用阳离子肽刺激先天免疫的方法

专利名称：用阳离子肽刺激先天免疫的方法
技术领域：
本发明一般性地涉及肽，具体地涉及有效作为治疗剂并用于药物发现的肽，所述治疗剂和药物发现涉及由微生物感染产生并用于调节先天免疫或抗炎活性的病理过程。
背景技术：
在世界范围内，感染性疾病是死亡的首要原因。根据1999世界卫生组织的调查，每年有超过1千3百万人死于感染性疾病。感染性疾病在北美是第三位主要死亡原因，每年占死亡人数的20％并且从1980年至今增加了50％。许多内科治疗和手术治疗的成功也是取决于对感染性疾病的控制。发现和应用抗生素是现代医学的重大成就之一。如果没有抗生素，医生们将不能进行复杂的手术、化学疗法或大多数医疗干预手段如导管插入。
目前世界范围内的抗生素销售额是260亿美元。然而，过量使用和有时不适当应用抗生素，导致发展出新的抗生素抗性细菌株。抗生素抵抗(antibioticresistance)已经成为医学现象的一部分。细菌如万古霉素抗性肠球菌，VRE和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)以及MRSA，是不能用抗生素对付的菌株，通常地，感染这些细菌的患者死亡。抗生素的发现被证明是新药物开发的最困难领域之一，许多大的制药公司削减或完全停止了它们的抗生素开发项目。然而，随着抗生素抵抗的显著增加，包括无法治疗的感染的出现，存在着明显的未满足的医疗需求，需求新类型的抗微生物疗法(anti-microbial therapy)，作用于先天免疫的试剂将是一类这样的试剂。
先天免疫系统(innate immune system)是极为有效的和进化的普遍防御系统。先天免疫的成分通常以低水平存在，并且在受到刺激时，非常迅速地被激活。刺激可以包括细菌信号分子和机体细胞表面的模式识别受体(pattern recognitionreceptors)的相互作用或疾病的其它机制。每天，通过我们摄取的食物和水、我们呼吸的空气以及我们接触的表面、宠物和人，人暴露于数几万种潜在的病原微生物。先天免疫系统的作用是，防止这些病原体引起疾病。先天免疫系统不同于所谓的适应性免疫(adaptive immunity)(其包括抗体和抗原特异性B淋巴细胞及T淋巴细胞)，原因是先天免疫系统始终存在，快速地产生效果，并且对任何特定病原体都是相对非特异的。适应性免疫系统(adaptive immune system)需要放大特异性识别成分(specific recognition elements)，因而需要花费数天至数周来应答。即便用疫苗预先刺激了适应性免疫，它也可能需要三天或者更长时间来对病原体作出反应，然而，先天免疫可以立刻或很快地(数小时)获得。先天免疫涉及多种效应物(effector)功能，包括吞噬细胞、补体等，但对其的理解通常不充分。一般来讲，许多先天免疫应答是由微生物信号分子和宿主细胞表面被称作Toll-样受体(Toll-like receptor)的模式识别受体的结合而“触发”的。在炎症反应(inflammatory response)中，许多这些效应物功能集合在一起。然而，过于严重的炎症反应可以导致对机体有害的反应，在极端的情形下，可以发生脓毒症和潜在的死亡。
在感染期间从感染原释放的结构性组成分(structural components)引起炎症反应，当其未受到抑制时，可以导致潜在的致命情况，脓毒症(sepsis)。每年在北美大约有780,000个患者发生脓毒症。脓毒症的发生可能是在社区获得的传染病如肺炎导致的结果，或者可能是创伤、癌症或大手术治疗的并发症。当机体完全无法控制炎症反应时，便会发生严重的脓毒症，机体器官开始衰竭。在美国，每年由于脓毒症发生多达120,000例死亡。脓毒症也可能涉及血液中的病原微生物或毒素(例如，败血症(septicemia))，其为人类死亡的主要原因。革兰式阴性细菌是与这类疾病联系最为普遍的生物体。然而，革兰式阳性细菌也在越来越多地引起感染。革兰式阴性细菌和革兰式阳性细菌以及它们的组分都能导致脓毒症。
微生物组分的存在诱导促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)的释放，在这些促炎细胞因子中肿瘤坏死因子α(TNF-α)是极重要的。TNF-α和其它促炎细胞因子又可以引起其它促炎介质(pro-inflammatory mediators)释放，并导致炎症级联反应。革兰氏阴性脓毒症通常由细菌外膜组分脂多糖(LPS；也称作内毒素)的释放引起。血液中的内毒素，被称作内毒素血症，主要是来自于细菌感染，并且可以在抗生素治疗期间被释放。革兰氏阳性脓毒症可由细菌细胞壁组分的释放引起，所述组分如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)、由链球菌(Streptococci)产生的鼠李糖-葡萄糖聚合物(rhamnose-glucose polymers)、或由葡糖球菌(Staphylococci)产生的荚膜多糖。也已经显示，细菌或其它非哺乳动物DNA，可以诱导脓毒症状态，包括TNF-α的产生，所述细菌或非哺乳动物DNA通常含有未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二聚体(CpG DNA)，这不同于哺乳动物DNA。哺乳动物DNA含有CpG二核苷酸的频率要低得多，它们常常是甲基化的形式。除了在细菌感染期间它们的天然释放，抗生素治疗也可以引起细菌细胞壁组分LPS和LTA的释放，也可能引起细菌DNA的释放。这随之可能妨碍从感染中恢复，或者甚至引起脓毒症。
尽管在科技文献和专利文献中认识到的阳离子肽(cationic peptide)的主要作用是抗微生物效应，但阳离子肽正在越来越多地被认为是防御感染的一种形式(Hancock，R.E.W.，and R.Lehrer.1998.Cationic peptidesa new source ofantibiotics.Trends in Biotechnology 1682-88.)。已经从广范的各种微生物中分离出具有抗微生物活性的阳离子肽。在自然界，这种肽提供了对抗微生物如细菌和酵母的防御机制。一般地，认为这些阳离子肽通过与细胞质膜相互作用，而且在大多数情况下，形成通道和损伤，由此对细菌施加其抗微生物活性。在革兰式阴性细菌中，它们和LPS作用，使外膜具有可通透性，由此导致自促式的穿透外膜的吸收，并到达细胞质膜。阳离子抗微生物肽(cationic antimicrobial peptide)的例子包括indolicidin(来自牛嗜中性细胞的抗微生物多肽)、防御素(defensins)、杀菌肽(cecropins)和爪蟾抗菌肽(magainins)。
尽管还不知道抗微生物功能和效应物功能是否是独立的，但近来越来越多地认识到，这种肽是先天免疫的其它方面中的效应物(Hancock，R.E.W.and G.Diamond.2000.The role of cationic peptides in innate host defenses.Trends inMicrobiology 8402-410.；Hancock，R.E.W.2001.Cationic peptideseffectors ininnate immunity and novel antimicrobials.Lancet Infectious Diseases 1156-164)。
一些阳离子肽具有结合细菌产物如LPS和LTA的亲和力。在对LPS的响应中这些阳离子肽能够抑制细胞因子的产生，因此能够在不同程度上防止致死性休克。然而，还没有证明这种效应是否归因于肽和LPS及LTA的结合，或者归因于肽与宿主细胞的直接相互作用。阳离子肽是响应于微生物或微生物信号分子如LPS的攻击(challenge)，通过类似于哺乳动物免疫系统所应用的调控通路(涉及Toll受体和转录因子；NFκB)而被诱导的。阳离子肽因而在先天免疫中似乎具有重要的作用。影响到抗细菌肽的诱导的突变能够降低对细菌攻击的响应中的存活。另外，果蝇(Drosophila)的Toll通路的突变——其导致抗真菌肽的表达减少，也导致对致命的真菌感染的敏感性增加。在人类中，患有特异性颗粒体缺乏综合征(specific granule deficiency syndrome)的患者完全缺乏α-防御素，遭受频繁和严重的细菌感染。其它证据包括一些肽可由感染原诱导，以及已经发现在炎症发生的位点这些肽的浓度相当高。阳离子肽也可以调控细胞迁移，以促进白细胞对抗细菌感染的能力。例如，已经指出，两种人α-防御素肽，HNP-1和HNP-2，具有对鼠类和人T细胞以及单核细胞的直接趋化活性，人β防御素似乎通过与CCR6相互作用，而用作未成熟的树突细胞和记忆T细胞的化学引诱物(chemoattractants)。类似地，发现猪阳离子肽PR-39对嗜中性粒细胞有趋化性。然而，关于不同结构和组成的肽是否共享这些特性，是不清楚的。
LL-37是单一已知的来自人的cathelicidin(一种具强效膜活性的抗微生物肽类的前体)，它是由骨髓前体、睾丸、炎症疾病期间的人角化细胞和呼吸道上皮细胞产生。Cathelicidin多肽的特征是在称之为cathelin结构域的N端前原区(prepro region)具有高水平的序列同一性(sequence identity)。Cathelicidin多肽作为未活化的肽原前体(propeptide precusors)被贮存，一旦受到刺激，它便被加工成为活性的肽。
发明概述 本发明是基于如下开创性发现可以基于受内毒性的脂多糖、脂磷壁酸、CpG DNA或其它细胞成分(例如微生物或它们的细胞成分)调节，而又被阳离子肽影响的多核苷酸表达谱型，筛选出可阻断或降低个体的脓毒症和/或炎症的新颖化合物。而且，在使用阳离子肽作为工具的基础上，能够鉴定出先天免疫的选择性强化剂，它们不会引起脓毒症反应，并能够阻断/抑止炎症和/或脓毒症应答。
因此，在一个实施方案中，提供了鉴定多核苷酸或多核苷酸谱型的方法，所述多核苷酸或多核苷酸谱型受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节，同时受阳离子肽抑制。本发明的方法包括将一种或多种多核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即将该种或多种多核苷酸与阳离子肽接触。检测在阳离子肽存在时和阳离子肽不存在时的表达差异，在表达上的变化，或者是增量调节(up-regulation)或者是减量调节(down-regulation)，可以作为受脓毒症或炎症诱导物调节同时又受阳离子肽抑制的多核苷酸或多核苷酸谱型的标志。在另一个方面，本发明提供了由上述方法鉴定的一种或多种多核苷酸。脓毒症或炎症调节物的例子包括LPS、LTA或CpG DNA或微生物成分(或它们的任意组合)，或相关试剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可阻止脓毒症或炎症的试剂的方法，包括将由前述方法鉴定出的多核苷酸与一种试剂进行组合，其中，与不存在该试剂时的表达相比较，在存在该试剂时该多核苷酸的表达受到了调节，并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。
在另一个实施方案中，本发明通过1)在存在或缺乏阳离子肽的情况下，将细胞与LPS、LTA和/或CpG DNA接触，和2)检测所述细胞在存在或缺乏该肽的情况下的多核苷酸表达谱型，提供了一种鉴定在炎症或脓毒症应答受抑制时的多核苷酸表达谱型的方法。在该肽存在时获得的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。在另一个方面，将该肽存在时获得的谱型与一种受测化合物存在时获得的谱型相比较，从而鉴定出提供类似谱型的化合物。在另一个方面，本发明提供了由前述方法鉴定的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法，包括将编码涉及先天免疫的多肽的一种或多种多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时相比较，在存在该试剂时该多核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。优选地，该试剂并不刺激对象内的脓毒症反应。在一个方面，该试剂增加抗炎症的多核苷酸的表达。示例性但非限制性的抗炎多核苷酸编码的蛋白例如IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答蛋白2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL-19(NM_013371)或IL-10(M57627)。在一个方面，该试剂降低编码涉及NK-κB激活的蛋白酶体亚基例如蛋白酶体亚基26S(NM_013371)的多聚核苷酸的表达。在一个方面，该试剂可以作为蛋白激酶的拮抗剂。在一个方面，该试剂是选自SEQ ID NO4-54的肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定多核苷酸表达谱型以鉴定可选择性地强化先天免疫的化合物的方法。本发明包括检测在有阳离子肽接触时和无阳离子肽接触时细胞的多核苷酸表达谱型，其中，在该肽存在时的谱型代表刺激先天免疫；检测在有一种受测化合物接触时细胞的多核苷酸表达谱型，其中，如果使用该受测化合物时的谱型与在该阳离子肽存在时观察到的谱型相类似，则表示该受测化合物可强化先天免疫。优选的是，该化合物并不刺激个体内的脓毒症反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了由哺乳动物对象的核酸样品推断该对象的感染状态的方法，该方法是依靠于确定该核酸样品中的多核苷酸表达谱型，例如与未感染的个体相比，表50、51和/或52中的至少两种多聚核苷酸的表达量增加。还包括由上述任一方法获得的多核苷酸表达谱型。
在另一个方面，提供了作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽。仍然在另一个方面，提供了鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽的方法，包括在受测肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触，并测量趋化性。如果在受测肽存在时趋化性降低，则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。阳离子肽也可以起到降低SDF-1受体多核苷酸(NM_013371)的表达的作用。
在上述所有方法中，本发明的化合物或试剂包括但不限于肽(peptides)、阳离子肽(cationic peptides)、肽模拟物(peptidomimetics)、化学化合物(chemicalcompounds)、多肽(polypeptides)、核酸分子(nucleic acid molecules)和类似物。
仍然在另一方面，本发明提供了被分离的阳离子肽。本发明的被分离的阳离子肽可用下列任一通式和单字母氨基酸记号表示X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(SEQ ID NO4)，其中X1是一个或两个R、L或K，X2是一个C、S或A，X3是一个R或P，X4是一个A或V，X5是一个V或W；X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(SEQ ID NO11)，其中X1是一个或两个D、E、S、T或N，X2是一个或两个P、G或D，X3是一个G、A、V、L、I或Y，X4是一个R、K或H，X5是一个S、T、C、M或R；X1X2X3X4WX4WX4X5K(SEQ ID NO18)，其中X1是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X2是一个或两个芳香氨基酸(F、Y和W)，X3是一个P或K，X4是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X5是一至三个选自R或P的氨基酸；X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(SEQ ID NO25)，其中X1是一个或两个R或K，X2是一个极性的或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是C、S、M、D或A，X4是F、I、V、M或R；X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(SEQ ID NO32)，其中X1是一个或两个R或K，X2是一个极性的或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是一个C、S、M、D或A，X4是一个F、I、V、M或R，X5是一个A、I、S、M、D或R；和KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQ ID NO39)，其中，X1是极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X2是一个A、L、S或K，X3是1至17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸；KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(SEQ ID NO46)，其中X1是疏水氨基酸，X2是亲水氨基酸。
此外，在另一方面本发明提供了被分离的阳离子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO53)和KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO54)。
还提供了编码本发明的阳离子肽的核酸序列，包含这些多聚核苷酸的载体和含有这些载体的宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了刺激或强化对象的先天免疫的方法，包括给予所述对象本发明的肽，例如，SEQ ID NO1-4、11、18、25、32、39、46、53或54中列出的肽。如本文的实施例所示，可以由单核细胞活化、增殖、分化或MAP激酶途径的活化来证实先天免疫，这仅仅是示例。在一个方面，本方法包括进一步给予对象血清因子如GS-CSF。对象优选地是任何哺乳动物，更特别地是人类对象。
在另一实施方案中，本发明提供了刺激对象先天免疫的方法，所述对象患有感染或处于患感染的风险中，方法包括，给予对象次优浓度(sub-optimalconcentration)的抗生素，并与本发明的肽相联合。在一个方面，所述肽是SEQ ID NO1或SEQ ID NO7。


图1说明了Seq ID No7和头孢吡肟在治疗金黄葡萄球菌(S.aureus)感染中的协同作用。通过腹膜内(IP)注射给予CD-1鼠(8只/组)含有1×107金黄色葡萄球菌的5％猪粘蛋白液(mucin)。在给予金黄色葡萄球菌之后6小时，经单独的IP注射给予受测化合物(50μg-2.5mg/kg)。此时，也给予头孢吡肟，剂量是0.1mg/kg。其后24小时，使小鼠安乐死，抽取血液并铺板，进行存活计数。显示出平均值±标准偏差。重复此试验两次。
图2显示，暴露于SEQ ID NO1，诱导了ERK1/2和p38的磷酸化。使来自人外周血源单核细胞的裂解物暴露于50μg/ml的SEQ ID NO1，暴露15分钟。A)特异于磷酸化形式的ERK和p38的抗体被用来检测ERK1/2和p38的活化。所有受测供体显示，ERK和p38的磷酸化响应于SEQ ID NO1处理而增加。八个中的一个代表性供体。如材料与方法中描述，用磷酸化条带的强度除以相应对照条带的强度，确定磷酸化ERK(B)和p38(C)的相对量。
图3显示，在不存在血清的情况下，LL-37诱导的ERK1/2磷酸化并不发生，并且磷酸化的程度依赖于存在的血清类型。用50μg/ml LL-37处理人血源单核细胞(human blood derived monocytes)15分钟。在12％丙烯酰胺凝胶上分离裂解物，然后转移至硝酸纤维素膜并用特异于磷酸化(活化)形式的激酶的抗体探查。为了使蛋白上样标准化，再用β-肌动蛋白探查膜。用ImageJ软件定量。图3中的插入图说明，在无血清的条件下，LL-37不能诱导人单核细胞中的MAPK活化。将细胞暴露于50mg/ml的LL-37(+)或作为载体对照的无内毒素的水(-)，暴露15分钟。(A)暴露于含10％胎牛血清的培养基中的LL-37之后，可以检测到磷酸化的ERK1/2，然而，在血清不存在的情况下，没有检测到ERK1/2磷酸化(n＝3)。(B)在暴露于含10％胎牛血清的培养基中的50μg/ml LL-37之后，Elk-1被激活(被磷酸化)，Elk-1是ERK1/2下游的转录因子，但是在不存在血清时，Elk不被激活(n＝2)。
图4显示，LL-37诱导的ERK1/2活化发生在较低浓度时，并且在一些细胞因子存在的条件下被放大。当新鲜分离的单核细胞在含有GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中被刺激时，LL-37诱导的ERK1/2磷酸化在低至5μg/ml的浓度时都是明显的。EKR1/2的这种协同激活似乎主要归因于GM-CSF。
图5显示，在16HBE4o-人支气管上皮细胞系中，肽影响多种细胞因子基因的转录和IL-8的释放。使细胞在半透膜上生长至会合，并在顶面(apicalsurface)上用50μg/ml的SEQ ID NO1刺激4小时。A)SEQ ID NO1处理的细胞比对照组产生显著更多的IL-8，如对在顶面——而不是底侧面(basolateral surface)收集到的上清通过ELISA所测定的。显示了三个独立试验的平均值±标准偏差(SE)，星号表示p＝0.002。B)从上述试验物收集RNA，进行RT-PCR。已知由ERK1/2或p38调节的许多细胞因子基因，在用肽刺激后被增量调节。显示了两个独立试验的平均值。
发明详述 本发明提供了可由一组通式表征的新颖的阳离子肽，它们能够调节(例如，增量调控和/或减量调控)多核苷酸的表达，由此调控脓毒症和炎症应答和/或先天免疫。
本文使用的“先天免疫”是指生物防御病原体入侵、保护自己的先天具有的能力。在此使用的病原体或微生物可以包括，但不限于细菌、真菌、寄生虫和病毒。先天免疫与获得性/适应性免疫不同，对于后者，生物主要是基于抗体和/或免疫淋巴细胞来发展自己的防御机制，其特征是特异性、可放大性和辨认自身与非自身。先天免疫提供了广泛的非特异性免疫，并且对于以前的暴露没有免疫记忆。先天免疫的特点是能够有效地抵抗广范围的各种潜在病原体，而不依赖于对一种病原体的先前接触，先天免疫的另一个特点是能够快速的生效(与特异性免疫应答相比较而言，特异性免疫应答的激发需要数天到数周的时间)。而且，先天免疫包括影响到其它疾病的免疫应答，这些疾病例如癌症、炎症疾病、多发性硬化症、各种病毒感染，等等。
正如本文所使用的，术语“阳离子肽”是指约5到约50个氨基酸长的氨基酸序列。在一个方面，本发明的阳离子肽的长度为约10到约35个氨基酸。如果一个肽具有足够的正电荷氨基酸，以致于pKa大于9.0，则认为该肽是“阳离子肽”。通常，该阳离子肽的氨基酸残基中至少有两个是带正电荷的，例如赖氨酸和精氨酸。“具正电荷”是指在pH 7.0时具有净的正电荷的氨基酸残基侧链。自然出现的阳离子抗微生物肽的例子包括防御素、cathelicidins、爪蟾抗菌肽、峰毒肽(melittin)、杀菌肽、bactenecins(来自牛嗜中性粒细胞的抗微生物多肽)、indolicidins、polyphemusins、tachyplesins(来自马蹄蟹血细胞的抗微生物多肽)，以及它们的类似物，这些自然出现的阳离子抗微生物多肽可以依据本发明重组产生。许多生物都制造阳离子肽，把这些分子作为抵抗微生物的非特异性防御机制的一部分来使用。分离出来的这些肽对广范围的各种微生物具有毒性，包括细菌、真菌和某些带被膜的病毒。当阳离子肽对许多病原体发挥抵抗作用时，显著的异常和不同程度的毒性是存在的。然而，本专利揭露了对微生物不具毒性却能够通过刺激先天免疫防御感染的其它阳离子肽，并且本发明并不限于具有抗微生物活性的阳离子肽。事实上，在本发明中使用的许多肽并没有抗微生物活性。
在本技术领域已知的阳离子肽包括，例如人cathelicindin IL-37、牛嗜中性细胞多肽indolicidin、以及牛bactenecin的变体，Bac2A。
IL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID1)IndolicidinILPWKWPWWPWRR-NH2(SEQ ID NO2)Bac2A RLARIVVIRVAR-NH2(SEQ ID NO3) 在先天免疫中，免疫应答并不依赖于抗原。先天免疫过程可以包括分泌分子和前面提出的细胞组分的产生。先天免疫中，病原体由在种系中编码的受体识别。这些Toll样受体具有广泛的特异性，能够识别许多病原体。当阳离子肽出现在免疫应答中时，它们辅助宿主对病原体的应答。在免疫应答中的这种变化诱导趋化因子的释放，趋化因子促使免疫细胞集中到感染发生的部位。
趋化因子或化学诱导细胞因子属于一类免疫因子，它们介导趋化和其它促炎症现象(参见，Schall，1991，Cytokine 3165-183)。趋化因子是长度大约70-80个残基的小分子，通常被分为两亚类，具有由单个氨基酸隔开的N端半胱氨酸(CxC)的α亚类，和在N端具有两个相邻半胱氨酸(CC)的β亚类。RANTES、MIP-1α和MIP-1β属于β亚类(参见综述Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci，15159-165；Murphy，P.M.，1994，Annu.Rev.Immunol.，12；593-633)。β型趋化因子RANTES、MCP-1和MCP-3的氨基末端牵连到介导细胞迁移和由这些趋化因子诱导的炎症反应的调节。这种关联由实验观察看出，剔除MCP-1氨基末端的8个残基、MCP-3氨基末端的9个残基和RANTES氨基末端的8个残基，以及将甲硫氨酸增加到RANTES的氨基末端，会对其趋化性、钙转移和/或由它们的天然相似物刺激的酶释放产生拮抗作用(Gong等，1996 J.Biol.Chem.27110521-10527；Proudfoot等，1996 J.Biol.Chem.2712599-2603)。另外，可以通过将Tyr 28和Arg30通过双突变变为亮氨酸和缬氨酸，将与α型趋化因子类似的趋化活性引入到MCP-1中，这表明该蛋白的内部区域在调控趋化活性时也发挥着作用(Beall等，1992，J.Biol.Chem.2673455-3459)。
迄今已被表征的所有趋化因子的单体形式都具有明显的结构同源性，尽管α型和β型的四级结构有所不同。β型和α型趋化因子的单体结构非常类似，但是这两种类型的二聚体结构则完全不同。还鉴别出了另外一种趋化因子，淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，它只有一个N端半胱氨酸，它代表了趋化因子的第三个亚家族(γ)(Yoshida等，1995，FEBS Lett.360155-159；和Kelner等，1994.Science 2661395-1399)。
趋化因子的受体属于与G蛋白偶联的具有7个跨膜结构域的受体(GCR’s)大家族(参见综述Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci.15159-165；和Murphy，P.M.，1994，Annu.Rev.Immunol.12593-633)。竞争结合和交互失敏(cross-desensitization)研究已表明趋化因子受体在结合配体时具有明显的混杂性。证明β趋化因子间的混杂性的例子包括CC CKR-1结合RANTES和MIP-1α(Neote等，1993，Cell 72415-425)，CC CKR-4结合RNATES、MIP-1α和MCP-1(Power等，1995，J.Biol.Chem.27019495-19500)，以及CC CKR-5结合RNATES、MIP-1α和MIP-1β(Alkhatib等，1996，Science，in press和Dragic等，1996，Nature 381667-674)。红细胞具有一种能够结合α和β趋化因子的受体(被称为达菲抗原(Duffy antigen))(Horuk等，1994，J.Biol.Chem.26917730-17733；Neote等，1994，Blood 8444-52；和Neote等，1993，J.Biol.Chem.26812247-12249)。因此，趋化因子以及它们的受体间的明显的序列和结构同源性使得在受体-配体的相互作用中存在着交叉。
一方面，本发明提供了包括本发明的阳离子肽在内的化合物通过直接作用于宿主细胞而减少脓毒症和炎症应答的应用。在这一方面，鉴别被一种或多种脓毒症或炎症诱导物调控的多核苷酸的方法被提供，其中该调控被阳离子肽改变。所述的脓毒症或炎症诱导物包括，但不限于内毒性脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和/或CpG DNA或完整的细菌或其它细菌组分。该鉴别方法是依靠将多核苷酸与脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即与阳离子肽接触。在存在阳离子肽和缺少阳离子肽时，对多核苷酸的表达进行观察，表达上的变化说明该多核苷酸或多核苷酸谱型受脓毒症或炎症诱导物的调控，并受阳离子肽的抑制。在另一个方面，本发明提供了由该方法鉴定的多核苷酸。
这样的多核苷酸一旦被鉴定出来，就可用于筛选能够通过影响该多核苷酸的表达而阻止脓毒症或炎症的化合物。对表达的这种影响可以是表达的增量调控(up regulation)或减量调控(down regulation)。通过鉴定不激发脓毒症反应的化合物和能够阻止或抑止炎症或脓毒症反应的化合物，本发明还提出了鉴别先天免疫强化剂的方法。此外，本发明提供了在上述方法中使用和鉴别出的化合物。
候选化合物从广泛的来源获得，包括各种合成化合物和天然化合物的文库。例如，可以利用许多方法来随机和定向合成出各种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。作为选择，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库(libraries)可被利用或方便地生产。此外，可以通过传统的化学、物理和生化手段方便地修饰天然的或合成产生的文库和化合物，也可利用这些文库和化合物得到组合文库(combinatorial libraries)。已知的药理学的药剂可以作定向或随机的化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等等，从而得到结构类似物(structural analogs)。候选试剂也可以从生物分子中找到，包括但不限于肽、肽模拟物(peptidiomimetics)、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、多肽、多聚核苷酸、化合物(chemical compounds)、衍生物(derivatives)、结构类似物(structural analogs)或它们的组合(combinations)。
筛选实验的温育要素(components)包括允许受测化合物与感兴趣的多核苷酸相互接触的条件。接触可以是在液相中、固相中，或者在细胞中。为了筛选出多个化合物，受测化合物可以选择为组合文库。依本发明的方法鉴定出的化合物可以通过在检测化合物时通常使用的任何方法，在溶液中或者在结合到固体支持物之后，被进一步评估、检测、克隆、测序等等。
一般而言，在本发明的方法中，利用阳离子肽来检测和定位在脓毒症和炎症过程中必需的多核苷酸。一旦被鉴定出来，就可以通过观察其在阳离子肽存在和缺乏时的表达来获得多核苷酸的表达谱型。在阳离子肽存在的情况下获得的谱型对于鉴定能够抑制该多核苷酸的表达并由此阻止脓毒症或炎症的其它化合物又是很有用的。对于本领域技术人员而言，已熟知的是，非肽类化合物和肽模拟物能够模拟肽结合受体的能力和酶结合位点，并由此可被用来阻断或激发生物反应。当一种感兴趣的另外的化合物提供了与在阳离子肽存在时相类似的多核苷酸表达谱型时，也可该应用化合物来调节脓毒症或先天免疫应答。如此讲来，本发明的阳离子肽在作为脓毒症和炎症的已知抑制剂和先天免疫的已知强化剂的同时，也可用作鉴定抑制脓毒症和炎症和强化先天免疫的其它化合物的工具。
正如在后面的实施例中看到的，本发明的肽具有广泛的降低由LPS调控的多核苷酸表达的能力。在严重的感染或炎症期间所看到的许多症状例如发烧和白血细胞数目升高都归咎于血液中的高水平内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组分，它是脓毒症在病理生理学上强有效的引发剂(trigger)。炎症和脓毒症的基本机制是相关联的。在实施例1中，利用多核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞的转录应答的影响。特别地，观察了对由LPS诱导的超过14,000个不同的特定多核苷酸探针的影响。表格显示了用肽处理过的细胞与对照细胞相比所见到的变化。得到的数据表明该肽具有降低由LPS诱导的多核苷酸表达的能力。
类似地，实施例2说明了本发明的肽能够中和革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产物对免疫细胞的刺激。另外，注意到，某些促炎症的多核苷酸受阳离子肽的减量调节，这些阳离子肽在表24中列出，例如TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受体相关因子2(T55353)、TNF受体相关因子3(AA504259)、TNF受体超家族成员12(W71984)、TNF受体超家族成员17(AA987627)、小的诱导性细胞因子亚家族B成员6(AI889554)、IL-12Rβ2(AA977194)、IL-18受体1(AA482489)，而抗炎症的多核苷酸受阳离子多肽的增量调节，这些阳离子多肽在表25中列出，例如IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、可由TGF-B诱导的早期生长应答2(AI473938)或CD2(AA927710)。这些结果的适用性和应用通过对鼠的体内应用证实。
在另一个方面，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法。在此方法中，将编码涉及先天免疫的多肽的多核苷酸与感兴趣的试剂接触。在存在该试剂和缺少该试剂的情况下，测定该多核苷酸的表达。比较表达情况，表达的特异性调节说明先天免疫被强化。在另一方面，该试剂并不激发脓毒症反应，如同缺乏促炎症细胞因子TNF-α的增量调节(upregulation)时所揭示的。仍然在另一个方面，该试剂降低或阻断炎症或脓毒症应答。还是在另一个方面，该试剂降低TNF-α和/或白介素的表达，白介素包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-8。
在另一方面，本发明提供了利用阳离子肽进行直接的多核苷酸调节的方法和包括阳离子肽在内的化合物在激化先天免疫的元素(elements)中的应用。在这一方面，本发明提供了为了鉴定可强化先天免疫的化合物而确定多核苷酸表达谱型的方法。在本发明的该方法中，对与阳离子肽接触的和未与阳离子肽接触的细胞作了多核苷酸表达谱型的初步检测。在该肽存在的情况下得出的多核苷酸表达谱型表明先天免疫受到刺激。然后检测了在受测化合物存在的情况下多核苷酸的表达谱型，其中使用受测化合物得到与在阳离子肽存在时相类似的表达谱型，说明这是一个可强化先天免疫的化合物。在另一个方面，本发明提供了在上述方法中确认的化合物。在另一个方面，本发明的化合物刺激趋化因子或趋化因子受体的表达。趋化因子或趋化因子受体可以包括，但不限于CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。仍然是在另一方面，该化合物是肽、肽模拟物(peptidomimetic)、化学化合物(chemical compounds)或核酸分子。
仍然是在另一方面，该多核苷酸表达谱型包括促炎症的多核苷酸的表达。这些促炎症多核苷酸包括，但不限于环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整联蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)和它们的任意组合。仍然在另一个方面，该多核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达，细胞表面受体包括但不限于视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)。
在实施例4中可以看到，本发明的阳离子肽可改变巨噬细胞和上皮细胞中的多核苷酸表达。此实施例的结果说明，促炎症的多核苷酸受阳离子肽的减量调节(down-regulated)(表24)，而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的增量调节(up-regulated)(表25)。
在后面例如表1-15中将说明，阳离子肽能够中和宿主对感染原的信号分子的应答，还能改变宿主细胞的转录应答，这些主要是通过减量调节促炎应答和/或增量调节抗炎应答来完成。实施例5说明，该阳离子肽能够通过诱导趋化因子的释放来辅助宿主对病原体的应答，趋化因子促使免疫细胞聚集到感染位点。这些结果通过鼠的体内应用被证实。
从后面的实施例可以看到，阳离子肽明显影响宿主对病原体的应答，原因在于阳离子肽诱导选择性的促炎应答，例如促使免疫细胞聚集到感染位点的应答，但不诱导潜在有害的促炎细胞因子，由此辅助宿主免疫应答的调控。脓毒症似乎部分地是由对感染原的过度促炎应答引起的。阳离子肽诱导抗炎应答和抑制某些具有潜在危害的促炎应答，由此帮助宿主对病原体产生一种“平衡”的应答。
在实施例7中，为了研究阳离子肽与细胞相互作用时产生这些效果的基本机制，对所选择的MAP激酶的活化作了分析。巨噬细胞在应答细菌感染时激活MEK/ERK激酶。MEK是MAP激酶激酶，当它被激活时，便会磷酸化下游的激酶ERK(细胞外调节性激酶)，然后ERK形成二聚体并转移到细胞核，它在那里激活转录因子如EIK-1，由此改变多核苷酸的表达。已经表明MEK/ERKK激酶可削弱巨噬细胞内的沙门氏菌(Salmonella)的复制。由MEK激酶和NADPH氧化酶介导的信号传导在对细胞内病原体的先天性防御中发挥着重要的作用。如下面所示，阳离子肽通过影响MAP激酶，对细菌感染产生影响。这些阳离子肽可以直接影响激酶。表21显示了在对肽的应答中MAP激酶多核苷酸表达的变化，但是不限于这些。这些激酶包括MAP激酶激酶6(H070920)、MAP激酶激酶5(W69649)、MAP激酶7(H39192)、MAP激酶12(AI936909)和被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)。
在另一方法中，本发明的方法可以被组合使用，以鉴定具有多种特征的试剂，即具有抗炎症/抗脓毒症活性和能够部分地通过体内诱导趋化因子而强化先天免疫的肽。
在另一个方面，本发明提供了由哺乳动物对象的核酸样品推断该对象的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多核苷酸表达谱型，其例证是表55中的至少两个多聚核苷酸与未感染的对象相比，多核苷酸表达增加。在另一方面，本发明提供了由哺乳动物对象的核酸样品推断该对象的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多核苷酸表达谱型，其例证是表56或表57中的至少两个多核苷酸与未感染的个体相比较的多核苷酸表达。在本发明的一个方面，感染状态的原因在于感染原或从它们那里得到的信号分子，例如，但不限于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、病毒、真菌或寄生虫。在另一个方面，本发明提供了依据上述方法确定的受感染对象的多核苷酸表达谱型。一旦经确定，这样的多核苷酸将可用于诊断与这些感染原或信号分子的存在或活性相关的症状。
后面的实施例10显示了本发明的这个方面。特别地，表61证明了MEK和NADPH氧化酶抑制剂都能限制细菌的复制(通过IFN-γ引发的巨噬细胞的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)感染激化了MEK激酶)。这是通过改变宿主细胞信号分子而如何影响细菌存活的一个例子。
仍然在本发明的另一个方面，提出了可抑制由基质细胞源性因子1(SDF-1)诱导的T细胞趋化性的化合物。还提出了可降低SDF-1受体表达的化合物。这些化合物也可以用作CXCR-4的拮抗剂或抑制剂。在一个方面，本发明提供了作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽。在另一个方面，本发明提供了鉴定作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽的方法。该方法包括，在存在受测肽和缺少受测肽时，将T细胞与SDF-1接触，并测量趋化性。在受测肽存在的情况下，趋化性的降低表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。这些化合物和方法在HIV病人的治疗应用中是有用的。这些类型的化合物及其实用性已经被证明，例如实施例11(也参见表62，63)。在该实施例中，已经表明阳离子肽可抑制细胞迁移(cell migration)以及抗病毒活性。
在一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式A)的氨基酸序列的被分离的阳离子肽X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(SEQ ID NO4)，其中X1是一个或两个R、L或K，X2是一个C、S或A，X3是一个R或P，X4是一个A或V，X5是一个V或W。本发明的肽的例子包括，但不限于LLCRIVPVIPWCK(SEQID NO5)，LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO8)，RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQ ID NO10)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式B)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(SEQ ID NO11)，其中X1是一个或两个D、E、S、T或N，X2是一个或两个P、G或D，X3是一个G、A、V、L、I或Y，X4是一个R、K或H，X5是一个S、T、C、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQ ID NO13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQ ID NO14)，SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO15)，ELPLKRGRVPVE(SEQ ID NO16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO17)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式C)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽X1X2X3X4WX4WX4X5K(SEQ ID NO18)(此式包括CP12a和CP12d)，其中X1是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X2是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W)，X3是一个P或K，X4是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X5是一至三个选自R或P的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQ ID NO19)，RRAWWKAWWARRK(SEQ ID NO20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO21)，RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQ ID NO22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO23)和RRRWKWAWPRRK(SEQ ID NO24)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式D)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(SEQ IDNO25)，其中X1是一个或两个R或K，X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是C、S、M、D或A，X4是F、I、V、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQ ID NO26)，KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO27)，KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO28)，RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO29)，KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO31)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式E)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(SEQ IDNO32)，其中X1是一个或两个R或K，X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是一个C、S、M、D或A，X4是一个F、I、V、M或R，X5是一个A、I、S、M、D或R。本发明的肽的例子包括，但不限于RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQ ID NO33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO34)，KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ ID NO36)，KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQID NO37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO38)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式F)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQ ID NO39)，其中X1是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X2是一个A、L、S或K，X3是1-17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQ IDNO40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ ID NO41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQ ID NO42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO43)，KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQ ID NO44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO45)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式G)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(SEQ ID NO46)，其中，X1是疏水性氨基酸，X2是亲水性氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO47)，KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO49)，KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO51)，和KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO52)。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述式子的氨基酸序列的被分离的阳离子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO53)或KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO54)。
在此使用的术语“分离的”是指基本上没有其它蛋白质、脂类和核酸(例如，与体内产生的肽天然联系在一起的细胞组分)的肽。优选地，该肽的纯度依重量来算至少为70％、80％，或者最优选90％。
本发明还包括被列举的多肽的类似物(analogs)、衍生物(derivatives)、保守变异体(conservative variations)和阳离子肽变体(cationic peptide variants)，只要这些类似物、衍生物、保守变异体或变体具有可检测到的强化先天免疫或抗炎症的活性。肽的类似物、衍生物、保守变异体或变体的活性不一必与该肽的活性完全相同。
阳离子肽“变体”是指作为所参照的阳离子肽的变化形式的肽。例如，术语“变体”包括参照肽的至少一个氨基酸在表达文库中被替换而得到的阳离子肽。术语“参照”肽是指本发明的任何阳离子肽(例如，在上面式子中所定义的)，由它们得到变体、衍生物、类似物或保守变异。术语“衍生物”包括杂合肽，它包括两种阳离子肽中的每一种的至少一部分(例如，两种阳离子肽中的每一种的30-80％)。还包括将一个或多个氨基酸从在此列举的肽的序列中删去所得到的肽，只要该衍生物具有强化先天免疫或抗炎症的活性。由此可以开发得到同样具有效用的更小的活性分子。例如，可以移去那些对于强化先天免疫和肽的抗炎活性并不是必要的氨基端氨基酸或羧基端氨基酸。同样，可以将一个或一些(例如，少于5个)氨基酸添加到阳离子肽上而且不会完全抑制该肽的活性，这样便得到另外的衍生物。此外，C端衍生物，例如C端甲基酯，和N端衍生物可以被获得，而且它们被包括在本发明内。本发明的肽包括本发明所公开的肽的任何类似物、同源物(homolog)、突变体(mutant)、异构体(isomer)或衍生物，只要在此所述的生物活性仍然保留着。还包括前面提出的通式所包含的肽的反向序列。此外，可以用“L”构型的氨基酸替代“D”构型的氨基酸，反之亦然。作为选择，可以通过化学方法或者在其序列中增加两个或多个半胱氨酸残基并氧化形成二硫键，将该肽环化。
本发明还包括作为在此列举的那些肽的保守变异体的肽。在此使用的术语“保守变异体”是指至少一个氨基酸被别的生物活性类似的残基替换所得到的多肽。保守变异体的例子包括用一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替代另一个疏水性残基，或者用一个极性残基替代另一个极性残基，例如，精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，谷氨酰胺替代天冬酰胺，等等。可以彼此替换的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异体”还包括用取代的氨基酸替换未取代的原氨基酸(parent amino acids)所得到的肽。这些取代的氨基酸可以包括甲基化的或酰胺化的氨基酸。其它替代对于本领域技术人员是熟知的。在一个方面，针对取代的多肽制出的抗体也能够特异地结合未取代的多肽。
本发明的肽可以用普遍使用的方法合成，例如，该方法包括α氨基的t-BOC或FMOC保护。两种方法都涉及逐步合成步骤，其中从该肽的C末端开始，每一步增加一个氨基酸(参见，Coligan等，Current Protocols in Immunology，WileyInterscience，1991，Unit 9)。本发明的肽也可以用已熟知的固相肽合成方法合成，例如由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，852149，1962)以及Stewart和Young(SolidPhase Peptides Synthesis，Freeman，San Francisco，1969，第27-62页)描述的方法，其中使用了苯乙烯-二乙烯基苯共聚聚合物，每克聚合物中有0.1-1.0mMol胺。化学合成完成后，用HF-10％苯甲醚在0℃处理1/4-1小时，将该肽脱保护并从聚合物上切割下来。待试剂蒸发后，用1％乙酸溶液将肽从聚合物中提取出来，然后冻干得到粗产物。使用例如凝胶过滤的技术将该肽纯化，例如在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂。将柱洗脱物的合适级分冻干，便可产生匀质的肽，然后用标准的技术例如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光或者溶解性测量对它进行表征。如果需要的话，该肽可以使用固相Edman降解法定量。
本发明也包括编码本发明的肽的被分离的核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)。编码本文描述的肽的类似物、突变体、保守变异体和变体的核酸也包括在内。本文使用的术语“分离的”是指基本上除去了与体内产生的核酸天然联系着的蛋白、脂和其它核酸所得到的核酸。优选地，该核酸的纯度在重量上为至少70％、80％或优选90％。可以使用体外合成核酸的传统方法替代体内方法。正如本文使用的，“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，它们可以是一个独立的片断，也可以是一个大的遗传构建物(construct)的一部分(例如，将一个启动子可操作地连接到编码本发明的肽的核酸上)。大量的遗传构建物(例如，质粒和其它表达载体)在本领域是已知的，它们可被用于在无细胞系统或原核细胞或真核(例如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中制造本发明的肽。考虑到遗传密码的简并性，本领域普通技术人员能够容易地合成编码本发明的多肽的核酸。可以方便地使用传统的分子生物学方法利用本发明的核酸获得本发明的肽。
可以将编码本发明的阳离子肽的DNA插入到“表达载体”中。术语“表达载体”是指一种遗传构建物例如质粒、病毒或其他本领域已知的载体，它们可以经过设计而含有编码本发明的多肽的核酸。这些表达载体优选为含有启动子序列的质粒，启动子有助于插入的基因序列在宿主细胞中的转录。表达载体通常含有复制起点、启动子和能实现被转化的细胞的表型选择的多核苷酸(例如，抗生素抗性多核苷酸)。在本发明中可以使用各种启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子。通常，该表达载体含有复制子位点和由与宿主细胞相容的物种所获得的控制序列。
可以使用本领域技术人员已熟知的传统技术，将本发明的核酸转化或转染到受体(recipient)中。例如，当宿主细胞是大肠杆菌时，可以使用本领域已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。作为选择，可以使用物理方法，例如电穿孔或微注射。电穿孔是通过高电压脉冲将核酸转移到细胞中。此外，可以使用本领域已熟知的方法，通过原生质体融合将核酸引入宿主细胞中。用于转化真核细胞的合适方法例如电穿孔和脂转染也是已知的。
本发明所包含的“宿主细胞”或“受体细胞”是指可以在其中用本发明的核酸来表达本发明的多肽的任何细胞。该术语也包括受体细胞或宿主细胞的任何子代。本发明优选的受体细胞或宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、金黄葡萄球菌(S.aureus)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)，尽管其它的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、真菌和哺乳动物细胞和本领域已知的其它生物也可以被利用，只要该表达载体含有复制起点以允许其在该宿主中表达。
根据本发明的方法所使用的阳离子肽多核苷酸序列可以从生物体中分离得到，或者在实验室合成。编码感兴趣的阳离子肽的特定DNA序列可以通过如下方法获得1)从基因组DNA从分离出双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以提供感兴趣的阳离子肽所需的密码子；和3)利用从供体细胞分离出的mRNA的反转录在体外合成双链DNA序列。在后一种情况中，可以得到mRNA的双链DNA互补序列，它通常被称之为cDNA。
当所需要的肽产物的氨基酸残基的整个序列都是已知时，合成其DNA序列通常是被选择的方法。在本发明中，合成DNA序列具有一个优点，即允许整合进最可能被细菌宿主识别的密码子，由此便没有翻译上的困难，可以获得高水平的表达。此外，事实上任何肽都可以被合成，包括那些编码天然阳离子肽的肽、它们的变体或合成的肽。
当所需要的肽的完整序列是未知的时候，DNA序列的直接合成便不可能，此时可以选择的方法是获得cDNA序列。分离出感兴趣的cDNA序列的标准程序包括构建含有cDNA文库的质粒或噬菌体，cDNA文库是由大量存在于供体细胞中具有高水平遗传表达的mRNA的反转录获得。当联合应用聚合酶链式反应技术时，即使稀有表达产物也能被克隆。当阳离子肽的氨基酸序列的某实体部分是已知时，可以产生标记的单链或双链DNA或RNA探针序列，同样的序列被认为是存在于目标cDNA中，于是在已变性成为单链形式的cDNA克隆拷贝上进行DNA/DNA杂交实验时就可以应用这些探针(Jay等，Nuc.Acid.Res.，112325，1983)。
本发明的肽可以通过注射或在一段时间内逐渐输注而胃肠道外给予。优选地，以治疗有效量给予肽，以增强或刺激先天免疫应答。先天免疫在本文已被描述，然而，先天免疫受到刺激的指示(indicator)的例子包括但不限于单核细胞激活、增殖、分化或MAP激酶通路激活。
可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内(intracavity)或经皮给予肽。传送肽的优选方法包括通过微球体或类蛋白形式的胶囊进行口服，以气雾剂形式传送至肺，或者利用离子电渗透或电穿孔经皮传送。其它的给予方法对本领域技术人员是已知的。
本发明的肽的不经肠道施用的制备物包括无菌的含水或无水溶液、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射用的有机酯例如油酸乙酯。含水载剂包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和含缓冲介质的不经肠道载体，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液或非挥发性油。静脉内施用的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖液的那些)，以及类似物。也可以含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似物。
在一种实施方案中，本发明提供了协同治疗(synergistic therapy)的方法。例如，如本文描述的肽可以和次抑制性浓度(sub-inhibitory concentrations)的抗生素协同联合应用。应用于和本发明的肽的协同疗法的特定类型的抗生素的例子包括氨基糖苷类(aminoglycosides)(例如，妥布霉素)、青霉素类(penicillins)(例如，哌拉西林)、头孢菌素类(cephalosporins)(例如，头孢他啶)、氟喹诺酮(fluoroqunolones)(例如，环丙沙星)、碳青霉烯类(carbapenems)(例如，亚胺培南)、四环素类(tetracyclines)和大环内酯类(macrolides)(例如，红霉素和克拉霉素)。对于上述抗生素进一步的是，典型的抗生素包括氨基糖苷(阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、链霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、红霉素依托酸盐/乙基丁二酸盐/葡庚糖酸盐/乳糖醛酸盐/硬脂酸盐)，β-内酰胺如青霉素类(例如，青霉素G、青霉素V、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氨苄青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧苄青霉素、美洛西林、阿洛西林和哌拉西林)，或头孢菌素类(例如，头孢噻吩、头孢唑啉、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢呋辛、头孢尼西、头孢美唑、头孢替坦、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢他美、头孢哌酮、头孢氨噻、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟和头孢磺啶)。其它种类的抗生素包括例如碳青霉烯类(例如，亚胺培南)，单环菌素(monobactams)(例如，氨曲南)，喹诺酮类(quinolones)(例如，氟罗沙星、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、洛美沙星和西诺沙星)，四环素类(例如，多西环素、米诺环素、四环素)，和糖肽(glycopeptides)(例如，万古霉素、替考拉宁)。其它抗生素包括氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素、甲氧苄啶、磺胺恶唑、呋喃妥因、利福平、莫匹罗星和阳离子肽。
在感染模型中，在治疗学上评价了单独的肽以及与次优浓度(sub-optimal concentrations)的抗生素联合应用的肽的效力。金黄色葡糖球菌是重要的革兰氏阳性病原体，并且是抗生素抗性感染的重要原因。简言之，感染发生6小时后，通过单独注射肽和以及与次优浓度的抗生素联合注射，在金黄色葡糖球菌感染模型中检测肽的治疗效果。这将模拟在感染期间出现的抗生素抗性环境，在这样的环境中，抗性细菌的MIC过高，从而不能成功地进行治疗(即，应用的抗生素剂量是低于最佳浓度的)。证明了抗生素和肽的联合导致效果改善，这提示了联合疗法的潜力(参见实施例12)。
本发明将参照下列非限制性实施例更详细地进行描述。尽管已经参照其中一些优选实施方案详细描述了本发明，应该理解的是，其修改和变化包含在描述和要求的精神和范围内。
实施例1
抗脓毒症/抗炎活性 利用多核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞转录应答的影响。将A549人上皮细胞系保持在DMEM(Gibco)中，并补充以10％胎牛血清(FBS，Medicorp)。将A549细胞铺在100mm组织培养皿中，每个培养皿含2.5×106个细胞，过夜培养，然后和100ng/ml的大肠杆菌O111B4 LPS(Sigma)共同温育4小时，其中含有50μg/ml的肽及培养基，或者不含有肽而只有培养基(作为对照)。经刺激后，用焦碳酸二乙酯处理的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞一次，再用细胞刷刮下细胞。用RNAquesous(Ambion，Austin，TX)分离总RNA。用含有Superase-In(RNA酶抑制剂；Ambion)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。用DNA-free试剂盒(Ambion)除掉DNA污染。通过1％琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。
所使用的多核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1)，它由双份的大约14,000个的人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用PerkinElmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0，Marina DelRey，CA)确定点的平均强度、中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序计算将每个子小格(subgrid)的底部强度计为10％，并对每个小格(grid)减去此值。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点数值的集合中，获得中间点强度值，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在表1和表2中看到。表2只显示了那些在受测的14,000个多核苷酸中表达发生明显变化的多核苷酸。该数据表明，该肽具有广泛地降低由LPS诱导的多核苷酸表达的能力。
在表1中，多核苷酸微阵列的研究表明了SEQ ID NO27的肽有效地降低了由E.coli O111B4 LPS增量调节的多种多核苷酸的表达。肽(50μg/ml)和LPS(0.1μg/ml)与A549细胞一起温育4小时，或者LPS单独与A549细胞温育4小时，然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针，并杂交到Human Operon阵列(PRHU04)上。表1的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。“比值LPS+ID27/对照”一列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。
表1肽SEQ ID 27降低A549人上皮细胞中被大肠杆菌O111B4 LPS增量调节的多核苷酸表达



a表1到表64中的所有登记号均指GenBank登记号(Accession Numbers)。
在表2中，多核苷酸微阵列的研究表明了浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地降低了由100ng/ml的E.coli O111B4 LPS增量调节的许多多核苷酸的表达。肽和LPS与A549细胞一起温育4小时，或者LPS单独与A549细胞温育4小时，然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针，并杂交到Human Operon阵列(PRHU04)上。表2的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。其它列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。
表2被大肠杆菌O111B4 LPS增量调节并被阳离子肽降低的人A549上皮细胞多核苷酸表达



实施例2中和对免疫细胞的刺激 测试了化合物压制(neutralize，中和)革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌产物对免疫细胞的刺激的能力。细菌产物刺激免疫系统的细胞，由此产生炎症细胞因子，当它们不受压制时，就可能导致脓毒症。开始的实验是利用由美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)获得的鼠巨噬细胞系RAW 264.7、人上皮细胞系A549和来自BALB/c鼠骨髓的原代巨噬细胞(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。用150mm培养板培养来自鼠骨髓的细胞，培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Life Technologies，Burlington，ON)，并补充以20％FBS(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)和20％L细胞条件培养液作为M-CSF来源。当巨噬细胞铺满60-80％时，移去培养基中的L细胞条件培养液，培养14-16小时，直到它们进入静态，然后用10ng/ml LPS或100ng/ml LPS+20μg/ml肽处理24小时。用ELISA(R & D Systems，Minneapolis，MN)测定释放到培养物上清中的细胞因子。细胞系RAW 264.7和A549被保持在补充有10％胎小牛血清的DMEM中。将RAW 264.7细胞以每孔106个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中，将A549细胞以每孔105个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中，两者均于37℃在5％CO2中过夜培养。从过夜生长的细胞中吸去DMEM，换以新鲜培养基。在一些实验中，通过静脉穿刺将志愿者的血液收集(按照UBC临床研究道德委员会承认的程序，证明号C00-0537)到含有14.3USP单位肝素/ml血液的试管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。将血液与带有肽或者没有肽的LPS，于37℃在聚丙烯管中混合6小时。样品于2000×g离心5分钟，收集血浆，然后贮存于-20℃，直到用ELISA(R & D Systems)对其作IL-8分析时才取出。在这些细胞实验中，将细胞与LPS或其它细菌产物于37℃在5％CO2中温育6-24小时。鼠伤寒沙门氏菌LPS和E.coli O111B4 LPS购自Sigma。将来自金黄葡萄球菌(Sigma)的脂磷壁酸(LTA)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物进行鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染。内毒素污染小于1ng/ml，该浓度不会导致RAW 264.7细胞产生明显的细胞因子产物。无帽的脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)由ColoradoState University的John T.Belisle博士馈赠。将分支杆菌(Mycobacterium)的AraLAM过滤灭菌，用鲎变形细胞试验测定内毒素污染，发现为3.75ng/1.0mg LAM。在加入LPS的同时(或者在一些特别指出的地方，是在随后加入)，加入一定浓度范围的阳离子肽。移走上清，用ELISA(R & D Systems)对产生的细胞因子进行检测。所有实验都至少进行三次，得到的是类似的结果。为了证实体内的抗脓毒症活性，将2或3μg E.coli O111B4 LPS的磷酸缓冲盐溶液(PBS；pH 7.2)经腹膜注射到半乳糖胺敏化的8-10周雌性CD-1或BALB/c鼠体内，由此诱导脓毒症。在涉及肽的实验中，在注射LPS的10分钟内，将处于100μl无菌水中的200μg肽注射在不同的腹膜内位点。在其他实验中，将400μg E.coli O111B4 LPS注射进入CD-1鼠，10分钟后，再通过腹膜内注射导入肽(200μg)。注射后对存活情况进行48小时监测。
传统上认为产生过量的TNF-α是与脓毒症的发生联系在一起的。在此实施例中使用的三种类型LPS、LTA或AraLAM代表了由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌释放的产物。SEQ ID NO1的肽能够明显降低由鼠伤寒沙门氏菌、洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)和E.coli O111B4 LPS刺激的TNF-α生成，前者所受的影响要稍小些(表3)。在后两种情况中可以看到，浓度低至1μg/ml的肽(0.25nM)也能导致TNF-α生成的显著降低。一种不同的肽，SEQ ID NO3并不降低RAW巨噬细胞中LPS诱导的TNF-α生成，说明这是阳离子肽的一个并不统一和不可预测的性质。还测试了每个式子的代表性肽影响由E.coli O111；B4 LPS刺激的TNF-α生成的能力(表4)。尽管这些肽中有许多都降低了TNF-α生成的至少60％，但是它们降低TNF-α生成的能力是有差别的。
某些浓度的肽SEQ ID NO1和SEQ ID NO2还能够削弱细菌产物刺激上皮细胞系生成IL-8的能力。已经知道LPS能够有效地刺激上皮细胞生成IL-8。肽在低浓度(1-20μg/ml)时能压制上皮细胞对LPS的IL-8诱导应答(表5-7)。肽SEQ ID 2也抑制由LPS诱导的人全血中的IL-8生成(表4)。相反，高浓度的肽SEQ ID NO1(50-100μg/ml)实际上会导致IL-8的水平升高(表5)。这表明肽在不同的浓度具有不同的效果。
肽对炎症刺激的影响也在原代鼠细胞中得到了证实，肽SEQ ID NO1明显降低了BALB/c鼠的源自骨髓的巨噬细胞中的TNF-α生成(＞90％)，所述细胞已经用100ng/ml E.coli O111B4 LPS刺激过(表8)。这些实验都是在存在血清的情况下进行的，其中含有LPS结合蛋白(LBP)，这是一种能够介导LPS快速结合到CD14上的蛋白。在用100ng/ml E.coli LPS进行刺激后一小时再将SEQ ID NO1延迟加入到巨噬细胞上清中，仍然导致TNF-α生成的明显降低(70％，表9)。
SEQ ID NO1能够阻止LPS在体外诱导生成TNF-α，与此相一致，某些肽也能使鼠避免由高浓度LPS诱发的致死性休克。在一些实验中，通过预先注射半乳糖胺使CD-1鼠对LPS产生过敏性。由半乳糖胺敏化的小鼠在注射以3μg的E.coli O111B4 LPS之后4-6小时内死掉。在注射LPS后15分钟，再注射200μg的SEQ ID NO1，有50％的小鼠存活(表10)。在其它实验中，将更高浓度的LPS注射到没有预先注射D型半乳糖胺的BALB/c鼠中，肽提供的保护是100％，与之相比，在对照组中无一存活(表13)。发现被选择的其它肽在这些模型中也是具有保护性的(表11，12)。
阳离子肽还能够减弱革兰氏阳性细菌的产物对巨噬细胞的刺激，这些细菌产物例如分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)和金黄葡萄球菌(S.aureus)的LTA。例如，SEQ ID NO1抑制革兰氏阳性细菌产物LTA(表14)和AraLAM(表15)对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导，后者的程度稍轻些。还发现另一个肽SEQ ID NO2降低了LTA对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导。浓度为1μg/ml的SEQ ID NO1能够明显降低(＞75％)1μg/ml金黄葡萄球菌LTA对TNF-α生成的诱导。在SEQ ID NO1浓度为20μg/ml时，AraLAM诱导TNF-α的抑制率＞60％。可以引入多黏菌素B(PMB)作为对照，以证明在SEQ ID NO1对AraLAM诱导TNF-α的抑制中，内毒素污染不是一个显著因素。这些结果证明阳离子肽能够减弱免疫系统对细菌产物的促炎细胞因子应答。
表3在RAW 264.7细胞中SEQ ID NO1减少由LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的SEQ ID 1的情况下，用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、100ng/ml洋葱伯克霍尔德菌LPS和100ng/ml E.coli O111B4 LPS，刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。100％是表示单独用LPS温育RAW 264.7细胞6小时所获得的TNF-α的量(鼠伤寒沙门氏菌LPS＝34.5±3.2ng/ml，洋葱伯克霍尔德菌LPS＝11.6±2.9ng/ml，E.coli O111B4LPS＝30.8±2.4ng/ml)。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品，并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
表4在RAW 264.7细胞中阳离子肽减少由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的阳离子肽的情况下，用100ng/ml E.coli O111B4 LPS刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品，并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
表5在A549细胞中SEQ ID 1减少由LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli O111B4)的情况下，用浓度逐渐增高的SEQ ID 1刺激A549细胞24小时。用ELISA测定培养物中的IL-8浓度。单独的细胞的IL-8背景水平为0.172±0.029ng/ml。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
表6SEQ ID 2减少在A549细胞中由E.coli LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli O111B4)的情况下，用浓度逐渐增高的SEQ ID 2刺激人A549上皮细胞24小时。用ELISA测定培养物上清中的IL-8浓度。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
表7SEQ ID 2减少在人血液中由E.coli LPS诱导的IL-8。用E.coli O111B4LPS和浓度逐渐增高的肽刺激人全血4小时。将人全血样品离心，移走血清并用ELISA测定IL-8浓度。数据表示成两个供血者的平均值。
表8SEQ ID 1减少在鼠骨髓巨噬细胞中由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml的肽或者没有肽的情况下，将源自BALB/c鼠骨髓的巨噬细胞与100ng/ml E.coli O111B4 LPS共同培养6小时或24小时。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。数据表示TNF-α的量，它来自两个培养孔，其中源白骨髓的巨噬细胞与LPS单独温育6小时(1.1±0.09ng/ml)或24小时(1.7±0.2ng/ml)。TNF-α的背景水平为6小时是0.038±0.008ng/ml，24小时是0.06±0.012ng/ml。

表9推迟加入到A549细胞中的SEQ ID 1抑制由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在逐渐后延的时间点，将肽(20μg/ml)加入到已含有A549人上皮细胞和100ng/ml E.coli O111B4 LPS的培养孔中。6小时之后收集上清并用ELISA测定TNF-α水平。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
表10通过SEQ ID 1对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过三次腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111B4 LPS(3μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的腹膜内位点注射肽SEQ ID1(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
表11通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111B4 LPS(2μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的腹膜内位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
表12通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的BALB/c鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使BALB/c鼠(8周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111B4 LPS(2μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的腹膜内位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
表13通过SEQ ID 1对BALB/c鼠的致命性内毒素血症进行防御。将400μg E.coli O111B4 LPS腹膜内注射到BALB/c鼠体内。在一个不同的腹膜位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
表14肽抑制由金黄葡萄球菌LTA诱导的TNF-α生成。在存在浓度逐渐升高的肽和没有肽的情况下，用1μg/ml金黄葡萄球菌LTA刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。
表15肽抑制由分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml肽或多黏菌素B(Polymyxin B)或者没有肽的情况下，用1μg/mlAraLAM刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml的TNF-α水平。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。

实施例3评价阳离子肽的毒性
使用两种方法测量肽的潜在毒性。第一种，使用细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit，Roche)(乳酸脱氢酶-LDH)分析。这是一种对细胞死亡和细胞裂解进行定量的比色分析，它的基础是从损伤细胞的细胞溶质释放到上清的LDH的活性测量。LDH是存在于所有细胞中的稳定的细胞质酶，当质膜受损时，它便释放到细胞培养物的上清中。死亡细胞或质膜受损细胞的数量增加导致培养物上清中的LDH酶活增加，可以采用ELISA平板记录仪测量OD490nm(在此分析中形成的颜色的量与裂解细胞的数目成正比)。在此分析中，将人支气管上皮细胞(16HBEo14，HBE)与100μg的肽共同温育24小时，移走上清并测定LDH。用来测量阳离子肽的毒性的另一种分析是WST-1分析(Roche)。该分析是对细胞繁殖和细胞成活进行定量的比色分析，它的基础是活细胞中的线粒体脱氢酶能裂解四唑盐WST-1(作为对[3H]-胸苷吸收分析的替代，它没有放射性)。在此分析中，将HBE细胞与100μg的肽共同温育24小时，然后每孔加入10μl细胞繁殖试剂(Cell Proliferation Reagent)WST-1。将细胞与试剂一起温育，然后用ELISA平板记录仪测量OD490nm。
下面在表16和17中显示的结果表明大多数肽对受测细胞都是没有毒性的。然而，两种分析的测量结果表明式F的肽中有四个(SEQ ID NOS40，41，42和43)确实导致膜损害。
表16通过LDH释放分析测量阳离子肽的毒性。将人HBE支气管上皮细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时。测量细胞培养物上清中的LDH活性。作为对照，加入Triton X-100以释放出100％的LDH。数据表示成平均值±标准偏差。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。

表17通过WST-1分析测量阳离子肽的毒性。将HBE细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时，然后测量细胞存活。数据表示成平均值±标准偏差。作为对照，加入Triton X-100以释放出100％的LDH。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。


实施例4阳离子肽对多核苷酸的调节 利用多核苷酸阵列来测量阳离子肽本身对巨噬细胞和上皮细胞的转录应答的影响。将鼠巨噬细胞RAW 264.7、人支气管细胞(HBE)或A549人上皮细胞植到150mm组织培养皿中，密度为每个培养皿5.6×106个细胞，过夜培养，然后与50μg/ml的肽共同温育4小时，或者只与培养基温育。经刺激后，用焦碳酸二乙酯处理过的PBS洗涤细胞一次，再用细胞刷从培养皿上刮下细胞。用Trizol(GibcoLife Technologies)分离总RNA。用含有RNA酶抑制剂(Ambion，Austin，TX)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。在37℃用DNaseI(Clontech，Palo Alto，CA)处理该RNA一小时。加入终止混合物(0.1M EDTA[pH 8.0]，1mg/ml糖原)之后，样品用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取一次，再用氯仿提取一次。然后加入2.5体积100％乙醇和1/10体积乙酸钠，pH5.2将RNA沉淀。该RNA重悬于含有RNA酶抑制剂(Ambion)的无RNA酶的水中，并贮存于-70℃。通过1％琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。用分离出来的RNA作为模板，使用β肌动蛋白特异性引物(5′-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′(SEQ ID NO55)和5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′(SEQ ID NO56))进行PCR扩增，以判断是否有基因组DNA污染。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实经过35次循环并没有扩增产物出现。
Atlas cDNA表达阵列(Clontech，Palo Alto，CA)由双份(in duplcate)点在正电荷膜上的588个经由选择的鼠cDNA组成，它们在较早的多聚核苷酸阵列研究中被使用(表18，19)。用5μg总RNA制备得到32P放射性标记的cDNA探针，将其与阵列于71℃温育过夜。进行泛洗，然后于4℃暴露于磷屏成像系统(phosphoimager screen，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)3天。使用MolecularDynamics PSI磷屏成像仪(phosphoimager)获取图像。使用AtlasImage 1.0图象分析软件(Clontech)和Excel(Microsoft，Redmond，WA)分析杂交信号。针对背景水平对每个点的强度进行校正，并针对探针标记间的差异对强度进行标准化处理，方法是利用被发现在刺激条件间几乎没有变化的5个多核苷酸的平均值β肌动蛋白、泛蛋白、核糖体蛋白S29、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和Ca2+结合蛋白。当一个给定的cDNA的标准化杂交信号小于20时，则将其值定为20，由此计算比值和相对表达。
下步使用的多核苷酸阵列(表21-26)是Resgen Human cDNA阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU03-S3)，它由双份的7,458个人cDNA点组成。用15-20μg总RNA制备探针，探针用Cy 3标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Virtek玻片记录仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 4.1，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度、中间强度和背景强度。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行标准化处理和分析。将平均背景强度从Imagene测定的平均强度中减去，计算出强度值。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表中看到。
使用的其它多核苷酸阵列(表27-35)是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1)，它由双份的14,000个人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中，将A549上皮细胞植到100mm组织培养皿中，密度为每个培养皿2.5×106个细胞。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度、中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10％，并对每个小格减去此值。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表中看到。
实施半定量RT-PCR以证实多核苷酸阵列的结果。在热循环仪中将1μgRNA样品和1μl寡聚dT(500μg/ml)以及浓度为1mM的1μl混合dNTP储液，于65℃温育5分钟，反应体积为12lμl，使用的水为DEPC处理水。加入4μl 5×第一链缓冲液，2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂(40units/μl)，于42℃温育2分钟，然后加入1μl(200units)的Superscript II(Invitrogen，Burlington，ON)。对于每个cDNA来源，在没有Superscript II的情况下进行平行实验，以提供阴性对照。利用5’和3’引物(1.0μM)、0.2mM dNTP混合物、1.5mMMgCl2、1U Taq DNA聚合酶(New England Biolabs，Missiauga，ON)和1×PCR缓冲液扩增cDNA。每个PCR均在热循环仪上进行，包括30-40个循环，每个循环包括94℃变性30秒，52℃或55℃退火30秒，72℃延伸40秒。针对每种引物和每份RNA样品，优化PCR的循环次数，使其位于反应的线性范围内。为了评估抽提步骤和估计RNA的量，在每个实验中对管家(housekeeping)多核苷酸β肌动蛋白基因进行了扩增。用电泳观察反应产物，并用光密度分析法(densitometry)进行分析，这样就可参考β肌动蛋白多核苷酸的扩增计算出起始的RNA相对浓度。
表18显示，在小块Atlas微阵列上，所选择的已知多核苷酸中，SEQ ID NO1对RAW 264.7细胞的处理增量调节了其中30多个不同的多核苷酸的表达。由肽SEQ ID NO1增量调节的多聚核苷酸主要来自两类一类包括受体(生长因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素、神经递质)、细胞表面抗原和细胞粘连，另一类包括细胞-细胞通讯(生长因子、细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素)、细胞骨架、细胞游动和蛋白质更新(turnover)。受增量调节的特定多核苷酸包括编码下列蛋白的多核苷酸趋化因子MCP-3、抗炎细胞因子IL-10、巨噬细胞集落刺激因子和受体例如IL-1R-2(结合到IL-1R1上的多产性IL-1的推定拮抗物)、PDGF受体B、NOTCH4、LIF受体、LFA-1、TGFβ受体1、G-CSF受体和IFNγ受体。该肽还增量调控编码几种金属蛋白酶及其抑制物的多核苷酸，包括骨形态发生蛋白BMP-1、BMP-2、BMP-8a、TIMP 2和TIMP 3。而且，该肽增量调节一些特异性转录因子，包括JunD，以及YY和LIM-1转录因子，和激酶例如Etk1和Csk，表明它具有广泛的影响。多核苷酸阵列的研究还发现，SEQ ID NO1减量调节了RAW 264.7巨噬细胞中的至少20个多核苷酸(表19)。由肽减量调节的多聚核苷酸包括DNA修复蛋白和几种炎症介质例如MIP-1α、制癌蛋白M(oncostatin M)和IL-12。肽对多核苷酸表达的许多影响都被RT-PCR证实(表20)。利用中等大小的微阵列(7835个多核苷酸)还发现，肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO19和SEQ ID NO1，以及每个式子的代表性肽改变了人上皮细胞系中的转录应答。SEQ ID NO1对多核苷酸表达的影响在两种人上皮细胞系A549和HBE中加以比较。表21描述的是被2种或更多种肽增量调控的与宿主免疫应答相关的多核苷酸，与未受刺激的细胞相比，它们的比率为2倍多。表22描述的是被2种或更多种肽减量调控的与宿主免疫应答相关的多聚核苷酸，与未受刺激的细胞相比，它们的比率为2倍多。表23和表24分别显示了受增量调节和减量调节的人上皮促炎多核苷酸。表25和表26显示了受阳离子肽影响的抗炎多聚核苷酸。一个明显的趋向是阳离子肽增量调节抗炎症应答，减量调节促炎症应答。要找到一个与抗炎症应答相关却又受减量调节的多核苷酸，是非常困难的(表26)。被阳离子肽增量调控的促炎多聚核苷酸主要是与迁移和粘连相关的多核苷酸。应该注意到，在受减量调控的促炎多核苷酸中，有几种toll样受体(TLR)多核苷酸受到所有阳离子肽的影响，TLR多核苷酸对于宿主对感染原的应答的信号传导是非常重要的。被所有的肽增量调控的一种重要的抗炎多聚核苷酸是IL-10受体。IL-10是涉及调控促炎细胞因子的重要细胞因子。对于肽SEQ ID NO6，当使用的是原代人巨噬细胞时，也可以观察到对多核苷酸表达的这些影响，如表27和28所示。下面的表31-37显示了每个式子的代表性肽对人上皮细胞表达所选多核苷酸(受测的14,000个中选出)的影响。为了测试肽改变人上皮多核苷酸表达的能力，每个式子至少选用了6种肽，它们确实具有广泛的刺激效果。对每个式子而言，通常至少有50个多核苷酸被该组中的每一个肽增量调节。
表18RAW巨噬细胞中被肽SEQ ID NO1处理增量调节的多核苷酸a。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地诱导了数种多核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
管家多核苷酸的标准化后的强度的变化范围为0.8-1.2倍，因此这些多核苷酸可以有效地用于标准化过程。当一个给定的cDNA的标准化后的杂交强度低于20时，将其值定为20，由此计算比值和相对表达。阵列实验用不同的RNA制备物重复三次，平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生两倍或更大变化的多核苷酸。



表19RAW巨噬细胞中被SEQ ID NO1处理减量调节的多核苷酸a。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少了数种多核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。阵列实验用不同的细胞重复三次，平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生大约两倍或更大变化的多核苷酸。


表20在对肽SEQ ID NO1的应答中多核苷酸表达的变化能够通过RT-PCR证实。
将RAW 264.7巨噬细胞与50μg/ml的肽共同温育4小时，或者单独与培养基温育4小时。分离总RNA，进行半定量RT-PCR。每种多核苷酸的特异性引物对被用于扩增RNA。β肌动蛋白的扩增被用作阳性对照并被用于进行标准化。对RT-PCR产物进行密度测量分析。结果表示为被肽处理的细胞与单独同培养基温育的细胞相比，其多核苷酸表达中的相对倍数变化。数据表示为三次实验的平均值±标准偏差。

表21A549上皮细胞中被肽处理增量调节的多核苷酸a。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加数种多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。





表22A549上皮细胞中被肽处理减量调节的多核苷酸a。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少数种多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。





表23A549细胞中被肽处理增量调节的促炎多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些促炎多核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

表24A549细胞中被肽处理减量调节的促炎多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些促炎多核苷酸的表达(数据是表22的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。


表25A549细胞中被肽处理增量调节的抗炎多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些抗炎多核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。


表26A549细胞中被肽处理减量调节的抗炎多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些抗炎多核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

表27原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO6增量调节的多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO6增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。



表28原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO6减量调节的多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO6减少了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。


表29HBE细胞中被SEQ ID NO1增量调节的多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO1增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第三列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表30HBE细胞中被肽SEQ ID NO1(50μg/ml)减量调节的多核苷酸。
发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO1降低了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多核苷酸的强度显示在第三列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表31A549细胞中被式A的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。



表32A549细胞中被式B的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表33A549细胞中被式C的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。



表34A549细胞中被式D的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表35A549细胞中被式E的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表36A549细胞中被式F的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“比值 ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。




表37A549细胞中被式G的肽和其它的肽诱导的多核苷酸表达的增量调节。
发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第二列和第三列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“比值 ID#∶对照”列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。登记号和基因表示为U00115，锌指蛋白；M91036，血红蛋白γG；K000070，假想蛋白；AF055899，溶质载体家族27；AK001490，假想蛋白；X97674，细胞核受体辅激活物2；AB022847，未知；AJ275986，转录因子；D10495，蛋白激酶C，δ；L36642，EphA7；M31166，pentaxin相关性基因；AF176012，未知；AF072756，激酶锚蛋白4；NM_014439，IL-1超家族z；AJ271351，推定的转录调节物；AK000576，假想蛋白；AJ272265，分泌磷蛋白2；AL122038，假想蛋白；AK000307，假想蛋白；AB029001，KIAA1078蛋白；U62437，胆碱能受体；AF064854，未知；AL031588，假想蛋白；X89388，RAS p21蛋白激活物；D45399，磷酸二酯酶；AB037716，假想蛋白；X79981，钙依粘连蛋白5；AF034208，RIG样7-1；AL133355，染色体21开放阅读框架53；NM_016281，STE20样激酶；AF023614，跨膜激活物和CAML相互作用蛋白；AF056717，ash2样；AB029039，KIAA1116蛋白；J03634，抑制素，βA；U80764，未知；AB032963，未知；X82835，IX型电压门控钠离子通道。


实施例5用肽在细胞系、人全血和鼠中诱导趋化因子 使用了鼠巨噬细胞系RAW 264.7、THP-1细胞(人单核细胞)、人上皮细胞系(A549)、人支气管上皮细胞(16HBEo14)和人全血。HBE细胞在含有厄尔溶液的MEM中生长。THP-1细胞在RPMI 1640培养基中生长和维持。RAW和A549细胞系维持在补充以10％胎牛血清的DMEM中。将这些细胞接种到具有DMEM的24孔板中，密度为每孔106个细胞(见上)，将A549细胞接种到具有DMEM的24孔板中，密度为每孔105个细胞(见上)，它们都于37℃在5％CO2中温育过夜。将DMEM从过夜生长的细胞中吸去，代之以新鲜培养基。在这些细胞与肽温育后，用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定释放到培养物上清中的趋化因子。
动物研究经由UBC动物管理委员会同意(UBCACC#A01-0008)。BALB/c鼠购自Charles River Laboratories，并用标准的动物设施喂养。年龄、性别和体重匹配的成年鼠通过腹膜内注射阿佛丁(4.4mM 2-2-2-三溴乙醇，2.5％2-甲基-2-丁醇，在蒸馏水中)被麻醉，剂量为每10g体重200μl。使用改自Ho和Furst 1973的非手术的气管内滴注方法实施滴注。简单的说，将已麻醉的鼠的上颌牙钩在支撑架顶部的金属丝上，使其颚处于打开状态，用弹簧推压胸部，使其咽、喉和气管处于一条垂直线上。从外面照亮气管，将一根插入导管插入到被清楚照亮的气管内腔。将20μl肽悬液或无菌水置于插管近端的小孔中，并将其用200μl空气慢慢滴注到该气管中。滴注之后，将这些动物于竖直位置保持2分钟，以使该流体流到呼吸树内。4小时后，通过腹膜内注射300mg/kg的戊巴比妥，将这些鼠无痛致死。将该气管暴露，将一个静脉内导管插入到气管近端，并用缝合线适当地系结。进行灌洗；通过气管插管将0.75毫升无菌PBS引入肺中，在数秒后，吸出该流体。该步骤用同样的PBS样品重复三次。将灌洗液放在管子中，并置于冰上，每只鼠的总回收体积约为0.5ml。将此支气管肺泡灌洗(BAL)液1200rpm高速离心10分钟，移走上清，用ELISA检测其中的TNF-α和MCP-1。
阳离子肽对趋化因子的增量调节作用在多个不同的系统被证实。鼠MCP-1是人MCP-1的同源物，它是β(C-C)趋化因子家族的成员。已经证明MCP-1能招集单核细胞、NK细胞和一些T淋巴细胞。当RAW 264.7巨噬细胞和来自3个供体的人全血被浓度不断增加的肽SEQ ID NO1刺激时，ELISA表明它们在其上清中产生了明显量的MCP-1(表36)。被浓度范围为20-50μg/ml的肽刺激了24小时的RAW 264.7细胞产生了明显量的MCP-1(背景之上200-400pg/ml)。当用100μg/ml的LL-37刺激这些细胞(24小时)和全血(4小时)时，产生了高水平的MCP-1。
阳离子肽诱导趋化因子的效应也在一种完全不同的细胞系统，A549人上度细胞中被检测。有趣的是，尽管这些细胞应答LPS时会产生MCP-1，并且这种应答会被肽拮抗；但是A549细胞直接应答肽SEQ ID NO1时，并没有MCP-1产生。然而，高浓度的肽SEQ ID NO1的确诱导产生了一种嗜中性粒细胞特异性趋化因子IL-8(表37)。因此，SEQ ID NO1在不同的浓度和在不同的细胞类型中能够诱导不同模式的应答。测试了各个式子对应的许多肽在A549细胞中诱导IL-8的能力(表38)。这些肽中有许多在低浓度10μg/ml时诱导出高于背景水平的IL-8。还发现高浓度(100μg/ml)的SEQ ID NO13在人全血中诱导出IL-8(表39)。在HBE细胞(表40)和未分化的THP-1细胞(表41)中肽SEQ ID NO2也明显诱导IL-8。
通过气管内滴注给予BALB/c鼠SEQ ID NO1或无内毒素的水，3-4小时后检测支气管肺泡灌洗液中的MCP-1和TNF-α水平。发现用50μg/ml肽SEQ ID NO1处理的鼠与只给予水或麻醉剂的鼠相比，前者产生的MCP-1水平明显增高(表42)。对肽SEQ ID NO1并没有促炎应答，因为与只给予水或麻醉剂的鼠相比，该肽没有明显诱导出更多的TNF-α。还发现，在用肽SEQ ID NO1(高到100μg/ml)处理的RAW 264.7细胞和骨髓源巨噬细胞中，肽SEQ ID NO1没有明显诱导TNF-α的生成(表43)。因此，肽SEQ ID NO1选择性地诱导趋化因子的产生，而不诱导炎症介导物例如TNF-α的产生。这说明肽SEQ ID NO1具有双重作用，它既作为能够阻止细菌产物诱导炎症的因子，又有助于招集可清除感染的吞噬细胞。
表38RAW 264.7细胞和人全血中MCP-1的诱导。
用浓度不断增加的LL-37刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞和人全血4个小时。将人全血样品离心，移走血清，用ELISA检测其中的MCP-1，同时用ELISA检测RAW 264.7细胞的上清中的MCP-1。RAW细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差，人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。

表39A549细胞和人全血中IL-8的诱导。
用浓度不断增加的肽分别刺激A549细胞和人全血24小时和4小时。将人全血样品离心，移走血清，用ELISA检测其中的IL-8，同时用ELISA检测A549细胞的上清中的IL-8。A549细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差，人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。


表40A549细胞中阳离子肽诱导IL-8。
用10μg肽刺激A549人上皮细胞24小时。移走上清，并用ELISA检测其中的IL-8。


表41人血中肽诱导IL-8。
用浓度不断增加的肽刺激人全血4小时。将人血样品离心，移走血清，并用ELISA检测其中的IL-8。数据来自两个供体的平均值。

表42HBE细胞中IL-8的诱导。
将浓度不断增加的肽与HBE细胞共同温育8小时，移走上清，检测其中的IL-8。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。

表43未分化的THP-1细胞中IL-8的诱导。
将指定浓度的肽与人单核细胞THP-1细胞共同温育8小时，移走上清，并用ELISA检测其中的IL-8。

表44在鼠的气道中肽SEQ ID NO1诱导MCP-1。
用阿佛丁(avertin)将BALB/c鼠麻醉，并对其气管内滴注肽或水，或者不进行滴注(不作处理)。对鼠进行4小时监测，麻醉，并分离出BAL流体，用ELISA分析其中的MCP-1和TNF-α浓度。数据表示为各种条件下四只或五只鼠的平均值±标准偏差。

表45阳离子肽没有明显诱导TNF-α。
将指定的肽(40μg/ml)与RAW 246.7巨噬细胞共同温育6小时。收集上清，并用ELISA检测其中的TNF-α水平。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。

实施例6
阳离子肽增加趋化因子受体的表面表达 为了分析IL-8RB、CXCR-4、CCR2和LFA-1的细胞表面表达，RAW巨噬细胞用10μg/ml适当的一抗(Santa Cruz Biotechnology)染色，接着用FITC偶联的羊抗兔IgG[IL-8RB和CXCR-4(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)-]或FITC偶联的驴抗羊IgG(Santa Cruz)。用FACscan对细胞进行分析，计数10,000次并开启前部和侧部分散器(forward and side scatter)以排除细胞碎片。
多核苷酸阵列数据表明，与未受刺激的细胞相比，一些肽分别增量调节了趋化因子受体IL-8RB、CXCR-4和CCR2的表达10、4和1.4倍。为了证实该多核苷酸阵列数据，用流式细胞仪检测用肽刺激了4小时的RAW细胞上的受体的表面表达。当50μg/ml的肽与RAW细胞共同温育4小时时，IL-8RB平均被增量调节高于未刺激的细胞2.4倍，CXCR-4平均被增量调节高于未刺激的细胞1.6倍，CCR2被增量调节高于未刺激的细胞1.8倍(表46)。作为对照，CEMA被证明可导致类似的增量调节。Bac2A是唯一可明显增量调节LFA-1(高于对照细胞3.8倍)的肽。表46在对肽的应答中，CXCR-4、IL-8RB和CCR2的表面表达增加。
用肽刺激RAW巨噬细胞4小时。清洗该细胞，用适当的一抗和FITC标记的二抗染色。显示的数据表示为平均值(用肽刺激的RAW细胞的倍数变化)±标准偏差。

实施例7阳离子肽导致的MAP激酶的磷酸化 以2.5×105-5×105个细胞/ml的密度接种细胞，并让其过夜。在早晨，用无血清的培养基洗细胞一次(无血清培养基-4小时)。去掉该培养基并换之以PBS，然后于37℃放置15分钟，再于室温15分钟。加入肽(浓度为0.1μg/ml-50μg/ml)或水，温育10分钟。迅速移去PBS，代之以冰冷的放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液和抑制剂(NaF、B-甘油磷酸、MOL、钒酸盐、PMSF、亮抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽)。将培养板在冰上摇动10-15分钟，或者摇至细胞裂解，收集裂解物。对于THP-1细胞，步骤稍有不同；要使用更多的细胞(2×106)。它们在缺乏血清的情况下过夜，加入1ml冰冷的PBS以停止反应，然后放置在冰上5-10分钟，旋转沉淀，然后用RIPA重悬。使用蛋白质分析(Pierce，Rockford，IL.)测定蛋白浓度。细胞裂解物(20μg蛋白)用SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。该膜用10mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl(TBS)/5％脱脂奶粉封闭1小时，然后在冷的含有一抗的TBS/0.05％Tween 20中过夜温育。用TBS/0.05％Tween 20清洗30分钟后，该膜在室温与含有1μg/ml二抗的TBS温育1小时。该膜用TBS/0.05％Tween 20清洗30分钟后，再于室温与辣根过氧化酶偶联的羊抗鼠IgG(1∶10,000，在TBS/0.05％Tween 20中)温育1小时。用TBS/0.1％Tween 20清洗该膜30分钟后，利用增强化学发光(ECL)检测可以看到免疫反应性条带。对于使用外周血单核细胞的实验外周血(50-100ml)采自所有的对象。在Ficoll-Hypaque上通过密度梯度离心从外周血分离出单核细胞。间期细胞(单核细胞)被回收、洗涤，然后重悬于含有10％胎牛血清(FCS)和1％L-谷酰胺的推荐的细胞培养的首要培养基(RPMI-1640)中。以每孔4×106个细胞的密度将细胞加到6孔培养板中，于37℃在5％CO2气体中放置1小时，让黏附发生。洗去浮在表面的培养基和未黏附的细胞，加入含有肽的适当的培养基。由它们排斥台盼蓝的能力估计新鲜收获的细胞中应有＞99％存活。用肽进行刺激后，在各种磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂存在的情况下，用RIPA缓冲液裂解细胞，收集裂解物。分析蛋白含量，将各个样品的大约30μg加载到12％SDS-PAGE凝胶上。将胶中蛋白转移点到硝酸纤维素上，用含有5％脱脂奶粉和1％Triton X 100的Tris缓冲盐(TBS)封闭1小时。用磷酸化特异性抗体检测磷酸化。
由肽诱导的磷酸化的结果总结于表46。发现在鼠巨噬RAW细胞系和HBE细胞中，SEQ ID NO2导致p38和ERK1/2发生剂量依赖的磷酸化。在THP-1人单核细胞系中，SEQ ID NO3导致MAP激酶的磷酸化，在鼠RAW细胞系中，SEQID NO3导致ERK1/2的磷酸化。
表47在对肽的应答中MAP激酶的磷酸化。

表48 在人血单核细胞中MAP激酶的肽磷酸化.SEQ ID NO1，(50μg/ml)被用来促进磷酸化。

实施例8阳离子肽通过强化免疫应答对细菌感染进行防御 通过腹膜内注射对BALB/c鼠施以1×105沙门氏菌和阳离子肽(200μg)。对鼠进行24小时监测后，将它们处死，取出脾脏，匀浆化，重悬于PBS，涂在含有卡那霉素(50μg/ml)的Luria Broth琼脂平板上。平板于37℃温育过夜，对存活细菌进行计数(表49和50)。通过腹膜内注射对CD-1鼠施以含有1×108金黄葡萄球菌的5％猪粘蛋白液和阳离子肽(200μg)(表51)。对鼠进行3天的监测后，将它们处死，取出血液，涂板，计算活细胞数。通过腹膜内(IP)注射对CD-1雄鼠施以5.8×106CFU EHEC细菌和阳离子肽(200μg)，监测3天(表52)。在这些动物模型的每一个中都有一部分肽表现出对感染的防御。当将表50和51中的防御分析结果与表31-37中的基因表达结果作比较时，发现在沙门氏菌模型中最具防御性的肽能够诱导上皮细胞中共同的基因子集(表53)。这清楚地表明基因表达的谱型与肽展示防御的能力是一致的。最小抑制浓度(MIC)测试的结果(表54)表明，这些阳离子肽中有许多并不直接抵抗微生物。这表明肽防御感染的能力依赖于该肽刺激宿主先天免疫的能力，而不是依赖于直接的抗微生物活性。
表49在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。
将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中，24小时后，这些动物无痛处死，取出脾脏，匀浆化，用PBS稀释，平板计数，确定细菌存活数。

表50在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。
将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中，24小时后，这些动物无痛处死，取出脾脏，匀浆化，用PBS稀释，平板计数，确定细菌存活数。

表51在鼠的金黄葡萄球菌感染模型中阳离子肽的效应。
将含有1×108细菌的5％猪粘蛋白液腹膜内(IP)注射到CD-1鼠中。经由另外的腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。监测3天，将这些鼠无痛处死，取出血液，涂板计算存活数。下列的肽在控制金黄葡萄球菌感染方面是没有效果的SEQ ID NO48，SEQ ID NO26。

表52在鼠EHEC感染模型中肽的效应。
将5.8×106CFU EHEC细菌腹膜内(IP)注射到CD-1雄鼠(5周大)中。经由另外的一次腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。对这些鼠进行3天的监测。

表53在体内有活性的肽诱导A549上皮细胞中基因表达谱型的增量调节。
发现在用浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO30、SEQ ID NO7和SEQ ID NO13处理4小时后，每一种肽都增加了一套基因(a pattern of genes)的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多核苷酸的强度显示在第二列(用Cy3和Cy5标记cDNA两种情况的平均值)。增量调节倍数列是指受肽刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。表中还包括作为阴性对照的肽SEQ ID NO37，它在鼠感染模型中没有活性。


表54 在此研究的多数阳离子肽，特别是在感染模型中有效的阳离子肽并不是明显抗微生物的。将系列稀释的肽与指定的细菌在96孔板中温育过夜。杀死该细菌的肽的最低浓度表示为MIC。符号＞表示MIC太大而不能测量。8μg/ml或更低的MIC被认为是临床上有意义的活性。缩写E.coli，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)；S.aureus，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；P.aerug，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；S.typhim，肠炎沙门氏菌鼠伤寒亚种(Salmonellaenteritidis ssp.typhinmurium)，C.rhod，Citobacter rhodensis；EHEC，肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohaemorrhagic E.coli)。


实施例9由细菌信号分子诱导的多核苷酸在诊断/筛选中的应用 鼠伤寒沙门氏菌LPS和E coli O111B4 LPS购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。将金黄葡萄球菌的LTA(Sigma)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物开展鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染(即，小于1ng/ml，这个浓度并不会导致RAW细胞产生明显的细胞因子产物)。使用Applied Biosystem(应用生物系统公司)(Missisauga，ON.)的Model 392DNA/RNA合成仪合成CpG寡脱氧核苷酸，经纯化后重悬于无内毒素的水(Sigma)中。使用如下序列CpG5′-TCATGACGTTCCTGACGTT-3′(SEQ ID NO57)和非CpG5′-TTCAGGACTTTCCTCAGGTT-3′(SEQ ID NO58)。测试了非CpG寡聚物刺激细胞因子生成的能力，发现它没有导致TNF-α或IL-6的明显产生，因此可看作一种阴性对照。将RAW 264.7细胞与单独的培养基、100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG共同温育4小时(这些浓度可最佳地诱导RAW细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α))，再从这些细胞中分离出RNA。使用该RNA制备出多核苷酸cDNA探针，将其与Clontech Atlas多核苷酸阵列滤膜杂交，如前面所述。cDNA探针与各个固定化DNA的杂交可以通过放射自显影法显现，并且可以使用磷光显像系统进行定量。表55-59总结了至少2-3个独立实验的结果。发现用LPS处理RAW 264.7细胞导致超过60种多核苷酸的表达量增加，这些多核苷酸编码的蛋白包括炎症蛋白，例如IL-1β、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、CD40和多种转录因子。将LPS、LTA和CpG DNA诱导的多聚核苷酸表达的变化进行比较，发现所有这三种细菌产物都以相类似的程度增加促炎多核苷酸的表达，例如iNOS、MIP-1α、MIP-2α、IL-1β、IL-15、TNFR1和NF-κB(表57)。表57描述了被细菌产物以类似的程度增量调节的19种多核苷酸，它们的刺激比值在这三种细菌产物间的差异不超过1.5倍。也有几种多核苷酸是被LPS、LTA和CpG以类似的程度减量调节。还发现在对这三种细菌产物的应答中，有许多多核苷酸是被不同地调节的(表58)，包括其表达水平在一种或多种细菌产物间的差异大于1.5倍的许多多核苷酸。与LPS或CpG相比较而言，LTA处理差异性地影响了最大子集的多聚核苷酸的表达，包括对Jun-D、Jun-B、Elk-1和细胞周期蛋白G2和A1的超量刺激。仅仅有一些多聚核苷酸的表达被LPS或CpG处理更多地改变。与LTA或CpG处理相比较而言，LPS处理更能够增加一些多核苷酸的表达，包括cAMP应答元件DNA结合蛋白(CRE-BP)、干扰素诱导性蛋白1和CACCC框结合蛋白BKLF。与LPS或LTA处理相比较而言，CpG处理更能够增加一些多核苷酸的表达，包括白血病抑制因子(LIF)和蛋白酶连接蛋白1(PN-1)。这些结果表明，尽管LPS、LTA和CpG DNA刺激表达应答的多核苷酸很大程度地重叠，但是它们对其中某些多聚核苷酸的调节也表现出不同的能力。
被使用的其它多核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号是PRHU04-S1)，它由点成双份的约14,000个人寡聚体点组成。用5μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中，将A549上皮细胞涂到100mm组织培养皿中，密度为每个培养皿2.5×106个细胞，过夜温育，然后用100ng/ml E.coli O111B4 LPS刺激4小时。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度、中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10％，并对每个小格减去此值。使用Polynucleotidespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。LPS处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。表60描述了许多以前未曾报道的变化，它们在诊断感染方面将是有用的。
为了证实和评估这些变化在功能上的显著性，通过密度分析法对所选择的mRNA和蛋白的水平进行估计和定量。应用CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白特异性探针进行Northern印迹杂交，证明用所有三种细菌产物进行刺激后出现的是类似的表达(表60)。类似地，通过应用Griess试剂评估炎症介导物NO的水平，测定一氧化氮合成酶iNOS的酶活，证明在24小时后产生的NO水平是可比较的，这是与iNOS表达的类似的增量调节相一致的(表59)。Western印迹分析证明CpG更优先地刺激白血病抑制因子(LIF，细胞因子IL-6家族的成员)(表59)。其他的验证性实验证明，LPS增量调节TNF-α和IL-6的表达，如ELISA的分析结果；还增量调节MIP-2α和IL-1βmRNA的表达和减量调节DP-1和细胞周期蛋白D mRNA的表达，如Northern印迹分析的结果。通过检测细菌组分刺激人全血中促炎细胞因子生成的能力，可以将该分析扩展到与临床更相关的离体系统。发现E.coli LPS、鼠伤寒沙门氏菌LPS和金黄葡萄球菌LTA都刺激类似量的血清TNF-α和IL-1β。CpG也刺激这些细胞因子的产生，尽管其水平要低得多，但还是部分地支持了细胞系的数据。
表55A549上皮细胞中被E coli O111B4 LPS增量调节的多核苷酸。
多核苷酸微阵列的研究表明，E coli O111B4 LPS(100ng/ml)增加许多多核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表55的第三列。“比值LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。



表56A549上皮细胞中被E coli O111B4 LPS减量调节的多核苷酸。
多核苷酸微阵列的研究表明，E coli O111B4 LPS(100ng/ml)降低了A549细胞中许多多核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表格的第三列。“比值LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。



表57被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA刺激后，以类似的程度表达的多核苷酸。
发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG)有效地诱导数种多核苷酸的表达。与RAW细胞共同温育4小时，分离出RNA，转变为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值LPS/LTA/CpG∶对照”列是指被细菌产物刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

表58被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA有差异地调节的多核苷酸。
发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG)有效地诱导数种多核苷酸的表达。与RAW细胞共同温育4小时，分离出RNA，转变为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值LPS/LTA/CpG∶对照”列是指被细菌产物刺激的细胞中的多核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。


表59表57和表58阵列数据的证实。
a)总RNA分离自未刺激的RAW巨噬细胞和用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpG DNA或单独的培养基处理了4小时的细胞，实施Northern印迹杂交，探查膜上的GAPDH、CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白，如以前所述[Scott等]。将Northern印迹的杂交强度与GAPDH作比较，以发现上样中的不一致。这些实验至少被重复三次，表示的数据是各种条件相对于培养基的平均水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。
b)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpGDNA或单独的培养基刺激RAW 264.7细胞24小时。制备蛋白裂解物，在SDS-PAGE凝胶上分离，实施Western印迹杂交以检测LIF(R&D系统)。这些实验至少被重复三次，表示的数据是LIF相对于培养基的水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。
c)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpGDNA或单独的培养基刺激RAW巨噬细胞24小时，收集细胞上清，使用Griess试剂检测上清中的NO形成量，NO量是用稳定的NO代谢物亚硝酸盐的积累量来估计的，方法如前面所述[Scott等]。表示的数据是三个实验的平均值±标准偏差。


表60A549人上皮细胞中被细菌信号分子(LPS)增量调节的基因表达谱型。
多核苷酸微阵列的研究表明，E.coli O111B4 LPS(100ng/ml)增加A549细胞中许多多核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。被LPS刺激的细胞中的多核苷酸表达变化的这些例子代表着它们与未处理的细胞相比，强度水平的变化在2倍以上。

实施例10改变信号传导作用以防御细菌感染 鼠伤寒沙门氏菌株SL1344由美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得，在Luria-Bertani(LB)培养基中培养。为了实施巨噬细胞感染，将冷冻的甘油储物接种到盛于125ml摇瓶的10ml LB中，37℃振荡过夜培养至稳定相。将RAW 264.7细胞(1×105个细胞/孔)接种到24孔板中。用培养基稀释细菌直至可获得约为100的标称感染复数(MOI)，通过1000rpm的10分钟离心使细菌离心到单层上，以使感染同步发生，再让感染于37℃在5％CO2培养箱中继续进行20分钟。用PBS洗细胞3次以除去细胞外的细菌，然后将细胞在含有100μg/ml庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM+10％FBS中温育以杀死任何残留的细胞外细菌，避免再感染。两小时后，将庆大霉素浓度降至10μg/ml，并在整个分析中维持该值。细胞在感染前用具有以下浓度的抑制剂预处理30分钟50μMPD98059(Calbiochem)，50μM U 0126(Promega)，2mM二苯碘(DPI)，250μM乙酰香兰酮(夹竹桃麻素，Aldrich)，1mM抗坏血酸(Sigma)，30mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和2mM NG-L-一甲基精氨酸(L-NMMA，Molecular Probe)或2mMNG-D-一甲基精氨酸(D-NMMA，Molecular Probe)。在感染后的即刻、2小时和6-8小时再加入新鲜的抑制剂，以保证效力。对照细胞用每毫升培养基同等体积的二甲基亚砜(DMSO)处理。鼠伤寒沙门氏菌SL1344在细胞内的存活/复制用庆大霉素抗性分析测定，如以前所述。简单地说，在感染后2小时和24小时，细胞用PBS洗两次以除去庆大霉素，用含有1％Triton X-100/0.1％SDS的PBS裂解，细胞内的细菌数目由LB琼脂平板上的菌落数计算出。在这些感染条件下，由标准的平板计数估计，巨噬细胞平均每个细胞含有一个细菌，这样便可在感染后的24小时对巨噬细胞进行分析。细菌的纤丝化(filamentation)与细菌应激(stress)有关。NADPH氧化酶和iNOS能被MEK/ERK信号传导激活。结果(表61)清楚的说明，改变细胞信号传导是可藉以解决细胞内沙门氏菌感染的一种方法。由于细菌增量调节人细胞内的多种基因，所以阻断信号传导的这种策略代表了抗感染治疗的一种普遍方法。
表61在IFN-γ致敏的(primed)RAW细胞中信号传导分子MEK对细胞内细菌的影响。

实施例11抗病毒活性 SDF-1是一种C-X-C趋化因子，它是HIV-1共受体CXCR-4的自然配体。为了抑制HIV-1的复制，考虑趋化因子受体CXCR-4和CCR5作为可能的目标。SDF-1的晶体结构表现出反平行的β-片层和带正电荷的表面，这些特征对于其结合CXCR-4中带负电荷的细胞外环是非常重要的。这些发现说明，趋化因子衍生物、小的CXCR4拮抗剂，或模拟趋化因子的结构或离子性质的激动剂都可以成为治疗X4HIV-1感染的有用试剂。发现阳离子肽抑制SDF-1诱导的T细胞迁移，这暗示这些肽可以用作CXCR-4拮抗剂。迁移分析如下进行。用趋化性培养基(RPMI1640/10mM Hepes/0.5％BSA)将人Jurkat T细胞重悬至5×106个细胞/ml。利用5μm聚碳酯Transwell插件(Costar)在24孔板中实施迁移分析。简单地说，肽或对照用趋化性培养基稀释，并置于下位腔中，同时将0.1ml细胞(5×106个/ml)加入到上位腔中。37℃3小时后，用流式细胞仪测定迁移到下位腔中的细胞数目。下位腔的培养物用30秒的时间穿过FACscan，开启前部和侧部分散器以排出细胞碎片。将活细胞的数目与“100％迁移对照”作比较，对于后者，5×105个/ml的细胞被直接移液到下位腔中，然后用FACscan计数30秒。结果说明，肽的加入导致人Jurkat T细胞的迁移受到抑制(表62)，这很可能是因为CXCR-4的表达受到影响(表63和64)。
表62肽抑制人Jurkat T细胞的迁移

表63对应于表56的多核苷酸阵列数据

表64对应于表62和63的FACs数据

实施例12协同联合(synergistic combinations) 方法和材料 在磷酸盐缓冲液(PBS)和5％的猪粘蛋白(Sigma)中制备金黄葡萄球菌，达到最终期望的浓度1-4×107CFU/ml。将100μl的金黄葡萄球菌(与5％的猪粘蛋白混合)经腹膜内注射入每一只CD-1鼠(6-8周龄，雌性，体重是20-25g(CharlesRiver))。感染发生之后6小时，将100μl的肽(总共50-200μg)与0.1mg/kg头孢吡肟(Cefepime)一同IP注射。24小时之后，处死动物，进行心脏穿刺，取出100μl血液。将血液用1ml含有肝素的PBS稀释。然后，进一步将其稀释并在Mueller-Hinton琼脂平板上(10-1、10-2、10-3和10-4)铺板，进行存活菌落计数。在24小时后计数存活菌落，即菌落形成单位(CFU)。每一试验最少进行三次。数据被表示为每个处理组的平均CFU±标准偏差(每组8-10只小鼠)。
在全身性金黄葡萄球菌感染发生后6小时，给予肽和次优(sub-optimal)头孢吡肟，进行试验(图1)。图1中的数据被表示为血液的存活菌落数目的平均值±标准偏差，所述血液采自感染发生之后24小时的小鼠。将次优的抗生素(头孢吡肟)剂量与SEQ ID NO7联合，结果得到了改进的治疗效应。肽与次优的抗生素在鼠感染模型中联合发挥作用的能力是一个重要的发现。它提示了在临床中延长抗生素的寿命和降低抗生素抵抗的发生率的潜能。
SEQ ID NO1作为一个例子，在人外周血源单核细胞和人支气管上皮细胞系中，诱导促细胞分裂原激活蛋白激酶，ERK1/2和p38的磷酸化和活化，但这不发生于B或T淋巴细胞中。磷酸化并不取决于G蛋白偶联受体FPRL-1，FPRL-1以前被认为是人单核细胞和T细胞上涉及SEQ ID NO1诱导的趋化性的受体。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)——而不是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)——的存在，显著增强ERK1/2和p38的活化。暴露于SEQ ID NO1也导致Elk-1活化以及各种由Elk-1调控的基因的增量调节，Elk-1是位于ERK1/2下游并被磷酸化的ERK1/2激活的转录因子。SEQ ID NO1通过这些通路进行信号转导的能力，在免疫、单核细胞激活、增殖以及分化中具有广泛的意义。
方法和材料 SEQ ID NO1(序列是LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)，是在UBC的Nucleic Acid/Protein Synthesis(NAPS)Unit经Fmoc[(N-(9-芴基)甲氧基羰基)]化学作用合成的。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)购自ResearchDiagnostics Inc.(Flanders，NJ，USA)。百日咳毒素由List Biological Laboratories Inc.(Campbell，CA，USA)提供。
用标准技术制备血液单核细胞。简言之，将100ml新鲜的人静脉血收集于肝素钠真空采集管中(Becton Dickinson，Mississauga，ON，Canada)，根据UBCClinical Research Ethics Board协议C02-0091，血液来自志愿者。在E-toxa-clean(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada)清洗过的无内毒素的瓶中，将血液以1∶1的比例与RPMI 1640培养基[补充有10％v/v的胎牛血清(FBS)、1％的L-谷氨酰胺、1nM丙酮酸钠]混合。用Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech，BaieD′Urfe，PQ，Canada)室温下分离PBMC，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。通过与用霍乱弧菌(Vibrio cholera)神经氨酸酶(Calbiochem Biosciences Inc.，La Jolla，CA，USA)预处理的新鲜的绵羊血红细胞(UBC animal care unit)形成玫瑰花结移除T细胞并经Ficoll-Paque Plus重复分离，富集单核细胞。用PBS清洗富集的单核细胞，随后于37℃培养1小时(每孔约2-3×106)，随后去除非附着细胞；如流式细胞分析所测定，单核细胞的纯度大于95％(数据未显示)。通过移除非粘附细胞并将它们加入新的平板，37℃1小时，分离B淋巴细胞。此过程共重复3次。附着于平板的任何残留的单核细胞，和残留的非附着细胞基本上都是B细胞。在Falcon 6孔组织培养板(Becton Dickinson，Mississauga，ON，Canada)中培养细胞。于37℃，在1ml的培养基中培养附着的单核细胞，培养基中加入了溶于无内毒素水(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada)的SEQ ID NO1和/或细胞因子。无内毒素水被加入作为载体对照。对于应用百日咳毒素进行的研究，将培养基替换为含有100ng/ml毒素的1ml新鲜培养基，并且于37℃温育60分钟。将SEQ ID NO1和细胞因子直接加入含百日咳毒素的培养基。为了分离T淋巴细胞，将形成玫瑰花结的T细胞和绵羊血红细胞重悬浮于20ml PBS中，并加入10ml蒸馏水以裂解绵羊血红细胞。然后，1000rpm离心细胞5分钟，随后移除上清。迅速将沉淀的T细胞在PBS中清洗，加入增量的水，直至所有的绵羊血红细胞被裂解。在PBS中清洗残余的T细胞一次，用0.4％的台盼兰溶液证实其存活。在补充有10％v/v的热灭活FBS、1％v/v的L-谷氨酰胺、1nM丙酮酸钠(GIBCO Invitrogen Corporation，Burlington，ON，Canada)的RPMI 1640中培养原代人血单核细胞及T细胞。对于每一试验，使用2至8个供体。
猿病毒40-转化的永生化16HBE4o-支气管上皮细胞系由Dr.D.Gruenert(University of California，San Francisco，CA)馈赠。按照常规在37℃，100％湿度和5％CO2下培养细胞，直到汇合。让细胞生长在带有Earles’盐的极限必需培养基中(GIBCO Invitrogen Corporation，Burlington，ON，Canada)，培养基中含有10％FBS(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺。为了试验，在24孔板的Costar Transwell插件(inserts)(3μm孔径，Fischer Scientific)上生长细胞。以每0.25ml培养基5×104个细胞将细胞接种到插件的顶部，而0.95ml的培养基被加入孔的底部，在37℃和5％CO2下培养。用Millipore电压电阻表每日测定跨膜电阻，典型地，在8至10天之后，电阻为500-700欧姆时，插件被用于试验。使用传代8至20次之间(betweenpassages 8 and 20)的细胞。
Western免疫印迹 刺激之后，用含1mM钒酸盐(Sigma)的冰冷的PBS清洗细胞。然后加入125μl RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，NP-401％，脱氧胆酸钠0.25％，NaCl150mM，EDTA 1mM，PMSF 1mM，抑酶肽，亮抑酶肽，抑胃酶肽各1μg/ml，原钒酸钠1mM，NaF 1mM)，于冰上温育细胞，直至目测观察到它们被完全裂解。用BCA分析(Pierce)定量裂解物。将30μg的裂解物上样于1.5mm厚的凝胶上，100伏电压下处理样品大约2小时。于70V下将蛋白质转移至硝酸纤维素膜75分钟。室温下用含有5％脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl pH 8，150mM NaCl，0.1％吐温20)封闭膜2小时。然后，用抗ERK1/2-P或抗p38-P(Cell SignalingTechnology，Ma)的单克隆抗体于4℃温育膜过夜。用辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(Amersham Pharmacia，New Jersey)和化学发光检测(Sigma，Mo)检测免疫反应条带。为了定量条带，扫描膜，随后用软件程序ImageJ通过光密度测定法定量。用β-肌动蛋白抗体(ICN Biomedical Incorporated，Ohio)再次探查点印迹，进行光密度测定，以便校正蛋白质上样量。
激酶分析 用非放射性试剂盒(Cell Signaling Technology)进行ERK1/2活性分析。简言之，细胞被处理15分钟并在裂解缓冲液中裂解。用仅与磷酸化(即，活化)形式的ERK1/2反应的固定化磷酸ERK1/2抗体免疫沉淀等量的蛋白质。然后，固定化的沉淀的酶被用于激酶分析，其中使用Elk-1，接着用抗体进行蛋白质印迹分析，从而可以检测和定量磷酸化底物。
IL-8的定量 按照制造商的说明书，用可从商业上获得的酶联免疫吸附分析试剂盒(Biosource)测定I6HBE40-细胞上清液中的人IL-8。
半定量RT-PCR 如制造商所描述，来自两个独立试验的总RNA用RNaqueous(Ambion)从16HBE4o-细胞分离。DNA酶处理样品，然后用第一链cDNA(first-strand cDNA)合成试剂盒(Gibco)完成cDNA合成。得到的cDNAs被用作模板，用于合成多种细胞因子基因的PCRs中，所述基因是MCP-1(5*-TCATAGCAGCCACCTTCATTC-3’(SEQ ID NO59)，5’-TAGCGCAGATTCTTGGGTTG-3(SEQ ID NO60))，MCP-3(5*-TGTCCTTTCTCAGAGTGGTTCT-3’(SEQ ID NO61)，5’-TGCTTCCATAGGGACATCATA-3’(SEQ ID NO62))IL-6，(5’-ACCTGAACCTTCCAAAGATGG-3’(SEQ ID NO63)，5’-GCGCAGAATGAGATGAGTTG-3’(SEQ ID NO64))，和IL-8，(5’-GTGCAGAGGGTTGTGGAGAAG-3′(SEQ ID NO65)，5′-TTCTCCCGTGCAATATCTAGG-3′(SEQ ID NO66))。每一RT-PCR反应至少进行两次。分析线性扩增期的结果，并根据管家对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，进行标准化。通过包含进没有加入反转录酶的对照，证实了RNA扩增反应。
结果 A.肽诱导外周血源性单核细胞中的ERK1/2和p38磷酸化。
为了确定肽是否诱导MAP激酶，ERK1/2和/或p38活化，用50μg/ml的SEQID NO1或水(作为载体对照)处理外周血源性单核细胞15分钟。为了显示活化(磷酸化)形式的激酶，用特异于双磷酸化形式的激酶(对于ERK1/2和p38，分别在Thr202+Tyr204和Thr180+Tyr182上磷酸化)的抗体进行蛋白质印迹。用β-肌动蛋白抗体重新探查凝胶，以便将上样差异标准化。总之，在对SEQ ID NO1处理的响应中，观察到ERK1/2(n＝8)和p38(n＝4)的磷酸化增加(图2)。
图2显示，对SQE ID NO1的暴露诱导了ERK1/2和p38的磷酸化。将来自人外周血源性单核细胞的裂解物暴露于50μg/ml的SQE ID NO1，时间是15分钟。A)用特异于磷酸化形式的ERK和p38的抗体检测ERK1/2和p38的活化。被测试的所有供体显示出，响应于SEQ ID NO1处理，ERK1/2和p38的磷酸化增加。八个中的一个代表性供体。如材料和方法中所述，用磷酸化条带的强度除以相应对照条带的强度，确定ERK(B)和p38(C)的磷酸化的相对量。
B.在人血清中肽诱导的ERK1/2活化多于在胎牛血清中肽诱导的ERK1/2活化。
我们已能够证明，在不存在血清的情况下，LL-37诱导的ERK1/2磷酸化并不发生，并且磷酸化的数量取决于存在的血清的类型，这样，人血清(HS)中的ERK1/2活化比胎牛血清(FBS)中的活化高得多。
图3显示，在不存在血清的情况下，不发生LL-37诱导的ERK1/2磷酸化，并且磷酸化的数量取决于存在的血清的类型。用50μg/ml的LL-37处理人血源性单核细胞15分钟。在12％的丙烯酰胺凝胶上分离裂解物，然后转移至硝酸纤维素膜并与特异于磷酸化(活化)形式激酶的抗体杂交。为了将蛋白上样标准化，使印迹和β-肌动蛋白重新杂交。用ImageJ软件进行定量。图3的插图表明，在无血清的条件下，LL-37不能诱导人单核细胞中的MAPK活化。将细胞暴露于50mg/ml的LL-37(+)，或暴露于作为载体对照的无内毒素的水(-)，暴露15分钟。(A)暴露于含有10％胎牛血清的培养基中的LL-37之后，可检测到磷酸化的ERK1/2，然而，在血清不存在时，没有检测到ERK1/2的磷酸化(n＝3)。(B)Elk-1是ERK1/2下游的转录因子，在暴露于含10％胎牛血清的培养基中的50μg/ml的LL-37之后，Elk-1被激活(磷酸化)，但是在血清不存在时，Elk-1不激活(n＝2)。
C.肽诱导的ERK1/2和p38活化是剂量依赖性的，并且证实了与GM-CSF的协同作用。
在新鲜分离的人血单核细胞中，将GM-CSF、IL-4或M-CSF(均是100ng/ml)与SEQ ID NO1共同加入，测定ERK1/2的磷酸化情况。用50μg/ml的SEQ ID NO1处理细胞时，ERK1/2的磷酸化是明显的(是未处理细胞的8.3倍，n＝9)，但是这不发生在更低的浓度时(n＝2)。在100ng/ml的GM-CSF存在下，SEQ ID NO1诱导的ERK1/2磷酸化显著增加(是未处理细胞的58倍，n＝5)。而且，在GM-CSF存在的情况下，在被测试的两个供体中，分别响应于5μg/ml和10μg/ml浓度的SEQID NO1，发生了ERK1/2的活化(图4)。这证明，在存在GM-CSF的情况下，SEQ ID NO1诱导的ERK1/2活化以更低的阈值发生，GM-CSF是见于感染位点局部的细胞因子。
图4显示，LL-37诱导的ERK1/2活化在较低的浓度下发生，并且在一些细胞因子存在时被放大。在含有GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中刺激新鲜分离出的单核细胞时，LL-37诱导的ERK1/2磷酸化在低至5μg/ml的浓度下也是明显的。ERK1/2的这种协同激活似乎主要归因于GM-CSF。
D.ERK1/2的活化导致Elk-1控制的基因的转录和IL-8的分泌 IL-8的释放至少部分地是由ERK1/2和p38激酶的活化支配的。为了确定肽是否能够诱导IL-8分泌，人支气管上皮细胞系16HBE4o-在Transwell膜(Transwellfilters)中生长至汇合，这使得可以发生细胞极化，产生不同的顶面(apical surface)和底面(basal surface)。用50μg/ml的SEQ ID NO1刺激顶面上的细胞4小时，检测到释放入顶面上清液中的IL-8量在统计学上显著增加(图5)。为了确定肽诱导的MAP激酶活化的下游转录效应，用RT-PCR评价已知由ERK1/2或p38调节的基因的表达。对RNA进行RT-PCR，所述RNA分离自在血清存在下用50μg/ml的SEQ ID NO1处理4小时的16HBE4o-细胞，来自两个独立试验。已经证明，MCP-1和IL-8处于ERK1/2和p38的转录调控下，与此一致的是，它们分别被增量调节2.4倍和4.3倍。以前没有证明MCP-3的转录受促细胞分裂原激活蛋白激酶的活化影响，与此一致的是，其表达不受肽处理影响(图5)。这些数据和下列假设一致ERK1/2和p38信号通路活化的激活对具有免疫调节功能的细胞因子基因的转录有功能效应。图3B的插图也证实，肽以血清依赖方式诱导转录因子Elk-1的磷酸化。
图5显示，在16HBE4o-人支气管上皮细胞系中，肽既影响多种细胞因子基因的转录，也影响IL-8的释放。细胞在半透膜上生长至汇合，用50μg/ml的SEQ IDNO1在顶面上刺激4小时。A)SEQ ID NO1处理的细胞比对照细胞产生显著更多的IL-8，这种增多在从顶面——而不是底侧面(basolateral surface)——收集的上清液中通过ELISA检测到。三个独立试验的平均值±标准偏差被显示，星号代表p＝0.002。B)从上述试验收集RNA并进行RT-PCR。已知是被ERK1/2或p38调节的许多细胞因子基因，在用肽刺激之后被增量调节。显示了两个独立试验的平均值。
尽管本发明已针对目前优选的实施方案进行了描述，应该理解的是，可以进行多种修改而不背离本发明的精神。因此，本发明仅被权利要求限定。
序列表<110>英属哥伦比亚大学R·E·W·汉考克B·B·芬利M·G·斯科特D·鲍迪什C·M·罗森伯格J-P·S·鲍尔斯<120>先天免疫决定(Determination)的效应物<130>581-304PCT<140>US 10/661,471<141>2003-09-12<150>US 10/308,905<151>2002-12-02<150>US 60/336,632<151>2001-12-03<160>66<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>37<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>1Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>2<211>13<212>PRT<213>牛(Bovine)<400>2Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg1 5 10
<210>3<211>12<212>PRT<213>牛<400>3Arg Leu Ala Arg Ile Val Val Ile Arg Val Ala Arg1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(14)<223>Xaa独立地是R、L或K并且可以存在一个或两个<400>4Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Ile Pro Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>5Leu Leu Cys Arg Ile Val Pro Val Ile Pro Trp Cys Lys1 5 10<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>阳离子肽
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<223>阳离子肽<220>
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<220>
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<223>阳离子肽<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(18)<223>Xaa选自R或P并且可以存在一个、两个或三个<400>18Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Lys<210>19<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>阳离子肽
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<223>阳离子肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(2)<223>Xaa是R或K并且可以存在一个或两个<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa是极性氨基酸或带电荷的氨基酸(S，T，M，N，Q，D，E，K，R和H)<220>
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>26<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
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1 5 10 15Arg Ala Arg<210>29<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>29Arg Lys Met Val Lys Val Asp Val Arg Gly Ile Met Ile Arg Lys Asp1 5 10 15Arg Arg<210>30<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>30Lys Gln Cys Val Lys Val Ala Met Arg Gly Met Ala Leu Arg Arg Cys1 5 10 15Lys<210>31<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>31Arg Arg Glu Ala Ile Arg Arg Val Ala Met Arg Gly Arg Asp Met Lys1 5 10 15
Arg Met Arg Arg20<210>32<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa是R或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa是极性氨基酸或带电荷的氨基酸(S，T，M，N，Q，D，E，K，R和H)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa是一个C，S，M，D或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa是一个F，I，V，M或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(6)<223>Xaa是R或K并且可以存在一个或两个<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Xaa是一个A，I，S，M，D或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)
<223>Xaa是一个F，I，V，M或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa是一个F，I，V，M或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa是一个A，I，S，M，D或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa是一个F，I，V，M或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>Xaa是R或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa是一个C，S，M，D或A<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa是R或K<400>32Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa<210>33<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>33Arg Thr Cys Val Lys Arg Val Ala Met Arg Gly Ile Ile Arg Lys Arg1 5 10 15Cys Arg<210>34<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>34Lys Lys Gln Met Met Lys Arg Val Asp Val Arg Gly Ile Ser Val Lys1 5 10 15Arg Lys Arg<210>35<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>35Lys Glu Ser Ile Lys Val Ile Ile Arg Gly Met Met Val Arg Met Lys1 5 10 15Lys<210>36<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽
<400>36Arg Arg Asp Cys Arg Arg Val Met Val Arg Gly Ile Asp Ile Lys Ala1 5 10 15Lys<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>37Lys Arg Thr Ala Ile Lys Lys Val Ser Arg Arg Gly Met Ser Val Lys1 5 10 15Ala Arg Arg<210>38<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>38Arg His Cys Ile Arg Arg Val Ser Met Arg Gly Ile Ile Met Arg Arg1 5 10 15Cys Lys<210>39<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa是极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa是一个A，L，S或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa是一个A，L，S或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>Xaa是一个A，L，S或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa是一个A，L，S或K<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(31)<223>Xaa是选自下列的氨基酸G，A，V，L，I，P，F，S，T，K和H并且可以存在1到17个<400>39Lys Xaa Lys Xaa Phe Xaa Lys Met Leu Met Xaa Ala Leu Lys Lys Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>40<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽
<400>40Lys Cys Lys Leu Phe Lys Lys Met Leu Met Leu Ala Leu Lys Lys Val1 5 10 15Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu Thr Lys20 25<210>41<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>41Lys Sar Lys Ser Phe Leu Lys Met Leu Met Lys Ala Leu Lys Lys Val1 5 10 15Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser20 25<210>42<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>42Lys Thr Lys Lys Phe Ala Lys Met Leu Met Met Ala Leu Lys Lys Val1 5 10 15Val Ser Thr Ala Lys Pro Leu Ala Ile Leu Ser20 25<210>43<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>43
Lys Met Lys Ser Phe Ala Lys Met Leu Met Leu Ala Leu Lys Lys Val1 5 10 15Leu Lys Val Leu Thr Thr Ala Leu Thr Leu Lys Ala Gly Leu Pro Ser20 25 30<210>44<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>44Lys Asn Lys Ala Phe Ala Lys Met Leu Met Lys Ala Leu Lys Lys Val1 5 10 15Thr Thr Ala Ala Lys Pro Leu Thr Gly20 25<210>45<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>45Lys Gln Lys Leu Phe Ala Lys Met Leu Met Ser Ala Leu Lys Lys Lys1 5 10 15Thr Leu Val Thr Thr Pro Leu Ala Gly Lys20 25<210>46<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(26)<223>Xaa在残基4，7，8，10，11，14，15处是疏水氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(26)<223>Xaa在残基5，6，9，12，13处是亲水氨基酸<400>46Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>47<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>47Lys Trp Lys Ser Phe Leu Arg Thr Phe Lys Ser Pro Val Arg Thr Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>48<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>48Lys Trp Lys Ser Tyr Ala His Thr Ile Met Ser Pro Val Arg Leu Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25
<210>49<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>49Lys Trp Lys Arg Gly Ala His Arg Phe Met Lys Phe Leu Ser Thr Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>50<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>50Lys Trp Lys Lys Trp Ala His Ser Pro Arg Lys Val Leu Thr Arg Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>51<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>51Lys Trp Lys Ser Leu Val Met Met Phe Lys Lys Pro Ala Arg Arg Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25
<210>52<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>52Lys Trp Lys His Ala Leu Met Lys Ala His Met Leu Trp His Met Ile1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>53<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>53Lys Trp Lys Ser Phe Leu Arg Thr Phe Lys Ser Pro Val Arg Thr Val1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25<210>54<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>阳离子肽<400>54Lys Trp Lys Ser Tyr Ala His Thr Ile Met Ser Pro Val Arg Leu Val1 5 10 15Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser20 25
<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR扩增引物<400>55gtccctgtat gcctctggtc20<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR扩增引物<400>56gatgtcacgc acgatttcc 19<210>57<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CpG寡核苷酸<400>57tcatgacgtt cctgacgtt 19<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>非CpG寡核苷酸<400>58ttcaggactt tcctcaggtt20<210>59<211>21<212>DNA<213>人类<400>59tcatagcagc caccttcatt c 21
<210>60<211>20<212>DNA<213>人类<400>60tagcgcagat tcttgggttg20<210>61<211>22<212>DNA<213>人类<400>61tgtcctttct cagagtggtt ct 22<210>62<211>21<212>DNA<213>人类<400>62tgcttccata gggacatcat a 21<210>63<211>21<212>DNA<213>人类<400>63acctgaacct tccaaagatg g 21<210>64<211>20<212>DNA<213>人类<400>64gcgcagaatg agatgagttg20<210>65<211>21<212>DNA<213>人类<400>65gtgcagaggg ttgtggagaa g 21
<210>66<211>21<212>DNA<213>人类<400>66ttctcccgtg caatatctag g 2权利要求
1.刺激在对象中的天然免疫的方法，包括给予该对象治疗有效量的SEQ IDNO1-4、11、18、25、32、39、46、53或54所示的肽，从而刺激免疫应答。
2.权利要求1所述的方法，其中所述天然免疫被宿主免疫细胞活化、增殖、分化或MAP激酶通路激活所证实。
3.权利要求2所述的方法，其中所述MAP激酶是MEK和/或ERK。
4.权利要求1所述的方法，进一步包括给予该对象GM-CSF。
5.刺激患有感染或处于患感染风险中的对象的天然免疫的方法，包括联合给予该对象抗生素和SEQ ID NO1-4、7、11、18、25、32、39、46、53或54所示的肽。
6.权利要求1所述的方法，其中该肽含有至少一个为D-对映异构体的氨基酸。
7.权利要求1所述的方法，其中该肽是环状的。
8.权利要求1所述的方法，其中该肽序列是反向的。
9.权利要求1所述的方法，进一步包括给予该对象抗生素。
10.权利要求9所述的方法，其中所述抗生素选自氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类、cerbacephems、头霉素(cephamycins)、氯霉素、甘氨酰环素(glycylcyclines)、licosamides、氨基环醇类(aminocyclitols)、阳离子抗微生物肽、脂肽(lipopeptides)、poymyxins、链阳性菌素(streptogramins)、oxazoladinones、林可胺类(lincosamides)、氟喹诺酮、碳青霉烯类、四环素类、大环内酯类、β-内酰胺碳青霉烯类、单环菌素、喹诺酮类、四环素类或糖肽。
11.权利要求5所述的方法，其中所述肽具有抗炎活性。
12.权利要求5所述的方法，其中所述肽具有抗脓毒症活性。
13.权利要求5所述的方法，其中所述肽含有至少一个为D-对映异构体的氨基酸。
14.权利要求5所述的方法，其中所述肽是环状的。
15.权利要求5所述的方法，其中所述肽序列是反向的。
16.权利要求5所述的方法，其中所述抗生素选自氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类、cerbacephems、头霉素、氯霉素、甘氨酰环素、licosamides、氨基环醇类、阳离子抗微生物肽、脂肽、poymyxins、链阳性菌素、oxazoladinones、林可胺类、氟喹诺酮、碳青霉烯类、四环素类、大环内酯类、β-内酰胺碳青霉烯类、单环菌素、喹诺酮类、四环素类或糖肽。
17.刺激患有感染或处于患感染风险中的对象的天然免疫的方法，包括联合给予该对象GM-CSF以及SEQ ID NO1-4、7、11、18、25、32、39、46、53或54所示的肽。
18.权利要求17所述的方法，其中所述肽具有抗炎活性。
19.权利要求17所述的方法，其中所述肽具有抗脓毒症活性。
20.权利要求17所述的方法，其中所述肽含有至少一个为D-对映异构体的氨基酸。
21.权利要求17所述的方法，其中所述肽是环状的。
22.权利要求17所述的方法，其中所述肽序列是反向的。
全文摘要
描述了鉴定多核苷酸或多核苷酸谱型的方法，所述多核苷酸或多核苷酸谱型被一种或多种脓毒症诱导因子或炎症诱导因子调节并被肽抑制。鉴定用于抑制炎症反应或脓毒症反应的多核苷酸表达谱型的方法。该方法包括，在阳离子肽存在或不存在的条件下，用LPS、LTA、CpG DNA和/或完整微生物或微生物组分接触细胞；检测细胞在存在和缺乏该肽的情况下的多核苷酸表达谱型，其中在肽存在下的谱型代表炎症反应或脓毒症反应的抑制。也包括通过本发明方法鉴定出的化合物和试剂。在另一方面，本发明提供了增强对象的先天免疫的方法和化合物。
文档编号A61P37/02GK1901933SQ200480031833
公开日2007年1月24日 申请日期2004年9月10日 优先权日2003年9月12日
发明者R·E·W·汉考克, B·B·芬利, M·G·斯科特, D·鲍迪什, C·M·罗森伯格, J-P·S·鲍尔斯 申请人:英属哥伦比亚大学