹果的未成熟果实之外，还优选啤酒花的蔓和苞片部分，特别是也可以不将苹果或啤酒花的各部分分离而整体使用。
所谓的啤酒花苞片是指从啤酒花的球果中去除啤酒花苦味素部分而得到的物质，一般来说，将啤酒花球果粉碎后，通过筛分将啤酒花苦味素部分除去，从而得到啤酒花苞片。但是，在最近的啤酒酿造中，为了节省将啤酒花苞片筛分除去的麻烦，有下述倾向即不将对啤酒酿造无用的啤酒花苞片除去，而是将啤酒花球果直接成形为颗粒状，并作为啤酒花颗粒用于啤酒酿造中。因此，作为本发明的原料，只要含有啤酒花的蔓和苞片即可，没有特别的限定，即使将含有啤酒花苞片的啤酒花球果或啤酒花颗粒作为原料也没有任何问题。
作为从啤酒花中得到空泡毒素中和剂的制造方法为，将啤酒花蔓、苞片或含有啤酒花苞片的啤酒花球果、啤酒花颗粒、或者含有这些啤酒花植物体部分的物质作为原料，将其用水或80v/v％或以下的醇、丙酮、乙腈等与水混合的有机溶剂的水溶液进行提取。作为优选例，可以举出乙醇为50v/v％或以下的含水乙醇。原料与提取溶剂的比例优选为120～100(重量比)左右，提取优选在4～95℃、搅拌下进行20～60分钟左右。通过过滤得到提取液，此时如果需要也可以使用珍珠岩等过滤辅助材料。
通过浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥等通常的方法从这样得到的提取液中将溶剂除去，可以得到作为粉末状态的空泡毒素中和剂。这里得到的空泡毒素中和剂足以供于实用，但如果需要，也可以通过下述的使用吸附树脂的方法进一步提高其纯度。但是，此过程终究是用于提高空泡毒素中和剂的纯度的工序，不需要的话也可以省略。
将与多酚类具有亲和性的合成树脂制成粒状后，处理上述提取液，浓缩空泡毒素中和剂。此工序可在填充有粒状合成树脂的柱中通过啤酒花提取液，充分洗涤柱后，将吸附于柱上的空泡毒素中和剂溶出；也可将粒状树脂浸渍在啤酒花提取液中，进行成批处理。
使空泡毒素中和剂吸附于合成树脂时，将啤酒花提取液冷却至15～30℃的室温左右后，如果需要，为了提高吸附效率，优选通过减压浓缩等预先将提取液的有机溶剂浓度降低。作为合成吸附剂的材质，也可以使用羟丙基化葡聚糖、亲水性乙烯聚合物、苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等。
接下来洗涤合成树脂，可以进一步提高空泡毒素中和剂的纯度。优选使用水或1～10w/w％的乙醇水溶液作为用于洗涤的溶剂，优选使用树脂量1～10倍左右的溶剂量来进行洗涤。
接着，将空泡毒素中和剂从吸附有多酚类的合成树脂中脱离溶出。作为溶出中使用的溶剂，可以使用含水醇、含水丙酮、含水乙腈等，作为特别优选的例子，可举出30w/w％或以上的乙醇水溶液或者乙醇。溶出溶剂的在树脂中通过的量优选为树脂量的2～6倍左右。
通过浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥等通常的方法从所得溶出液中除去溶剂，可以得到作为粉末状态的空泡毒素中和剂。另外，减压浓缩时也可以将醇、丙酮、乙腈等回收并再利用。所使用的合成树脂在用80v/v％或以上的醇水溶液、0.05N左右的氢氧化钠水溶液等进行洗涤后，可以反复使用。
这样得到的空泡毒素中和剂能够直接供于实际应用，也可以通过使用下述超滤膜的方法来进一步提高其纯度。但是，该过程终究是用于提高空泡毒素中和剂的纯度的工序，不需要的话也可以省略。
将利用上述方法得到的空泡毒素中和剂溶解于水或与水混合的有机溶剂中，用级分分子量为1000或以上的超滤膜进行处理。作为膜的材料，只要是纤维素、醋酸纤维素、聚砜、聚丙烯、聚酯、聚醚砜、PVDF等通常用作超滤膜材料的物质即可，可以没有特别限定地使用。另外，级分分子量只要在1000或以上，则没有特别问题都可使用，但如果使用级分分子量过大的膜，则产量急剧下降，而使用级分分子量小的膜时，则处理所需要的时间变长，因此优选级分分子量为5000～50,000左右的超滤膜。另外，处理也根据提取溶剂的种类、提取溶剂与啤酒花或啤酒花苞片的比例的不同而不同，但优选处理至大概上部残留液的量变为处理开始时的1/10～1/100左右。此时的压力也根据超滤膜、过滤装置的不同而不同，但优选大概为0.1～10.0kg/cm2。另外，如果需要，也可以再次用水等适当溶剂将处理过一次的上部残留液稀释，并进行同样的再处理，从而提高纯度。
通过浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥等通常的方法除去所得上部残留液中的溶剂，可以得到作为粉末状态的空泡毒素中和剂。另外，减压浓缩时也可以将醇、丙酮、乙腈等回收并再利用。
这样得到的空泡毒素中和剂为略带苦味的无臭的肉色、褐色或淡黄色的粉末，是吸附于与多酚具有亲和性的合成树脂并通过级分分子量为1000或以上的超滤膜进行处理时不透过膜的原花青素。
收率以啤酒花苞片重量换算时为0.5～20.0w/w％、以啤酒花球果重量换算时为0.5～15.0w/w％。
作为从苹果中得到空泡毒素中和剂的制造方法，可以将苹果果实、优选为苹果的未成熟果实，通过压榨进行榨汁，制成含空泡毒素中和剂的溶液，将该溶液通过浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥等通常的方法制成粉末来使用。另外，也可以根据需要，使用填充有对多酚具有亲和性的粒状树脂等的柱等，将空泡毒素中和剂精制，提高纯度后使用。该工序与将从啤酒花中得到的空泡毒素中和剂进行浓缩精制的工序相同。
这样得到的空泡毒素中和剂可与通常使用的载体、辅助剂、添加剂等一起制成制剂，可以按照常规方法作为口服、非口服制品、药品而使用，还可以与食品材料混合后制成饮食品。
药品，作为口服剂有片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂等，作为非口服剂有软膏剂、乳剂、水剂等外用剂，无菌溶液剂、混悬剂等注射剂等。将这些制品作为药品投予给人体时，以每天1～数次投予2mg～500mg、即以2mg～1000mg的全天量进行投予，能够充分达到其效果。
含有本发明的空泡毒素中和剂的药品可与生理学上允许的赋形药、载体、赋形剂、协调剂、稳定剂、香味剂等一起为所要求的单位体积形态。混合于片剂、胶囊剂的佐药为下述的物质即黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等结合剂，微晶纤维素等赋形剂，玉米淀粉、全凝胶化淀粉、褐藻酸等膨化剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖、乳糖、糖精等甜味剂，薄荷、acamono oil、樱桃等香味剂。另外，为胶囊剂时，在上述材料中还可以进一步含有油脂等液体载体，而且，其他材料可以作为覆盖剂或者以其他方法使制剂的物理形态发生改变。例如，片剂可被虫胶、砂糖覆盖。糖浆剂或西也剂可含有作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、色素以及樱桃或橙香等香味剂。
用于注射剂的无菌组合物可通过下述的常用方法进行配方使注射用水等赋形药中的活形物质，芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等天然产植物油，或者油酸乙酯等合成脂肪赋形药溶解或者混悬的方法。另外，根据需要还可以配合缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。作为外用剂，可以使用作为基材的凡士林、石蜡、油脂类、羊毛脂、聚乙二醇等，通过常用的方法制成软膏剂、乳剂等。
含有本发明的空泡毒素中和剂的饮食品可以是上述制剂的形态，也可以以糖、薄脆饼干、小甜饼、饮料等形态在各自的食品原料中添加所要量，并通过常用的制造方法进行加工制造。作为健康食品、功能性食品的摄取，由于是用于预防疾病和维持健康，因此制成每天分数次口服摄取、包含全日量为5mg～500mg的加工品来摄取。
向这些饮食品中添加空泡毒素中和剂时，可以将空泡毒素中和剂以粉末状态直接添加，但优选将空泡毒素中和剂制成1～2％的水溶液、醇水溶液的溶液或醇溶液，按照最终浓度变为1～10,000ppm、优选为100～5000ppm的方式添加至饮食品中。
本发明的空泡毒素中和剂在以预防该消化器官疾病为目的而使用时可用作预防剂，在以预防一度治愈过的该消化器官疾病的复发为目的而使用时可用作防复发剂，在以通过除去幽门菌来治疗该消化器官疾病为目的而使用时可用作除菌剂。另外，在预防、防复发或治疗该消化器官疾病时，可以单独使用本发明的幽门螺杆菌除菌剂，也可以与质子泵抑制剂和/或抗生素组合使用。
本发明的空泡毒素中和剂的一日给药量可根据其用法、患者的年龄、性别等其他条件、疾病程度等来适当选择，通常作为有效成分的本发明化合物的量为成人每天0.1～2000mg左右、优选为0.5～1800mg左右、特别优选为1.0～1500mg左右，每日分1～4次给药，如可在空腹时给药。
以下列举实施例，但本发明不受其限定。
实施例1(通过凝胶型合成吸附剂从啤酒花球果制备空泡毒素中和剂)在研钵中将20g啤酒花球果粉碎，用2L的水搅拌，在95℃下提取40分钟。过滤后放冷，将提取液通过填充有80ml亲水性乙烯聚合物树脂的柱，接着使用400ml的5％乙醇水溶液进行洗涤。接着，在同一柱中通过400ml 80％乙醇水溶液，回收相同的溶出液，冷冻干燥，得到800mg作为无臭的略带苦味的淡黄色粉末状态的空泡毒素中和剂。从啤酒花得到的收率为4％。
实施例2(通过凝胶型合成吸附剂从啤酒花苞片制备空泡毒素中和剂)用600ml 50％乙醇水溶液搅拌20g啤酒花苞片，在30℃下提取20分钟。过滤后减压浓缩，将该浓缩液通过填充有80ml苯乙烯-二乙烯基苯树脂的柱，接着用400ml的水进行洗涤。接着，在同一柱中通过400ml80％乙醇水溶液，回收相同的溶出液，冷冻干燥，得到1.6g作为无臭的略带苦味的淡黄色粉末状态的空泡毒素中和剂。从啤酒花苞片得到的收率为8％。
实施例3(通过超滤膜从啤酒花球果制备空泡毒素中和剂)在研钵中将20g啤酒花球果粉碎，用2L的水搅拌，在95℃下提取40分钟。过滤后放冷，利用级分分子量为50,000的超滤膜、在1.0kg/cm2、室温下处理提取液，直至变为20ml。将所得的上部残留液减压干燥，得到200mg作为无臭的略带苦味的淡黄色粉末状态的空泡毒素中和剂。从啤酒花得到的收率为1％。
实施例4(通过超滤膜从啤酒花苞片制备空泡毒素中和剂)用600ml 50％乙醇水溶液搅拌20g啤酒花苞片，在80℃下提取40分钟。过滤后，利用级分分子量为1,000的超滤膜、在3.0kg/cm2、室温下处理提取液，直至变为60ml。将所得的上部残留液冷冻干燥，得到0.8g作为无臭的略带苦味的淡黄色粉末状态的空泡毒素中和剂。从啤酒花苞片得到的收率为4％。
实施例5(空泡毒素中和剂的进一步精制和定性分析)将0.8g实施例2所得到的空泡毒素中和剂溶解于500ml 10％乙醇水溶液中，利用级分分子量为5,000的超滤膜、在1.0kg/cm2、室温下处理，直至变为20ml。将所得的上部残留液冷冻干燥，得到0.4g作为无臭的略带苦味的肉色粉末状态的空泡毒素中和剂。在下述条件下对该粉末进行HPLC分析时，显示图3所示的特征性色谱图，另外，进行作为通常的多酚类定量法之一的儿茶酸定量(食品标准分析法)时，换算为儿茶酸含量，得到的值为40.6％。
(HPLC条件)装置岛津LC-10A系统，色谱柱ODS-80TM(Toso、4.6mmI.D.×25cm)，流动相从(A液∶B液)＝(100∶0)到(50∶50)的30分钟的直线梯度、A液5％乙腈(含0.1％HCl)、B液乙腈，进样量20μg，检测200～300nm的多波长检测。
实施例6(从苹果的未成熟果实制备空泡毒素中和剂)将400g苹果的未成熟果实(平均重量为5.03g)与1％盐酸酸性甲醇一起进行均质化后，边加热回流边提取(3次)，将提取液减压浓缩馏去甲醇后，加入氯仿进行分层(2次)，回收水层，过滤后加蒸馏水至200ml。然后，通过使用了Sep-pak C18的固相萃取法进行精制，冷冻干燥得到空泡毒素中和剂。
实施例7(片剂、胶囊剂)按照实施例5所得到的物质10.0g乳糖 75.0g硬脂酸镁 15.0g合计 100.0g将上述各重量份均匀混合，按照常法制成片剂、胶囊剂。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到片剂、胶囊剂。
实施例8(散剂、颗粒剂)按照实施例5所得到的物质20.0g淀粉 30.0g乳糖 50.0g
合计100.0g将上述各重量份均匀混合，按照常法制成散剂、颗粒剂。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到散剂、颗粒剂。
实施例9(注射剂)按照实施例5所得到的物质1.0g表面活性剂 9.0g生理盐水 90.0g合计 100.0g将上述各重量份加热混合、灭菌，制成注射剂。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到注射剂。
实施例10(糖)蔗糖20.0g麦芽糖浆(75％固体成分) 70.0g水 9.5g着色剂 0.45g香料0.045g按照实施例5所得到的物质 0.005g合计100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成糖。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到糖。
实施例11(果汁)浓缩桔子果汁15.0g果糖5.0g柠檬酸 0.2g香料0.1g色素0.15g抗坏血酸钠 0.048g按照实施例5所得到的物质 0.002g水 79.5g合计100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成果汁。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到果汁。
实施例12(小甜饼)软质面粉32.0g整个鸡蛋16.0g奶油16.0g砂糖25.0g水 10.8g发酵粉 0.198g按照实施例5所得到的物质 0.002g合计100.0g使用上述各重量份的各成分，按照常法制成小甜饼。另外，代替按照实施例5所得到的物质，分别添加按照实施例1、2、3、4、6所得到的物质，也同样地得到小甜饼。
实施例13空泡毒素对培养细胞的细胞毒性试验将来自于人胃癌的细胞株AZ-521细胞或者来自于人肾癌的细胞株G401细胞调整为2.0×105细胞/ml的悬浮液。将其100μl分装于96孔板中后，放置一晚，制备各个细胞的单层膜。将一定浓度的空泡毒素与各种浓度的实施例5或6所得到的空泡毒素中和剂混合，在37℃下培养30分钟，之后将其加入至上述板中。空泡毒素的最终浓度为120nM，实施例5或6的最终浓度为0～100μg/ml。将板在5％CO2氛围中、37℃下培养8小时后，通过中性红(0.05％PBS溶液)进入至空泡的程度(Ab540)来评价空泡毒素对细胞的毒性。其结果示于图4和图5。依赖于实施例5和6所得到的空泡毒素中和剂的浓度，相对于AZ-521细胞和G401细胞两者，由空泡毒素所导致的细胞毒性都被无毒化。
实施例14对培养细胞的结合将来自于人胃癌的细胞株AZ-521细胞或者来自于人肾癌的细胞株G401细胞调整为2.0×105细胞/ml的悬浮液。将其100μ1分装于96孔板中后，放置一晚，制备各个细胞的单层膜。将各种浓度的生物素标记的空泡毒素与一定浓度的实施例5或6所得到的空泡毒素中和剂在37℃下培养30分钟后，添加至细胞的单层膜中。空泡毒素的最终浓度为0～100nM，实施例5或6的最终浓度为10μg/ml。将细胞的单层膜在5％CO2、37℃的培养箱中培养4小时后，用0.25％戊二醛将细胞固定。利用抗生物素蛋白标记的辣根过氧化物酶(Pharmacia)和TMBZ色素的显色(Ab450nm)来评价粘着在细胞表面的生物素标记的空泡毒素的量。其结果示于图6和图7。依赖于实施例5或6所得到的空泡毒素中和剂的浓度，空泡毒素对细胞的结合被抑制。
实施例15小鼠胃伤害实验对绝食了24小时(仅自由摄取饮水)的4周龄C57BL/6J小鼠，使用摄食器(ingestion probe)投予相当于每10g体重为5μg的空泡毒素和50～250μg的实施例5所得到的物质。分开饲养动物，一只小鼠一个笼子。给药48小时后，将胃摘除。将摘除标本用10％福尔马林固定，用立体显微镜观察其前后。对固定标本进行苏木精嗜红染色，按照Ghiara等人的方法(Ghiara.P.，et al.Infect.Immun.63，4154-4160.(1995))，将胃损伤的程度点数化，进行评价。其结果示于表1。实施例5显著地抑制了胃的损伤。
表1
*表示与3相比，危险率为5％以下，有显著差异。
综上所述，本发明的空泡毒素中和剂由于具有将空泡毒素无毒化的效果，因此在以空泡毒素为病原因子的感染症的预防和治疗上有效。本发明品可以作为以空泡毒素为病原因子的感染症的预防/治疗剂以及生物化学上的实验用试剂等而进行产品化。
作为与幽门菌相关的消化器官疾病，可例示出胃溃疡、十二指肠溃疡、胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等。
权利要求
1.一种具有将幽门螺杆菌所产生的空泡毒素中和(无毒化)效果的原花青素类。
2.如权利要求1所述的原花青素类，该原花青素类来自于啤酒花或啤酒花苞片。
3.如权利要求1所述的原花青素类，该原花青素类来自于苹果。
4.与幽门螺杆菌相关的消化器官疾病的预防剂、防复发剂或者治疗剂，其含有权利要求1所述的原花青素类作为有效成分。
5.与幽门螺杆菌相关的消化器官疾病的预防剂、防复发剂或者治疗剂，其含有权利要求2所述的原花青素类作为有效成分。
6.与幽门螺杆菌相关的消化器官疾病的预防剂、防复发剂或者治疗剂，其含有权利要求3所述的原花青素类作为有效成分。
7.幽门螺杆菌所产生的空泡毒素的中和剂，其含有权利要求1所述的原花青素类作为有效成分。
8.幽门螺杆菌所产生的空泡毒素的中和剂，其含有权利要求2所述的原花青素类作为有效成分。
9.幽门螺杆菌所产生的空泡毒素的中和剂，其含有权利要求3所述的原花青素类作为有效成分。
10.含有权利要求1所述的原花青素类作为有效成分的医药部外品。
11.含有权利要求2所述的原花青素类作为有效成分的医药部外品。
12.含有权利要求3所述的原花青素类作为有效成分的医药部外品。
13.含有权利要求1所述的原花青素类作为有效成分的饮食品。
14.含有权利要求2所述的原花青素类作为有效成分的饮食品。
15.含有权利要求3所述的原花青素类作为有效成分的饮食品。
全文摘要
本发明提供副作用少、不产生耐性菌、且具有预防、防复发或治疗与幽门螺杆菌相关的消化器官疾病以及幽门螺杆菌的除菌效果的药品、医药部外品或饮食品。本发明提供含有对幽门螺杆菌所产生的空泡毒素具有中和(无毒化)效果的原花青素类、特别优选为来自于苹果未成熟果实或者啤酒花苞片的原花青素类作为有效成分的药品、医药部外品、饮食品。
文档编号A61K36/185GK1863524SQ20048002880
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月4日 优先权日2003年10月2日
发明者八寿锦之助, 田头素行, 平山寿哉, 野田公俊 申请人:朝日啤酒株式会社, 平山寿哉, 野田公俊