专利名称：mRNA转染的抗原呈递细胞的制作方法
技术领域：
本文公开的主题涉及一种扩增RNA的方法，以根据所需的功能获得主要为有义方向或反义方向的RNA分子。也提供了一种用编码肿瘤抗原或微生物抗原的有义RNA转染抗原呈递细胞的方法，以及根据本文公开的方法制备的抗原呈递细胞。
背景技术：
T淋巴细胞在对传染原和肿瘤细胞的免疫应答中，以及在器官移植排斥和自身免疫中起重要作用。只有在抗原以与抗原呈递细胞表面上的MHC分子相结合的小片段形式呈递给T细胞时，T细胞才识别该抗原。为了使T细胞产生应答，抗原呈递细胞(APC)必须向静息T淋巴细胞提供两种信号。第一种信号使免疫应答具有特异性，是在识别主要组织相容性复合物(MHC)中呈递的外源抗原肽后通过T细胞受体(TCR)转导的。第二种信号诱导T细胞增殖及成为功能性的。因此抗原呈递是诱导免疫应答中的一个重要步骤。
曾经使用各种方法将抗原递送给APC，以试图诱导对该特定抗原的免疫应答。这些方法包括使用病毒载体、将抗原插入脂质体中以及用纯化的抗原或重组蛋白直接脉冲细胞。
最近报道了一种基于用RNA转染APC的抗原递送系统。美国专利6,306,388号和5,853,719号和相关专利和申请公开了用负载RNA的抗原呈递细胞治疗或预防癌症和病原体感染的方法，在此引入作为参考。简而言之，即扩增肿瘤总RNA或选择的编码肿瘤抗原的RNA，并将其转染到树突细胞内。用病原体来源的RNA转染的抗原呈递细胞也可以用于传染性疾病的治疗。
基于抗原修饰的树突细胞的疫苗在有效的抗肿瘤免疫方面具有广阔的前景，RNA被公认为是向树突细胞(DC)递送抗原的一种载体(Mitchell和Nair，2000；Nair和Boczkowski，2002；Ponsaerts等，2003；和Ponsaerts等，2002)。编码抗原的肿瘤RNA克服了其他抗原递送方法所固有的限制，因为它提供了最广泛可能的肿瘤抗原库(repertoire)，既不需要特异性HLA单倍型也不需要鉴定和表征总RNA群体中存在的确定的肿瘤抗原。
现在已经肯定地证明，RNA-转染的DC能够刺激主要溶细胞性T细胞(CTL)应答(Boczkowski等，1996)。有大量研究已经证实该方法在各种模型中的可行性。一项使用肾细胞癌总RNA转染的DC的研究证明了对原发性和转移性肿瘤的T细胞反应性的有效刺激(Heiser等，2001a)。另外一些体外研究证明，负载自体肿瘤RNA的DC能够诱导对膀胱癌(Schmitt等，2001)、多发性骨髓瘤(Milazzo等，2003)、乳腺癌(Müller等，2003)和结肠直肠癌(Nencioni等，2003)的特异性CTL。已经对结肠直肠癌(Rains等，2001)、肾细胞癌(Su等，2003)和恶性胶质瘤(Kobayashi等，2003)进行了利用负载自体肿瘤总RNA的DC检验接种策略的临床试验。总RNA中只有一小部分，即2-3％，对应于mRNA或抗原编码类型。富集RNA中的mRNA提高了编码RNA类型在递送给DC的相同质量RNA中的比例。一种富集编码RNA类型的方法是利用物理分离方法分离polyA+RNA。已经描述了制备临床级基于DC的用前列腺细胞系mRNA转染的疫苗的方法(Mu等，2004)，并且启动了使用所开发方法的临床试验(Mu等，2003)。富集编码RNA群体的另一种方法是偏向于只扩增聚腺苷酸化类型的RNA扩增。进行的研究证明了能够从小肿瘤样本中大量扩增RNA，从而富集编码类型，而不丧失其生物学功能(Boczkowski等，2000)。在一项旨在确定从肿瘤总RNA扩增的RNA是否仍然保留其生物活性的研究中，用从黑色素瘤细胞系扩增的RNA转染的鼠DC产生抗肿瘤CTL应答。该研究中描述的RNA扩增方案也用于来自显微切割的激光切片的前列腺肿瘤细胞，其中报道使用自体患者材料诱导肿瘤特异性的CTL(Heiser等，2001b)。因此，使用肿瘤RNA作为抗原来源具有另一个优点，即只需要少量从中可以提取和扩增的输入肿瘤组织。
mRNA(polyA+RNA)转变为互补DNA，以及随后的序列扩增，是分子生物学领域技术人员公知的基本技术。这些基本技术的各种变化方案的描述可见美国专利5,962,271、5,962,272和6,593,086号，其内容在此引入作为参考。例如，发表的RNA扩增方案使用模板转换技术(Chenchik等，1998)。该技术的示意图在
图1A中示出。该技术利用MMLV逆转录酶的RNAseH-缺陷型突变体的独特性质，来掺入其他残基，主要是在合成的第一链cDNA的5’末端处添加胞嘧啶。如果在第一链合成反应中存在3’末端处含有几个连续G残基的寡核苷酸，则在G和C核苷酸之间将发生Watson-Crick碱基配对。一旦逆转录酶到达转录物的5’末端，即转换模板，并从退火的寡核苷酸的限定序列继续转录。cDNA的3’末端通过含有其他确定序列的poly-dT寡核苷酸的退火限定。第一链cDNA的限定的3’和5’末端允许不受限制的基于PCR的扩增。为了使扩增产物中的抗原序列随后能够转录和翻译，通过向PCR反应中使用的含G寡核苷酸(capswitch)中添加T7启动子序列，引入T7RNA聚合酶启动子序列。该模板转换方案最早由Chenchik等人报道，其设计是为了易于操作，并且易于随后亚克隆到质粒载体中。
在该方案中，capswitch和poly-dT寡核苷酸都含有丰余序列。这允许在PCR反应中使用单一寡核苷酸进行扩增。例如，如果第一链cDNA合成使用含T7的寡核苷酸，并且PCR步骤使用含T7的寡核苷酸，则该寡核苷酸能够与该cDNA的5’末端和3’末端都退火。PCR终产物将在两个末端都具有T7RNA聚合酶结合位点。因此，在随后的转录反应中，RNA聚合酶将结合到5’和3’末端，合成有义和反义方向的RNA。
用有义和反义方向的RNA转染抗原呈递细胞都产生有希望的结果。但是，这些方法对抗原呈递细胞的负面影响以前没有认识到。因此，需要优化编码抗原的mRNA在树突细胞和其他抗原呈递细胞中表达的方法。本发明满足了这一需要。
发明概述在本文公开主题的一个实施方案中，提供了用至少一种mRNA转染抗原呈递细胞的方法。该方法包括通过如下步骤制备基本不含反义方向的RNA和双链RNA、而包含至少一种有义方向的mRNA的制品(i)从样品中扩增至少一种mRNA，产生多核苷酸模板，其中该多核苷酸模板含有适于体外转录的启动子，该启动子只是可操作地连接到该多核苷酸模板的有义链；和(ii)体外转录该多核苷酸模板，产生至少一种有义方向的mRNA，其中该多核苷酸模板不是克隆的模板；和用来自该制品的至少一种有义方向的mRNA转染至少一种抗原呈递细胞。在该方法的一些实施方案中，从样品中扩增mRNA包括从样品中逆转录该mRNA，产生含有cDNA的多核苷酸模板；利用第一引物和第二引物扩增该多核苷酸模板cDNA，其中第一引物和第二引物中只有一个将适于体外转录的启动子插入该多核苷酸模板cDNA中。在一些实施方案中，第一引物含有poly T延伸和与第二引物基本没有序列同源性的5’序列，第二引物含有适于体外转录的启动子。
在本文公开主题的另一实施方案中，提供了通过上述方法制备的负载mRNA的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。此外，在一些实施方案中，该树突细胞是成熟的树突细胞。在另外一些实施方案中，该树突细胞是未成熟的树突细胞。
在另一实施方案中，提供了一种组合物，其在载体中含有至少一种如上所述的新的负载mRNA的抗原呈递细胞。
在另一实施方案中，提供了一种在受试者中产生对至少一种抗原的免疫应答的方法。该方法包括将上述新的负载mRNA的抗原呈递细胞导入受试者中，其中该负载mRNA的抗原呈递细胞向受试者的免疫系统呈递至少一种抗原，从而产生对该至少一种抗原的免疫应答。
在另一实施方案中，提供了一种治疗受试者疾病的方法。该方法包括对需要治疗的受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物含有至少一种用RNA制品体外转染的抗原呈递细胞，该RNA制品含有至少一种有义方向的mRNA，且基本不含反义方向的RNA和双链RNA，其中所述至少一种有义方向的mRNA是通过上述方法产生的，以及通过体外转录多核苷酸模板，产生所述至少一种有义方向的mRNA，其中该多核苷酸模板不是一种克隆的模板。在一些实施方案中，该疾病是一种癌症。在其他一些实施方案中，该疾病是微生物感染的结果。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是从治疗的受试者中获得的自体抗原呈递细胞。
因此，本文公开主题的一个目的是提供一种扩增RNA的新方法，以根据所需的功能获得主要是有义方向或反义方向的RNA分子。这一目的和其他目的通过本文公开的主题全部或者部分地实现。
通过本文下面结合附图和实施例的描述，以上所述的本文公开主题的目的、其他目的和方面都将是显而易见的。
附图简述图1A和1B是扩增过程的示意图。图1A显示传统的扩增程序。该图表示限定cDNA 3’和5’末端的寡核苷酸中存在的丰余序列能够导致含T7的引物在下游退火，结果导致以反义方向转录的RNA类型的形成。图1B显示本文公开的扩增程序，其解决了产生反义RNA的问题。
图2是放射自显影照片的数字图像，其显示对总RNA样品(T)和使用传统引物和过程扩增的样品(A)进行的Northern印迹分析，其中使用与有义RNA或反义RNA互补的泛蛋白探针。等质量的各RNA(10μg)加样到每个泳道中。凝胶显示扩增的RNA群体中存在泛蛋白的反义RNA。
图3是放射自显影照片的数字图像，其显示对5’末端和3’末端引物之间去除同源性的Northern印迹分析，去除同源性阻断了反义RNA的形成。Northern印迹分析是针对从SK-Mel 28RNA或人肿瘤RNA扩增的样品进行的。利用传统扩增程序(泳道1)或者利用本文公开的主题(泳道2)扩增RNA。利用识别有义泛蛋白RNA或反义泛蛋白RNA的探针进行Northern印迹分析。
图4显示利用传统引物(CDS64T)扩增的RNA含有双链RNA。示出了RNAse消化之前及之后，RNA样品的电泳图。扩增的RNA群体用单链RNA特异性的RNAse(T1)消化，或者另外用识别双链RNA的RNAse(RNAse III)消化。左图显示利用传统CDS64T oligo扩增的RNA，右图显示利用本文公开主题的CDS64T+oligo扩增的RNA。
图5是微阵列1相对于微阵列3的染料交换(dye flip)。在所有染料交换比较中获得相同的数据。
图6是用不同RNA转染的树突细胞的散布流动图分析(scatter flowplot analysis)。未成熟的树突细胞(左图)用来自LNCaP细胞系的RNA以每一百万个细胞2μg的量转染，该RNA用传统CDS 64T oligo(中图)或新CDS 64T+oligo(右图)扩增。D03-017实验的门(Gate)R1圈出了含有DC的活的大细胞群体的轮廓。右下角的数字表示样品中存在的大的活细胞的百分数。
图7显示用两种RNA群体转染的成熟DC的表型没有不同。未成熟的树突细胞在第6天收获，用如下扩增的RNA电穿孔1)使用传统的扩增程序(存在dsRNA)；2)使用本文公开的主题(不存在dsRNA)；或3)用GFP RNA作为对照。将细胞放回条件培养基中，成熟过夜，并分析其表型标记的表达HLA-DR、CD83和CD14。Y-轴表示对于分析的各种标记的阳性细胞的百分比。
发明详述除非另外指出，本文公开主题的实施使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术都属于本领域的技能。这些技术在文献中有充分说明。这些方法在以下出版物中有记载。参见，例如，Sambrook等MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等编(1987))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press，Inc.)；PCRAPRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等IRL Press at OxfordUniVersity Press(1991))；PCR 2A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))；ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编(1988))；USINGANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编(1999))；和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编(1987))。
抗原呈递细胞(APC)在肿瘤和传染性疾病的治疗中起重要作用。APC加工并在其表面上呈递抗原。向抗原呈递细胞递送抗原的一种方式是通过RNA转染。RNA转染的方法在以下文献中有记载Boczkowski等，2000和Grunebach等，2003。其他核酸转染方法是本领域技术人员公知的。
编码抗原的RNA可以是编码所选抗原的确定的RNA、总RNA或扩增的RNA。一旦APC负载RNA，该RNA即在APC内翻译，产生的蛋白质被加工并且在MHC分子内呈递。这启动了对呈递的肽特异性的免疫应答。
RNA可以用改良形式的CAPswitch技术扩增，该技术记载在美国专利5,962,271号和5,962,272号中，或者可以用在5’末端产生确定序列的任何其他方法扩增。其他方法包括但不限于涉及确定序列与RNA 5’末端连接的方法，如欧洲专利0 625 572号所述。上述各项专利在此引入作为参考。
用于扩增RNA的大多数已知方法产生包括有义和反义RNA分子的RNA群体。但是，现有技术没有认识到这些反义mRNA在抗原呈递细胞转染中所具有的有害作用。PCR模板反义方向的转录产生低产量的有义方向的模板。而且，反义类型能够与有义转录物退火，导致序列特异性的双链RNA-介导的基因沉默(Zamore和Aronin，2003，和Dykxhoorn等，2003)。这些问题在下面详细讨论。
相反方向的转录物具有形成dsRNA有义-反义双链体的可能性。认为dsRNA双链体参与的调节现象的数量和种类迅速增加。例如，已经证实dsRNA抑制β-细胞功能，通过刺激一氧化氮的产生诱导胰岛损伤(Blair等，2002)。也已证实双链RNA是痘苗病毒感染的细胞中细胞凋亡的触发剂(Kibler等，1997)。尽管对于与dsRNA-触发的细胞死亡有关的中间物有大量研究，但是双链RNA诱导细胞凋亡的机理还未完全搞清。
除了dsRNA双链体可能的有害作用以外，反义RNA可能在对于抗原呈递细胞的生存力和功能重要的基因沉默化中起作用。反义RNA的存在也导致细胞中功能蛋白质合成可用的模板量减少。另外，反义RNA的存在可以促进TLR3活化的RNA依赖性蛋白激酶不依赖于序列地抑制细胞中的蛋白质翻译。
但是，除了上述作用以外，反义RNA或双链RNA形式的反义RNA还可以用于行使生物学功能。一个非限制性的例子是通过触发DC中的Toll受体途径提供成熟刺激。
对于为了抗原递送目的的APC转染，优选有义链RNA组合物，因为有义RNA导致mRNA编码的抗原翻译。以前用于转染抗原呈递细胞的组合物中存在反义RNA具有可能有害的作用。这些作用包括但不限于(a)用于在细胞中合成功能性蛋白质的有义方向模板减少；(b)通过siRNA、反义RNA或双链RNA机制，转导细胞的基因被序列特异性地沉默化；和(c)TLR3活化的RNA依赖性蛋白激酶介导的，不依赖于序列地抑制细胞中的蛋白质翻译。反义RNA的存在可以用许多方法检测，例如使用特定反义RNA的特异性探针的Northern印迹分析。例如，利用识别泛蛋白反义RNA的探针能够评价扩增程序。
另一方面，在某些情况下，优选反义组合物。例如，可能需要沉默一种特定基因。在此情况下，需要获得基本不含有义方向分子的组合物。
本文公开的主题提供一种改进的RNA扩增方法，其中扩增产物的方向可以控制。该方法导致制备出基本单向的RNA分子。换句话说，该RNA将主要是有义方向或反义方向，并且基本不含相反方向的RNA分子和相反方向RNA分子互补性结合产生的dsRNA。提供了基本不含反义方向分子的有义方向RNA的制品。如本文所述，不含反义分子的扩增RNA是作为mRNA来源的原始细胞如癌细胞所表达的基因的可靠代表。另外，本文实施例证明，用不含反义分子的RNA转染细胞产生较高的DC回收率，这对于基于DC的疫苗的大规模生产具有重要意义，并且与现有已知的方法相比是一个进步。
也提供了基本不含有义方向分子的反义分子的制品。
I.定义“扩增”是指使用引物和核酸聚合酶的核酸扩增程序，其产生多个拷贝的靶核酸序列。这样的扩增反应是本领域技术人员公知的，包括但不限于聚合酶链反应(PCR，参见U.S.4,682,195，4,683,202和4,965,188)、RT-PCR(参见U.S.5,322,770和5,310,652)、连接酶链反应(LCR，参见EP 0 320 308)、NASBA或类似的反应，如U.S.5,399,491记载的TMA和缺口LCR(GLCR，参见U.S.5,427,202)。如果核酸靶标是RNA，则首先可用逆转录酶将RNA拷贝为互补DNA链(参见U.S.5,322,770和5,310,652)。
本文所用的“抗原”是指能与抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文使用的术语“抗原”包括能够结合抗体或TCR的完整分子和完整分子的特定部分(表位)。当与APC表面上的MHC分子复合时，TCR只结合肽的片段，这被称为APC的“抗原呈递”。
“抗原呈递细胞(APC)”是指能够以抗原-MHC复合物的形式呈递一种或多种抗原的一类细胞，该复合物可被免疫系统的特定效应细胞识别，从而诱导对该一种或多种呈递抗原的有效的细胞免疫应答。APC可以是完整的全细胞，例如巨噬细胞、B-细胞、内皮细胞、活化T-细胞和树突细胞；或其他天然发生的或合成的分子，例如与β2-微球蛋白复合的纯化MHC I类分子。虽然有许多类型的细胞能够在其细胞表面呈递抗原以被T-细胞识别，但是只有树突细胞能够以有效的量呈递抗原，从而活化幼稚T-细胞，用于细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)应答。
“癌症”是指显示相对自发生长的细胞的异常存在，因此癌细胞显示异常生长表型，其特征在于细胞增殖控制明显丧失。癌细胞可以是良性或恶性的。在许多实施方案中，癌症影响到膀胱、血液、脑、乳腺、结肠、消化道、肺、卵巢、胰腺、前列腺或皮肤细胞。本文使用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括来源于癌细胞祖先的任何细胞。包括转移的癌细胞，体外培养物和来源于癌细胞的细胞系。癌症包括但不限于实体瘤、液体瘤、血液恶性肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、腺瘤、肉瘤、癌、母细胞瘤等。优选地，癌细胞是肾癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。
本文使用的“克隆”是指将利用本发明方法通过扩增RNA制备的cDNA插入载体，例如质粒载体中。该载体通常含有用于扩增该载体的复制起点和克隆的目标多核苷酸序列。本文使用的克隆通常不包括目标多核苷酸序列的扩增，特别是不包括聚合酶链反应扩增。本文公开主题的方法不包括使用克隆的模板进行体外转录。特别是，本文公开主题的方法提供了提供基本为有义RNA用于转染抗原呈递细胞的方法，而不需要克隆模板用于体外转录。
“树突细胞(DC)”是指在多种淋巴和非淋巴组织中发现的一群多样性的形态学上相似的细胞类型(Steinman，1991)。树突细胞是生物中最有效且优选的APC，并且提供T细胞活化和增殖所需的信号。树突细胞来源于骨髓祖细胞，在外周血中少量循环，并且表现为未成熟的郎罕氏细胞或终末分化的成熟细胞。树突细胞也可以由单核细胞分化而来。虽然树突细胞可以由单核细胞分化而来，但是它们具有不同的表型。例如，一种特定分化标记，CD14抗原，在树突细胞中未发现，但是单核细胞却具有该标记。另外，成熟树突细胞不吞噬细胞，而单核细胞强烈吞噬细胞。已经证实成熟DC可以提供T细胞活化和增殖所需的所有信号。本领域技术人员公知分离抗原呈递细胞(APC)和产生树突细胞前体和成熟树突细胞的方法。参见，例如，Berger等，2002；美国专利申请20030199673和20020164346；和WO 93/20185，其内容在此引入作为参考。在一个优选实施方案中，利用Romani等，1994或Sallusto等，1994所述的方法，由CD14+外周血单核细胞(PBMC)制备树突细胞，其内容在此引入作为参考。或者，也可以利用Caux等，1996的方法由CD34+细胞制备树突细胞。
“基本不含”用来指一种制品，其中反义RNA分子和dsRNA的含量低于有义mRNA分子的10％，优选低于5％、4％、3％、2％或1％。优选地，反义和dsRNA分子检测不到。
“mRNA”是指可翻译的RNA。mRNA含有核糖体结合位点和起始密码子。优选地，mRNA也含有5’帽、终止密码子和polyA尾。
“可操作连接”和“有效连接”在此可以替换使用，是指启动子区与核苷酸序列以一种方式连接，使得该核苷酸序列的转录受该启动子区控制和调节。类似地，也称核苷酸序列处于与之可操作连接的启动子的“转录控制”之下。有效连接启动子区与核苷酸序列的技术在本领域中公知。
“病原体”是指与疾病病原学有关的任何病毒或生物，也指其减毒衍生物。这样的病原体包括但不限于细菌、原生动物、真菌和病毒病原体，如缠绕杆菌属(Helicobacter)，如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，沙门氏菌属(Salmonella)的种，志贺氏杆菌属(Shigella)的种，肠杆菌属(Enterobacter)的种，弯曲杆菌属(Campylobacter)的种，各种分枝杆菌，如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、布鲁氏杆菌属(Brucella)的种、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、葡萄球菌属(Staphyloccus)的种，如金黄色葡萄球菌(S.aureus)，链球菌属(Streptococcus)的种，梭状芽孢杆菌属(Clostridum)的种，白色念珠菌(Candida albicans)，疟原虫属(Plasmodium)的种，利什曼原虫属(Leishmania)的种，锥虫属(Trypanosoma)的种，人免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人乳头状瘤病毒(HPV)，巨细胞病毒(CMV)，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)，疱疹病毒(例如1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、冠状病毒、水痘-带状疱疹病毒和EB病毒)，乳头瘤病毒，流感病毒，乙型肝炎病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒和风疹病毒。当用于逆转录病毒病原体如HIV和HCV时，本发明的方法特别有用。
病原体RNA可以是病原体基因组(例如逆转录病毒基因组)或病原体mRNA的形式，可以是剪切或未剪切的。例如，对于HIV，HIV RNA可以是在病毒复制过程中从病毒颗粒或从宿主细胞中分离的病毒RNA基因组的形式，也可以是剪切或未剪切的HIV mRNA的形式。在一个优选实施方案中，病原体RNA是从HIV病毒体中分离的HIV基因组RNA。病原体RNA可以被逆转录产生cDNA，该cDNA然后可用作核酸扩增的模板。
优选地，病原体RNA来自或者衍生自感染个体中存在的多个病原体种。在本文中，“衍生自”是指该核酸至少部分是从病原体或含有病原体核酸的细胞中纯化的，或者该核酸是由病原体核酸扩增的。通过由个体中存在的多个病原体种衍生核酸，产生的疫苗可以引发可能针对个体中存在的所有病原体种的免疫应答。
II.mRNA扩增和体外转录的方法通过用图表总体比较本文公开的新方法和标准扩增方法，可以看出本文公开主题的典型优点。图1A中示出了标准扩增程序包括的步骤。本文公开主题的新方法的一个实施例所包括的步骤在图1B中示出。
参见图1A，标准RNA扩增是SMART扩增方法的一种改进形式(Clontech)，由于该程序中使用的突变RT(Powerscript逆转录酶，Clontech)的独特性质，在一个RT反应中提供第一链cDNA的确定的3’和5’末端。连接到mRNA的5’末端上的寡核苷酸用作短的延伸模板，以便在逆转录酶到达该mRNA的5’末端时，该酶转换模板，并且通过连接的寡核苷酸的末端继续前进。于是该cDNA的5’末端具有确定的序列，称为互补确定序列或CDS。
如图1A所示，通过提供含有确定序列(CDS)以及poly T延伸的oligo，限定了该cDNA的3’末端。该oligo的polyT部分与mRNA的polyA区退火，用作第一链cDNA合成的锚。以这种方法，cDNA的3’末端含有CDS确定序列。在cDNA的两个末端存在确定的寡核苷酸序列使其能够在PCR反应中扩增cDNA。提供如下PCR引物TTTT[CDS]作为3’引物，T7[CDS]作为5’引物。该5’引物的T7部分是T7RNA聚合酶结合位点，该位点允许产生含有T7启动子的多核苷酸模板，有利于多核苷酸模板在最后一步的RNA转录。在图1A所示的这种标准方案中，初始3’引物和5’引物具有共同的序列，因此T7[CDS]引物能够与两端都退火。结果，以两个方向合成含有T7[CDS]序列的多核苷酸模板，例如cDNA，其最终导致两个方向的RNA的形成。
在该扩增程序中，希望的产物是RNA，不是DNA。因此，在PCR步骤中在多核苷酸模板的两条链上掺入RNA聚合酶结合序列。当该RNA聚合酶结合序列与多核苷酸模板cDNA的3’末端退火时，产生反义RNA，当该RNA聚合酶结合域在多核苷酸模板cDNA的5’末端退火时，产生有义RNA。因此，终产物含有两种方向的RNA。如上所述，产物中有义和反义RNA的存在可能导致产生dsRNA，dsRNA对RNA产物转染的细胞可能具有有害的作用。
RNA的定向或方向被定义为编码目标基因的方向(有义方向)或与有义方向相反的方向(反义方向)。
本文公开主题提供了相对于现有方法的几个优点。通过提供只产生有义RNA或只产生反义RNA的方法，消除了dsRNA的存在。本文公开主题的组合物优于其他方法产生的组合物，因为它们基本不含相反方向的RNA。这是利用彼此基本没有序列同源性的引物实现的。一个引物插入RNA聚合酶结合位点。根据该RNA聚合酶结合位点是插入5’末端还是3’末端，当cDNA转录为RNA时只产生有义RNA或只产生反义RNA。
II.A.产生基本不含反义RNA和dsRNA的有义方向RNA的方法在本文公开主题的一个方案中，反义RNA的形成被阻断。要扩增的起始RNA一般是poly A+RNA，它可以利用常规方法(例如使用polydT层析法)分离。一起或分离的细胞质和核RNA均可用于本文公开的主题中。在本文公开主题中有用的还有对应于肿瘤或病原体抗原或肿瘤或病原体独特表位的RNA，和对应于″小基因″的RNA(即编码确定表位的RNA序列)。肿瘤特异性或病原体特异性RNA可以利用本领域公知的大量方法之一通过从总RNA群体中分离独特抗原来获得。一个非限制性的例子是，可以利用扣除杂交方法从总RNA群体中分离独特RNA。扣除杂交的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利5,256,536和6,800,734，和Utt等，1995，其内容引用作为参考。一个非限制性的例子是，来自癌细胞(例如肾细胞癌)的总mRNA可以作为底物，用来制备对应于所有表达基因的一组cDNA分子。为了除去非靶细胞特异性(或者优先表达)的序列，将cDNA制品与相应正常细胞(例如正常肾组织)的mRNA消耗性地杂交。该步骤从cDNA制品中除去了两种细胞型共同的所有序列。除去可与其他mRNA杂交的所有cDNA序列后，剩下的包括总mRNA群体的选定部分，并且含有癌细胞mRNA群体独特的序列。
图1B显示本文公开主题的一个实施方案。在该实施方案中使用T7聚合酶，但是也可以使用适合体外转录的任何RNA聚合酶和在用于PCR的寡核苷酸中的该酶相应的结合位点。显然，能够使用不同引物和不同聚合酶获得相同的结果。同样显然，能够改变所述方法以便只产生反义分子。本文公开主题包括用于优先产生一种方向的RNA的通用方案。
在图1B所示的本文公开的新方法中，反义RNA的产生被阻断。这是通过重新设计初始的含polyT引物，使之含有与5’引物没有同源性的独特序列而实现的。这导致多核苷酸模板，优选cDNA的形成，其含有不同且独特的末端，可以被特定聚合酶，例如T7聚合酶转录。T7[CDS]引物只与5’末端退火，不与3’末端退火，因此不合成含T7启动子的反义cDNA。因此，反义方向RNA的合成将受到影响，将合成出基本不含反义方向RNA分子的RNA制品。
上述方法产生基本不含反义RNA的RNA分子的制品，即在该制品中实质上没有反义RNA。本文公开主题的制品与其他RNA制品相比，具有对抗原呈递细胞毒性较低的有利特征。用该制品转染的抗原呈递细胞产生较高产量的健康细胞。不受理论限制，对转染细胞的惊人的效果可能是因为反义方向或dsRNA的有害作用被消除。这导致转染细胞的产量在数量上和性质上均提高。与用有义和反义RNA转染的细胞群体相比，只用有义RNA转染的细胞显示较高的生存力，并且获得的剂量数较高。由于RNA电穿孔的DC疫苗生产相对昂贵，本文获得的剂量数增加具有显著的经济效益。获得的剂量数增加对于治疗的患者也具有健康效益。
II.B.检测核酸的方法已知有许多方法用于定量有义、反义和dsRNA，包括但不限于杂交试验(Northern印迹分析)和基于PCR的杂交试验。
可以利用各种裂解酶或化学溶液，按照Sambrook等，1989所述的程序分离mRNA，或者利用商业上获得的核酸结合树脂按照厂商提供的使用说明书来提取mRNA。然后按照标准程序，分别使用核酸探针和/或引物，通过杂交(例如Northern印迹分析)和/或扩增方法检测提取的核酸样品中所含的mRNA。
含有至少10个核苷酸并且与所检测的核酸序列显示互补性或同源性的核酸分子可以在诊断方法中用作杂交探针或引物。本领域公知特异性杂交不需要“完全匹配的”探针。由于少量碱基的置换、缺失或插入而实现的探针序列的微小改变不会影响杂交特异性。通常多达20％的碱基对错配(在最佳排列时)是可以容许的。片段的总大小，以及互补性延伸的大小，将取决于特定核酸片段的预期用途。较小的基因片段通常用于杂交实施方案，其中根据想要检测的互补序列，互补区的长度可能不同，例如在大约10个至大约100个核苷酸之间，甚至是全长。
在长度大于约10个核苷酸的延伸上具有互补序列的核苷酸探针将提高杂合体的稳定性和选择性，从而提高获得的特定杂合分子的特异性。人们可以设计具有长度大于约25个、甚至更优选大于约50个核苷酸、需要时甚至更长的基因互补延伸的核酸分子。这些片段可以如下容易地制备，例如通过化学手段直接合成该片段，通过采用核酸再生技术，如使用两种引物寡核苷酸的PCRTM技术，如美国专利4,603,102号所述，在此引用作为参考，或者通过将选择的序列引入重组载体内进行重组制备。
在某些实施方案中，有利地使用本文公开主题的核酸序列，并结合用于检测杂交、因此检测互补序列的适当工具，例如标记。多种适当的指示工具在本领域中公知，包括荧光、放射性、酶或其他配体，如亲和素/生物素，它们能够产生可检测的信号。也可以使用荧光标记或酶标签，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，代替放射性或其他对环境不利的试剂。在酶标签的情况中，比色指示底物是公知的，它们可以用来提供人眼或分光光度计可见的手段，用来鉴定与含互补核酸的样品的特异性杂交。
杂交反应可以在不同“严格性”的条件下进行。相关条件包括温度、离子强度、孵育时间、反应混合物中其他溶质如甲酰胺的存在、和洗涤程序。较高的严格性条件是这样的条件，例如较高的温度和较低的钠离子浓度，这需要在杂交成分之间具有较高的最低互补性才能形成稳定的杂交复合物。提高杂交反应严格性的条件众所周知，并且在本领域中公开。参见Sambrook等，1989。
人们也可以使用定量PCR或高通量分析，如基因表达系列分析(SAGE)，如Velculescu等，1995所述，来检测和定量mRNA水平或其表达。简而言之，该方法包括从怀疑含有转录物的细胞或组织中分离多种mRNA。任选地，该基因转录物可以被转化为cDNA。对该基因转录物的样品进行序列特异性分析并且进行定量。将这些基因转录物序列的丰度与参照数据库序列丰度包括患病和健康患者的正常数据集进行比较。该患者患有与该患者的数据集最密切相关的疾病，对于该用途，包括该转录物的差异。
在某些方案中，可能必须使用多核苷酸作为核苷酸探针或引物用于RNA的扩增和/或检测。一种对检测差异表达mRNA有用的引物与基因或多核苷酸的相当大小的同源区至少约80％相同。对于本文公开的主题，扩增是指使用能够以适当保真性复制靶序列的引物依赖性聚合酶的任何方法。扩增可以用天然或重组DNA-聚合酶如T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段和逆转录酶进行。
MacPherson等，1991教导了PCR的一般程序。但是，用于各个应用反应的PCR条件根据经验确定。许多参数影响反应的成功。其中包括退火温度和时间、延伸时间、Mg2+ATP浓度、pH、引物的相对浓度、模板和脱氧核糖核苷酸。
扩增后，产生的DNA片段可以用琼脂糖凝胶电泳检测，然后用溴化乙锭染色和紫外线照明显示。差异表达的目标基因的特异性扩增可以通过证明扩增的DNA片段具有预测的大小、显示预期的限制性消化模式和/或与正确克隆的DNA序列杂交来证实。检测基因表达的其他方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，PCT申请WO 97/10365号；美国专利5,405,783；5,412,087；5,445,934；5,405,783；5,412,087；5,445,934；5,578,832；和5,631,734号；和Tijssen(编)，1993。
III.转染APC的方法本文公开的主题提供了用有义方向RNA转染的APC的组合物。培养和转染抗原呈递细胞的方法是公知的。未决的美国临时专利申请60/522,512号公开了方法实例，该申请的内容在此引入作为参考。但是，转染方法不是本发明的关键。
III.A.分离和培养APC分离和培养抗原呈递细胞的方法是本领域技术人员公知的。一个非限制性例子是，可以从含有DC前体细胞的适当组织来源中分离或制备未成熟的DC，并且在体外分化，产生未成熟的DC。例如，适当的组织来源可以是骨髓细胞、外周血祖细胞(PBPC)、外周血干细胞(PBSC)和脐带血细胞中的一种或多种。在一个实施方案中，该组织来源是外周血单核细胞(PBMC)。该组织来源可以是新鲜的或是冷冻的。在另一方案中，细胞或组织来源用有效量的促进非干细胞或祖细胞生长和分化的生长因子预处理，然后更容易从目标细胞中分离。这些方法在本领域中公知，记载于Romani等，1994和Caux，C.等，1996中。
抗原呈递细胞(APC)包括但不限于巨噬细胞、内皮细胞、B细胞和树突细胞，如未成熟的树突细胞、成熟的树突细胞和朗罕氏细胞。专业抗原呈递细胞，特别是树突细胞(DC)，是一种有效的载体，通过对CD4+和CD8+T细胞的作用刺激细胞介导的免疫(Banchereau，1998，和Banchereau，2000)。它们的功能所固有的是，它们有效地加工抗原，在MHC I类和II产物上呈递给CD4+和CD8+T细胞。通过表面抗原富集技术从外周血或骨髓中分离的或从PBMC培养物中收获的树突细胞可以负载特定候选抗原，然后能够将相关抗原呈递给幼稚或静止T细胞(Heiser，2000，和Mitchell，2000)。优选地，抗原呈递细胞是要接种的个体自体的，病原体或癌细胞RNA也是从患者中分离或衍生的。
III.A.1.从PBMC中分离APC在一种方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中分离未成熟的DC。在一个优选实施方案中，用有效量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在存在或不存在白介素4(IL-4)和/或IL-13的条件下处理PBMC，使PBMC分化为未成熟的DC。最优选地，PBMC在GM-CSF或IL-4的存在下培养大约6天，产生未成熟的DC，其适用于本文公开主题的方法。
III.A.2.从干细胞中分离APC本领域中知道许多分离干细胞用于体外增殖和分化的方法。以下的描述只是为了说明，并非限制本文公开主题的范围。
干细胞可以从骨髓细胞中分离，分离方法是用结合不希望细胞如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)和GR-1的抗体淘选骨髓细胞。关于该方案的详细描述，参见Inaba等，1992。
人CD34+细胞可以从多种来源获得，包括脐带血、骨髓和动员的外周血。CD34+细胞的纯化可以利用抗体亲和法实现。参见，例如，Paczesny等，2004；Ho等，1995；Brenner，1993；和Yu等，1995。
DC也可以由外周血中频繁但是不增殖的CD14+前体(单核细胞)在GM-CSF+IL-4的保护下产生(参见，例如WO 97/29182)。该方法在Sallusto和Lanzavecchia，1994和Romani等，1994中记载。简而言之，CD14+前体是丰富的，因此据报道在大多数情况下没有必要用细胞因子如G-CSF(用来增加外周血中的CD34+细胞和更多定向前体)预处理患者。参见Romani等，1996。其他人报道利用该方法产生的DC显示相当高的均一性，并且能够以未成熟状态产生，或者完全分化或成熟。据认为它能够避免非人蛋白质，如FCS(胎牛血清)，并且利用自体单核细胞条件培养基作为成熟刺激物，获得完全且不可逆的成熟且稳定的DC。Romani等，1996；Bender等，1996。但是，与本文公开主题不同，这些研究未产生IL-12水平升高和/或IL-10水平降低的成熟DC。
干细胞通过与适当的细胞因子一起孵育可以分化为树突细胞。Inaba等，1994描述了鼠干细胞通过与鼠GM-CSF一起孵育在体外分化为树突细胞。简而言之，鼠干细胞与1-200ng/ml鼠GM-CSF，优选与约20ng/ml GM-CSF在标准RPMI培养基中一起孵育。大约每隔一天用新鲜培养基更换该培养基一次。培养7天后，根据表面标记的表达和形态学估计，高百分比的细胞为树突细胞。树突细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)或其他标准方法分离。
未成熟的树突细胞可以由CD34+造血干细胞或祖细胞制备。CD34+造血干细胞或祖细胞可以从选自下组的组织来源分离骨髓细胞，外周血祖细胞(PBPC)，外周血干细胞(PBSC)和脐带血细胞。人细胞CD34+造血干细胞优选地通过与人GM-CSF和TNF-α一起培养在体外分化。参见，例如，Szabolcs等，1995。
对于小鼠DC，鼠干细胞可以通过将培养中的该干细胞与鼠GM-CSF一起孵育分化为树突细胞。一般而言，培养物中的GM-CSF的浓度至少为约0.2ng/ml，优选至少约1ng/ml。该范围通常是约20ng/ml至200ng/ml。在许多优选实施方案中，该剂量为约100ng/ml。为了制备鼠DC，任选地以相似的剂量范围添加IL-4。
当转导人细胞时，以类似的剂量范围使用人GM-CSF，也加入TNF-α以促进分化。TNF-α一般也以大约相同的剂量范围加入。为了制备人DC，任选地以类似的剂量范围加入SCF或其他增殖配体(例如Flt3)。
本领域技术人员应当明白，用于分化干细胞的所有上述剂量范围都是近似值。不同供应者和来自同一供应者的不同批次的细胞因子在细胞因子活性上不同。熟练技术人员能够容易地滴定每种细胞因子，用来确定任一特定细胞因子的最佳剂量。
III.B.转染APC本文公开主题的一种新方法可以用来提供RNA转染的抗原呈递细胞，在需要诱导或调节对呈递肽的免疫应答的情况下，用于多种治疗用途。在本文公开主题的一个实施方案中，利用来源于肿瘤细胞的有义方向RNA的制品转染抗原呈递细胞，提供可以用作癌症免疫治疗剂的细胞组合物。在本文公开主题的另一实施方案中，可以利用来源于一种或多种病原体的有义方向RNA的制品转染细胞，并且提供可用于治疗和/或预防传染性疾病的组合物。另外，在本文公开主题的另一实施方案中，编码耐受原性肽的有义方向的RNA也可以用于制备用于治疗自身免疫病的APC。
转染抗原呈递细胞的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于电穿孔，被动摄取，脂转染，阳离子试剂，病毒转导，CaPO4，纳米颗粒介导的转染，肽介导的转染，等等。例如，肽介导的转染的方法在美国专利申请20030125242和20030087810号中披露，其内容引入作为参考。肽介导的转染的其他方法是本领域技术人员公知的。优选地，该肽是一种阳离子肽。纳米颗粒介导的转染的方法也是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利申请20040038406号，其内容引用作为参考。转染方法不是本文公开主题的关键，因此以上列出的方法是用来举例的，不是限制本文公开主题的范围。
树突细胞在成熟或未成熟时都可以在体外负载，然后在接种前在体外成熟，或者在接种后在体内成熟。或者，核酸可以原位递送给抗原呈递细胞。原位转染的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利申请20040082530和20030032615号，PCT申请WO 01/23537号，美国专利6,603,998号，Hoerr等，2000，Liu等，2002；Lisziewics等，2003；和O’Hagen，2001，其内容引用作为参考。
优选地，转染的APC是专业APC，如树突细胞或巨噬细胞。或者，可以使用人工产生的APC。可以利用常规方法用有义RNA转染APC。例如，APC可以在阳离子脂的存在下接触肿瘤来源的RNA。也可以利用其他已知的转染方法将RNA导入APC中。美国专利6,306,388号公开了用RNA转染APC的方法。来源于基本所有类型癌细胞或病原体的RNA都可以用作扩增方法的起始材料。在其他情况下，可能希望扩增编码耐受原性蛋白质的RNA。
IV.体内治疗利用本文公开主题的方法产生的T细胞或树突细胞可以直接施用给受试者，以产生对选择的免疫原有活性的T细胞。施用可以利用本领域公知的方法进行，以成功递送细胞，致使其最终与受试者的血细胞或组织细胞接触。
该细胞以任何适当的方法施用，通常与药物可接受的载体一起施用。在本文公开主题的内容中可以获得向受试者施用细胞的适当方法，尽管可以利用一种以上的途径施用特定细胞组合物，但是一种特定途径通常比另一种途径能提供更直接和更有效的反应。
药物可接受的载体部分取决于所施用的特定组合物，以及用来施用该组合物的具体方法。因此，本文公开主题的药物组合物有许多种类的适宜制剂。最通常的是，进行质量控制(微生物学、克隆原性测定、生存力试验)，并在给药苯海拉明和氢化可的松之后将细胞再回输到受试者体内。参见，例如，Korbling等，1986和Haas等，1990。适合胃肠外给药，例如关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径的制剂，和载体，包括含水等渗无菌注射溶液，其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受者血液等渗的溶质，和可能包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的含水及非水无菌悬浮液。静脉内或腹膜内给药是施用本文公开主题的树突细胞或T细胞的优选方法。
对受试者施用的细胞(例如活化的T细胞或树突细胞)的剂量是有效量，随着时间延长在受试者中有效地达到需要的有益治疗性反应，或者抑制癌细胞的生长，或者抑制感染。
只是为了说明，该方法可以如下实施在输注之前从受试者中获得并贮存血样，用于随后的分析和比较。在大约60-120分钟内，向70kg患者中静脉内或腹膜内输入通常至少约104至106，一般为1×108至1×1010个细胞。在一个方案中，通过静脉内输液施用。通过脉冲血氧定量法密切监测生命体征和氧饱和度。输液后5分钟和1小时时采集血样，贮存起来以备分析。大约每个月重复一次细胞回输，一年中总共进行10-12次处理。第一次处理后，可以根据医生的判断在门诊进行输液。如果在门诊进行回输，要在治疗后监护参与者至少4小时。
对于施用，根据受试者的体重和总体健康，可以按照根据该细胞型的LD-50(或其他毒性值)以及该细胞型在不同浓度下的副作用所确定的速度，施用本文公开主题的细胞。施用可以通过单一剂量或分剂量进行。本文公开主题的细胞可以作为用已知常规疗法对疾病的其他治疗的补充，这些常规疗法包括使用细胞毒性剂、核苷酸类似物和生物反应修饰剂。相似地，任选地添加生物反应修饰剂，以用本文公开主题的DC或活化T细胞进行治疗。例如，该细胞任选地与佐剂或细胞因子如GM-CSF、IL-12或IL-2一起施用。
V.评价免疫原性的方法通过本文公开主题的方法产生的抗原呈递细胞或驯化T细胞的免疫原性可以用公知的方法测定，这些方法包括但不限于51Cr-释放裂解试验可以比较抗原特异性T细胞对肽脉冲的51Cr-标记靶标的裂解。“更有活性的”组合物显示更高的随时间变化的靶标裂解率。裂解的动力学以及固定时间点(例如4小时)的总靶标裂解率可以用来评价其表现。Ware等，1983。
细胞因子释放试验分析T细胞接触修饰的APC后分泌的细胞因子的类型和数量可以确定功能活性。细胞因子可以用ELISA或ELISPOT试验测定，以确定细胞因子产生的速度和总量。Fujihashi等，1993；Tanquay和Killion，1994。
体外T细胞驯化可以测定本文公开主题的组合物从正常供体或患者来源的PBMC中引发反应性T细胞群体的能力。在该系统中，可以检测引发的T细胞的裂解活性、细胞因子释放、多克隆性和与抗原性表位的交叉反应性。Parkhurst等，1996。
转基因动物模型免疫原性可以如下在体内评估用本文公开主题的组合物接种HLA转基因小鼠，并确定诱导的免疫应答的性质和程度。另外，hu-PBL-SCID小鼠模型通过过继转移人PBL可以在小鼠中重建人免疫系统。如前Shirai等，1995；Mosier等，1993所述，可以用该组合物接种这些动物，并分析其免疫应答。
增殖试验T细胞将响应反应性组合物而增殖。通过测定例如3H-胸苷摄取可以定量监测增殖。Caruso等，1997。
灵长类动物模型可以利用非人灵长类动物(黑猩猩)模型系统监测HLA-限制性配体的体内免疫原性。已经证明，黑猩猩与人的MHC分子具有相同的重叠MHC-配体特异性，从而使人们能够检测HLA-限制性配体的相对体内免疫原性。Bertoni等，1998。
监测TCR信号转导事件几个细胞内信号转导事件(例如磷酸化)与MHC-配体复合物成功接合TCR有关。这些事件的定性和定量分析与组合物通过TCR接合活化效应细胞的相对能力有关。Salazar等，2000；Isakov等，1995。
VI.疫苗和使用方法本文公开主题进一步提供一种疫苗组合物，其含有上述负载的抗原呈递细胞。在这些疫苗中，负载的抗原呈递细胞置于适合对受试者治疗性施用的缓冲液中。该疫苗可进一步含有佐剂，用于加强抗原呈递细胞或T细胞的刺激。配制药物组合物的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Science的最新版。
树突细胞疫苗的最佳免疫间隔可以由本领域技术人员确定。在一个优选实施方案中，受试者以每次1×106至1×107个活RNA-负载DC的量接种5次。为接种选择的剂量水平预期是安全且良好耐受的。
分离、制备、转染、配制和对患者施用抗原呈递细胞的方法在本领域中公知。参见，例如，Fay等，2000；Fong等，2001；Ribas等，2001；Schuler-Thurner等，2002；和Stift等，2003，其内容引用作为参考。
临床上使用的APC施用途径包括但不限于静脉内(IV)、皮下(SC)、皮内(ID)和淋巴内。已经报道了IV、SC和ID施用后有客观的临床反应。当前偏爱ID施用，因为真皮是树突细胞的正常驻留地，树突细胞从这里迁移到引流淋巴结。在鼠模型中，SC-注射的树突细胞后来在引流淋巴结的T细胞区被发现，并且触发优于IV免疫的保护性抗肿瘤免疫。在鼠模型上有证据表明，直接向淋巴结内注射树突细胞在产生保护性抗肿瘤免疫或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)方面优于其他递送途径(Lambert等，2001，其内容引入作为参考)。这提示应当递送完整树突细胞剂量，使它影响单一的引流淋巴结或流域(而不是将剂量分散在多个部位来处理尽可能多的淋巴结)。
为了评价疫苗的免疫原性，可以根据CD4+和CD8+T细胞的成熟谱来监测接种个体中的免疫应答。例如，癌细胞特异的或病原体特异的效应细胞功能可以根据表达效应T细胞的表型CD45RA+CCR7-并且分泌高水平γ-IFN和粒酶B的细胞的存在来确定。HIV-特异性增殖反应的恢复可以根据细胞在用HIV-RNA转染的树突细胞刺激后产生IL-2的能力和成为低CFSE的能力来确定。恢复HIV-特异性记忆T细胞区室。
该疫苗诱导的特异性T细胞的成熟可以利用流式细胞分析试验用表面和细胞内标志物来确定。CD8+T细胞通过对表面标志物TCR、CD45RA、CCR7和CD107或细胞内分子如粒酶β或γ-IFN染色来监测。CD3、CD4、CCR7和IL-2可以用来监测CD4+T细胞。可以利用这些试验监视与包含来自患者的自体HIV序列的肽孵育后的免疫应答。通过在基线时以及在每次新的接种之前每月比较细胞免疫应答，可以确定该疫苗对细胞免疫应答幅度的影响。免疫应答的幅度也可以用CFSE增殖试验确定。
VII.其他应用本文公开的主题不限于向抗原呈递细胞递送抗原。本文公开的主题可用于向任何细胞系或组织细胞递送确定的靶标。本文公开主题的RNA也可以用来转染其他细胞型，为在细胞中合成功能性蛋白质提供模板。
基于使用扩增的RNA或cDNA的任何方法，其中希望优选以一个方向扩增，将从本文公开的新方法中获益。
如果从特定来源中PCR扩增确定的抗原靶标，本文公开主题也可以用于该靶标的制备。
本文公开主题的方法、RNA制品和细胞组合物相比现有技术具有明显的优点。本文公开的主题提供非常有效的制备高品质RNA制品的方法，和该RNA制品在细胞组合物中的应用。
显而易见，虽然已经较全面地详细描述了优先扩增有义RNA的方法，但是同一概念也可以用在另一方向上，用来优先扩增反义RNA。用反义RNA转染也具备许多治疗和研究用途。
以上内容总体描述了本文公开的主题。通过参考下面的实施例可以获得更全面的理解。这些实施例只是用于举例说明的目的，不是限制本文公开主题的范围。如果条件允许或者有利，也考虑同等方案的形式改变和替换。尽管本文使用了特定的术语，但是这些术语都是描述性的，不是为了限制。
实施例实施例1与传统寡核苷酸相比，使用新寡核苷酸的RNA扩增A.用于RNA扩增的寡核苷酸传统的(CDS 64T)(SEQ ID NO1)5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)63VN-3’新的(CDS64T+oligo)(SEQ ID NO2)
5’-CGATAAAAGCTCCGGGGATAACAGA(T)63VN-3’V＝A，G或CN＝A，G，C或TCapswitch(SEQ ID NO3)5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3’T7capswitch(SEQ ID NO4)5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3’B.RNA扩增在10μL逆转录酶反应体系中使用1微克来自SKMel 28细胞系或肾细胞癌肿瘤标本的总RNA，该反应体系中含有1μM CapSwitch引物，1μM CDS64T或CDS 64T+oligo引物，1μL POWERSCRIPTTM逆转录酶(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，California，U.S.A.)，1×第一链合成缓冲液，1μM dNTPs，2mM DTT。该反应混合物在42℃下孵育1小时。
然后将2μL RT产物稀释至100μL PCR反应混合物中，该混合物中含有0.4μM f T7 Capswitch和CDS64T或CDS 64T+oligo引物，0.4μMdNTPs，1×KlenTaq PCR缓冲液和1μL Advantage KlenTaq聚合酶混合物(BD Biosciences Clontech)。以95℃5秒，65℃5秒，68℃6分钟进行20个循环实现扩增。扩增的cDNA用PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Valencia，California，U.S.A.)纯化。各3μg cDNA用T7 MMACHINEMMESSAGE试剂盒(Ambion，Woodward，Texas，U.S.A.)按照使用说明书在体外转录反应中转录。终RNA按照RNA纯化方案用RNeasy小型柱(QIAGEN)纯化。
实施例2确定用传统寡核苷酸扩增的RNA群体中反义RNA的存在A.Northern印迹分析RNA在1.2％变性琼脂糖凝胶上分析，并且通过在10×SSC中毛细管转移将其转移到尼龙膜上。转移过夜后，该RNA与膜交联。过夜杂交在EXPRESSHYBTM溶液(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，California，U.S.A.)中在68℃下进行。杂交后，该膜用低严格性洗液2×SSC，0.5％SDS在室温下洗涤，用高严格性洗液1×SSC，0.1％SDS在55℃下洗涤，并暴露于磷成像仪屏。
用于检测有义和反义方向RNA的单链探针设计为与人泛蛋白mRNA的泛蛋白NCBI mRNA序列互补，该序列的GenBank保藏号为M26880。
泛蛋白有义探针(SEQ ID NO5)5’-GAGAACGTCAAGGCAAAGATCCAGGACAAGGAAGGCATTCCTCCTGACCAGCAGAGGTTGATCTTTGCCGGAAAGCAGCTGGAAGATGGGCGGACCCTGT-3’泛蛋白反义探针(SEQ ID NO6)5’-ACAGGGTCCGCCCATCTTCCAGCTGCTTTCCGGCAAAGATCAACCTCTGCTGGTCAGGAGGAATGCCTTCCTTGTCCTGGATCTTTGCCTTGACGTTCTC-3’所有双链探针的标记都用Deka Prime II试剂盒(Ambion，Woodward，Texas，U.S.A.)按照使用说明书进行。所有单链探针的标记都用KINASEMAXTM末端标记试剂盒(Ambion)进行。
B.结果图1A为用传统寡核苷酸产生反义RNA的机制示意图。为了通过实验确定反义方向转录的RNA是否存在于用传统引物扩增的RNA群体中，用互补于有义和反义方向泛蛋白RNA的寡核苷酸探针进行Northern印迹分析(图2)。互补于泛蛋白mRNA的核苷酸1691-1953的寡核苷酸探针识别总RNA群体中对应于泛蛋白mRNA同种型的2.3kb和1.3kb带。
在扩增的RNA群体中也检测到两种泛蛋白转录物，其强度较高。由于是用等量(10μg)的总RNA和扩增的RNA进行Northern印迹分析，在扩增的群体中获得较高的泛蛋白mRNA的信号强度指示在扩增的RNA样品RNA中每份质量有较高水平的转录物。这是由于扩增程序富集了聚腺苷酸化的mRNA类型但是只有3-5％的总RNA组成polyA+RNA的事实。用互补于反义转录物的泛蛋白探针进行的Northern印迹分析揭示在扩增的RNA群体中存在反义泛蛋白转录物。如预期的，在总RNA群体中未发现反义方向的泛蛋白转录物(图2，右图，T)。
实施例3应用新寡核苷酸序列阻断反义RNA的合成A.Northern印迹分析如实施例2所述，RNA在1.2％变性琼脂糖凝胶上分析，并通过在10×SSC中毛细管转移将其转移到尼龙膜上。转移过夜后，该RNA与膜交联。过夜杂交在EXPRESSHYBTM溶液(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，California，U.S.A.)中在68℃下进行。杂交后，该膜用低严格性洗液2×SSC，0.5％SDS在室温下洗涤，用高严格性洗液1×SSC，0.1％SDS在55℃下洗涤，并暴露于磷成像仪屏。
用于检测有义和反义方向RNA的单链探针设计为与人泛蛋白mRNA的泛蛋白NCBI mRNA序列互补，该序列的GenBank保藏号为M26880。
泛蛋白有义探针(SEQ ID NO5)5’-GAGAACGTCAAGGCAAAGATCCAGGACAAGGAAGGCATTCCTCCTGACCAGCAGAGGTTGATCTTTGCCGGAAAGCAGCTGGAAGATGGGCGGACCCTGT-3’泛蛋白反义探针(SEQ ID NO6)5’-ACAGGGTCCGCCCATCTTCCAGCTGCTTTCCGGCAAAGATCAACCTCTGCTGGTCAGGAGGAATGCCTTCCTTGTCCTGGATCTTTGCCTTGACGTTCTC-3’所有双链探针的标记都用Deka Prime II试剂盒(Ambion，Woodward，Texas，U.S.A.)按照使用说明书进行。所有单链探针的标记都用KINASEMAXTM末端标记试剂盒(Ambion)进行。
B.结果如图1A所示及实施例2所述，用于限定全长转录物3’和5’末端的传统引物中的丰余寡核苷酸序列允许T7引物在PCR过程中退火。改变新引物CDS64T+oligo中含64T的寡核苷酸的序列以消除与限定序列5’末端的寡核苷酸的同源性，阻止了T7 capswitch引物的退火。这最终阻止了反义方向的泛蛋白的转录。
重新设计含polyT的寡核苷酸(CDS 64T)，以消除与Capswitch引物的任何同源性。新的引物(CDS64T+oligo)然后用于RNA扩增。
用CDS 64T和CDS 64T+oligo扩增的RNA通过Northern印迹分析进行分析。为了排除反义RNA的存在是从特定细胞系中扩增RNA过程的伪迹的可能性，也对来自肾细胞癌肿瘤标本的总RNA进行扩增方案(图3)。
Northern印迹分析表明含64T寡核苷酸的重新设计在从细胞系和肿瘤材料中分离的RNA中均导致反义泛蛋白RNA合成被完全阻断。在使用各种寡核苷酸的扩增程序中获得的扩增RNA的产量相似，如表1所示。表1
实施例4检测含反义RNA的群体中的双链RNAA.核糖核酸酶保护实验核糖核酸酶保护实验(RPA)用RPA IIITM核糖核酸酶保护实验试剂盒(Ambion，Woodward，Texas，U.S.A.)进行，以确定扩增的RNA中是否存在双链类型。在该实验中，分析90μg 64T+oligo或CDS64T扩增的RNA。各种RNA在如下三种实验条件下分析1)未处理的(对照)，2)仅用RNAse T1消化，和3)RNAse III消化后用RNAse T1消化。
对于RPA，用乙醇沉淀30μg RNA，在10μl RPA III杂交缓冲液中重建，与传统CDS64T寡核苷酸引物一起在56℃下孵育过夜，以使互补的RNA链退火。孵育后，向样品中加入150μl RNase T1消化缓冲液和8U RNase T1酶，在37℃下孵育1小时。重复乙醇沉淀。
将进一步用RNAse III消化的样品重悬于10μl RNAse III消化缓冲液和15.U酶中。37℃孵育1小时后，样品用乙醇沉淀。对照样品含有不含核酸酶的水，而不是任一种核酸酶。乙醇沉淀后，所有样品均用20μl不含核酸酶的水重建，并用Agilent生物分析仪2100(Agilent，Palo Alto，California，U.S.A.)上的RNA 6000纳米芯片进行分析。
B.结果存在反义RNA引起的一个问题是它可能与它的编码对应物退火，产生双链RNA。这又能通过siRNA介导的机制产生有害作用，如序列依赖性沉默。为了研究使用传统CDS64T寡核苷酸扩增的RNA群体是否含有双链RNA类型，进行了RNAse保护实验。
用传统的(CDS 64T)或新的(CDS 64T+oligo)含poly T寡核苷酸扩增的RNA群体首先用单链RNA特异性的RNAse T1消化，然后进一步用双链RNA类型特异性的RNAse III消化(图4)。
扩增的RNA迁移为拖带(smear)，分子量分布介于200bp与6kb之间，峰强度在1.5kb附近(图4，未消化的曲线)。这种分子量分布是典型mRNA群体的特征。这也符合以下观点，即在扩增过程中只有聚腺苷酸化的mRNA群体被富集。用单链特异性RNAse(T1)消化后，在使用CDS 64T扩增的RNA群体中检测到约400bp的单峰(图4，左图)。由于该物质被保护不被单链RNAse酶切，它最有可能由双链RNA类型组成。
为了证实被保护群体的双链RNA性质，该RNA进一步用双链特异性RNAse III消化，此峰完全消失(图4，左图)。这进一步提示该400bp物质是由双链RNA组成的。
值得注意的是，用单链特异性RNAse T1消化后，在使用CDS64T+oligo扩增的群体中没有RNA峰被保护(图4，右图)，提示扩增的群体不含任何双链RNA类型。
实施例5扩增的RNA的质量和保真度的检查A.微阵列分析该研究中使用来自SK Mel 28细胞系的4等份各10μg总RNA和4等份各2μg扩增RNA。2等份总RNA和扩增RNA均用氨基烯丙基标记的核苷酸间接标记，方法是合成第一链cDNA，然后将氨基烯丙基与花菁3或5(Cy3/Cy5)荧光分子偶联。其余的总RNA和扩增RNA等份利用间接标记方案分别用Cy5和Cy3标记，进行染料交换(dyeswap)实验。按照使用说明书，使标记的cDNA与Agilent人基因组IA微阵列(Agilent，Palo Alto，California，U.S.A.)杂交。
该实验重复四份进行，其中微阵列1和2与Cy3-标记的总RNA和Cy5-标记的扩增RNA杂交。微阵列3和4与Cy5-标记的总RNA和Cy3-标记的扩增RNA杂交。
用Axon扫描仪采集微阵列图像。数据分析用TIGR TM4程序组进行，该程序组可在互联网上从tigr.org获得。其他分析用GeneSpring(Silicon Genetics，Redwood City，California，U.S.A.)进行。
B.结果用微阵列技术对使用实施例1所述的扩增方案扩增的RNA的质量和保真度进行初始检查。为了评价实验数据的质量，进行两个初始分析聚类和染料交换。
利用分级聚类将微阵列分组。在没有实验误差的情况下，重复的实验(即微阵列)将聚类在一起。4个微阵列的结果显示，用相同标记的RNA群体探查的微阵列聚类在一起微阵列1和2聚类在一起，微阵列3和4聚类在一起。
检验微阵列数据和RNA质量的第二种试验是“交换”用来标记cDNA的花菁染料。在没有实验误差或标记偏好(即一个cDNA群体优先被一种染料标记)的情况下，当比较标记RNA时存在正相关性。图5显示染料交换比较。这些基因被紧密地分组，并且显示正相关。Agilent人1A阵列(Agilent，Palo Alto，California，U.S.A.)含有约22,575个靶基因，其中用一个RNA群体检测到15,742个，在另一个RNA群体中检测到15,599个。预计没有群体能够与全部22,575个基因杂交，因为人1A微阵列含有一些在SK Mel 28细胞中不表达的基因靶标。
实施例6用不含反义对应物的RNA转染的细胞的产量和回收率分析A.DC培养物的产生及用RNA电穿孔来自健康志愿者的白细胞采集物(leukapheresis)在COBESPECTRATM(Gambro BCT，Lakewood，Colorado，U.S.A.)上使用Lifeblood的AutoPBSC程序(Memphis，Tennessee，U.S.A)采集。利用Ficoll密度梯度(HISTOPAQUE-1007 HYBRI-MAX，Sigma，St.Louis，Missouri，U.S.A.)从该采集物中分离外周血单核细胞，并培养1-2小时，以使单核细胞粘附。除去未粘附的细胞，剩余的单核细胞在添加各1000U/mL的GM-CSF(LEUKINE液，Berlex，Montville，New Jersey，U.S.A.)和IL-4(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota，U.S.A.)的X-VIVO 15TM(Cambrex，East Rutherford，New Jersey，U.S.A.)培养基中培养6-7天。
收获产生的单核细胞来源的树突细胞，用AO/PI(吖啶橙/碘化丙锭)定量，并且每一百万个细胞用2或4μg RNA电穿孔。转染的细胞在含800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4和IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2成熟混合物的X-VIVO 15中培养过夜。收获成熟树突细胞，并且用AO/PI(吖啶橙/碘化丙锭)定量。
B.结果为了确定反义RNA和双链RNA是否引起负作用，用RNA转染DC。未成熟DC由PBMC产生，分为两组。一个实验组用来自LNCaP细胞系用CDS 64T扩增的RNA群体转染，第二组用CDS 64T+oligo扩增的RNA转染。该实验中使用的RNA浓度为每一百万个DC 2μg。将细胞放回含成熟细胞因子(TNFα，IL-6和IL-1β)和PGE2的培养基中过夜，收获，并且分析其表型标记表达和生存力。
结果表明，在用CDS64T+oligo扩增的RNA转染的细胞中，活大细胞的百分比高于用CDS64T扩增的RNA转染的细胞(图6)。用CDS64T RNA转染的群体在R1门的左侧显示明显的彗星样尾。R1门含有大细胞群体，主要是树突细胞。起源于R1门的彗星样尾含有细胞碎片和死亡细胞。该尾在用CD64T+oligo扩增的RNA转染的群体中较不明显。此外，R1门中的细胞数也较大(在该实施例中为54％，相对于48％)。这些发现综合在一起表明，在使用新寡核苷酸和新方法扩增的RNA转染的DC群体中，电穿孔后回收的活大细胞数较高。
用两种方法扩增的RNA转染的成熟活DC的表型没有不同(图7)。为了比较活成熟树突细胞的回收率，未成熟DC用不同RNA转染，成熟，收获，并且分析。表2总结了用三名独立健康志愿者的白细胞采集物材料进行的三个大规模实验的数据。表2中总结的数据证明，在用CDS64T+oligo扩增的RNA转染的实验组中，回收的细胞总数高于用CDS 64T扩增的RNA转染的组。这表明用新寡核苷酸和新扩增方法转染的细胞的回收率和产量较高。
表2
实施例的讨论RNA作为向DC中递送抗原的载体克服了基于DC的疫苗制备的许多限制。一个优点是可从少量肿瘤中提取RNA，并且扩增产生足够的量来转染自体DC。疫苗试验允许制备疫苗和治疗具有最小肿瘤负载至晚期疾病的患者。具有最小肿瘤负载的患者可能从免疫治疗中受益更多，因为他们的免疫妥协较低。
为了从少量起始材料中制备足够量的RNA，进行了在本文和其他文献(Boczkowski等，2000和Heiser等2001b)中描述的扩增方案。该方案是基于模板转换原理，导致高质量全长RNA的扩增。这些实施例证明了原始方案产生含有反义RNA的扩增RNA群体。
由于原始方案是为了构建cDNA文库而开发的，并且需要扩增有义和反义cDNA两条链，所以形成反义RNA。这是使用与含有丰余序列的3’和5’末端都退火的单一PCR引物造成的。为了允许以后的RNA转录，该PCR引物含有T7启动子序列。结果当与3’末端退火时，它产生在3’末端含T7的cDNA，因此产生反义RNA。定量分析估计，用CDS64T扩增的RNA中5-7％为反义方向。但是，在用新CDS64T+oligo扩增的RNA中检测不到反义RNA。当通过改变序列而不是核苷酸组成(CDS 64T改变为CDS64T+oligo)除去5’和3’寡核苷酸序列的丰余性时，不产生反义产物。另外，限定5’末端的(capswitch)寡核苷酸的序列改变也阻止了反义RNA的形成。因此，本文提出了证明使用传统方法和寡核苷酸引物产生反义RNA的实验证据。本文公开的主题设计了一种方案来消除反义RNA和dsRNA，部分是通过修饰引物，使得只有有义RNA被转录。
进行微阵列分析来评价用新方案扩增的RNA的保真性。利用4个重复技术方案将扩增的RNA与起始总RNA群体进行比较。聚类分析把用同样标记的RNA标记的微阵列聚类在一起1和2在一起，微阵列4和3在一起。染料交换实验显示了紧密分组的基因，并且检查了两组之间的正相关性。这两个分析都证实了标记、杂交和数据提取的高质量。也证实了在该研究中使用的RNA的高质量。
对差异基因表达的这种初始微阵列分析的一个最重要的结果是两个RNA群体(总RNA相比扩增的RNA分别为15,742和15,599)之间只有0.9％的差异(143个基因)。这些差异包括在总RNA样品中检测到但在扩增群体中检测不到的基因(真阴性)，和在总RNA样品中检测不到但在扩增群体中检测到的基因(假阳性)。这两种情况都可能是扩增程序引起的偏差。最重要的是，这个数字非常小，起始总RNA群体中的大多数转录物都存在于最终扩增的RNA群体中。这表示用开发的新方法扩增的RNA有极高的保真度。因此，本文证明从肿瘤总RNA扩增的RNA准确代表了起始肿瘤材料中表达的基因的定性和定量水平，因此在转染到自体DC内时，将成为完美匹配的患者特异性疫苗。
这些实施例进一步确定了扩增RNA中存在反义RNA与存在dsRNA类型之间的相关性。RNAse保护实验(RPA)证明，含有反义RNA的群体也含有双链类型，反义RNA的缺失与双链RNA的缺失相关。用于转染DC的群体中存在双链RNA产生问题，因为dsRNA-介导的沉默机制已经得到很好地证明(Heiser等2001b和Chenchik等1998)。
RPA实验中使用的RNAse III与切酶(Dicer)有相似的序列特异性，切酶是一种细胞内RNAse，负责将高分子量双链RNA切割为22个核苷酸的双链RNA。22个核苷酸的短dsRNA分子又构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)的活性成分，该复合物用于序列特异性基因沉默。用单链特异性RNAse消化导致分子量分布低于100个核苷酸的dsRNA类型积累(图4，左图)。
序列特异性RNA介导的沉默是一种进化上保守的机制，它在DC中发现，并且在DC中成功用于选择性沉默靶基因(Laderach等，2003)。用含有大dsRNA的RNA转染后，DC中形成的小dsRNA可以导致RISC形成，并且不利地影响DC的表型或功能。
在旨在确定用含有双链形式的RNA转染是否导致负作用的实验中，从一个供体中产生DC，然后将未成熟的DC分为两组。用原始方法或本文公开的新方法从同一起始总RNA中扩增RNA，因此其中分别含有dsRNA和不含dsRNA，用这些RNA并行地转染各组。该研究对三个不同的供体进行。该研究的结果证明，用不含dsRNA类型的RNA转染导致较高的细胞产量。由于两个RNA群体的不同只是存在或不存在dsRNA，可以得出以下结论用通过原始方案扩增的RNA转染的组中产量下降是由于存在dsRNA。这与本文预测的dsRNA可能导致对DC的有害作用相一致。但是，用任一RNA群体转染的回收的活细胞在表型上不显示任何差异。
此处提供的数据清楚并且令人吃惊地证明，使用扩增的不含双链形式的RNA导致较高的细胞回收率。因此，用本文所述新方案和寡核苷酸引物扩增的RNA转染细胞，意外地提高了成熟的、自体RNA转染的细胞的产量，该产量与用于患者接种的剂量数成正比(表2)。因此，细胞回收率的提高将降低疫苗生产的成本，并且允许延长患者接种，这是相对于以前所知方法的一个重要优点。
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<223>用于将mRNA扩增为cDNA的寡核苷酸引物<400>3aagcagtggt aacaacgcag agtacgcggg 30<210>4<211>46<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于将mRNA扩增为cDNA并且向cDNA中加入T7聚合酶结合位点的寡核苷酸引物<400>4taatacgact cactataggg aggaagcagt ggtaacaacg cagagt 46
<210>5<211>100<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于捕获人泛蛋白mRNA的单链有义寡核苷酸探针<400>5gagaacgtca aggcaaagat ccaggacaag gaaggcattc ctcctgacca gcagaggttg60atctttgccg gaaagcagct ggaagatggg cggaccctgt 100<210>6<211>100<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于捕获人泛蛋白mRNA的单链反义寡核苷酸探针<400>6acagggtccg cccatcttcc agctgctttc cggcaaagat caacctctgc tggtcaggag60gaatgccttc cttgtcctgg atctttgcct tgacgttctc 100
权利要求
1.一种用至少一种mRNA转染抗原呈递细胞的方法，其包括(a)通过如下步骤制备基本不含反义方向RNA和双链RNA并且含有至少一种有义方向mRNA的制品(i)从样品中扩增至少一种mRNA，产生多核苷酸模板，其中该多核苷酸模板含有适于体外转录的启动子，该启动子只与该多核苷酸模板的有义链可操作地连接；和(ii)体外转录所述多核苷酸模板，产生至少一种有义方向的mRNA，其中所述多核苷酸模板不是克隆的模板；和(b)用来自该制品的所述至少一种有义方向的mRNA转染至少一种抗原呈递细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述样品中的mRNA来自细胞或病毒体。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞选自癌细胞和微生物细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述癌细胞来源于选自下组的癌症血液恶性肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、腺瘤、肉瘤、癌和母细胞瘤。
5.权利要求3的方法，其中所述微生物细胞选自缠绕杆菌属的种，沙门氏菌属的种，志贺氏杆菌属的种，肠杆菌属的种，弯曲杆菌属的种，分枝杆菌属的种，炭疽芽孢杆菌，鼠疫耶尔森氏菌，土拉热弗朗西丝氏菌，布鲁氏杆菌属的种，问号钩端螺旋体，葡萄球菌属的种，链球菌属的种，梭状芽孢杆菌属的种，白色念珠菌，疟原虫属的种，利什曼原虫属的种，和锥虫属的种。
6.权利要求2的方法，其中所述病毒体选自人免疫缺陷病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人乳头状瘤病毒，巨细胞病毒，人嗜T淋巴细胞病毒，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，EB病毒，流感病毒，冠状病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒和风疹病毒。
7.权利要求1的方法，其中所述至少一种有义方向的mRNA编码一种抗原，并且其中该抗原由所述至少一种转染的抗原呈递细胞从该至少一种有义方向的mRNA翻译而来。
8.权利要求7的方法，其中所述至少一种转染的抗原呈递细胞呈递表达的抗原。
9.权利要求1的方法，其中所述来自样品的至少一种mRNA是多种mRNA。
10.权利要求9的方法，其中所述多种mRNA包括来源于细胞或病毒体的总mRNA群体。
11.权利要求9的方法，其中所述多种mRNA包括来源于细胞或病毒体的总mRNA群体的选定部分。
12.权利要求11的方法，其中利用扣除杂交法选择所述总mRNA群体的选定部分。
13.权利要求11的方法，其中所述总mRNA群体的选定部分来源于癌细胞，并且该选定部分包含编码癌细胞独特抗原的mRNA。
14.权利要求1的方法，其中从样品中扩增mRNA包括(a)逆转录来自样品的mRNA，产生包含cDNA的多核苷酸模板；和(b)使用第一引物和第二引物扩增该多核苷酸模板cDNA，其中该第一引物和第二引物中只有一个向该多核苷酸模板cDNA内插入适于体外转录的启动子。
15.权利要求14的方法，其中所述体外转录包括使用所述启动子特异性的聚合酶将所述多核苷酸模板cDNA体外转录为有义方向的mRNA。
16.权利要求15的方法，其中所述聚合酶是T7聚合酶。
17.权利要求14的方法，其中所述第一和第二引物彼此基本没有序列同源性。
18.权利要求14的方法，其中所述第一引物包含poly T延伸和与所述第二引物基本没有序列同源性的5’序列，并且该第二引物包含适于体外转录的启动子。
19.权利要求18的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO2的序列。
20.权利要求1的方法，其中所述转染是利用选自下组的方法实现的电穿孔、纳米颗粒介导的转染、肽介导的转染和脂转染法。
21.权利要求1的方法，其中所述抗原呈递细胞选自树突细胞和巨噬细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述树突细胞是未成熟的树突细胞。
23.权利要求21的方法，其中所述树突细胞是成熟树突细胞。
24.权利要求1的方法，其中所述转染是体外转染。
25.权利要求1的方法，其中所述转染是原位转染。
26.利用权利要求1的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
27.权利要求26的负载mRNA的抗原呈递细胞，其中该抗原呈递细胞是树突细胞。
28.利用权利要求2的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
29.利用权利要求3的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
30.利用权利要求4的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
31.利用权利要求5的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
32.利用权利要求6的方法制备的一种负载mRNA的抗原呈递细胞。
33.一种组合物，其在载体中含有至少一种权利要求26的负载mRNA的抗原呈递细胞。
34.一种在受试者中产生对至少一种抗原的免疫应答的方法，包括向受试者中导入权利要求26的负载mRNA的抗原呈递细胞，其中该负载mRNA的抗原呈递细胞将至少一种抗原呈递给该受试者的免疫系统，从而产生对该至少一种抗原的免疫应答。
35.权利要求34的方法，其中所述mRNA编码至少一种来源于细胞或病毒体的抗原。
36.权利要求35的方法，其中所述细胞选自癌细胞和微生物细胞。
37.权利要求36的方法，其中所述癌细胞来源于选自下组的癌症血液恶性肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、腺瘤、肉瘤、癌和母细胞瘤。
38.权利要求36的方法，其中所述微生物细胞选自缠绕杆菌属的种，沙门氏菌属的种，志贺氏杆菌属的种，肠杆菌属的种，弯曲杆菌属的种，分枝杆菌属的种，炭疽芽孢杆菌，鼠疫耶尔森氏菌，土拉热弗朗西丝氏菌，布鲁氏杆菌属的种，问号钩端螺旋体，葡萄球菌属的种，链球菌属的种，梭状芽孢杆菌属的种，白色念珠菌，疟原虫属的种，利什曼原虫属的种，和锥虫属的种。
39.权利要求35的方法，其中所述病毒体选自人免疫缺陷病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人乳头状瘤病毒，巨细胞病毒，人嗜T淋巴细胞病毒，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，EB病毒，流感病毒，冠状病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒和风疹病毒。
40.权利要求34的方法，其中所述至少一种来自样品的mRNA是多种mRNA。
41.权利要求34的方法，其中所述抗原呈递细胞选自树突细胞和巨噬细胞。
42.权利要求41的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
43.权利要求42的方法，其中所述抗原呈递细胞是未成熟的树突细胞。
44.权利要求42的方法，其中所述抗原呈递细胞是成熟树突细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述抗原呈递细胞是从受试者获得或者衍生的自体抗原呈递细胞。
全文摘要
一种扩增RNA的方法，其获得主要是有义方向的RNA分子，基本不含反义方向的RNA分子。也提供了用含有编码免疫原性抗原的有义RNA且基本不含反义RNA和dsRNA的组合物转染抗原呈递细胞的方法，以及按照该方法制备的树突细胞。
文档编号A61K39/00GK1882603SQ200480034113
公开日2006年12月20日 申请日期2004年11月24日 优先权日2003年11月25日
发明者艾里纳·切雷帕诺瓦 申请人:阿哥斯医疗公司