从乳腺分泌物中分离细胞的方法

专利名称：从乳腺分泌物中分离细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种从人体分离细胞的方法，以及这些细胞的用途。
背景技术：
干细胞被定义为具有致克隆性、自我更新能力的祖细胞，这类细胞经分化过程可以产生广泛种类的更特化的细胞类型。按照经典理论，存在两种不同类型的干细胞。胚胎干细胞(ES)来源自胚泡的内细胞团，具有多能性，因此它可以在体内分化成所有分化细胞类型。另外亚群的干细胞来源自ES细胞，具有器官特异性或组织特异性。这些专能细胞，也称为成体干细胞，被认为仅能分化成为它们起源器官的组织。这些专能细胞的实例是造血干细胞，它们用于持续再生血液和免疫系统的细胞。
已经从广泛的组织中分离了干细胞，从具有持续的高细胞更替率的组织，例如，血液、脐带血、骨髓、皮肤、肠和乳房组织，到具有低更替率的组织，例如，脑、骨骼肌和幼齿。无论干细胞的组织来源，一个长期存在的观念是成体干细胞只能分化成它们起源的组织。然而，最近的工作已经证明，当暴露于新的环境时，器官特异性干细胞可以克服这些固有的限制，转分化成其它组织。例如，已经表明神经干细胞能转分化成血细胞，来源于骨髓的干细胞能转分化成肌肉、脑、肝和心脏细胞，来源于皮肤的干细胞能转分化成脑细胞。因此，与器官特异性干细胞的发育限制相关的观念现在看起来可能不正确，这些ES细胞在适当的环境刺激下能转分化成另一种细胞类型是可行的。
人乳汁含有不同类型细胞的混合物。作为与乳房被持续充填和排空相关的压力的结果，由于分泌型上皮细胞(乳细胞，lactocyte)从乳房基膜上脱落，因此在乳汁中能发现这些细胞。在所有细胞群体中，乳细胞占约10-20％。人乳汁中发现的其它细胞大多是白细胞(免疫细胞如淋巴细胞、巨嗜细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)，据信乳汁中这些细胞的作用是避免乳腺受到感染，并向婴儿提供免疫保护。迄今为止，这些被认为是乳汁中仅有的细胞类型。

发明内容
因此，本发明要解决的问题是提供从人体分离祖细胞的新方法。在本文中，术语祖细胞将包括所有具有干细胞样特征的细胞，优选地但不限于包括多能或专能祖细胞，例如干细胞。
本发明通过直接或间接从人乳腺分泌物中得到这些细胞解决了上述问题，这些乳腺分泌物可以是男或女性的初乳、成熟乳、或干燥期分泌物，所述人体处于至少一个下列的期中非怀孕期、怀孕期、泌乳期、恢复期。换句话说，在此我们证明，令人惊奇地，祖细胞也能在人体分泌的乳汁中发现，并且对母亲和婴儿来说这些细胞具有用于产生组织的潜力。必须指出，不但人乳腺分泌物，而且一般地哺乳类动物乳腺分泌物也可以用于分离相应的祖细胞。利用祖细胞特异性抗体，可以毫不含糊的表明，事实上哺乳动物分泌物，即，例如人乳汁中，包含祖细胞。
在本发明的第一个优选实施方案中，从乳腺分泌物中分离祖细胞，其中将乳腺分泌物的非细胞部分与细胞部分分离开，和特别地从因此获得的细胞部分中去除非多能或非专能细胞。除了多能细胞，乳腺分泌物的细胞部分还可以包含分泌型上皮细胞、白细胞和尤其是非人体细胞如细菌细胞。优选从乳腺分泌物中去除那些非多能细胞。
根据本发明另一个优选的实施方案，使用泌乳期的乳腺分泌物来分离祖细胞，其中使用的乳腺分泌物来自特定的乳腺分泌阶段，比如开始个体哺乳后；相对的结束个体哺乳时；泌乳期(lactation phase)；优选泌乳早期。
如果使用磁珠，从分泌物中分离那些祖细胞的特别有用和可行的方法是可能的。为此目的，那些磁性珠优选与祖细胞特异性抗体连接，从而允许磁珠与祖细胞相结合。
通常，第一步，从乳腺分泌物中洗出细胞组分；第二步，用祖细胞标记物抗体染色所述细胞组分；第三步，通过结合抗体，优选但不限于使用上述磁珠，直接或间接地将祖细胞与其他细胞分开。为此目的，将抗体染色的祖细胞与珠子连接，优选小铁珠，并经由珠子提取所述祖细胞，对于小铁珠优选使用磁体，随后将珠子、以及如果需要时将抗体从祖细胞上去除。例如通过选择珠子这是可能的，所述珠子上已经连接特异性抗体，这些抗体选择性结合祖细胞。为了获得纯细胞，随后将珠子从祖细胞上去除，例如这可以通过酶切割珠子与抗体间的连接。如果珠子和抗体之间的连接是基于DNA，这种切割可以通过使用DNA酶实现，如果珠子和抗体之间的连接是基于氨基酸链，可以使用蛋白酶。
令人惊奇的是，尽管正常情况下祖细胞必须在非常特异性的饲养层上培养，即生长，例如小鼠成纤维细胞饲养层，但是本发明方法中分离的祖细胞，并不需要这样的特异性饲养层，而可以一般地生长在其它饲养层上，例如基于具体实施例范围内公开的饲养层。
更具体地，所述分离方法包括以下步骤(i)将全人乳腺分泌物进行离心，一般地离心后脂肪层在顶层，其下是富含蛋白质和碳水化合物的上清，底层是细胞沉淀；(ii)去除脂肪部分和上清；(iii)加入缓冲液或培养基，缓冲液例如但不限于磷酸盐缓冲液、tris盐缓冲液、TBS和/或PBS，培养基例如但不限于Williams培养基或RPMI培养基，使细胞(不只包含祖细胞)重悬于缓冲液/培养基中，并如前离心，优选重复此过程3或4次，以获得基本上纯的细胞沉淀；(iv)从细胞沉淀中分离祖细胞。
优选地，按以下步骤从细胞沉淀中分离祖细胞(v)细胞沉淀悬浮于培养基中，优选地在含例如胎牛(牛)血清的RPMI培养基中；(vi)该悬液与(磁性)珠子一起孵育，所述珠子优选之前已经与祖细胞特异性抗体(优选干细胞特异性抗体，例如抗小鼠IgG抗体)一起孵育，所述抗体经例如DNA或氨基酸的小链与所述磁珠连接，其中细胞悬液与这些磁珠优选在4℃下共同孵育15分钟；(vii)一旦祖细胞已经与磁珠结合，将磁体附着于含细胞/珠子的管子上，从而将与磁珠结合的祖细胞吸引向磁体，而未结合的细胞不被吸引并保留在上清液中；(viii)去除上清液，只留下经祖细胞抗体与磁珠结合的祖细胞。
必须指出的是，其它类型的珠子或通常的分离手段也能使用，只要允许它们选择性与祖细胞结合。这些珠子必须能与祖细胞分开，为此优选可以使用以下处理步骤(ix)应用适当的切割手段除去经干细胞抗体与珠子结合的祖细胞，如果抗体经小链DNA与珠子结合，优选通过加入DNA酶来切割，(x)再次与磁体结合以除去珠子，使得不再与干细胞结合的珠子吸引向磁体；(xi)取出现在含分离祖细胞的上清液。
基于多能细胞特异性生长的替代性分离方法包括以下步骤(i)第一步，将全人乳腺分泌物进行离心，离心后脂肪层在顶层，其下是富含蛋白质和碳水化合物的上清，底层是细胞沉淀；(ii)任选的第二步，在培养基中洗涤细胞沉淀，优选仅在RPMI培养基中洗涤细胞。
(iii)第三步，将细胞沉淀中的细胞铺板到含生长培养基的细胞培养处理的装置上并进行培养。优选培养10-30天，最优选14-20天。
(iv)收获细胞，即使它们从支持物上脱离，优选用胰酶处理。随后洗涤脱离的细胞，优选用生长培养基溶液进行洗涤。
(v)将收获并洗涤后的细胞铺板到重构的基膜制备物上生长，优选直至汇合。在此最后的步骤中，优选使用从EHS小鼠肉瘤中提取的溶解的基膜制备物，例如，可从BD Biosciences获得的MatrigelTM。
这种方法得到的细胞培养物具有典型的祖细胞形态。这些细胞看上去不像乳细胞，并且由于生长培养基是对祖细胞/干细胞/乳细胞生长允许性的，所以它们不能是细菌细胞。
本发明进一步涉及用上述方法获得的祖细胞，它们优选是多能或专能祖(干)细胞。
另外，本发明涉及这些祖细胞的用途，例如用于离体、体外和/或体内应用。不受本发明范围的限制，这种用途可以扩展到以下具体实例或其组合中创建有利于母体和/或婴儿和/或其它个体的组织或细胞；随后的基因治疗或宫内胎儿治疗；产生用于治疗疾病的细胞、组织、腺体或器官；随后的克隆或科学研究；一或几组的以下目标临床、诊断、生物工程、泌乳工程、乳房组织再生、乳房再造外科、乳房美容或隆乳外科、外分泌腺组织再生和/或外科。
本发明的进一步实施方案概括在从属权利要求中。


在附图中，示出了本发明的优选实施方案图1表示去除脂肪和脱脂乳汁后，人乳中全部的混合细胞群；图2表示从总乳细胞群中分离后的干细胞(sc)。这些细胞已被制成显微细胞涂片，并用苏木精和伊红进行染色。图2a)和2b)显示单个干细胞(sc)。图2c)显示仍与Dynabeads(Db)结合的单个干细胞。Dynabeads(Db)的直径为4.5μM，由此可以大约估计干细胞大小为6-7μM；图3从总乳细胞群中纯化干细胞以后，可以使用多种培养条件培养分离的干细胞；这个图显示放入培养中一天后的单个干细胞；图4培养1-2周后，从总细胞群中分离的干细胞开始进行细胞分裂(有丝分裂)；箭头所指的是正在进行有丝分裂的细胞；图5培养几个月后，这些细胞没有显示已经分化成其它细胞类型；这个图显示培养两个月后的干细胞，细胞已经做成显微细胞涂片并用苏木精和伊红染色；图6培养两个月后，干细胞没有分化；这个图显示培养两个月之后的、用SSEA-4(a)和Tra 1-60(b)抗体分离的干细胞；洗除这些细胞的培养基并做成显微细胞涂片，然后用结合了荧光标记第二抗体(偶联AlexaFluor-488的山羊抗小鼠IgG)的SSEA-4(a)和Tra 1-60(b)抗体在共聚焦显微镜下观察；图7显示培养中干细胞的生长速率；观察到细胞经四天时间分裂并增殖；在四天的培养中，用Dynabeads和SSEA-4抗体分离的细胞已经显示出细胞总数从约50个细胞每平板增加到150个细胞每平板；确定平板的中心区域，使用十字形计数模式计数细胞；在每个培养中取N＝10个区域，简单合计每天的数目；图中显示的是重复进行三次相同试验的数据。
图8表示根据本发明的替代性方法、从哺乳动物分泌物中获得的多能细胞的单层。
具体实施方案为了确定被认为是干细胞的细胞是否确实是干细胞，历史上有必要将感兴趣的细胞移植入经亚致死照射的小鼠内。如果这些移植细胞定殖于这些小鼠的任何器官并在此重新形成群体，这些需要验证的细胞就被确定为多能干细胞。然而，最近通过鉴定多能干细胞的细胞外标记物(例如Tra-1-60和SSEA-4；Chemicon International，Temecula，California，US)就能鉴定多能(干)细胞，而不用进行更长时间的移植过程。
通过重复轻微离心、吸除上清液并将细胞重悬于缓冲液或培养基的过程几次，使所有细胞洗除人乳以后，根据制造商说明用dynabeads从总乳细胞群中分离干细胞(图1)。可以使用Tris盐缓冲溶液(TBS)或者磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为缓冲液。特别地可以使用TBS溶液，其中含10mM Tris、150mM NaOH，并将溶液pH值调至约7.4。对于PBS溶液，其中可以含1.1mM KH2PO4、140mM NaCl、4.5mMNa2HPO4.7H2O和2.7mM NaCl，并可以将溶液pH值调至约7.4。作为培养基可以使用Williams或RPMI(Roswell Park Memorial Institute)，它们可以从Sigma Aldrich，US获得，产品编号为R6504、R7755、R4130或W4125、W4128、W1878。培养基也可以是可从Gibco(CA，US)获得的RPMI，目录号11875-093。
干细胞特异性抗体，例如，Tra-1-60、Tra 1-81和/或SSEA-4，都是单克隆抗体，例如都可以从Chemicon international，CHEMICON International，28820 Single OakDrive，Temecula CA 92590获得，这些抗体与Dynabeads结合，用来分离祖细胞。也可以使用R&D Systems，Inc CA，US的造血干细胞抗体CD133(cat#MAB1133)。
通过使用免疫-磁性细胞分离原理，已经从外周血中分离到原始造血干细胞和祖细胞。使用偶联单克隆抗体的磁性颗粒(CliniMACS System and Reagent AC133from Miltenyi Biotec)，多个研究组已经成功分离并培养了CD133阳性细胞。
任何干细胞特异性抗体(包括SSEA-3、SSEA-1和TRA 1-81Oct-4、CD133)与Dynabeads一起孵育。Dynabeads可以从Dynal AS，NO获得，是一种铁质小珠，经DNA小链使小珠与抗小鼠IgG抗体连接。例如Dynabeads可以以名称DynalCD34获得。Dynabeads先在室温下孵育一小时，然后与从乳汁中分离的细胞在4℃下共同孵育15分钟。
典型地经过约30分钟到1小时，干细胞已经与Dynabeads结合，随后在含有细胞/Dynabeads的管子侧边加上磁体。Dynabeads是均匀的、基于聚苯乙烯的、顺磁性珠子，直径约4.5μM。Dynabeads(以及结合的干细胞)被吸引向磁体，而未结合的细胞不被吸引仍保留在上清液中。然后去除上清液，只留下经干细胞抗体与Dynabeads结合的细胞。通过加入DNA酶断裂DNA小链，移除经干细胞抗体与Dynabeads结合的细胞。这被称为释放缓冲液，它是Dynal试剂盒62500U/ml(说明书指示15000-20000U/管)的一部分。然后，对不再结合干细胞的Dynabeads再次施加磁体，从而去除Dynabeads。现在的上清液中含有被去除的干细胞。这些干细胞就可以用于以上/下列出的任何随后的应用。
这些分离的祖(干)细胞可以在Knockout-Dulbecco’s modified Eagle’s培养基中培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上。通常的培养温度为37℃。
饲养细胞用途的实例■通过与作为饲养细胞的原代小鼠胚胎成纤维细胞共培养，当前实现延长人胚胎干细胞的繁殖。
■通过使用表达sonic hedgehog的饲养细胞加速形成培养的上皮细胞。
■成人骨髓细胞支持人胚胎干细胞培养更长时间的扩张。
■在体外的血管发生模型中，胚胎干细胞增殖和成熟为内皮细胞需要OP9饲养细胞。
■选择性扩张和连续培养来自成年猪血的巨嗜细胞。来自成年猪血的巨嗜细胞直接被选择性扩张并连续培养在覆盖STO小鼠成纤维细胞饲养层之上的培养基中。
■依赖于成纤维细胞的活力，新的人未成熟成巨核细胞白血病细胞系，M-MOK，被建立并表征。从患有急性成巨核细胞白血病的女孩骨髓中建立新的依赖于成纤维细胞的人未成熟成巨核细胞白血病细胞系，已经确定其生长完全依赖于存在人胚胎肺来源的成纤维细胞HEL-O，从而建立这种新型细胞系。
■用已经预先照射过的胎儿G30猪成纤维细胞作为饲养层，体外培养来自猪胚泡的胚盘细胞。
■已经发现在与来自小鼠骨髓的内皮脂肪细胞克隆细胞系(14F1.1)共培养中，婴儿和儿童的急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞优先存活，并在小鼠基质细胞存在下表现大量生长。这些ALL细胞严格依赖于小鼠基质细胞克隆14F1.1，缺乏内皮脂肪细胞时或使用多样的饲养细胞时将不再增殖。
细胞生长用Dynabeads和抗体SSEA-4分离得到的细胞表现出在4天中细胞总数已经从约50个细胞/平板增加到150个细胞/平板(见图7)。
方法细胞准备150ml全乳在2000rpm离心15分钟，收集细胞。细胞沉淀重悬于约4ml TBS 1％BSA中，并再次离心10分钟。最后沉淀重悬于200μl的RPMI 1％ FCS中。
珠子准备在RPMI 1％胎牛血清中洗涤珠子3次。
用浓度为500μl TBS 1％ BSA中1ul的第一抗体包被珠子，并在室温下孵育1小时，并伴随轻度混合。
分离包被珠子，并在1ml TBS 1％ BSA中洗涤3次，然后转移到洁净管中。最后在1ml RPMI 1％ FCS中洗涤。
细胞分离200μl细胞制备物加到珠子中，并在约100℃条件下培养30分钟。
培养后去掉没有结合的组分。
向细胞和珠子复合物中加入200μl RPMI 1％ FCS，随后轻轻吸打进一步释放未结合物质。
向200μl珠子和细胞复合物中加入5μl释放缓冲液，37℃下保温15分钟，并轻轻混合。
剧烈吸打珠子和细胞复合物以帮助释放细胞。
收集200ul分离细胞悬液，并加入洁净的Eppendorf管中。
然后将该细胞悬液立即导入培养系统中。
培养方法细胞被接种到胶原包被的培养板上。
沉降期之后，仔细吸除上清以去除污染物，再加入新鲜培养基。随后培养物在放于37℃、5％ CO2的培养箱中的平板中培养，每两天更换一次培养基。
培养基补充10％胎牛血清的William’s E培养基；10-7M地塞米松(Sigma)；谷氨酰胺2mmol/L ITS+预混合物含胰岛素(6.25μg/ml)、转铁蛋白(6.25μg/ml)、亚硒酸(6.25ng/ml)、牛血清白蛋白(1.25mg/ml)和亚油酸(5.35μg/ml)，从Becton-Dickinson，Bedford，MA获得。青霉素/链霉素5,000μg/ml两性霉素B(250μg/ml)。
抗体可用于本系统的潜在抗体的一些实例是(所有抗体从CHEMICONInternational，28820 Single Oak Drive，Temecula CA 92590获得)SSEA-1(目录号MAB4301)SSEA-3(MAB4303)SSEA-4(MAB4304)TRA 1-60(MAB4360)TRA 1-81(MAB4381)造血细胞抗体CD133(目录号#MAB1133)，从R&D Systems，Inc获得。
缓冲液TBS 1％ BSA，10mM Tris，150mM NaOH
RPMI 1％ FCSPBS 1.1mM KH2PO4，140mM NaCl，4.5mM Na2HPO4.7H2O从人乳中纯化干细胞以后，使用与Dynabeads结合的干细胞的细胞外标记物(Tra-1-60和SSEA-4)，我们将干细胞涂片到显微镜载玻片上，用苏木精和伊红进行染色(图2)。使用这些相同纯化的干细胞，我们已经能够培养这些细胞(图3)，并证明这些细胞确实发生了细胞分裂(图4)。更长时间培养以后，我们已经能用苏木精和伊红对其进行染色(图5)，并且已经证明这些细胞仍保持干细胞，因为由共聚焦显微镜观察，在培养几个月以后它们继续结合干细胞抗体(Tra-1-60和SSEA-4)(图6)。分离细胞的生长也被验证，见图7。
分离/生长多能细胞的替代方式是使用特定组合的生长培养基，由此可以生长多能细胞的单层，这些细胞看起来明确不像乳细胞(见图8)。事实上，培养物中生长的这些细胞与例如肝干细胞培养物物理等同。可以它们表达的细胞标记物及其基因活性对这些细胞进一步分类。
这种分离或选择性生长的替代方式可以如下实施准备包被MartrigelTM的平板Martrigel(重构基膜商品，BD MartrigelTM，BD Biosciences ref-354234)在冰上缓慢解冻。使用前吸液头和培养板于冰上冷却和保持。等分50μl解冻的Martrigel，并用吸液头铺展到24孔平底微板的每个孔中，在冰上保持30分钟。随后，微板在37℃下保温30分钟以使之形成凝胶。凝胶以后将1ml生长培养基等分入每个孔中，将板子放回培养箱中待用(不超过5天)。
细胞的生长和准备离心新鲜表达的后乳(约50ml，后乳是具有高脂肪含量和奶油色的人乳；它提供婴儿所需要卡路里的大部分并且是增加体重的最主要原因)，以沉淀细胞(细节见上文)。
细胞沉淀在RPMI培养基(RPMI Medium 1640，GIBCO ref-108-36)中仅洗涤两次。
随后将细胞铺板到盛有生长培养基(细胞生长培养基组成RPMI 1640；胎牛血清20％；胰岛素5ug/ml；霍乱毒素50ng/ml；氢化可的松0.5ug/ml；青霉素链霉素两性霉素B2×)的细胞培养处理的塑料培养皿中，并培养约14-20天。
培养期结束后，在平板中显示出大的集落并接近汇合，选择这样的集落，并经胰酶处理收获细胞(胰酶-EDTA 1×，JRH Bioscience ref＝59218)。
收集的细胞用生长培养基洗涤一次，并铺板到包被MartrigelTM的平板上，细胞密度约为1500细胞/ml。
约14天后可以观察到汇合的细胞斑块。
说明细胞具有典型的上皮细胞形态，汇合的细胞片生长并且集落内的细胞紧密结合。以此方式培养的来源于乳汁的细胞将在原代培养中增殖并形成具有明确边界的大量圆形集落，这强烈指示这些细胞具有祖细胞样性质。细胞看起来未分化并且可以观察到很多细胞具有大的核质比，这是祖细胞样特征的进一步证据。
使用的具体材料霍乱毒素(LIST BIOLOGICAL LABORATORIES ref-101B)胎牛血清(Invitrogen ref-10099141)氢化可的松(Sigma ref-HO135)胰岛素(Sigma ref-19278)青霉素/链霉素 两性霉素B(Scott Scientific ref-17.745E)微板(IWAKI ref-3820-024)细胞培养皿(Corning ref-430165)因为多能干细胞的可塑性，这些分离细胞可以应用于广泛的不同领域。例如这些细胞可以应用于
■创建有益于母亲和婴儿(和潜在的其他个体)的组织，包括基因治疗、子宫内胎儿治疗，和产生用于治疗疾病的细胞、组织、腺体、或器官。这包括它们在科学研究、临床、诊断或商业应用的用途。这还可以包括产生生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子和细胞因子。进一步说，这可以包括产生作为前体细胞的细胞，或因此产生组织、腺体或器官，用于治疗疾病、组织再生、身体整形(body enhancement)、或者美容应用，可以是以下组织；嗅觉、听觉、视觉、淋巴、免疫、造血、内分泌、外分泌、肠(Bowel)、胃肠(Gastrointestinal)、派伊尔结(Peyers Patches)、胰岛、骨骼、肌肉、结缔、血管、血液、皮肤、毛发、甲、乳腺、脑和中枢神经系统、肝、心、肺、肾、骨、胰腺、生殖组织。
■保存为将来使用。这些干细胞、或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后的应用可以包括保存这些干细胞用于以下概括的将来使用。这包括保存它们用于科学研究、临床、诊断或商业应用。
■细胞培养，无论这是用于繁殖这些相同的干细胞、或用于将这些干细胞分化或脱分化为另一种细胞类型。这包括保存它们用于科学研究、临床、诊断或商业应用。
■克隆。这些干细胞、或分化或脱分化的细胞的随后的应用可以是用于产生克隆，无论是动物胚胎或动物个体。这包括保存它们用于科学研究、临床、诊断或商业应用。
■科学研究。这些干细胞、或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后的应用可以是用于研究。这可以包括产生生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、和细胞因子。另外，这可以包括产生作为前体细胞的细胞，或因此产生组织、腺体或器官，用于治疗疾病、组织再生、身体整形、或者美容应用，可以是以下组织；嗅觉、听觉、视觉、淋巴、免疫、造血、内分泌、外分泌、肠、胃肠、派伊尔结、胰岛、骨骼、肌肉、结缔、血管、血液、皮肤、毛发、甲、乳腺、脑和中枢神经系统、肝、心、肺、肾、骨、胰腺、生殖组织。
■临床、诊断或商业应用。这些干细胞、或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后的应用可以是用于临床、诊断或商业应用。这可以包括产生生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、和细胞因子。另外，这可以包括产生作为前体细胞的细胞，或因此产生组织、腺体或器官，用于治疗疾病、组织再生、身体整形、或者美容应用，可以是以下组织；嗅觉、听觉、视觉、淋巴、免疫、造血、内分泌、外分泌、肠、胃肠、派伊尔结、胰岛、骨骼、肌肉、结缔、血管、血液、皮肤、毛发、甲、乳腺、脑和中枢神经系统、肝、心、肺、肾、骨、胰腺、生殖组织。
■生物工程。这些干细胞、或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后的应用可以被用于产生人体中任何其它细胞类型。这些细胞、组织、或器官然后可以用于美容/整形外科、器官/组织移植或产生用于第三方的细胞/组织/器官。这可以包括产生生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、和细胞因子。另外，这可以包括产生作为前体细胞的细胞，或因此产生组织、腺体或器官，用于治疗疾病、组织再生、身体整形、或者美容应用，可以是以下组织；嗅觉、听觉、视觉、淋巴、免疫、造血、内分泌、外分泌、肠、胃肠、派伊尔结、胰岛、骨骼、肌肉、结缔、血管、血液、皮肤、毛发、甲、乳腺、脑和中枢神经系统、肝、心、肺、肾、骨、胰腺、生殖组织。
■泌乳工程。这些干细胞，或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后应用可以被用于产生乳汁的生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、和细胞因子。
■乳腺组织再生。这些干细胞、或从这些干细胞分化或脱分化的细胞的随后的应用可以用于产生乳腺组织。
■乳腺整形外科。上述这种再生组织然后能用于乳腺整形外科。
■乳腺美容外科。上述这种再生组织然后能用于乳腺美容外科。
■外分泌腺组织再生和/或外科。这些干细胞，或从这些干细胞分化或脱分化的细胞可以被用来产生外分泌腺组织，随后可以被用来再生或移植外分泌腺。
■生产生物化合物，包括细胞、细胞区室、细胞分泌物、细胞分离物、核苷酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、和细胞因子。
权利要求
1.从人体中分离祖细胞的方法，包括所有具有干细胞样特征的细胞，其中这些细胞直接或间接来源于人乳腺分泌物，它可以是男性或女性的初乳、成熟乳、或干燥期分泌物，所述人体处于至少一个下列的期中非怀孕期、怀孕期、泌乳期、恢复期。
2.根据权利要求1的方法，其中所述祖细胞是多能或专能的。
3.根据权利要求1的方法，其中所述祖细胞从乳腺分泌物中分离，其中所述乳腺分泌物的非细胞部分与细胞部分分离开。
4.根据权利要求3的方法，其中从细胞部分去除非多能或非专能细胞。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中从所述乳腺分泌物中去除分泌型上皮细胞、白细胞、特别是非人类细胞如细菌细胞。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中使用泌乳期的乳腺分泌物来分离祖细胞，并且其中所述乳腺分泌物来自乳腺分泌的特定阶段，如开始个体哺乳后；相对的结束个体哺乳时；泌乳期；优选泌乳早期。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中使用磁珠分离所述祖细胞。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中第一步，从乳腺分泌物中洗出细胞组分；第二步，用祖细胞标记物抗体染色所述细胞组分；第三步，通过结合抗体直接或间接地将祖细胞与其他细胞分开。
9.根据权利要求8的方法，其中将抗体染色的祖细胞与珠子连接，优选小铁珠，并经由珠子提取所述祖细胞，对于小铁珠优选使用磁体，随后将珠子、以及如果需要时将抗体从祖细胞上去除。
10.根据权利要求9的方法，其中经酶的方式实现去除珠子，所述酶选自DNA酶、蛋白酶、RNA酶。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中祖细胞的培养不使用成纤维细胞饲养层，尤其是不使用小鼠成纤维细胞饲养层。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中(i)第一步，将全人乳腺分泌物进行离心，离心后脂肪层在顶层，其下是富含蛋白质和碳水化合物的上清，底层是细胞沉淀；(ii)第二步，去除脂肪部分和上清；(iii)第三步，加入缓冲液或培养基，缓冲液例如但不限于磷酸盐缓冲液、tris盐缓冲液、TBS和/或PBS，培养基例如但不限于Williams培养基或RPMI培养基，使细胞重悬于缓冲液/培养基中，并如前离心，优选重复此过程3或4次，以获得基本上纯的细胞沉淀；(iv)和第四步，从细胞沉淀中分离祖细胞。
13.根据前述任一项权利要求的方法，其中从人乳腺分泌物中得到细胞沉淀，然后使用下列分离步骤(v)细胞沉淀悬浮于培养基中，优选地在含例如胎牛(牛)血清的RPMI培养基中；(vi)该悬液与磁珠一起孵育，所述磁珠之前已经与祖细胞、优选干细胞特异性抗体如抗小鼠IgG抗体一起孵育，所述抗体经DNA小链与所述磁珠连接，其中细胞悬液优选在4℃下孵育15分钟；(vii)一旦祖细胞已经与磁珠结合，将磁体附着于含细胞/珠子的管子上，从而将与磁珠连接的祖细胞吸引向磁体，而未结合的细胞不被吸引并保留在上清液中；(viii)去除上清液，只留下经祖细胞抗体与珠子结合的祖细胞。
14.根据权利要求13的方法，其中随后使用以下步骤(ix)应用适当的切割手段除去经干细胞抗体与珠子结合的祖细胞，如果抗体经小链DNA与珠子结合，优选通过加入DNA酶来切割，(x)再次与磁体结合以除去珠子，使得不再与干细胞结合的珠子吸引向磁体；(xi)取出现在含分离祖细胞的上清液。
15.根据权利要求1-12任一项的方法，其中通过离心随后在生长培养基中培养从人乳腺分泌物中分离细胞，所述生长培养基允许祖细胞/干细胞/乳细胞生长。
16.根据权利要求15的方法，其中(i)第一步，将全人乳腺分泌物进行离心，离心后脂肪层在顶层，其下是富含蛋白质和碳水化合物的上清，底层是细胞沉淀；(ii)第二步，在培养基中洗涤细胞沉淀，优选仅在RPMI培养基中(iii)第三步，将细胞沉淀中的细胞铺板到含细菌和/或真菌生长培养基的细胞培养处理的装置上并进行培养，优选培养10-30天，最优选14-20天。(iv)收获细胞，优选经胰酶处理，和洗涤细胞，优选用生长培养基(v)将收获的细胞铺板到重构的基膜制备物上生长，优选直至汇合。
17.根据权利要求16的方法，其中在步骤(v)中使用从EHS小鼠肉瘤中提取的溶解的基膜制备物，例如MatrigelTM。
18.祖细胞，优选多能或专能祖细胞，使用根据前述权利要求1-17任一项的方法获得。
19.使用根据权利要求1-17任一项的方法得到的多能或专能祖细胞的用途，用于离体、体外和/或体内应用。
20.根据权利要求19的用途，用于创建有益于母体和/或婴儿和/或其他个体的组织或细胞。
21.根据权利要求17或20的用途，包括随后的基因治疗处理或子宫内胎儿治疗。
22.根据权利要求19-21的用途，用于产生用于治疗疾病的细胞、组织、腺体或器官。
23.根据权利要求19-23任一项的用途，用于随后的克隆或科学研究。
24.根据权利要求19-23任一项的用途，用于以下的一个或几个目标临床、诊断、生物工程、泌乳工程、乳腺组织再生、乳腺整形外科、乳腺美容或者隆乳外科、外分泌腺组织再生和/或外科。
全文摘要
本发明涉及一种从人体分离祖细胞的方法，其中包括所有具有干细胞样特征的细胞，特别是包括多能(pluropotent)或专能(multipotent)祖细胞，其中这些细胞是直接或者间接地来源于人乳腺分泌物，它可以是男性或女性的初乳、成熟乳、或干燥期(dry period)的分泌物，所述人体处于至少一个下列的期中非怀孕期、怀孕期、泌乳期、恢复期。本发明进一步涉及这些分离细胞的优选用途。
文档编号A61K35/12GK1898380SQ200480038840
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月15日 优先权日2003年12月23日
发明者马克·德里克·克雷甘, 彼得·埃德温·哈特曼 申请人:卡拉格股份公司