细胞因子拮抗剂分子的制作方法

专利名称：细胞因子拮抗剂分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的蛋白质(称之INSP052和INSP055)，经本发明鉴定为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，以及涉及这些蛋白质和编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用，例如用于诊断、预防和治疗炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病或肝脏衰竭。
本文所引用的出版物、专利和专利申请，均纳入其全文作为参考。
背景技术：
目前，药物发现方法正蕴酿着一场根本革命，因为功能基因组学年代已经来临。术语“功能基因组学”应用于使用生物信息学工具将功能归因于感兴趣的蛋白质序列的方法。这些工具正日益显示其必要性，因为序列数据产生的速度远远高于研究实验室将功能划分给这些蛋白质序列的能力。
随着生物信息学工具的功效和准确性提高，这些工具正快速取代生物化学特性鉴定的常规技术。事实上，鉴定本发明所用的先进生物信息学工具现在能够输出可获得较高置信度的结果。
各所研究院和商业机构正在检查已有的序列数据，并且逐渐获得重大发现。然而，仍然有必要鉴定和特性分析其它基因和它们编码的多肽，作为研究和药物发现的目标。
本发明的申请人最近研制了一个卓越工具，用于评价未知功能的序列。此工具是一个数据库系统(命名为Biopendium搜索数据库)，它是WO01/69507的主题。该数据库系统由利用专有技术(proprietary technology)建立的综合数据资源组成，含有对全部已有蛋白质或核酸序列所作的逐一对比而获得的信息。
将不同数据资源的这些序列数据综合的目的在于把涉及序列本身和每一序列相关信息的尽可能多的数据集合成一个综合资源。将涉及每一序列的所有已有数据(若有的话，包括编码蛋白质的三维结构数据)综合在一起，以便更好地利用各个序列的已知信息，从而通过对这些序列作对比获得最佳的预测结果。从数据库就每个序列输入项目产生的诠释可了解该序列信息的生物相关内容。
该数据资源使得仅从序列即可准确预测蛋白质功能成为可能。若使用常规技术，只能针对与同一功能家族的其它蛋白质有高度序列同一性(约20-30％同一性以上)的蛋白质。而准确预测与未知功能的其它相关蛋白质有低程度序列同源性的蛋白质是不可能的。
含有信号肽的蛋白质细胞制造和分泌胞外蛋白质的能力是许多生物过程的关键。酶、生长因子、胞外基质蛋白和信号传导分子全部由细胞分泌出来。这是分泌小泡与质膜融合所致。多数情况下，但不是所有情况，蛋白质被信号肽导入内质网，并进入分泌小泡。信号肽是顺式作用序列，影响多肽链从细胞质转运至膜结合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌进入胞外基质，或者留在质膜内。留在质膜内的多肽有一或多个跨膜结构域。在细胞机能中发挥中心作用的并含有信号肽的蛋白质的例子是细胞因子、激素、胞外基质蛋白、粘附分子、受体、蛋白酶及生长和分化因子。
含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子已经显示，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子在多种生理功能中起作用，其中很多能在疾病过程中扮演角色。改变它们的活性是改变疾病表型的一个工具，因此鉴定新颖的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子与之密切相关，因为它们可能在许多疾病中起作用，尤其是炎症疾病、肿瘤、和心血管疾病。含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子参与广泛的生物过程，包括胚胎形成(Martin-Bermudo，M.D.等，Development.2000127(12)2607-15；Chen，L.M.，等，J Neurosci.2000 20(10)3776-84；Zweegman，S.，等，Exp Hematol.2000 28(4)401-10；Darribere，T.，等，Biol Cell.2000 92(1)5-25)，维持组织完整性(Eckes，B.，等，J Cell Sci.2000113(Pt 13)2455-2462；Buckwalter，J.A.，等，Instr Course Lect.2000 49481-9；Frenette，P.S.，等，.J Exp Med.2000 191(8)1413-22；Delmas，V.，等，Dev Biol.1999 216(2)491-506；Humphries，M.J.，等，Trends PharmacolSci.2000 21(1)29-32；Miosge，N.，等，Lab Invest.1999 79(12)1591-9；Nagaoka T，等Am J Pathol 2000 Jul 1571237-47；Nwariaku FE，等J Trauma1995 39(2)285-8；Zhu X，等Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi1999 15(1)53-5)，白细胞外渗/发炎(Lim，L.H.，等Am J Respir Cell Mol Biol.2000 22(6)693-701；Johnston，B.，等，Microcirculation.2000 7(2)109-18；Mertens，A.V.，等，Clin Exp Allergy.1993 23(10)868-73；Chcialowski，A.，等，Pol Merkuriusz Le k.2000 7(43)13-7；Rojas，A.I.，等，Crit Rev Oral Biol Med.1999 10(3)337-58；Marinova-Mutafchieva，L.，等，Arthritis Rheum.2000 43(3)638-44；Vijayan，K.V.，等，J Clin Invest.2000 105(6)793-802；Currie，A.J.，等，.J Immunol.2000 164(7)3878-86；Rowin，M.E.，等，Inflammation.2000 24(2)157-73；Johnston，B.，等，JImmunol.2000 164(6)3337-44；Gerst，J.L.，等，J Neurosci Res.2000 59(5)680-4；Kagawa，T.F.，等，Proc Natl Acad Sci U S A.2000 97(5)2235-40；Hillan，K.J.，等，Liver.1999 19(6)509-18；Panes，J.，1999 22(10)514-24；Arao，T.，等，J Clin Endocrinol Metab.2000 85(1)382-9；Souza，H.S.，等，Gut.1999 45(6)856-63；Grunstein，M.M.，等，Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol.2000 278(6)L1154-63；Mertens，A.V.，等，Clin ExpAllergy.1993 23(10)868-73；Berends，C.，等，Clin Exp Allergy.199323(11)926-33；Fernvik，E.，等，Inflammation.2000 24(1)73-87；Bocchino，V.，等，J Allergy Clin Immunol.2000 105(1Pt 1)65-70；JonesSC，等，Gut 1995 36(5)724-30；Liu CM，等，Ann Allergy Asthma Immunol1998 81(2)176-80；McMurray RW Semin Arthritis Rheum 1996 25(4)215-33；Takahashi H，等Eur J Immunol 1992 22(11)2879-85；Carlos T，等JHeart Lung Transplant 1992 11(6)1103-8；Fabrega E，等，Transplantation2000 69(4)569-73；Zohrens G，等，Hepatology 1993 18(4)798-802；Montefort S，等Am J Respir Crit Care Med 1994 149(5)1149-52)，肿瘤生成(Orr，F.W.，等，Cancer.2000 88(S12)2912-2918；Zeller，W.，等，JHematother Stem Cell Res.1999 8(5)539-46；Okada，T.，等，Clin ExpMetastasis.1999 17(7)623-9；Mateo，V.，等，Nat Med.1999 5(11)1277-84；Yamaguchi，K.，等，J Exp Clin Cancer Res.2000 19(1)113-20；Maeshima，Y.，等，J Biol Chem.2000 275(28)21340-8；Van Waes，C.，等，Int J Oncol.2000 16(6)1189-95；Damiano，J.S.，等，Leuk Lymphoma.2000 38(1-2)71-81；Seftor，R.E.，等，Cancer Metastasis Rev.1999 18(3)359-75；Shaw，L.M.，J Mammary Gland Biol Neoplasia.1999 4(4)367-76；Weyant，M.J.，等，Clin Cancer Res.2000 6(3)949-56)，血管生成(KochAE，等Nature 1995 376(6540)517-9；Wagener C & Ergun S.Exp Cell Res2000 261(1)19-24；Ergun S，等Mol Cell 2000 5(2)311-20)，骨再吸收(Hartman GD，& Duggan ME.Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6)1281-91；Tanaka Y，等J Bone Miner Res 1995 10(10)1462-9；Lark MW，等JPharmacol Exp Ther 1999 291(2)612-7；Raynal C，等Endocrinology 1996137(6)2347-54；Ilvesaro JM，等Exp Cell Res 1998 242(1)75-83)，神经功能异常(Ossege LM，等Int Immunopharmacol 2001 11085-100；Bitsch A，等，Stroke 1998 292129-35；Iadecola C & Alexander M.Curr Opin Neurol2001 1489-94；Becker K，等Stroke 2001 32(1)206-11；Relton JK，等Stroke 2001 32(1)199-205；Hamada Y，等J Neurochem 1996 661525-31)，血栓形成(Wang，Y.G.，等，J Physiol(Lond).2000 526(Pt 1)57-68；Matsuno，H.，等，Nippon Yakurigaku Zasshi.2000 115(3)143-50；Eliceiri，B.P.，等，Cancer J Sci Am.2000 6(Suppl 3)S245-9；von Beckerath，N.，等，Blood.2000 95(11)3297-301；Topol，E.J.，等，Am Heart J.2000139(6)927-33；Kroll，H.，等，Thromb Haemost.2000 83(3)392-6)，以及细菌病原体侵入/粘附在宿主细胞上(Dersch P，等EMBO J 1999 18(5)1199-1213)。
对一些含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族的结构和功能进行详细特征鉴定，已使得很多医药公司积极开展计划以研制用于治疗包括炎症、肿瘤、神经病、免疫和心血管功能等疾病的调节剂。事实上，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子参与生物学上的每一方面，从胚胎生成至细胞凋亡。它们对大部分组织的结构完整性和自身稳定功能是必不可少的。因此，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子存在缺陷能致病，并且许多疾病涉及对含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的功能进行调节，此种现象是不奇怪的。该家族成员列于表1中。
含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族实际上含有多个不同家族。在这些家族中，有些因为具备小分子牵引性(tractability)而有特定的药学价值。它们包括1.免疫球蛋白粘附分子代表整联蛋白反受体，包括胞内粘附分子(ICAM)和血管细胞粘附分子(VCAM)。成员由球状结构域、免疫球蛋白样结构域、胞外结构域等多个成员组成。该家族的某些成员，例如PECAM-1(CD31)和NCAM，介导同质粘附。而该家族的另一些成员，例如ICAM-1和VCAM-1，通过与整联蛋白相互作用来介导粘附。
2.细胞表面生长因子受体。生长因子位于细胞外，它们与靶细胞质膜上的具有特异性高亲和力的受体相互作用而发挥生物作用。各种不同生长因子受体的分子特性揭示它们属于定义的家族酪氨酸激酶受体、G-蛋白相关的七个跨膜受体、以及丝氨酸/苏氨酸激酶受体。酪氨酸激酶受体的特征为一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞内结构域，它们均具有酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶生长因子受体的例子是VEGFR、PDGFR、FGFR、CSF-1R和c-KIT，它们的细胞外还含有免疫球蛋白结构域。对生长因子功能作Dys-调节，产生许多不同疾病的表型，包括但不限于肿瘤(Bartucci M等，(2001)Cancer Res.Sep 15；61(18)6747-54，Dias S等，(2001)Proc NatlAcad Sci U S A.Sep 11；98(19)10857-62，Djavan B等，(2001)World JUrol.19(4)225-33)，炎症(Fiocchi C.(2001)J Clin Invest.Aug；108(4)523-6，Hodge S等，(2001)Respirology.Sep；6(3)205-211，Fenwick SA等，(2001)J Anat.Sep；199(Pt 3)231-40)，神经(Cooper JD等，(2001)Proc NatlAcad Sci U S A 98(18)10439-44，Fahnestock M等，(2001)Mol CellNeurosci 18(2)210-20)，以及新陈代谢(Vickers MH等，(2001)Endocrinology.142(9)3964-73)。
表1含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子

因此，业已证明，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子在多种生理功能中起作用，它们当中很多能在疾病过程中扮演角色。改变它们的活性是改变疾病表型的一个工具，因此鉴定新颖的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子与之密切相关，因为它们可能在许多疾病中起作用，尤其是免疫疾病、炎症疾病、肿瘤、心血管疾病、中枢神经系统疾病和感染。

发明内容
本发明基于如下发现INSP052和INSP055蛋白质起着含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的功能，特别是起着细胞因子拮抗剂的功能。含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的例子列于表1中。
本发明第一方面的一实施例提供一种多肽，该多肽(i)包括或由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ IDNO26所示的氨基酸序列组成；(ii)是其片段，该片段具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
“(i)的多肽的活性”指的是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性。而含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性指的是包含能被鉴定为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族内保守性特征的氨基酸序列或结构特征的多肽。
所述定义包括细胞因子拮抗剂活性。“细胞因子拮抗剂”指的是多肽、片断或功能等同物抑制至少一种细胞因子的活性。较佳地，本发明的细胞因子拮抗剂可以通过抑制细胞因子表达和/或分泌来抑制细胞因子的活性。以其它机制抑制细胞因子表达(例如与细胞因子或细胞因子受体结合)的细胞因子拮抗剂包括在本发明范围之内。较佳地，本发明的细胞因子拮抗剂能够抑制一种以上细胞因子的活性。
较佳地，本发明的细胞因子拮抗剂具有免疫调节活性。“免疫调节活性”指的是在体内或体外检测到的影响免疫反应的任何活性。免疫调节活性的例子包括免疫抑制活性、抗炎活性、促细胞凋亡活性、抗细胞凋亡活性以及抗肿瘤活性。
可由本发明的细胞因子拮抗剂抑制的细胞因子包括TGF-α、EGF、细胞因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-13、G-CSF、GM-CSF、CNTF、OSM、EPO、IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和M-CSF)的四α-螺旋束家族成员、细胞因子(如NGF、TGF-β、PDGF和VEGF)的半胱氨酸结家族成员、趋化因子(如IL-8、MIP-1-α、MIP-1-β、MIP-2、PF-4、PBP、1-309/TCA-3、MCP-1、MCP-2、MCP3和IP-10)、细胞因子(如TNF-α、TNF-β和LT-β)的TNF家族成员、以及细胞因子(包括FGF-α、FGF-β、IL-1-α、IL-1-β和IL-1ra)的β-三叶家族成员。本发明的优选细胞因子拮抗剂抑制TNF-α、IL-4和/或IL-2的活性。
细胞因子形成一个由分子量较低的分泌肽组成的异源家族，起着调节针对各类刺激物的细胞反应的调节剂，特别用作涉及炎症和免疫反应的调节剂，但也可用作涉及细胞扩增、修复、细胞-细胞相互反应以及分化的调节剂。
细胞因子主要表现为非酶类糖蛋白，过去基于序列同源性、结构组件、表达细胞和/或结合活性等标准被分为几类。这些序列家族的例子是白介素、淋巴因子、单核因子、干扰素，但近年已对许多其它序列作特性分析，认为它们具有细胞因子活性(例如，某些生长因子或趋化因子)，因此难以进行全面分类(Haddad JJ，2002，Biochem Biophys Res Commun，297700-13)。
细胞因子主要由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生，但也可由其它类型细胞(如白细胞、造骨细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、神经元细胞、内皮细胞或成纤维细胞)产生，不过，它们并非以组成型方式正常地产生。一般地，免疫细胞为应答攻击物质(例如细菌、病毒或其它致病原)而分泌产生细胞因子，所述攻击物质可以刺激它们的重新表达以及从细胞分泌出来，结果是或者改变它们的自身功能(自分泌/内分泌效应)或者改变附近细胞和局部小环境的功能(旁分泌/并列分泌效应)。
细胞因子通过触发各种细胞信号传导途径的受体作用于目标细胞(Ishihara K and Hirano T，2002，Biochim Biophys Acta，1592281-296)。一般地，细胞因子的作用通常具有多效性(一种细胞因子可触发多种生理作用)、重复性(不同细胞因子可负责一种近似的生理作用)、以及可以影响各种各样和重叠的目标细胞群。
通过以下事实可以观察细胞因子的生理作用要应答一种可导致细胞迁移和聚集的炎症反应，细胞因子可以协同方式诱导(或抑制)许多蛋白质的产生，包括其它细胞因子和/或细胞因子受体的产生。所以，许多生理反应(在生理和病理条件下)是细胞因子之间协同或拮抗相互作用的相互连接重复网络的结果。
对细胞因子及其受体的克隆和生理进行分析，大致上认识到它们基因多效性和重复性背后的分子基础。通常将这种性质归因于细胞因子受体复合物的组成，所述复合物包括一个被细胞因子家族全部成员使用的信号转导受体亚基以及一个每个细胞因子特有的结合亚基。所以，由细胞因子诱导的信号级联代表一种机理，对于特定细胞或组织具有最后结果，由细胞表面上同时收到的很多不同信息确定。
至今尚未能完全理解细胞因子网络机能的细节，但已经很清楚的是，细胞因子是众多疾病发病机理的重要介导剂，参与发病机理中，直接或间接地涉及先天和后天免疫反应。具体地说，细胞因子的主要病理-生理作用来自于它们过度或者不适当地局部产生，诱导炎症状态，从而不利于病人状态。所以，一般认为，有效地抑制一或多种细胞因子特别是促炎细胞因子的任何机理对治疗人的疾病都产生正面作用，方法是控制与特定细胞因子的不适当产生或延长产生有关的细胞事件的不良级联。
就这一点而言，关于产生和/或给予细胞因子拮抗剂以阻断它们的促炎活性的技术，现有文献已经公开了大量的策略和化合物。这些技术的非完整清单包括人细胞因子受体的可溶性变体、细胞因子特异性抗体、病毒性蛋白结合细胞因子、抑制细胞因子产生的小分子。这些免疫调节分子可针对低效或不当引导的免疫反应。然而，可供用于治疗人疾病的细胞因子拮抗剂是相当少的。药物发现计划仍未深入地研究潜在的替换化合物，它们通过调节胞外或胞内信号传导途径而用于细胞介导的炎症过程的药理干预中(StevcevaL，2002，Curr Med Chem.，92201-7；Inagaki-Ohara K等，2003，CurrOpin Pharmacol.，3435-42)。
以下实施例部分将提出证据，证明INSP052(本文也称为INSP052EC)的胞外结构域在伴刀豆球蛋白(ConA)刺激的人外周血单核细胞(hPBMC)试验中以及在使用CD4+T细胞的类似试验中能够使TNF-α、IL-4和IL-2的体外分泌下调。另外，还发现，在一个暴发型肝炎体内模型中导入INSP052ECcDNA，可以降低血清中的TNF-α和m-IL-6水平，对减少血清转氨酶有明显的作用。皮下注射INSP052EC蛋白质也证实了这种影响。
天冬氨酸氨基转氨酶(ASAT)和丙氨酸氨基转氨酶(ALAT)水平的大幅降低可能是由于TNF-α和IL-4水平降低所致。TNF-α和IL-4是重要的细胞因子，在注射ConA后参与诱导肝脏损坏。在肝炎小鼠模型中，TNF-α主要由肝巨噬细胞(也叫Kupfer细胞)产生，而IL-4由肝(天然杀伤T)NKT细胞产生。已经发现，抗TNF-α抗体能保护免于致病(Seino等，2001，Annals ofsurgery 234，681)，抑制NKT细胞产生IL-4也被证实在T细胞介导的小鼠肝炎中保护肝脏(Ajuebor等，2003J.Immunology 170，5252-9)。
此外，在LPS诱导释放细胞因子的小鼠模型中，已经证明了INSP052EC具有使LPS诱导的TNF-α或IL-6的释放下调的能力。
另外，将INSP052EC用在半抗原诱导的接触超敏性(CHS，一种皮肤炎症小鼠模型)中进行测试。我们注意到，INSP052EC以剂量依赖方式明显地减轻耳朵肿胀，提示白细胞浸润减少，随后发生炎症的机会也减少，所以证明了INSP052EC能够用来治疗T细胞介导的皮肤炎症，如过敏性接触皮炎和牛皮癣。
本文清楚地表明，INSP052(INSP052EC)的分离的胞外结构域(同样地，含有这种蛋白质序列或全长蛋白质的变体或融合蛋白)可用来调节细胞因子活性，特别是用作细胞因子分泌和/或表达的拮抗剂，可以在与先天或后天免疫反应有直接或间接关系的疾病中发挥治疗作用。由INSP052胞外结构域获得的这些结果，让我们推断出INSP052多肽的其它变体以及全长多肽序列也可能与上述提到的物质具有相同功能。所以，在治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病以及酒精性肝脏衰竭时可以考虑采用INSP052、INSP052EC(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)以及相关的功能等同蛋白质。它们治疗其它炎症疾病也可能有效的。
由被测试的INSP052EC基分子在采用不同细胞的试验和动物模型中所显示的抑制活性的范围确定，使用此类分子可以阻断细胞因子由于过度或不适当地局部产生而引致的病理-生理作用。通过INSP052EC基分子可以控制与促炎细胞因子延长产生相关的细胞事件，所以这些分子可用来拮抗异常的炎症状态，尤其是累及各种组织和器官(例如肝脏、皮肤、肺、中枢神经系统)的自身免疫疾病和炎症疾病相关的异常状态，并且为肿瘤、神经系统障碍、心血管疾病和传染性疾病提供了一个全新治疗机会。采用细胞因子试验，其中抽取自感染了其它疾病的病人的样品显示细胞因子过度表达和/或分泌，也可以鉴定INSP052EC基分子的其它临床应用(Wong CK和LamCW，Adv Clin Chem.2003，371-46；Whiteside TL，Biotechniques，2002，Oct.Suppl4-8，10，12-5)，由此验证了INSP052EC基分子作为细胞因子拮抗剂的治疗用途。
下文将具有SEQ ID NO2所示的序列的多肽称为“INSP052外显子1多肽”。将具有SEQ ID NO4所示的序列的多肽称为“INSP052外显子2多肽”。将具有SEQ ID NO6所示的序列的多肽称为“INSP052外显子3多肽”。将具有SEQ ID NO8所示的序列的多肽称为“INSP052外显子4多肽”。将具有SEQ ID NO10所示的序列的多肽称为“INSP052外显子5多肽”。将具有SEQ ID NO12所示的序列的多肽称为“INSP052外显子6多肽”。将具有SEQ ID NO14所示的序列的多肽称为“INSP052外显子7多肽”。将SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14组合得到SEQ ID NO16所示的序列。将具有SEQ ID NO16所示的序列的多肽称为“INSP052多肽”。具有SEQ ID NO20所示的序列的多肽是INSP052的胞外结构域。下文将具有SEQ ID NO22所示的序列的多肽称为“成熟INSP052多肽的胞外结构域”。下文将具有SEQ ID NO24所示的序列的多肽称为“成熟INSP052外显子2多肽”。下文将具有SEQ ID NO26所示的序列的多肽称为“成熟INSP052多肽”。下文将具有SEQ ID NO29所示的序列的多肽称为“带有组氨酸标签的成熟INSP052胞外结构域”。下文将具有SEQ ID NO30所示的序列的多肽称为“成熟INSP052胞外结构域的Fc融合子”。下文将具有SEQ ID NO31所示的序列的多肽称为“含有Ig结构域的INSP052片段(INSP052Ig2)”。
本文所用的术语“INSP052外显子多肽”包括如下的多肽包括或由此处所列的多肽序列组成，包括INSP052外显子1多肽、INSP052外显子2多肽、INSP052外显子3多肽、INSP052外显子4多肽、INSP052外显子5多肽、INSP052外显子6多肽、INSP052外显子7多肽、INSP052多肽、INSP052的胞外结构域、成熟INSP052的胞外结构域、INSP052成熟外显子2多肽、成熟INSP052的胞外结构域、带组氨酸标签的成熟INSP052胞外结构域、成熟INSP052胞外结构域的Fc融合子以及含有Ig结构域的INSP052片段。
在一实施例中的多肽由SEQ ID NO16所示的氨基酸序列(INSP052多肽)组成，或者是其片段或其功能等同物。而另一实施例的多肽由SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示的任一氨基酸序列组成，或者是其变体。
本发明第一方面的另一实施例提供一种多肽，该多肽i)包括或由SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列组成；ii)是其片段，该片段具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
SEQ ID NO20所示的氨基酸序列代表INSP052的胞外结构域，对应于全长蛋白质的氨基酸1-240(参见实施例部分)。SEQ ID NO22所示的氨基酸序列代表成熟INSP052的胞外结构域。INSP052胞外结构域可参见图7。
如果多肽片段包含了多肽序列边界C末端和/或N末端的附加残基，则胞外结构域将正确地折叠并表现生物活性是很有可能的。例如，INSP052多肽序列或同源序列的5、10、20、30、40、50或者甚至100个附加氨基酸残基包含在受体结合结构域边界的C末端和/或N末端的一端或两端，不会影响该多肽片段正确折叠和表现生物活性的能力。因为二级结构组件之间存在大环，所以可能需要将残基延长至100或200个。
对于INSP052胞外结构域的截短型变体，该结构域的C末端或N末端的一端或两端可以缺失一或几个氨基酸残基(例如2、3、4、5、10、15、20、25、30或以上)，而对其生物活性没有任何损害。
INSP052胞外结构域的其中一个优选截短型变体是含有Ig结构域的INSP052片段(INSP052Ig2)，它具有SEQ ID NO31所示的序列。本发明提供一种多肽，该多肽i)包括或由SEQ ID NO31所示的氨基酸序列组成；ii)是其片段，该片段具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
如下文所讨论，本发明的多肽可以是融合蛋白质形式，或者是“独立的(free-standing)”蛋白质形式。所以，本发明一个实施例提供一种多肽，该多肽由INSP052的胞外结构域组成。本发明另一个实施例提供一种多肽，该多肽由与至少一个其它多肽融合的INSP052(全长蛋白质或其胞外结构域，包括成熟版本及其截短型变体)组成，形成一个融合蛋白。
所以，本发明的又一实施例包括一种多肽，该多肽包括或由两个序列(a)和(b)组成，其中(a)是与以下物质具有至少90％同一性的氨基酸序列i)如SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO31所示的氨基酸序列；ii)是其片段，该片段具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物；以及(b)是选自以下组内的异源氨基酸序列信号序列、纯化标签、膜结合蛋白质的胞外结构域、分泌蛋白质、起始甲硫氨酸、含有内肽酶识别位点的接头区、或者来自免疫球蛋白分子的Fc区。
将编码一种多肽的聚核苷酸在读框内与一个异源蛋白质序列的编码序列进行克隆就可以获得这样的融合蛋白，其中所述多肽包含的序列以该多肽长度计与上述提到的INSP052多肽中任一个具有至少90％同源性，更好具有至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。
本文使用术语“异源”时，指的是人INSP052多肽以外的任何多肽。例如，可包含在融合蛋白N-或C-末端的异源序列包括膜结合蛋白的胞外结构域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚区、胞外蛋白质结构域、信号序列、输出序列、以及通过亲和色谱法可以纯化的序列。
很多这样的异源序列都可通过商业途径获得，它们存在于表达质粒中，这是因为融合蛋白包含这些序列是为了不明显损害与其融合的蛋白质的特异生物活性的前提下，提供附加性质(Terpe K，2003，Appl MicrobiolBiotechnol，60523-33)。
例如，这些附加性质是在体液停留的半衰期延长、纯化程序更容易、附加结合基团、经内切蛋白酶解而成熟、在重组生产中稳定性更高、或者细胞外定位。后一种特征特为重要，因为它可允许多肽在有利于它们的分离和纯化的空间定位。
现有文献已对融合蛋白的构建、纯化、检测、成熟和使用的基团、配体、接头的设计以及方法和策略进行了广泛讨论(Nilsson J等，Protein ExprPurif，111-16，1997；“Applications of chimeric genes and hybridproteins“Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000)。
若需要，在纯化蛋白质后通过蛋白水解切割或者在体内除去异源序列。其实施方式可以是例如在蛋白质与异源序列之间插入蛋白水解切割位点、将融合蛋白与适当的外/内肽酶接触。这些特征有利于融合蛋白的产生及其在制备药物组合物中的用途。
例如，通过含有内肽酶(如caspase)识别位点的接头序列将异源序列与蛋白质相连，所述的内切酶可在体内或体外将所希望的蛋白质与该异源序列分离。或者，如果需要表达的蛋白质未含有起始甲硫氨酸(例如，如果它是一个不带信号肽的成熟序列)，则该异源序列可以是起始甲硫氨酸，以允许该蛋白质在宿主细胞中正确表达。以后再采用现有文献公开的方法，以外肽酶(如甲硫氨酸氨基肽酶)除去此增加的氨基酸(Van Valkenburgh HA and KahnRA，Methods Enzymol，344186-193，2002；Ben-Bassat A，BioProccessTechnol，12147-159，1991)。
可与本发明的多肽融合的异源序列可以由有利于该蛋白质分泌的序列组成，例如信号肽和输出肽(Rapoport TA等，Annu Rev Biochem.1996；65271-303)。
或者，融合蛋白中的异源序列能够使蛋白质的纯化更容易。例如，利用INSP052 C-末端融合的6-组氨酸肽可以纯化INSP052多肽。这种融合蛋白质的一个例子如SEQ ID NO29所示。该6-组氨酸肽形成了一个所谓“组氨酸标签”，对纯化有利(Gentz等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86821-4)。“HA”标签(由流行性感冒红血球凝聚素蛋白质产生的表位)(Wilson等，1994，Cell，37767-78)或者其它亲和纯化标签(如GST、FLAG或MBP)都可替代组氨酸标签。
融合蛋白的异源序列可提供另一种功能活性。例如，具有细胞因子拮抗活性的INSP052胞外结构域可与具有抗炎活性或者一般地与具有免疫调节活性的异源序列融合，譬如说其它细胞因子拮抗剂、胶原II-结合剂(如WO01/37861公开的那些)以及细胞因子本身(如WO03/095488、WO03/014359和WO03/035105公开的那些)。
异源序列可提供更好的稳定性、延长本发明的多肽的半衰期，因而可提高它的治疗活性。例如，多肽可以与人血清白蛋白融合，或者与能结合循环人血清白蛋白的其它序列融合(参见Chuang VT等，Pharm Res.2002；19569-577；Graslund T等，Protein Expr Purif.1997，9125-32；WO01/77137)。或者，附加序列可帮助例如在脑中靶向特定位置(WO03/32913)。
异源序列通过形成蛋白质多聚体而提高稳定性。可以促进多聚化作用的异源序列的例子包括由蛋白质分离出来的结构域，如hCG(WO 97/30161)、胶原X(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白质(WO 98/02540)、或者卷曲螺旋肽(WO 01/00814)。
在一优选实施例中，多肽与Ig分子的恒定区融合。这样的多肽的例子如SEQ ID NO30所示。较佳地，多肽与人IgG1的CH2和CH3结构域等重链区融合。Ig分子的其它同种型也适合产生本发明的融合蛋白，譬如说同种型IgG2或IgG4，或者其它Ig类，如IgM或IgA。恒定区促进多聚化而能够提高稳定性。融合蛋白可以是单聚体或多聚体、异源或同源多聚体。
如何产生包含蛋白质和免疫球蛋白片段的融合蛋白的策略例如已在现有文献中有所描述(WO 91/08298；WO 96/08570；WO 93/22332；WO04/085478；WO 01/03737，WO 02/66514)。
例如，编码成熟INSP052胞外结构域的核酸序列可在一个表达载体中克隆，该表达载体与一个编码原始INSP052信号序列(或任何其它合适的信号/输出序列)的核酸序列的5’端融合，该核酸序列的3’端编码人免疫球蛋白λ重链IgG1的恒定区(NCBI Acc.No.CAA75302；segment 246-477)。得到的载体可用来转化CHO或HEK293宿主细胞系，可选择稳定地表达和分泌N-末端具有INSP052胞外结构域而C-末端具有IgG1序列的克隆。然后，再用该克隆按比例扩大生产以及在培养基中纯化重组融合蛋白。或者，可将核酸分子编码人免疫球蛋白λ重链IgG1的恒定区与INSP052胞外结构域的位置对换，仍然可以用INSP052的原始信号序列或任何其它合适的信号/输出序列表达和分泌得到的蛋白质。
也可用此技术产生异二聚体，方法是将在同一细胞内编码两种不同融合蛋白的构建体共表达(WO00/18932)。例如，一个细胞可以表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中第一融合蛋白包含与Fc结构域融合的INSP052胞外结构域，第二融合蛋白包含与具有不同活性的蛋白质(如另一个细胞因子拮抗剂、胶原II-结合剂(如WO 01/37861公开的那些)和/或细胞因子(如WO03/095488、WO03/014359和WO03/035105公开的那些)融合的Fc结构域。
当融合蛋白包含一个免疫球蛋白区时，这种融合可以是直接的，或通过一个短接头肽，长度短至1-3个氨基酸残基或较长，如13到20个氨基酸残基的长度相融合。例如，所述接头可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或13个氨基酸的接头序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met，将其导入本发明的多肽的序列和免疫球蛋白序列之间。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于该融合蛋白的纯化。
在一优选实施例中，将至少一部分连接于本发明多肽内一或多个官能团上，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。所述的部分最好是允许形成共轭物和复合物的稳定聚合物(Harris JM and Chess RB，NatRev Drug Discov，2214-221，2003；Greenwald RB等，Adv Drug DelivRev，55217-250，2003；Pillai O and Panchagnula R，Cur Opin ChemBiol，5447-451，2001)。该聚合物可在定点修饰适当残基之后于内部位置或端点位置产生。多肽或融合蛋白内的氨基酸残基可用作附着手段，只要它们的侧链能够导致聚合物附着(即氨基酸侧链带有一个官能团，例如赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸等等)。或者，这些位置上的残基可被一个不同氨基酸取代，后者所带的侧链能够使聚合物附着。
例如，INSP052胞外结构域的N-或C-末端可加上一个允许直接聚乙二醇化的附加半胱氨酸。或者，例如在糖基化位点上置换一个残基以使蛋白质包括一个半胱氨酸。另外，可对遗传编码的氨基酸上的侧链进行化学修饰，以便能使聚合物附着，或者也可采用带有合适侧链官能团的非天然氨基酸。可将聚合物附着于碳水化合物或者附着于已连接在氨基酸侧链目标位置的其它部分。
适用于这些目的聚合物都是对生物系统无毒的。这些聚合物可以是疏水的或亲水的、可生物降解的、不可生物降解的、或其组合。这些聚合物包括天然聚合物(如胶原、凝胶、纤维素、透明质酸)以及合成聚合物(如聚酯、聚原酸酯、聚酸酐)。疏水性不可降解的聚合物的例子包括聚二甲基硅氧烷、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯以及聚甲基丙烯酸甲酯。亲水性不可降解的聚合物的例子包括聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚乙烯醇、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚亚烃、聚丙烯酰胺及其共聚物。优选的聚合物包括环氧乙烷，为接续重复单元，例如聚乙二醇(PEG)。优选的附着方法是肽合成与化学连接联用。较佳地，通过可生物降解的连接物将水溶性聚合物专门附在蛋白质的氨基末端区上。这种修饰导致该蛋白质成为前体(或“前药”)形式，在连接物被降解后，释放出蛋白质，无聚合物修饰。
本发明第二方面提供一种编码本发明第一方面的多肽的纯化核酸分子。
较佳的是，该纯化核酸分子包括或由SEQ ID NO1所示的核酸序列(编码INSP052外显子1多肽)、SEQ ID NO3所示的核酸序列(编码INSP052外显子2多肽)、SEQ ID NO5所示的核酸序列(编码INSP052外显子3多肽)、SEQ ID NO7所示的核酸序列(编码INSP052外显子4多肽)、SEQ IDNO9所示的核酸序列(编码INSP052外显子5多肽)、SEQ ID NO11所示的核酸序列(编码INSP052外显子6多肽)、SEQ ID NO13所示的核酸序列(编码INSP052外显子7多肽)、SEQ ID NO15所示的核酸序列(编码INSP052多肽)、SEQ ID NO17所示的核酸序列(编码INSP055多肽)、SEQID NO20所示的核酸序列(编码INSP052多肽的胞外结构域)、SEQIDNO22所示的核酸序列(编码INSP052成熟多肽的胞外结构域)、SEQ IDNO24所示的核酸序列(编码成熟INSP052外显子2多肽)、或者SEQ IDNO26所示的核酸序列(编码成熟INSP055多肽)组成，或者是这些序列中任何一个的冗余等同物或片段。
将SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13所示的氨基酸序列组合，得到SEQ ID NO15所示的序列。
将SEQ ID NO23、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13所示的氨基酸序列组合，得到SEQID NO25所示的序列。
本发明第二方面的一个实施例提供一种核酸分子，其编码包括或由INSP052胞外结构域(SEQ ID NO20)组成的多肽。较佳的是，该核酸分子包括或由SEQ ID NO19所示的核酸序列组成。该核酸序列也列于共同待批专利申请WO03/093316的图7中，但这些序列的C-末端包括组氨酸残基。
本发明第二方面的一个实施例提供一种核酸分子，其编码包括或由成熟INSP052胞外结构域(SEQ ID NO22)组成的多肽。较佳的是，该核酸分子包括或由SEQ ID NO21所示的核酸序列组成。该核酸序列也列于共同待批专利申请WO03/093316的图7中，但这些序列的C-末端包括组氨酸残基。
本发明第二方面的一个实施例提供一种核酸分子，其编码包括或由成熟INSP052胞外结构域的变体组成的多肽，其中该变体是含有Ig结构域的INSP052片段(SEQ ID NO31)。
本发明第三方面提供一种在高度严谨条件下与本发明第二方面的核酸分子杂交的纯化核酸分子。
本发明第四方面提供一种含有本发明第二或第三方面的核酸分子的载体，例如表达载体。
本发明第五方面提供一种用本发明第四方面的载体转化的宿主细胞。
本发明第六方面提供一种配体，它特异性地结合，优选抑制本发明第一方面的多肽的活性。本领域技术人员应当理解，术语“配体”包括能够特异性地与本发明第一方面的多肽结合的任何分子，例如包括抗体和孤独受体。
“本发明的多肽的活性”及类似表达形式指的是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的特征活性。具体地说，该定义包括如上所限定的细胞因子拮抗剂活性，特别是细胞因子表达和/或分泌的拮抗剂活性，尤其是TNF-α、IL-4和IL-2细胞因子。较佳地，本发明的细胞因子拮抗剂具有免疫调节活性。例如，本发明的多肽在这一方面的用途是治疗T细胞介导的皮肤炎症，譬如说过敏性接触皮炎和牛皮癣。
以下详细描述鉴定本发明第六方面的配体的方法。具体地说，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物是与SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的多肽特异性结合的配体，所述方法包括将本发明第一方面的多肽与推断对所述多肽具有结合亲和性的一或多个化合物接触，以及选择与所述多肽特异性结合的化合物。通过如此方法鉴定的本发明多肽的配体可用来鉴定其它细胞因子拮抗剂。例如，可用筛选方法来鉴定与这些配体结合的化合物，譬如说可用作细胞因子拮抗剂的抗体。
本发明第七方面提供一种化合物，它能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者能调节本发明第一方面的多肽的活性。
本发明第七方面的化合物可增加(激动)或者减少(拮抗)多肽的基因表达水平或活性。
重要的是，对INSP052和INSP055多肽功能的鉴定允许设计能够鉴定有效地治疗和/或诊断疾病的化合物的筛选方法。本发明第六和第七方面的配体和化合物可通过某些方法鉴定。这些方法也包括在本发明的内容之中。
以下实施例部分将提出证据，证明INSP052的胞外结构域可用来预防或治疗炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病或肝脏衰竭。所以，本发明第七方面优选提供一种化合物，它构象上模仿INSP052胞外结构域或者是INSP052胞外结构域的激动剂，因为这样的化合物能用来预防或治疗上述提到的炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病或肝脏衰竭。
本发明第八方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在治疗或诊断中的应用，尤其是涉及炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝脏衰竭(包括酒精性肝脏衰竭)的治疗或诊断。
本发明第一、第二、第三、第四和第六方面的这些分子还可应用于制造预防或治疗如下疾病的药物，包括但不限于，细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其它病理病症的药物。
这些疾病优选包括肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、肝病、克劳恩(Cohn′s)病、胃炎、溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其它涉及免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，特别是细胞因子拮抗剂的病症。
特别优选的是，本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子应用于制造治疗炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝脏衰竭(包括酒精性肝脏衰竭)的药物。
本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子还可与其它治疗剂联用，以治疗上述列出的疾病。具体地说，具有细胞因子拮抗剂活性的本发明的多肽(包括融合蛋白)可与另一种治疗剂联用。
所以，本发明提供i)本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子，特别是包含INSP052胞外结构域的多肽或融合蛋白和ii)另一种治疗剂在制造治疗涉及细胞因子优选涉及TNF、IL-2和/或IL-4的疾病或适应症的药物中的用途。较佳地，所述疾病或适应症选自炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝脏衰竭(包括酒精性肝脏衰竭)。
所述另一种治疗剂可以与本发明的多肽一样拮抗同样的细胞因子，或者可以拮抗生理途径上致病的另一种分子或减缓疾病症状。
较佳地，所述治疗剂是一种细胞因子拮抗剂(最好是TNF、IL-2和/或IL-4拮抗剂)，或者是一种抗炎药。
可用作另一种治疗剂的细胞因子拮抗剂的例子包括TNF-α拮抗剂(如依那西普(etanercept)、infliximab TNF-α转换酶抑制剂(TACE抑制剂)和治疗类风湿性关节炎用的来氟米特(leflunomide))、以及IL-2拮抗剂(如防止移植排斥用的巴斯力莫(basilimab)和达克力莫(daclizumab))。另一种治疗剂也可以是抗炎药，例如类固醇或非类固醇类抗炎药，或者可以是已经用在治疗自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病或肝衰竭中的其它药剂。
另外的治疗剂可与本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子同时给予病人，即作为混合物给予。另一个选择是，本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子在病人已经接受了所述治疗剂之后给予，或者所述治疗剂在病人已经接受了本发明第一、第二、第三、第四和第六方面的分子之后给予。它们可以同时、先后或分开给药。
本发明第九方面提供一种诊断病人疾病的方法，该方法包括评估所述病人组织中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性，并将所述表达水平或者活性与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法最好在体外进行。
可用类似方法监测对病人疾病的治疗，其中多肽或核酸分子的表达水平或活性在一段时间内趋向于对照水平，表示该疾病获得缓解。
检测本发明第一方面的多肽的优选方法包括以下步骤(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将本发明第六方面的一种配体例如抗体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。
本领域的读者将懂得，本发明第九方面的方法有很多种，各不相同，例如，核酸与短探针杂交法、点突变分析法、聚合酶链式反应(PCR)扩增法以及使用抗体检测异常蛋白水平的方法。类似方法的使用可以是短期或长时间的，以便治疗病人被监测的疾病。本发明还提供一些用于这些方法中诊断疾病的试剂盒。
较佳的是，用本发明第九方面的方法诊断的疾病是涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的疾病，如上所述。
由本发明第九方面的方法诊断的优选疾病是炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病(包括病毒性或急性肝病)以及肝脏衰竭(包括酒精性肝脏衰竭)。
本发明第十方面提供本发明第一方面的多肽作为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的用途。Ig结构域在细胞表面受体中的重要性在LokkerNA等人的″Functional importance of platelet-derived growth factor(PDGF)receptor extracellular immunoglobulin-like domains.Identification of PDGFbinding site and neutralizing monoclonal antibodies，″J Biol Chem 1997 Dec26；272(52)33037-44中有描述。
本发明提供如上所述的本发明第一方面的多肽作为细胞因子拮抗剂，特别是TNF-α、IL-4和IL-2分泌的拮抗剂的用途。就这一点而言，本发明的多肽用作细胞因子拮抗剂是降低细胞因子表达水平、细胞因子活性水平、细胞因子分泌水平等等。
本发明也提供使用本发明第二或第三方面的核酸分子表达具有含免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子活性的蛋白质。本发明还提供实施含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性的方法，所述方法采用本发明第一方面的多肽。
本发明第十一方面提供一种药物组合物，该组合物含有本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物，并结合药学上可接受的载体。
根据本发明第十一方面的一实施例，本发明的药物组合物还可包含另一种治疗剂。所述另一种治疗剂可以与本发明的多肽一样拮抗同样的细胞因子，或者可以拮抗生理途径上致病的另一种分子或减缓疾病症状。
较佳地，所述治疗剂是一种细胞因子拮抗剂(最好是TNF、IL-2和/或IL-4拮抗剂)，或者是一种抗炎药。
可用作另一种治疗剂的细胞因子拮抗剂的例子包括TNF-α拮抗剂(如依那西普、infliximab TNF-α转换酶抑制剂(TACE抑制剂)和治疗类风湿性关节炎用的来氟米特)、以及IL-2拮抗剂(如防止移植排斥用的巴斯力莫和达克力莫)。另一种治疗剂也可以是抗炎药，例如类固醇或非类固醇类抗炎药，或者可以是已经用在治疗自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病或肝衰竭中的其它药剂。
本发明第十二方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在诊断或治疗中的用途。这些分子还可用来制造治疗如下疾病的药物，但不限于细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其它病理病症的药物。这些疾病优选包括肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、皮肤疾病、肝病、克劳恩病、胃炎、溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其它涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的病症。
特别优选的是，本发明第一、第二、第三、第四、第五和第六方面的分子应用于制造治疗炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病以及肝脏衰竭的药物。
本发明第十三方面提供一种治疗病人疾病的方法，该方法包括把本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物给予该病人。
当与健康受试者中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性相比，病人的该表达水平或活性较低的，给予该病人的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是激动剂。相反，当与健康受试者中所述多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病人的该表达水平或活性较高的，给予该病人的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是拮抗剂。拮抗剂的例子包括反义核酸分子、核酶和配体，例如抗体。
较佳的是，该疾病是涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的疾病，如上所述。
特别优选的是，该疾病是炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病以及肝脏衰竭。
本发明第十四方面提供转基因或剔除非人动物，它们被转化为表达更高水平、更低水平或者不表达本发明第一方面的多肽。这些转基因动物是研究疾病极为有用的模型，也可用在鉴定有效治疗或诊断这样一种疾病的化合物的筛选方案中。
较佳的是，该疾病是涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的疾病，如上所述。
特别优选的是，该疾病是炎症疾病、自身免疫疾病、皮肤疾病、肝病以及肝脏衰竭。
应当知道，针对本发明的多肽和核酸的保护范围不会延伸至以它们天然来源形式存在的核酸或多肽。更正确地说，本发明要求保护的多肽和核酸可视为被“分离的”或“纯化的”。本文所用的术语“分离的”和“纯化的”指的是从它的天然来源核酸或多肽所含的至少一个成分(例如核酸或多肽)分离得到的核酸或多肽。因此，例如组织提取物含有的多肽可构成“分离的”或“纯化的”多肽，就如合成或重组生成的多肽一样。在一实施例中，核酸或多肽仅在溶剂、缓冲液、离子或它们的溶液中通常所带有的其它成分存在下(如果有的话)找到。
应当注意，术语“分离的”和“纯化的”并不表示获得多肽或核酸的方法或者制成品的纯化程度。因此，这些分离的或纯化的物质可重组生产，从感兴趣的细胞或组织直接分离，或者基于已测定的序列合成生产。
以下，给出为实施本发明而可采用的标准技术和步骤的概要。应明白，本发明并不限于所述的这些具体方法、方案、细胞系、载体和试剂。还应明白，本文所用的术语目的仅在于描述具体实施例，该术语不应该被看成为限定本发明的范围。本发明的范围只由所附权利要求书的术语限定。
本说明书中使用核苷酸和氨基酸标准缩写。
除非另有指出，本发明的做法是采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，它们都已为本领域技术人员所掌握。
这些技术在有关文献中已有详细解释。例如，可参考以下特别适用的文献Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154 & 155；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayerand Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)ProteinPurificationPrinciples and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的术语“多肽”包括含有相互间以肽键或修饰肽键连接的两个或以上氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽同构物(isostere)。该术语指短链(肽和寡肽)和长链(蛋白质)。
本发明的多肽可以是成熟蛋白质形式，或者可以是前蛋白质，其可被前部分切割激活而产生活性成熟多肽。这些多肽中的前序列可以是先导序列或者分泌序列或者是用来纯化成熟多肽序列的序列。
本发明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，有利的往往包括一或多个附加氨基酸序列，这些附加氨基酸序列可含有分泌序列或先导序列、前序列(pro-sequences)、有助纯化的序列、或者例如在重组生产中赋予蛋白质更高稳定性的序列。另一个选择或者另一方面是，成熟多肽可与另一种化合物，例如与延长该多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
将编码一种多肽的聚核苷酸与一个异源蛋白质序列的编码序列在读框内进行克隆，就可以获得这样的融合蛋白，其中所述多肽包含的序列与INSP052多肽具有至少85％同源性。
本文使用术语“异源”时，指的是人INSP052多肽以外的任何多肽。例如，可包含在融合蛋白N-或C-末端的异源序列包括膜结合蛋白的胞外结构域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚区、胞外蛋白质结构域、信号序列、输出序列、以及通过亲和色谱法可以纯化的序列。如上所述，若需要，可通过蛋白水解切割方法消除该异源序列。
在一优选实施例中，蛋白质与Ig分子的恒定区融合。较佳地，它与人IgG1的CH2和CH3结构域等重链区融合。Ig分子的其它同种型也适合产生本发明的融合蛋白，譬如说同种型IgG2或IgG4，或者其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单聚体或多聚体、异源或同源多聚体。
在另一优选实施例中，功能性衍生物所含的至少一部分连接于一或多个官能团上，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。所述部分可以是聚乙二醇(PEG)部分。例如，可按已知的方法(例如WO99/55377所述的方法)进行聚乙二醇化。
多肽可含有除20个基因编码的氨基酸外的由天然过程，例如翻译后加工，或者由本领域公知的化学修饰技术修饰的氨基酸。在已知的修饰中，本发明的多肽通常带有的修饰是糖基化、脂质附着、硫酸化、例如谷氨酸残基的γ-羧酸化，羟基化和ADP-核糖基化。其它可能的修饰包括乙酰化、酰化、酰胺化、黄素的共价附着、血素分子的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、GPI锚着形成、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、转移-RNA介导的蛋白质中插入氨基酸例如精氨酰化，以及遍在蛋白化。
具体地说，氨基酸衍生物可含有取代或未取代的烷基，该烷基可以是直链、支链或环状烷基，可包括一或多个杂原子。氨基酸衍生物可以重新制造或者通过商业途径获得(Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Bachem，USA)。
进行改造的目的是使本发明的多肽具有改进的纯化、功效和/或药物动力学特点。例如，当肽容易被肽酶切割，将它注射入受试者是一个问题，用不可切割的肽模拟物置换特别敏感的肽键，获得的肽更稳定，因而更方便用在治疗上。同样，要使肽不容易被蛋白水解而更类似于非肽类有机化合物的标准方法是置换L-氨基酸残基。可采用氨基末端阻断基团，例如叔丁氧基羰基、乙酰基、theyl、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、环庚基、己二酰基、壬二酰基、丹酰基、苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基壬二酰基、甲氧基己二酰基、甲氧基环庚基以及2，4-二硝基苯基，来修饰本发明的多肽。
现有技术已经提供了许多能提高功效、延长活性、便于纯化和/或延长半衰期的其它修饰方法以及合成和研制肽模拟物的技术(WO 02/10195；Villain M等，Chem Biol，8673-679，2001；Hruby VJ and Balse PM，CurrMed Chem，7945-970，2000；Golebiowski A等，Curr Opin Drug DiscovDevel，4428-34，2001)。如下文献也公开了各种以体外和体内翻译系统将非天然氨基酸引入蛋白质的方法，从而研究和/或改进蛋白质结构和功能(Dougherty DA，Curr Opin Chem Biol，4645-52，2000)。
修饰可发生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。事实上，天然存在的肽和合成肽一般通过共价修饰封闭肽的氨基或羧基末端，或者封闭二者，这样的修饰存在于本发明的多肽中。
发生在多肽内的修饰通常随该多肽的制备方法而变化。对于重组制成的多肽，通过特定宿主细胞翻译后修饰能力以及存在于所述多肽的氨基序列中的修饰信号来确定大部分修饰的性质和程度。例如，不同类型的宿主细胞之间糖基化型式是不同的。
本发明的多肽可以任何合适的方式制成。这些多肽包括分离的天然存在的多肽(例如自细胞培养基中纯化而来)、重组产生的多肽(包括融合蛋白)、合成产生的多肽或者通过这些方法组合所产生的多肽。
本发明第一方面的功能等同多肽可以是与INSP052和INSP055多肽同源的多肽，较佳为INSP052的胞外结构域(即SEQ ID NO20或SEQ IDNO22)。如果一个多肽的序列与另一个多肽的序列具有足够高程度的同一性或相似性，本文就用术语“同源的”来形容该两个多肽。“同一性”表示在对比序列的任何特定位置上，两个序列之间的氨基酸残基是相同的。“相似性”表示在对比序列的任何特定位置上，两个序列的氨基酸残基是相似的。同一性和相似性的程度不难计算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，NewYork，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP052和INSP055多肽(较佳为INSP052的胞外结构域)的天然生物变体(例如，产生多肽的物种内等位基因变体或地理变体)和突变体(例如，含有氨基酸取代、插入或缺失的突变体)。这些突变体可包括其中一或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代的多肽，这样一个取代的氨基酸残基可以或不必是遗传密码编码的残基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或者在芳香族残基Phe和Tyr之间进行。特别优选的是这样一些变体有多个氨基酸，即5至10个氨基酸，1至5个氨基酸，1至3个氨基酸，1至2个氨基酸，或者仅有1个氨基酸以任意组合取代、缺失或插入的变体。特别优选的是不改变该蛋白质的性质和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特别优选的还有保守性取代。这些突变体也包括其中一或多个氨基酸残基包括一取代基团的多肽。
通常，两个多肽之间的同一性大于30％，就认为它们在功能上是等同的。本发明第一方面的功能等同多肽与INSP052和INSP055多肽，或其活性片段的序列同一性优选大于80％。更好的多肽分别具有大于85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
本发明第一方面的功能等同多肽还可以是已用一或多种结构对比技术鉴定的多肽。例如，可以应用Inpharmatica Genome ThreaderTM技术(它构成用于产生Biopendium检索数据库的检索工具的其中一部分，参见共同待审批国际专利申请号PCT/GB01/01105，公开号为WO 01/69507)来鉴定现时具有未知功能的多肽，这些多肽虽然与INSP052和INSP055多肽具有较低的序列同一性，但由于与INSP052和INSP055多肽序列共享较高水平的结构同源性，故可预计它们是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，所述方法采用本发明第一方面多肽。“较高水平的结构同源性”指用InpharmaticaGenome ThreaderTM预测两个蛋白质确定共享至少10％，更好是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和以上的结构同源性。
本发明第一方面的多肽还包括INSP052和INSP055多肽的片段、INSP052和INSP055多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子活性，或者带有与INSP052和INSP055多肽相同的抗原性决定簇。
本文所用的术语“片段”指氨基酸序列与INSP052和INSP055多肽或它的其中一种功能等同物的部分而非全部氨基酸序列相同的多肽。这些片段应包括所述序列的至少n个连续氨基酸，取决于特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性决定簇。
这些片段可以是“独立的(free-standing)”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分，也不与其它氨基酸或多肽融合，或者它们可包含在它们构成其中一部分或区域的较大多肽之内。当包含在较大多肽之内时，本发明的片段最好构成单个连续区域。例如，一些优选实施例涉及一个片段，其具有与该片段的氨基末端融合的前多肽区域，和/或具有与该片段的羧基末端融合的附加区域。然而，单一个较大多肽内可含有多个片段。
本发明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一个抗原性决定簇)可被应用来产生对这些多肽有免疫特异性的配体，例如多克隆或单克隆抗体。这些抗体可用于分离或鉴定表达本发明的多肽的克隆，或者用于亲和力层析法纯化这些多肽。抗体还可用来帮助诊断或治疗，以及其它应用，这对本发领域技术人员是显而易见的。
术语“免疫特异性”指抗体对本发明的多肽的亲和力远远大于它们对现有领域其它相关多肽的亲和力。本文所用的术语“抗体”指能够与所述抗原性决定簇结合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，这些抗体与本发明第一方面的多肽结合。
“远远较大的亲和力”指的是与已知的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的亲和力相比，本发明多肽的亲和力有可测量的增大。
较佳的是，对本发明多肽的亲和力相对于已知的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子至少增大1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，103倍，104倍，105倍或106倍。
如果需要多克隆抗体，可用本发明第一方面的多肽使一种选定哺乳动物免疫，例如小鼠、兔、山羊或马。用来免疫动物的多肽可通过重组DNA技术产生，或者可通过化学方法合成。有需要的时候，可将多肽与一载体蛋白质连接。通过化学方法与多肽偶联的常用载体包括牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血蓝蛋白。然后，用偶联的多肽来免疫动物。采集该免疫动物的血清，再按公知的程序，例如免疫亲和力层析法加以处理。
本领域技术人员可轻易地生产针对本发明第一方面的多肽的单克隆抗体。应用杂交瘤技术生产单克隆抗体的一般方法已为人所公知(例如，参见Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可针对各种性质，即同种型、表位、亲和力等，筛选对本发明第一方面的多肽产生的多系列单克隆抗体。单克隆抗体特别用于纯化它们所针对的各种多肽。另一方面，编码感兴趣的单克隆抗体的基因可通过例如本领域公知的PCR技术在杂交瘤中分离出来，并可在适当载体中克隆和表达。
还可使用嵌合抗体，其中非人的可变区与人稳定区连接或融合(例如，参见Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可对抗体进行修饰，例如通过使它人源化，以便在某一个体内的免疫原性减弱(参见ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的术语“人源化抗体”指非人供体抗体的重链和/或轻链可变区内CDR氨基酸和选定的其它氨基酸已经被人抗体的等同氨基酸所取代的抗体分子。所以，人源化抗体与人抗体极为相近，但具有该供体的抗体结合能力。
另一个选择是，抗体可以是“双特异性”抗体，即它是一种有两个不同抗原结合区的抗体，每一结合区针对不同表位。
可应用噬菌体展示技术选择基因，所述基因编码具有与本发明多肽结合的活性的抗体，它们来自筛选用来加工有关抗体的以PCR技术扩增的人淋巴细胞V基因库，或者天然文库(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。这些抗体的亲和力也可通过链改组加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技术产生的多克隆抗体或单克隆抗体得到额外应用，因为它们可用作免疫测定法、放射性免疫测定法(RIA)或者酶联免疫吸附测定法(ELISA)中的试剂。在这些应用中，可使用可分析检测到的试剂，例如放射性同位素、萤光分子或酶来标记抗体。
本发明第二和第三方面的优选核酸分子是编码SEO ID NO2、SEO IDNO4、SEO ID NO6、SEO ID NO8、SEO ID NO10、SEO ID NO12、SEO ID NO14和/或SEO ID NO16、SEO ID NO18、INSP052的胞外结构域(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)、SEQ ID NO24、或SEQID NO26所示的多肽序列的那些分子和功能等效多肽，例如INSP052胞外结构域的变体，譬如说含有Ig-结构域的INSP052片段(SEQID NO31)，或者由INSP052胞外结构域或其与一或多个附加多肽序列融合的变体组成的融合蛋白。这些核酸分子可用于本文描述的方法和应用中。本发明的核酸分子最好含有至少n个本文所公开的序列中的连续核苷酸，取决于特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本发明的核酸分子还包括上述核酸分子的互补序列(例如，用于反义或探测目的)。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因组DNA。这样一些核酸分子可通过克隆、化学合成技术或其组合获得。例如，核酸分子可通过应用诸如固相亚磷酰胺化学合成从基因组或cDNA文库化学合成，或者从生物体中分离而制备。RNA的产生是运用DNA序列的体内或体外转录。
核酸分子可以是双链或单链。单链DNA可以是编码链，也称有义链，或者它可以是非编码链，也称反义链。
术语“核酸分子”还包括DNA和RNA类似物，例如含有修饰骨架的那些类似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的术语“PNA”指反义分子或反基因试剂，其含有长至少5个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与最好以赖氨酸为末端的氨基酸残基肽骨架连接。该末端赖氨酸使组合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延长它们在细胞内的停留时间，在细胞内它们优先与补体单链DNA和RNA结合，并终止转录延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)Anticancer Drug Des.853-63)。
这些分子还可以有另一个不同序列，因为遗传密码简并性，该不同序列编码SEO ID NO2、SEO ID NO4、SEO ID NO6、SEO ID NO8、SEO ID NO10、SEO ID NO12、SEO ID NO14和/或SEO ID NO16、SEO ID NO18、INSP052的胞外结构域或其变体、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26或者SEQ ID NO31所示的多肽。这样一些核酸分子可包括，但不限于，成熟多肽自身的编码序列；成熟多肽的编码序列加上附加编码序列，例如编码先导序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的编码序列，加上或不加上前述附加编码序列，再加上另外一些非编码序列，包括非编码5’和3’序列，例如在转录(包括终止信号)、核糖体结合和mRNA稳定性中发挥作用的转录非翻译序列。核酸分子还包括编码附加氨基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些氨基酸。
本发明第二和第三方面的核酸分子也可编码本发明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。这样一种核酸分子可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体，或者该分子可以是非天然存在的变体。核酸分子的非天然存在的变体可通过诱变技术制成，包括适用于核酸分子、细胞或生物体的那些技术。
就此而言，这些变体是通过核苷酸取代、缺失或插入而不同于上述核酸分子的变体。取代、缺失或插入可涉及一或多个核苷酸。变体可在编码区或非编码区或者二者内发生变化。编码区内的变化可产生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。
本发明的核酸分子也可以采用本领域公知的方法为多种原因而进行改造，这些原因包括修饰克隆、加工、和/或基因产物(多肽)的表达。可用来改造核苷酸序列的技术还包括应用随机断裂所作的DNA改组、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新装配。可利用定点诱变插入新的限制位点，改变糖基化模式，修改密码子偏向，产生剪接变体，引入突变等等。
编码本发明第一方面的多肽的核酸分子可与异源序列连接，以致该组合核酸分子编码融合蛋白。这样一些组合核酸分子包括在本发明第二和第三方面之内。例如，要在肽库中筛选抑制多肽活性的抑制剂，用这种组合核酸分子表达可被市售抗体识别的融合蛋白是有用的。融合蛋白还可被改造成含有位于本发明多肽的序列与异源蛋白质的序列之间的切割位点，以致该多肽可被切割，并从该异源蛋白质中纯化出来。
本发明的核酸分子还包括一些反义分子，它们与编码本发明的多肽的核酸分子部分互补，因而能与编码核酸分子杂交。如本领域普通技术人员所知，这些反义分子，例如寡核苷酸，可设计成识别、特异性地结合以及防止编码本发明多肽的靶核酸的转录(例如，参见Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science 241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的术语“杂交”指两个核酸分子通过氢键相互缔合。通常，将一个分子固定于固相支持物上，而另一个分子在溶液中游离。然后，在有利氢键键合的条件下使两个分子相互接触。影响键合的因素包括溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相分子与固相支持物非特异性附着的试剂(Denhardt′s试剂或BLOTTO)；分子的浓度；提高分子缔合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；杂交后洗涤条件的严谨程度(参见上述文献Sambrook等)。
应用本领域公知的杂交测定法(例如，参见上述文献Sambrook等)，可检查一个完全互补分子与靶分子杂交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)的教导，在不同严谨程度的条件下，使基本上同源的分子竞争并抑制完全同源的分子与靶分子的结合。
“严谨程度”指在杂交反应中与不同的分子缔合相比，有利于极度相似的分子缔合的条件。高度严谨杂交条件定义为42℃下在一溶液中培养过夜，该溶液含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑鱼精子DNA，然后，约65℃下在0.1X SSC中洗涤过滤器。低度严谨条件涉及在35℃下进行的杂交反应(参见上述文献Sambrook等)。杂交使用的优选条件是高度严谨杂交条件。
本发明该方面的优选例子是其全长至少有70％与编码INSP052和INSP055多肽(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13和/或SEQ IDNO15，或SEQ ID NO17、或者图7所示的核酸序列或图7所示的核酸序列的编码部分(即SEQ ID NO19或SEQ ID NO21)、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25))的核酸分子相同的核酸分子以及基本上与这些核酸分子互补的核酸分子。本发明该方面的优选核酸分子含有一区域，该区域的全长至少有80％与SEQ ID NO1所示的SEQ ID NO2编码序列、SEQ ID NO3所示的SEQ ID NO4编码序列、SEQ ID NO5所示的SEQ ID NO6编码序列、SEQ ID NO7所示的SEQ ID NO8编码序列、SEQ ID NO9所示的SEQ ID NO10编码序列、SEQ ID NO11所示的SEQ ID NO12编码序列、SEQ ID NO13所示的SEQ ID NO14编码序列、SEQ ID NO15所示的SEQ ID NO16编码序列、SEQ ID NO17所示的SEQ ID NO18编码序列相同、SEQ ID NO23所示的SEQ ID NO24编码序列相同、SEQ ID NO25所示的SEQ ID NO26编码序列相同，或者是它们的一个互补核酸分子。特别优选的核酸是其包括或由以全长计与图7所示的INSP052胞外结构域(成熟INSP052的胞外结构域或者含有信号肽的INSP052胞外结构域)的编码序列至少有80％同一性。就此而言，特别优选的是其全长至少有90％，优选至少95％，更好至少98％或99％与所述核酸分子相同的核酸分子。优选的例子是编码基本上保留与INSP052和INSP055多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本发明还提供一种检测本发明核酸分子的方法，该方法包括以下步骤(a)在杂交条件下，将本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；以及(b)检测所形成的任何双链体。
下文另外讨论关于本发明可采用的测定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因组DNA的杂交探针，分离编码INSP052和INSP055多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与编码该多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因组克隆。
在这点上，可以使用以下技术，其中包括已为本领域技术人员所知的，为了举例说明讨论如下。DNA的测序和分析方法已为人公知，在本领域中可以获得到，事实上这些方法也用于以下讨论的本发明很多实施例中。这些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列诺片段测序酶(US BiochemicalCorp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐热T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者这些酶的组合，以及校读外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE扩增系统中找到的那些外切核酸酶。优选的测序方法可应用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化剂以及373和377DNA测序仪(Perkin Elmer)等仪器进行自动操作。
一种分离编码具有与INSP052和INSP055多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本领域公认的标准程序用天然或人工设计的探针探测基因组或cDNA文库(例如，参见″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，Greene Publishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特别有用的探针含有至少15个，优选至少30个，更好是至少50个邻接碱基，这些碱基对应于，或者与适当的编码基因的核酸序列(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25))互补。使用可分析检测到的试剂标记这些探针，方便鉴定。有用的试剂包括，但不限于，放射性同位素、萤光染料和能够催化待检测产物形成的酶。有了这些探针，本领域普通技术人员就能够从人、哺乳动物或其它动物来源中分离出感兴趣的基因组DNA、cDNA或RNA聚核苷酸编码蛋白质的互补拷贝，并能够在这些来源中筛选出有关序列，例如该家族、类型和/或亚型的额外成员。
多数情况下，分离的cDNA序列是不完整的，因为编码多肽的区域通常在5’端被截短。现时有一些方法可获得全长cDNA，或者将短cDNA延长。应用部分核苷酸序列和本领域公知的各种方法检测上游序列，例如启动子和调控组件，可将这些序列延长。例如，可采用的一种方法是基于快速扩增cDNA末端的方法(RACE；例如参见Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)对这种技术进行了改进，例如使较长cDNA的检索大大简化。另一种稍稍不同的技术称为“限制位点”PCR，它使用通用探针检索邻接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。以基于已知区域的趋异性引物，也可用反向PCR来扩增或延长序列(Triglia，T.等，(1988)Nucleic Acids Res.168186)。捕捉PCR是可使用的另一种方法，它涉及通过PCR技术扩增邻接人和酵母人工染色体DNA中一已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用来检索未知序列的另一种方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic Acids Res.193055-3060)。另外，人们可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文库来查看基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。这种方法不需要筛选文库，可用于寻找内含子/外显子接合。
当筛选全长cDNA时，最好用已经按大小进行选择包含了较大cDNA的文库。优选的还有随机引物文库，因为它们含有较多含基因5’区的序列。对于寡d(T)文库不能产生全长cDNA的情形，最好使用随机引物文库。基因组文库可用来将序列延伸进入5’非转录调控区。
在本发明一实施例中，本发明的核酸分子可用来进行染色体定位。在这一技术中，核酸分子特异性靶向，并能与单个人染色体的特定位置杂交。对本发明染色体的相关序列作图谱，是确认那些序列与基因相关性疾病相互关系的重要步骤。一旦将序列与准确染色体位置在图谱反映出来，就可以将染色体上序列的物理位置与基因图谱数据关联起来。这些数据例如可以在人类孟德尔遗传学数据库中找到(Johns Hopkins大学韦尔奇医学库在线提供)。然后，通过连锁分析(物理相邻基因的共同继承)确定基因与定位在同一个染色体区的疾病之间的关系。这为研究人员用定位克隆或其它基因发现技术检索疾病基因提供了有价值的信息。一旦通过遗传连锁分析粗略确定了疾病或综合征位于特定基因组区，定位在该区域的任何序列代表相关或调控基因，可作进一步研究。核酸分子还可用来检测由于正常、载体或染病个体之间移位、反转等造成染色体位置的差异。
本发明的核酸分子对于组织定位也是有价值的。这些技术通过检测编码多肽的mRNA可以确定该多肽在组织中的表达模式。这些技术包括原位杂交技术和核苷酸扩增技术，例如PCR。从研究中获得的结果可知道生物体中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表达模式与突变基因编码的mRNA的正常表达模式之间的比较研究为理解突变多肽在疾病中的作用提供了有价值的认知。不适当表达可以是时间、空间或量化。
还可采取基因沉默方法使编码本发明多肽的基因内源表达下调。一种方法是RNA干扰(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用来使序列特异性翻译后基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在体外合成，并导入细胞中。这些dsRNA寡核苷酸的序列特异性结合引发靶mRNA降解，从而减少或消除靶蛋白质表达。
上述评估基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上测量多肽的表达(例如，Western印迹)。
本发明的载体包含本发明的核酸分子，可以是克隆或表达载体。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，它们可用本发明的载体转化、转染或转导。
本发明的多肽可以重组形式制备，方法是在宿主细胞所含的载体内表达它们的编码核酸分子。这些表达方法已为本领域技术人员公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez与Hoeffler的书(1998，eds.″Gene expressionsystems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)详细叙述。
一般而言，可使用适合维持、繁殖或表达核酸分子在一所需宿主内产生多肽的任何系统或载体。应用各种公知的常规技术，例如上述Sambrook中描述的技术，可将适当的核苷酸序列插入一表达系统中。通常，可使编码基因受控于调控组件，例如启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)，任选地是操纵子，以便将编码所希望的多肽的DNA序列转录至转化宿主细胞的RNA内。
例如，适当的表达系统的例子包括染色体系统、附加体系统和病毒衍生系统，包括例如衍生自以下物质的载体细菌质粒、噬菌体、转位子、酵母附加体、插入组件、酵母染色体组件、病毒例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒，或者其组合，例如从质粒和噬菌体遗传因子所产生的载体，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色体(HACs)也可用来输送在质粒中所含有和表达的较大DNA片段。
特别适合的表达系统包括微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达系统转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或者用细胞表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用来产生本发明的多肽。
参照许多标准实验手册，例如Davis等(Basic Methods in MolecularBiology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可将编码本发明的多肽的核酸分子导入宿主细胞内。特别适合的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微量注射、阳离子质粒介导的转染、电穿孔、转导、划痕加载、弹导导入或感染(参见上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman & Leinwald，1998)。在真核细胞中，表达系统可以是暂时的(例如附加体)或者永久的(染色体整合)，取决于该系统的需要。
编码核酸分子可以包括或不包括编码调控序列例如信号肽或先导序列的序列，有需要的时候，例如将翻译的多肽分泌到内质网腔、胞质间隙或胞外环境中。这些信号可以与该多肽内源，或者它们可以是异源信号。先导序列可在翻译后加工中被细菌宿主除去。
除了调控序列之外，希望可以加入能调节与宿主细胞生长有关的多肽表达的调节序列。调节序列的例子是可引起基因的表达对化学和物理刺激，包括调节化合物的存在，或者对各种温度或代谢条件的应答增大或减少的序列。调节序列是载体的那些非翻译区，例如增强子、启动子以及5’和3’非翻译区。它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。这些调节序列的强度和特异性可以是不同的。取决于所用的载体系统和宿主，可使用任何数量的适当转录和翻译组件，包括组成型和诱导型启动子。例如在细菌系统内克隆时，可使用诱导型启动子，例如Bluescript噬菌粒的杂交lacZ启动子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM质粒(Gibco BRL)等等。在昆虫细胞内可用杆状病毒多角体蛋白启动子。由植物细胞基因组(例如，热激、RUBISCO和贮藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒启动子或先导序列)衍生而来的启动子或增强子可克隆到载体中。哺乳动物细胞系统优选使用哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有序列的多个拷贝的细胞系，可使用基于SV40或EBV的载体和一适当选择性标记物。
构建一个表达载体，以致于使特定核酸编码序列位于该带有适当调节序列的载体内，所述编码序列相对于调节序列的定位和方向使得该编码序列在该调节序列的“控制”下转录，即在调控序列下与DNA分子结合的RNA聚合酶转录该编码序列。在一些情况下，有需要将序列修饰成它可以适当方向附着于调控序列，即维持读框。
调控序列和其它调节序列可在插入载体之前先连接到核酸编码序列。另一个选择是，直接将编码序列克隆到已经含有调控序列和适当限制位点的表达载体中。
对于长时间高得率地生产重组多肽，最好有稳定的表达。例如，稳定地表达感兴趣的多肽的细胞系可以用含有病毒来源复制的表达载体和/或同一个或不同载体上的内源性表达组件和选择性基因转化。导入载体之后，允许细胞先在富集培养基中生长1-2天，再转移到选择培养基中。选择性标记物的目的是为选择带来抗性，它的存在可以使成功表达导入序列的细胞生长和恢复。稳定转化的细胞的抗性克隆可应用适合细胞类型的组织培养技术进行增殖。
本领域技术人员已知哺乳动物细胞系可用作表达宿主，而哺乳动物细胞系包括美国典型菌种保藏中心(ATCC)的许多无限增殖化细胞系，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK 293细胞、Bowes黑色素瘤细胞和人肝细胞癌(例如Hep G2)细胞以及其它许多细胞系。
杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的物质在市场上以试剂盒形式提供，可以购自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(“MaxBac”试剂盒)。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特别适合该系统使用的宿主细胞包括昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和草地夜蛾Sf9细胞。
本领域已经知道很多植物细胞培养基和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的例子包括美国专利US 5,693,506；US 5,659,122；和US 5,608,143中描述的系统。植物细胞培养基的遗传表达的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具体地说，可使用原生质体被分离和培养得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有转移基因。特别是所有植物可从培养细胞或组织中再生，包括但不限于甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其它树木、豆类和蔬菜的所有主要种属。
特别优选的细菌宿主细胞的例子包括链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌细胞。
特别适合真菌表达的宿主细胞的例子包括酵母细胞(例如酿酒酵母)和曲霉菌细胞。
本领域已经知道许多选择系统，它们都可用来回收转化细胞系。例如，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等，(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell 22817-23)基因可分别用在tk-或aprt±细胞中。
另外，选择的基础可以是抗代谢物、抗生素或除草剂抗性；例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt赋予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分别赋予绿黄隆和草丁膦乙酰转移酶抗性。此外，还描述了其它选择性基因，它们的例子为本领域技术人员所知。
虽然标记基因表达的存在或不存在提示感兴趣的基因也是存在的，但它的存在和表达有待确认。例如，如果在一标记基因序列中插入相关的基因，标记基因功能不存在则可以确定含有适当序列的转化细胞。另一个选择是，在单个启动子控制下将标记基因与编码本发明的多肽的序列串联放置。标记基因应答诱导或选择的表达通常也表示串联基因的表达。
另外，含有编码本发明的多肽的核酸序列，并表达所述多肽的宿主细胞可通过本领域技术人员公知的各种程序进行鉴定。这些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物分析，例如，萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术(例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA))，包括用来检测和/或定量分析核酸或蛋白质的膜、溶液或芯片技术(参见Hampton，R.等，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本领域技术人员公知的各种各样标记和连接技术可用在不同的核酸和氨基酸试验中。产生标记杂交的装置或者检测与编码本发明的多肽的核酸分子有关的序列的PCR探针包括，寡标记、镍翻译、末端标记或使用标记聚核苷酸的PCR扩增。另外，也可将编码本发明的多肽的序列克隆到载体内，以产生mRNA探针。这些载体是本领域公知的，可通过商业途径获得，加入诸如T7、T3或SP6等适当RNA聚合酶和标记核苷酸可在体外合成RNA探针。这些步骤使用市场上供应的各种试剂盒(Pharmacia & Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))进行。
易于检测的合适报导分子或标记包括放射性核、酶和萤光、化学发光或发色试剂和物质、协同因子、抑制剂、磁性粒子等等。
本发明的核酸分子还可用来制造转基因动物，特别是啮齿动物。这些转基因动物构成本发明的另一方面。这可通过局部修饰体细胞，或者通过种系治疗引入遗传修饰来实现。这些转基因动物特别适用于制作动物模型，分析作为本发明多肽的调节剂的药物分子。
从重组细胞培养基中回收和纯化多肽的方法是公知的，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阳离子或阴离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水基相互作用层析法、亲和力层析法、羟磷灰石层析法和血凝素层析法。高效液相层析法特别适用于纯化。当分离和/或纯化期间多肽发生变性时，可应用蛋白质再折叠的公知技术来再产生活性构造。
也可利用特异性载体结构来帮助蛋白质纯化，有需要的时候，将编码本发明的多肽的序列与编码有利于可溶性蛋白质纯化的多肽结构域的核酸序列连接。有利于纯化的结构域的例子包括金属螯合肽，例如允许在固定金属上纯化的肌氨酸-色氨酸组件，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的结构域。为了方便纯化，可以采用可切割的接头序列的内含物，例如在纯化结构域与本发明的多肽之间的对XA因子或肠激酶有特异性的序列。一种这样的表达载体为融合蛋白的表达提供准备，所述融合蛋白含有本发明的多肽，与硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前面的多个肌氨酸残基融合。肌氨酸残基有利于固定金属离子亲和力层析法(IMAC)的纯化，参见Porath，J.等的描述(Prot.Exp.Purif.3263-281，(1992))，而硫氧还蛋白或肠激酶切割位点为从融合蛋白纯化多肽提供了一种手段。Kroll，D.J.等对含有融合蛋白的载体进行了讨论(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
如果多肽的表达是用在筛选测定中，通常最好是在它表达的宿主细胞表面上产生该多肽。在此情况下，宿主细胞可在用于筛选测定之前，例如用萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术之前收获。如果多肽分泌到培养基中，可回收该培养基以便回收和纯化表达多肽。如果多肽是在细胞内产生，则回收多肽之前必须先溶解细胞。
本发明的多肽可用来筛选各种药物筛选技术使用的化合物库。这些化合物可以激活(激动)或抑制(拮抗)本发明多肽的基因的表达水平或活性，构成本发明的另一方面。优选的化合物是能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者调节本发明第一方面的多肽的活性。
激动剂或拮抗剂化合物可从，例如，细胞制剂、无细胞制剂、化学库或天然混合产物中分离出来。这些激动剂或拮抗剂可以是天然的或者是经修饰的基质、配体、酶、受体或者结构或功能类似物。关于这些筛选技术的综述，可参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
最有可能成为良好拮抗剂的化合物是与本发明的多肽结合但在结合后又不会诱导该多肽生物作用的分子。潜在的拮抗剂包括有机小分子、肽、多肽和抗体，它们与本发明的多肽结合，由此抑制或消除它的活性。以这种方式，多肽与正常细胞结合分子的结合可被抑制，从而抑制该多肽的正常生物活性。
用在此筛选技术中的本发明的多肽可以在溶液中游离，附着于固相支持物上，留在细胞表面或位于细胞内。一般而言，这些筛选程序可涉及使用表达与测试化合物接触的多肽的适当细胞或细胞膜，观察结合、或功能反应的刺激或抑制。再将与测试化合物接触的细胞和不接触测试化合物的对照细胞的功能反应作比较。借助适当检测系统，这种测定方法可以评估测试化合物是否导致多肽激活产生一个信号。一般情况下，在已知激动剂的存在下分析激活的抑制剂，在测试化合物存在下观察对激动剂激活的影响。
一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合；(b)通过测定化合物与多肽相互作用所产生的信号水平来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。
另一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合；(b)通过对化合物与多肽相互作用所产生的信号水平与在该化合物不存在下的信号水平作比较来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。
在另一优选实施例中，上述的通用方法还包括在多肽的标记或无标记配体存在下对激动剂或拮抗剂进行鉴定。本领域技术人员应当理解，术语“配体”包括与本发明第一方面的多肽特异性结合的任何部分，例如包括抗体或孤独受体。
在另一实施例中，鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括在允许结合多肽的条件和候选化合物存在下，测定配体与其表面上带有本发明的多肽的细胞、或者与含有这样一种多肽的细胞膜结合的抑制，并测定与该多肽结合的配体数量。能够引起配体结合减少的化合物就认为是激动剂或拮抗剂。配体最好是带标记的。
更具体地说，筛选多肽拮抗剂或激动剂化合物的方法包括以下步骤
(a)使标记的配体与在细胞表面上表达本发明的多肽的全细胞，或者与含有本发明的多肽的细胞膜培养，(b)测定与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量，(c)在步骤(a)的标记配体和全细胞或者细胞膜的混合物中加入候选化合物，使该混合物达到平衡；(d)测定步骤(c)之后与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量；以及(e)比较步骤(b)和(d)中结合的标记配体之差值，将引起步骤(d)的结合减少的化合物看成激动剂或拮抗剂。
可以看到，多肽在上述试验中以剂量依赖方式调节各种各样生理和病理过程。所以，本发明多肽的“功能等同物”包括在上述试验中表现出相同的剂量依赖方式的任一调节活性的多肽。虽然“功能等同物”的剂量依赖活性程度不必与本发明多肽相同，但较佳的“功能等同物”是在给定活性试验中表现出本发明多肽相似的剂量依赖关系的那些。
上述一些实施例可应用简单结合试验，其中测试化合物与带有多肽的表面的附着用直接或间接与该测试化合物结合的标记检测，或者可应用涉及与标记竞争物竞争的试验检测。另一个实施例采用竞争药物筛选测定法，其中能够结合多肽的中和抗体与测试化合物特异性地竞争结合。以此方式可用抗体检测对多肽有特异性结合亲和力的任何测试化合物的存在。
本领域技术人员将能够设计鉴定本发明多肽的调节剂的试验。此方面感兴趣的是Lokker NA等人在J Biol Chem 1997 Dec 26；272(52)33037-44中的描述，文章记载了一个鉴定拮抗剂的试验(此试验为中和抗体)。
也可将试验设计成检测加入的测试化合物对细胞内编码多肽的mRNA产生的作用。例如，ELISA可构建成通过本领域公知的标准方法以单克隆抗体或多克隆抗体测量多肽的分泌或细胞相关水平，这可用来检索抑制或增强在适当操纵的细胞或组织中产生多肽的化合物。然后，测定多肽与测试化合物之间的结合复合物的形成。
本发明包括的试验是在过表达或切除检测中涉及使用本发明的基因和多肽的试验。这些试验涉及细胞内这些基因/多肽水平的操纵，以及该操纵事件对被操纵细胞生理的影响的评估。例如，这些实验揭示与特定基因/多肽有关联的信号传导和代谢通道的详细信息，产生关于与待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，并提供调节相关基因和蛋白质的方法的思路。
可采用另一种药物筛选技术，它高通量筛选对感兴趣的多肽具有适当结合亲和力的化合物(参见国际专利申请WO84/03564)。在这一方法中，在固相基质上合成大量不同的小测试化合物，它们再与本发明的多肽反应，洗涤。一种固定多肽的方法是用非中和抗体。以本领域公知的方法可检测结合多肽。纯化的多肽也可直接铺在板上，用于上述药物筛选技术中。
通过本领域公知的标准受体结合技术，例如配体结合和交联试验，本发明的多肽可用来鉴定膜结合或可溶性受体，其中在配体结合和交联试验中，多肽用放射性同位素标记，以化学方法修饰，或者与有利于它的检测或纯化的肽序列融合，并与推定受体来源(例如，细胞组合物、细胞膜、细胞上清液、组织抽提物或体液)一起培育。结合的效率可用生物物理技术，如表面胞质基因共振和光谱测定。结合试验用于纯化和克隆受体，但也可鉴定多肽的激动剂和拮抗剂，这些激动剂和拮抗剂与其受体竞争结合多肽。进行筛选测定的标准方法已为本领域所熟悉。
本发明还包括一种筛选试剂盒，它可用在鉴定上述的激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质、酶的方法中。
本发明包括激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质和酶以及通过上述方法发现的能调节本发明的多肽的活性或抗原性的其它化合物。
本发明还提供一些药物组合物，其含有本发明的多肽、核酸、配体或化合物，以及合适的药物载体。这些组合物适合用作治疗或诊断试剂、疫苗、或其它免疫原性组合物，下文将作详细说明。
根据本文的术语，当组合物中以X+Y的总重量计时至少85％是X，认为含有多肽、核酸、配体或化合物[X]的组合物“基本上不含”杂质[本文以Y表示]。优选X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更好至少约95％、98％或者甚至99％(重量)。
药物组合物最好含有治疗有效量的本发明的多肽、核酸分子、配体或化合物。本文所用的术语“治疗有效量”指需要治疗、缓解、或预防目标疾病或病症，或者具有可检测的治疗或预防作用的治疗药剂的用量。任何一种化合物的有效治疗剂量最初可在例如肿瘤细胞的细胞培养试验、或者动物模型通常是小鼠、兔、狗、或猪模型中估计。动物模型还可用来确定适当的浓度范围和给药途径。有了这些信息，就可以确定给予人的有用给药剂量和途径。
人受试者的准确有效剂量取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应灵敏度，以及治疗耐受性/反应。该用量可以常规实验测定，由医生判断。通常，有效剂量从0.01毫克/千克至50毫克/千克，优选从0.05毫克/千克至10毫克/千克。组合物可单独给予病人，或者与其它药剂、药物或激素结合给予。
一种药物组合物还可含有药学上可接受的载体，作为治疗试剂给予。这些载体包括抗体和其它多肽、基因和其它治疗试剂，例如脂质体，只要该载体本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，而且载体的给予不会产生过高毒性。合适的载体可以是大的代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。
还可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)对药学上可接受的载体作了详尽讨论。
治疗组合物中药学上可接受的载体也可含有水、盐水、甘油和乙醇等液体。另外，这些组合物还可含有辅助物质，例如，湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。这些载体能将药物组合物配制成供病人摄取的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等等。
一旦配成以后，本发明的组合物可直接给予受试者。接受治疗的受试者可以是动物；特别是人受试者。
本发明使用的药物组合物可以任何途径给予，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、脊髓内、鞘内、心室内、透皮或经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹腔内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。本发明的药物组合物也可用基因枪或无针注射器给予。一般将治疗组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制成适合注射前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式。
通过注射可将组合物直接输送到皮下、腹腔内、静脉内或肌内，或者送到组织间质空间。组合物也可施加在病变部位。剂量治疗可分单剂或多剂。
如果本发明的多肽的活性在一特定疾病状态中是过度的，有多种方法可采用。其中一种方法包括把上述抑制剂化合物(拮抗剂)与药学上可接受的载体一起给予受试者，抑制剂化合物的量为通过例如阻断配体、基质、酶、受体的结合，或者抑制第二信号而抑制多肽的功能，从而缓解异常状况的有效量。这些拮抗剂优选是抗体。这些拮抗剂最好是嵌合抗体和/或人源化抗体，如前所述，可使它们的免疫原性减至最低。
另一种方法是给予保留了对上述配体、基质、酶、受体有结合亲和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相关部分的片段的形式给予。
在一替换方法中，应用表达封闭技术，例如用内部产生或另外给予的反义核酸分子(如上所述)，抑制编码多肽的基因表达。设计编码多肽的基因的调控区、5’区或调节区(信号序列、启动子、增强子和内含子)的互补序列或反义核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可获得对基因表达的修饰。类似地，用“三螺旋体”碱基成对方法可实现抑制。三螺旋体成对是有用的，这是因为它能引起抑制双螺旋体充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。应用三螺旋DNA的治疗取得最新进展，在文献中已有描述(Gee，J.E.等，(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and ImmunologicApproaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互补序列或反义分子还可设计成防止转录子与核糖体结合，从而封闭mRNA的翻译。这些寡核苷酸可给予，或在体内表达中原位产生。
另外，使用对它的编码mRNA序列有特异性的核糖体，可防止表达本发明的多肽。核糖体是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，参见Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可设计合成核糖体，在选定位置上特异性切割mRNA，从而防止mRNA翻译为功能多肽。核糖体通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然碱基合成。另一个选择是，核糖体可用非天然骨架，例如2’-氧-甲基RNA合成，保护核糖核酸酶免于降解，还可含有经修饰的碱基。
可对RNA分子进行修饰，以增加胞内稳定性和延长半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’末端加入侧翼序列或在分子的骨架内使用硫代磷酸或2’-氧-甲基而不用磷酸二酯酶连锁。这一概念对于产生PNA是固有的，可延伸至所有这些分子中，方法是包含非常规碱基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修饰鸟苷(butosine)以及乙酰基-、甲基-、硫代-、及类似修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它们不易被内源性内切核酸酶识别。
有一些方法治疗与本发明的多肽表达不足够或其活性相关的异常征状。其中一种方法包括把治疗有效量的能激活该多肽的化合物，即上述激动剂给予病人，缓解异常征状。另外，也可以给予治疗量的多肽与适当药物载体，以恢复多肽的相关生理平衡。
基因疗法可用来在受试者体内通过相关细胞内源性产生多肽。基因疗法以修正治疗基因置换缺陷基因，永久治疗多肽的不适当产生。
本发明的基因疗法可发生于体内或体外。体外基因疗法需要分离和纯化病人的细胞，导入治疗基因，以及将经基因改造的细胞再引入病人体内。与之相反，体内基因疗法不需要分离和纯化病人的细胞。
治疗基因往往被“包装”以方便给予病人。基因输送赋形剂可以是非病毒，例如脂质体，或者复制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利US5,252,479所述的腺伴随病毒(AVV)载体。例如，可对编码本发明的多肽的核酸分子进行改造，以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达。然后，分离这种表达构造体，导入用含有编码多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞内，使该包装细胞现在能产生含有感兴趣的基因的感染病毒粒子。将这些生产细胞给予病人，以体内改造细胞和体内表达多肽(参见“Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches”(纳入作为文献参考)，Human Molecular Genetics(1996)，T Strachan和A PRead，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一种方法是给予“裸露DNA”，其中治疗基因直接注入血流或肌肉组织。
对于本发明的多肽或核酸分子是致病试剂的情形，本发明提出它们可用在疫苗中，产生针对疾病引发剂的抗体。
本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或者是治疗性的(即感染后治疗疾病)。这些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白质或核酸，通常与前述药学上可接受的载体结合，包括本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的任何载体。这些载体还可用作免疫刺激剂(“辅助剂”)。此外，抗原或免疫原可与细菌类毒素例如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌和其它致病原的类毒素偶联。
因为多肽可以在胃内分解，所以含有多肽的疫苗最好肠胃外给予(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内注射)。适合肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与接受者的血液等渗的溶解物，以及无菌水悬浮液或非水悬浮液，可包括悬浮剂或增稠剂。
本发明的疫苗制剂可制成单剂或多剂容器。例如，密封安瓿和小瓶可储存于冻干条件下，只要在使用之前加入无菌液体载体。剂量取决于疫苗的比活性，通过常规实验可轻易测定。
还可通过基因传送与本发明的多肽结合抗体，例如参见国际专利申请WO 98/55607。
在配制疫苗组合物时也可使用“快速注射”技术(例如见www.powderject.com)。
国际专利申请WO 00/29428描述了许多接种疫苗和疫苗输送系统的合适方法。
本发明还涉及本发明的核酸分子作为诊断试剂的应用。检测以本发明的核酸分子为特点，并与功能障碍相关的基因的突变形式提供一种诊断工具，它可增加或限定因为基因的表达不足、过度表达或者空间或时间表达发生改变而引起的疾病或疾病易感性的诊断。通过各种技术可在DNA水平上检测携带基因突变的个体。
用于诊断的核酸分子可从受试者的细胞中获得，例如从血液、尿、唾液、组织活体或尸体材料中获得。基因组DNA可直接用作检测，或者在分析前用PCR、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或者其它扩增技术酶解扩增(参见Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一实施例中，本发明该方面提供一种诊断病人疾病的方法，该方法包括评估编码本发明的多肽的天然基因的表达水平，并将所述表达水平与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法包括以下步骤(a)在允许本发明的核酸分子和核酸探针形成杂交复合物的严谨条件下，将病人的组织样品与探针接触；(b)在与步骤(a)相同的条件下，将对照样品与所述探针接触；(c)以及检测所述样品中是否存在杂交复合物；其中，检测到病人样品中杂交复合物的水平与对照样品中杂交复合物不同，表示患病。
本发明另一方面包括一种诊断方法，其包括以下步骤(a)从待测试疾病的病人中获得组织样品；(b)从所述组织样品中分离本发明的核酸分子；(c)通过检测与疾病相关的核酸分子是否存在突变，诊断病人疾病。
为了帮助上述方法检测核酸分子，可包括扩增步骤，例如利用PCR技术。
将扩增产物大小的变化与正常基因型比较，可检测到缺失或插入。将扩增DNA与本发明的标记RNA，或者与本发明的标记反义DNA序列杂交，可以鉴定点突变。以核糖核酸酶消化或评估熔点温度的差异，发现完全匹配的序列与错配的双链体截然不同。病人是否存在突变可这样检测将DNA与在严谨条件下和该DNA杂交的核酸探针接触，形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关的突变的任何部分具有核酸探针链的未杂交部分；检测探针链的未杂交部分是否存在即表示该DNA链的对应部分存在或不存在与疾病相关的突变。
这样的诊断特别适用于产前，甚至新生儿测试。
参考基因与“突变体”基因之间的点突变和其它序列差异可通过公知技术鉴定，例如，直接DNA测序或单链构象多态性(参见Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，测序引物可与改良PCR产生的双链PCR产物或单链模板分子一起使用。以使用放射性标记核苷酸的常规程序或者通过使用萤光标记的自动测序程序，进行序列测定。克隆DNA节段也可用作检测特异性DNA片段的探针。当与PCR结合时该方法的灵敏度大大提高。另外，点突变和其它序列变异，例如多态性，可参照上述方法检测，例如使用等位基因特异性寡核苷酸对不同于单个核苷酸的序列进行PCR扩增。
在变性试剂存在或不存在下改变DNA片段的凝胶电泳迁移率，或直接对DNA测序都可以检测到DNA序列的差异(例如Myers等，Science(1985)2301242))。特定位置的序列变化可通过核酸酶保护试验揭示，例如RNase和S1保护，或者化学切割方法发现(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401)。
除了常规凝胶电泳和DNA测序之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突变也可用原位分析加以检测(例如，参见Keller等，DNA Probes，2ndEd.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，换言之，可分析细胞内DNA或RNA序列的突变，无需分离或固定在膜上。萤光原位杂交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的综述已有很多报导(例如，参见Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，and Trask等，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本发明另一实施例中，构建包括本发明核酸分子的寡核苷酸探针阵列，对遗传变体、突变和多态性进行有效筛选。阵列技术方法是公知的，获得广泛应用，可用来解释分子遗传方面的各种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(例如，参见M.Chee等，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一实施例中，按照PCT申请WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等((1996)Nat.Biotech.141675-1680))；以及Schena，M.等((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619))描述的方法制作和使用阵列。寡核苷酸对的范围从2至1,000,000以上。应用光引导化学法在基质的指定区域上合成低聚物。基质可以是纸、尼龙或其它种类的膜、过滤器、芯片、玻璃载片或其它任何合适的固相支持物。另外，参照PCT申请WO95/251116(Baldeschweiler等)中描述的方法，使用化学偶联程序和喷墨应用装置可在基质表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系统、热学、紫外线、机械或化学结合程序，以类似斑点(或狭线)印迹的“栅格”阵列将cDNA片段或寡核苷酸设置和连接于基质表面上。阵列，例如上述的那些阵列，可用人手或现有设备(斑点印迹或狭线印迹装置)、材料(任何合适的固相支持物)和机器(包括自动仪器)制作，它们可含有8、24、96、384、1536或6144个寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之间的任何数目，该数目能够使阵列有效地应用于市场上买到的仪器中。
除了上述讨论的方法之外，通过包括测定受试者样品中多肽或mRNA水平异常增加或减少的方法可以诊断疾病。采用本领域公知的任何方法可以在RNA水平上测定表达减少或增加，以便对聚核苷酸作定量分析，例如核酸扩增，如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹和其它杂交方法。
可用来确定从宿主获得的样品中本发明的多肽水平的测定技术已为本领域技术人员所知，在上文提到的一些文献中已有讨论(包括放射性免疫试验、竞争结合试验、Western印迹分析和ELISA试验)。本发明该方面提供一种诊断方法，其包括以下步骤(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将上述一种配体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。
测定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS还可为诊断多肽表达的变化或异常水平提供基础。在适合形成复合物的条件下将正常哺乳动物受试者，优选是人的体液或细胞抽提物与针对多肽的抗体结合，确立多肽表达的正常值或标准值。标准复合物形成的数量可用各种方法定量测定，例如光度计装置。
特异性结合本发明的多肽的抗体可用来诊断以多肽表达为特点的症状或疾病，或者用在试验中监测以本发明的多肽、核酸分子、配体和其它化合物治疗的病人。用于诊断目的的抗体可以用上述关于治疗所述的相同方法制成。对多肽的诊断分析包括利用抗体和标记检测人体液或者细胞或组织抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修饰或不作修饰，将它们与报导分子共价或非共价结合加上标记。可以应用本领域已知的各种各样报导分子，其中一些已在上文作了描述。
将在受试者活体组织获得的对照样品和患病样品中表达的多肽数量与标准值作比较。标准值与受试者值之间的偏差建立诊断疾病的参数。可用诊断分析区分多肽不存在、存在和过度表达，并监测治疗干预期间多肽水平的调节。这些分析也可用来评估动物研究、临床试验或个体病人的监测治疗中特定治疗方案的疗效。
本发明的一种诊断试剂盒可包括(a)本发明的核酸分子；(b)本发明的多肽；或者(c)本发明的配体。
本发明一方面提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括第一容器，其含有在严谨条件下与本发明的核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，其含有用来扩增该核酸分子的引物；以及为方便诊断疾病而使用的该探针和引物的使用说明书。这种试剂盒还可包括装有消化未杂交RNA的试剂的第三容器。
本发明另一方面也提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括核酸分子阵列，其中至少一个核酸分子是本发明的核酸分子。
为了检测本发明的多肽，一种诊断试剂盒可包括一或多种与本发明的多肽结合的抗体；一种用来检测该抗体与多肽之间结合反应的试剂。
这些试剂盒都可用于诊断疾病或疾病易感性，包括但不限于如下疾病细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其它病理病症。这些疾病优选包括肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、皮肤疾病、肝病、克劳恩病、胃炎、溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其它涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的病症。
以下，将通过举例说明，特别是结合INSP052和INSP055多肽对本发明的各个方面和实施例进行描述。
应明白，在不脱离本发明的范围的情况下可以作出各种改变。


图1(A)全长INSP052多肽序列、成熟分离的INSP052胞外结构域(INSP052EC)、WO04/009834中鉴定的最接近相关序列(SEQIDNO434和SEQIDNO880)的CLUSTALW多重序列对比。(B)INSP052EC与相应的带有组氨酸标签的INSP052EC(INSP052EC-6His)和相应的与Fc融合的INSP052EC(INSP052EC-FC)以及与含有Ig结构域的INSP052片段(INSP052Ig2)的CLUSTALW多重序列对比。Fc序列对应于人免疫球蛋白λ重链IgG1的恒定区的氨基酸246-477；NCBI Acc.No.CAA75302。下划线序列表示预测的信号肽。 表示预测的跨膜结构域。“*”表示对比序列之间相同的残基。“”表示对比序列之间同源残基。
图2人外周血单核细胞(hPBMC)与依次稀释的INSP052EC-6His制剂(以蛋白质制剂的稀释度表示，见实施例4)混合，以ConA刺激该细胞分泌的TNF-α百分比。两条曲线(分别加入交叉号或圆点)代表用两批不同蛋白质获得的结果。
图3人外周血单核细胞(hPBMC)与依次稀释的INSP052EC-6His制剂(以蛋白质制剂的稀释度表示，见实施例4)混合，以ConA刺激该细胞分泌的IL-4(白介素-4)百分比。两条曲线(分别加入交叉号或圆点)代表用两批不同蛋白质获得的结果。
图4人外周血单核细胞(hPBMC)与依次稀释的INSP052EC-6His制剂(以蛋白质制剂的稀释度表示，见实施例4)混合，以ConA刺激该细胞分泌的IL-2(白介素-2)百分比。两条曲线(分别加入交叉号或圆点)代表用两批不同蛋白质获得的结果。
图5人外周血单核细胞(hPBMC)与增大量的INSP052EC-6His(以蛋白质浓度(μg/ml)的对数表示)混合，以ConA刺激该细胞分泌IL-5(白介素5；A)和IL-2(白介素-2；B)的抑制。曲线与X/Y轴之间插入的直线表示IC50值。
图6纯化的CD4+T细胞与增大量的INSP052EC-6His(以μg/ml表示)混合，以ConA刺激该细胞分泌IL-5(白介素5；A)和IL-2(白介素-2；B)的抑制。在ConA存在(有)或不存在(无)下以及在ConA和地塞米松(Dex；0.1mg/kg)都存在下比较细胞因子分泌的效果。
图7用ConA攻击后8小时(见实施例6)，INSP052EC电迁移的动物(pDEST12.2 INSP052-6HIS)中丙氨酸氨基转氨酶(ALAT，A)和天冬氨酸氨基转氨酶(ASAT，B)的血液水平与空载体(pDEST12.2)对照动物和人IL6-电迁移动物(pDEST12.2hIL6-SII)相比有所下降。星号表示下降水平具有统计学意义(星号越多，下降幅度越大)。
图8在INSP052EC-6His-和hIL6-SII-电迁移的动物中TNF-α与IL-6细胞因子水平(见实施例6和图7)。
图9将两种剂量的INSP052EC-6His给予小鼠后再与ConA接触所获得的效果。注射ConA后8小时测量ASAT(A)和ALAT(B)的血液水平(见实施例6)。
图10先注射INSP052EC-6His再给予LPS对血液中释放出IL-6(A)或TNF-α(B)的影响。小鼠被分别给予所示浓度的蛋白质、地塞米松(Dex；0.1mg/kg)、或仅注射对照介质(见实施例7)。星号表示下降水平具有统计学意义(见图7)。
图11瞬时表达INSP052EC-6His的HEK293细胞对血液中LPS诱导释放出TNF-α的影响。小鼠被分别给予所示体积的表达INSP052EC-6His的胶囊细胞、或有或无地塞米松(Dex；0.1mg/kg)的对照细胞(HEK)(见实施例7)。星号表示下降水平具有统计学意义(见图7)。
图12先注射INSP052EC-6His再给予LPS对血液中释放出IL-6(A)或TNF-α(B)的影响。小鼠被分别给予所示浓度的蛋白质、地塞米松(Dex；0.1mg/kg)、或仅注射对照介质(见实施例8)。星号表示下降水平具有统计学意义(见图7)。
具体实施例方式
实施例1INSP052和INSP055序列将SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14和SEQ ID NO16结合所产生的多肽序列代表INSP052的连续外显子的翻译，该多肽序列可通过人基因组序列产生。代表INSP055的聚核苷酸和多肽序列SEQ ID NO17和SEQ ID NO18分别是INSP052的小鼠直向基因同源物(orthologue)的聚核苷酸和多肽。可以预测，SEQ ID NO16和SEQ ID NO18分别代表的INSP052和INSP055多肽序列含有信号肽序列和一个跨膜跨越结构域。具体地说，已经在DNA和蛋白质水平上鉴定了胞外结构域的全长序列和成熟序列(SEQ ID NO19-22)。
如WO 03/93316所描述，INSP052全长预测序列编码VEGF/PDGF受体相关的长416个氨基酸的I型膜蛋白，它属于免疫球蛋白超家族。推定信号序列由INSP052的氨基酸1-33组成。预测的跨膜TM结构域由INSP052的氨基酸241-263组成。所以，成熟INSP052的胞外结构域由INSP052的氨基酸34-240组成。后一序列与文献公开的两个序列SEQIDNO434和SEQIDNO880(WO 04/009834；SEQ ID NO27和28)相似。
INSP052EC的变体(成熟INSP052的胞外结构域；SEQ ID NO22)或其相应的全胞外结构域(SEQ ID NO20)可按以下方法产生将该蛋白质的N-和/或C-端与异源蛋白序列融合，以便当采用重组DNA技术生产时有利于它的产生、纯化和稳定性。现有文献已对融合蛋白的构建、纯化、检测、成熟和使用的基团、配体、接头的设计以及方法和策略进行了广泛讨论(Nilsson J等，Protein Expr Purif，111-16，1997；“Applications of chimeric genes andhybrid proteins“Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000)。
这些融合蛋白的其它例子是包括另一种蛋白质的信号肽(如人生长激素或β2-微球蛋白)、纯化标签(如组氨酸标签或HA标签)、不同膜结合蛋白的胞外结构域、分泌性蛋白质(如细胞因子或白蛋白等血清蛋白)、起始甲硫氨酸(为的是允许例如在大肠杆菌中直接表达)、含有内肽酶识别位点的接头区(有利于除去异源蛋白序列)、或者来自人免疫球蛋白的Fc区(图1B)的那些。
对于INSP052EC融合的一或多个这些序列的选择与所述重组蛋白的特定用途和/或纯化方案有函数关系。例如，可用包含白蛋白序列的融合蛋白，或者如实施例所示用INSP052EC-6HIS(SEQ ID NO29)(一种有利于检测和纯化的组氨酸标签序列)测试INSP052EC的活性。
另一个选择是，包含INSP052EC的融合蛋白可按如下方法获得将该序列与免疫球蛋白结构域恒定区(一个已知可提高重组蛋白质在循环中的稳定性和功效的蛋白质结构域)相连接。通过采用适当的表达载体，使获得的融合蛋白能够被哺乳动物细胞(如CHO或HEK293细胞)直接表达，这样，该融合蛋白可在培养基中分泌。
现有文献已经公开了产生包含免疫球蛋白片段的融合蛋白的不同策略(WO 91/08298；WO 96/08570；WO 93/22332；WO 04/085478；WO02/66514)。例如，可在一表达载体中克隆编码成熟INSP052EC的核酸序列，而所述表达载体又与一核酸序列融合，后者的5’端编码原始INSP052EC信号序列(或任何其它合适的信号序列)，3’端编码人免疫球蛋白λ重链IgG1的恒定区(NCBI Acc.No.CAA75302)(SEQ ID NO30)。得到的载体可用来转化CHO或HEK293细胞系，并且可选择一些克隆，它们能稳定地表达和分泌N-末端带有INSP052EC而C-末端带有IgG1序列的重组融合蛋白。再用该克隆进行大规模生产并在培养基中提纯重组融合蛋白。或者，可使核酸编码人免疫球蛋白λ重链IgG1的恒定区和INSP052EC的位置对换，仍然可以用INSP052的原始信号序列或任何其它合适的信号序列使如此得到的蛋白质表达和分泌。
允许INSP052EC多聚化的其它蛋白质序列是从诸如hCG(WO97/30161)、胶原X(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白质(WO98/02540)或卷曲螺旋肽(WO 01/00814)等蛋白质分离出来的结构域。
这些融合蛋白所包含的附加序列可以在纯化结束时或者有需要时，可通过任何合适的内肽酶/外肽酶在体内被消除。例如，重组蛋白质所包含的接头序列可递呈内肽酶(如caspase)的识别位点，以便在体内或体外使所希望的蛋白质与异源序列通过酶解方式分离。另一个选择是，如果被表达的蛋白质序列不含有起始甲硫氨酸(例如，如果序列仅编码蛋白质的成熟序列，没有信号肽)，可将本发明的蛋白质正确地表达在带有起始甲硫氨酸的宿主细胞内。然后，该附加氨基酸可保留在得到的重组蛋白质内，或者以外肽酶(如甲硫氨酸氨基肽酶)按照已公开的方法将它除去(Van Valkenburgh HA andKahn RA，Methods Enzymol.，344186-193，2002；Ben-Bassat A，Bioprocess Technol.，12147-59，1991)。
实施例2INSP052胞外结构域的克隆按照WO 03/093316描述的方法，用来自人基因组DNA的外显子组装件(exon assembly)克隆编码INSP052的全胞外区(氨基酸1-240)的DNA。然后，使蛋白质表达并纯化为组氨酸标签的融合蛋白(INSP052EC-6His；SEQID NO29)。
实施例3带His标签的INSP052胞外结构域(INSP052EC-6His-V1质粒)在哺乳动物细胞中的表达按照WO 03/093316描述的方法，构建带His标签的INSP052胞外结构域(INSP052EC-6His-V1)的表达载体、转染构建体，其中该构建体是用来使表达埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎肾293细胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)转染，以及纯化重组蛋白质INSP052EC-6His。再以该蛋白质进行一系列的功能试验。
实施例4以人PBMC进行的细胞因子表达调节试验4.1.简介以下基于细胞的体外试验测定在有利于纯化的组氨酸标签版本(INSP052EC-6His；见实施例2和3)中表达的INSP052EC(INSP052的克隆胞外结构域)对细胞因子分泌的作用，所述细胞因子的分泌由作用于人外周血单核细胞(hPBMC)的不同刺激物诱导。建立针对于IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4和IL-10的细胞因子珠子阵列(CBA)试验。具体地说，蛋白质的起始浓度有3种，将3个不同时间点看作3种不同浓度(刺激后24、48和72小时)。
最佳条件是96孔板上每孔100,000个细胞，终体积100μl，在2％甘油(MERCK)中。ConA的最佳浓度是5ng/ml。最佳试验时间是48小时。细胞因子分泌/表达的抑制剂地塞米松(阳性对照)最佳浓度是10-6M。细胞因子分泌/表达的刺激剂人白介素-18(hIL-18，阴性对照)最佳浓度是100ng/ml。
4.2血沉棕黄层的人PBMC的纯化用DMEM(GIBCO)稀释血沉棕黄层1至2。然后在50ml Falcon试管内的15ml Ficoll层中缓慢加入25ml稀释的血液，试管离心(2000rpm，20min，室温，无制动器)。然后收集界面(环)，细胞用25ml DMEM洗涤，然后离心(1200rpm，5min)。这一程序重复三次。由血沉棕黄层获得大约600×106总细胞。
4.3筛选将80μl 1.25×106细胞/ml用DMEM+2.5％人血清+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素-链霉素稀释，然后加入到96孔微滴定板上(NUNC，COSTAR)。
每孔加入10μl(每孔一种条件)蛋白质用PBS+20％甘油稀释(蛋白质终稀释浓度为1/10)。以该蛋白质的系列稀释液重复进行该试验。每孔(每孔一种条件)再加入10μl 50μg/ml ConA(ConA终浓度为5μg/ml)。
为清楚起见，下表给出实验设计

STIM表示ConA(5μg/ml)；Prot表示INSP052EC-6His；Dexa是地塞米松；IL-18是人白介素-18。
4.4CBA分析48小时后，收集细胞上清液，运用人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒(Becton-Dickinson)测定人细胞因子。
i)人Th1/Th2混合捕获珠的制备确定实验所需的分析试管数目。
混合前，使各捕获珠悬液强烈旋涡几秒钟。在每个分析试验中，每种捕获珠取10μl等分试样，加入到一个标有“混合捕获珠”的试管内。使捕获珠混合物彻底旋涡。
ii)测试样品的制备上清液用试验稀释剂(20μl上清液+60μl试验稀释剂)稀释(1∶4)。先把样品稀释溶液混合，再将样品转移到96孔锥形底微滴定板(Nunc)。
iii)人Th1/Th2细胞因子CBA试验步骤取50μl稀释上清液，加入到96孔锥形底微滴定板(Nunc)上。然后加入50μl混合捕获珠，再加入50μl人Th1/Th2PE检测试剂。该96孔板室温培育3小时，避免直接暴露于光中，然后1500rpm离心5分钟。小心地弃掉上清液。在下一步骤中，每孔加入200μl洗涤缓冲液，二次，然后1500rpm离心5分钟，小心地弃掉上清液。之后，向每孔加入130μl洗涤缓冲液，重悬捕获珠沉淀物。最后用流式细胞仪分析样品。利用CBA应用软件、活性碱基(Activity Base)和微软Excel软件分析数据。
4.5结果如图2、3和4所示，以两批不同蛋白质进行实验，INSP052EC-6His能够以剂量依赖方式下调ConA刺激hPBMC分泌出细胞因子(如TNF-α、IL-4和IL-2)。这些结果验证了INSP052EC具有治疗抗炎症和自身免疫疾病的潜在功效。
计算剂量反应对细胞因子分泌的作用(以IC50表示，该浓度是INSP052EC-6His使细胞因子分泌(以pg/ml计)降低至观察到的最大值的一半所需的浓度)，进行更详细分析。得到的抑制曲线(例如以IL-5和IL-2所作的实验，见图5)表明，INSP052EC-6His在μg/ml浓度范围是有效的细胞因子拮抗剂，特别是细胞因子分泌和/或表达的抑制剂TNF-α(IC506-10μg/ml)、IFN-γ(IC503-9μg/ml)、IL-2(IC5012-14μg/ml)、IL-4(IC5014μg/ml)、IL-10(IC5010-15μg/ml)和IL-5(IC5018μg/ml)。
实施例5采用人T细胞进行的细胞因子表达调节试验5.1材料和方法用MACS细胞分离试剂盒(Miltenyl Biotec)按照制造商的指示制备白细胞亚群。参照实施例4所述在血沉棕黄层中分离出hPBMC。小心操作，以确保单细胞悬浮。采用CD4+T细胞分离试剂盒II(产品目录号130-091-155)制备CD4+T细胞制剂。对PBMC细胞计数，离心10分钟，重悬于冷冻PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水pH 7.2，加入了0.5％牛血清白蛋白BSA和2mM EDTA)，悬浮浓度是每毫升2.5×108个细胞(每107个细胞40μl缓冲液)。每107个总细胞加入10μl生物素化的抗体鸡尾酒(与试剂盒一起提供)。悬浮液混合均匀，在4-8℃培育10分钟。每107个细胞加入30μl缓冲液，再按每107个总细胞加入20μl抗生物素化微珠。使悬浮液混合均匀，在4-8℃再培育15分钟。加入10-20倍标记体积的缓冲液，细胞与缓冲液一起洗涤，300xg离心10分钟。全部移去上清液，将细胞重悬于500μl缓冲液，至108个细胞。运用autoMACSTM分选器进行磁分离。按照制造商的指示制作autoMACSTM分选器并使其引发。将含有带磁性标记的细胞的试管放在autoMACSTM分选器内，选择“去除分选”程序。收集阴性组分(出口“negl”)。该组分代表富集CD4+T细胞。若需要，接着可收集阳性组分(出口“posl”)。该组分代表带磁性标记的非CD4+T细胞。
按照上文对hPBMC那样，进行筛选和CBA试验。
5.2结果用ConA刺激后，在纯化的CD4+T细胞中看到INSP052EC-6His导致hPBMC分泌的细胞因子减少。这种对细胞因子分泌的作用与hPBMC测到的结果是一致的，与样品中加入的蛋白质数量成正比，也比得上常见抗炎化合物导致的减少量(图6)。
实施例6暴发型肝炎小鼠模型6.1简介因为已经发现，INSP052EC蛋白质(在重组型式INSP052EC-6His中表达)在体外抑制ConA刺激人外周血单核细胞(hPBMC；见实施例4)以及CD4+T细胞(实施例5)分泌各种细胞因子，所以决定通过电迁移在体内ConA模型中测试INSP052EC的活性。
6.2背景-伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝炎毒性肝病是人类的一个全球性健康问题，至今尚未找到对其实施的药理治疗方案。例如，导致肝硬化的活动性慢性肝炎是一种由活化T细胞逐渐破坏肝脏实质细胞的病态。ConA诱导肝中毒是三个小鼠内T细胞依赖性细胞凋亡和坏死性肝损伤实验模型中之一。用活化抗-CD3单克隆AB或者用超抗原SEB攻击已被Ga1N(D-半乳糖胺)致敏的小鼠，诱发严重的细胞凋亡和继发性坏死性肝损伤(Kusters S，Gastroenterology.1996 Aug；111(2)462-71)。为未被致敏的小鼠注射T细胞促有丝分裂植物凝集素ConA，也能导致肝细胞凋亡，继而发展为坏死。ConA诱导全身释放出TNF-α和IFN-γ以及各种其它细胞因子。TNF-α和IFN-γ是肝损伤的重要介导剂。攻击后8小时释放出转氨酶，表示肝脏已严重受损。
已经知道，有几类细胞参与肝损伤，如CD4T细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞(Kaneko J Exp Med 2000，191，105-114)。抗-CD4抗体阻断T细胞的活化因而阻止肝损伤(Tiegs等，1992，J Clin Invest 90，196-203)。用针对CD8的单抗预处理小鼠也无法保护肝免受损伤，而消除了巨噬细胞能够防止诱发肝炎。
为了弄清楚INSP052EC作为含有IgG样结构域的TNF-α/IL-4细胞因子拮抗剂蛋白质在ConA诱导的肝炎中所起的作用，进行了本研究。已经知道，有几种细胞因子是诱导ConA诱发型肝损伤或者保护免于ConA诱发型肝损伤的关键。例如，TNF-α是注射ConA后产生的第一种细胞因子，而抗TNF-α抗体可保护免于致病(Seino等，2001，Annals of surgery 234，681-688)。IFN-γ似乎也是肝损伤的重要介导剂，这是因为对以ConA治疗的动物所测量的血液转氨酶水平下降，表明抗IFN-γ抗血清对小鼠提供的保护作用相当大(参见Kusters等，同上)。当肝受损后，观察到自身免疫病或病毒性肝炎病人的IFN-γ产生增多。另外，肝脏中表达IFN-γ的转基因小鼠也发展为肝损伤，类似于活动性慢性肝炎(Toyonaga等，1994，PNAS 91，614-618)。IFN-γ也可使肝实质细胞发生细胞中毒，这是因为IFN-γ诱体外导小鼠肝实质细胞发生细胞死亡，而TNF-α加速了这一过程(Morita等，1995，Hepatology 21，1585-1593)。
其它分子对ConA模型具有保护作用，已经对这方面作了描述。单独给予rhIL-6(重组人白介素-6)能完全抑制转氨酶的释放(Mizuhara等，1994，J.Exp.Med.179，1529-1537)。
6.3将cDNA电转移到肌纤维以使感兴趣的蛋白质(INSP052EC)全身表达对于体内基因转移的非病毒性技术中，最简单、低廉和安全的技术是将质粒DNA直接注射到肌肉再进行电穿孔法。肌纤维具有有丝分裂后性质和寿命长的特点，因此可稳定地表达转染基因，尽管转染DNA通常不发生染色体整合(Somiari等，2000，Molecular Therapy 2，178-187)。一些报导已证明，用电穿孔法处理相应的cDNA，可使肌肉产生的蛋白质分泌进入血流中(Aihara H and Miyazaki J，1998，Nature Biotech 16，867-870)。还有人证实了表达肌肉的EPO和IL-18BP在疾病模型中的体内功效(Rizzuto等，2000，Human Gene Therapy 41，1891-1900；Mallat Z等，2001，CirculationResearch 89，E41-45)。
6.4材料和方法6.4.1动物所有研究均选用雄性C57/BL6鼠(8周龄)。一般地，每个实验组有7只动物。在标准条件和12小时光暗循环中饲养小鼠，随意提供辐照食物和饮水。
6.4.2肌电转移6.4.2.1载体的选择在截然不同的Gateway兼容性pDEST12.2载体中克隆带StrepII标签的人IL6(hIL6-SII)和INSP052EC-6His基因，其中蛋白质的表达受CMV启动子的控制。
6.4.2.2电穿孔方案用气体(isofluran Baxter，RefZDG9623)麻醉小鼠。切开后肢皮层，施加回声影像凝胶。在后胫肌注射透明质酸酶(20U，在50μl 0.9％无菌氯化钠中，Sigma Ref.H3631)。10分钟后，在同一块肌肉注射100μg质粒(每腿50μg，在25μl 0.9％无菌氯化钠中)。进行肌内注射之前制备好在缓冲液PBS-L-谷氨酸酯中的DNA(6mg/ml；L-谷氨酸酯，Sigma P4761)。进行电转移时，用ElectroSquarePorator BTX ref ECM830给每只腿施加电场，操作条件是两个圆形电极(直径0.5mm)、以单极方式相隔1秒施加10次脉冲，每次脉冲75V，20毫秒。
6.4.3ConA模型6.4.3.1ConA静脉注射和血液取样8周龄雌性C57/B16小鼠购自IFFA CREDO。静脉注射18mg/kg ConA(Sigma ref.C7275)，在注射后1.5小时和8小时分别抽取血液样品。处死动物时，从心脏抽取血液。
6.4.3.2血液样品中细胞因子和转氨酶的检测运用TH1/TH2 CBA试验测定IL2、IL5、IL4、TNF-α和IFN-γ细胞因子的水平。运用炎症CBA试验测定TNF-α、IL-6、MCP1、IFN-α、IL-10和IL-12的水平。运用COBAS仪器(Hitachi)测定转氨酶(ALAT和ASAT)的血液参数。
6.4.3.3表达人INSP052EC-6His和hIL-6-SII的载体的电转移第0天，进行pDEST12.2.-INSP052EC、pDEST12.2-hIL-6以及对照空载体的电转移(电转移方案见上文)。电转移后第5天，静脉注射ConA(18mg/kg)，在两个时间点(1.5小时和8小时)抽取血液样品。
6.4.3.4ConA模型中INSP052和IL6蛋白质预处理注射ConA之前30分钟，皮下注射产生的CHO细胞、重组hIL-6或者产生的HEK293细胞和重组INSP052-6His。
6.5结果我们在上文(见实施例4和5，图2-6)已表明，表达HEK293细胞的INSP052EC-6His蛋白质能以剂量依赖方式在体外使ConA刺激hPBMC分泌出的TNF-α和IL-4(及其它细胞因子)数量减少。因为这两种细胞因子对T细胞诱导的ConA诱导型肝炎有重要作用，所以我们在该模型中测试了INSP052EC cDNA和蛋白质。
采用电转移方法全身输入INSP052EC-6His后，该蛋白质保护暴发型肝炎小鼠模型免于发生肝损伤。由图7可见，在ConA攻击后8小时，INSP052EC-6His电转移的动物与空载体对照动物相比，转氨酶水平有所下降。此外，这些动物中的TNF-α和IL-6细胞因子水平也明显降低(图8)。请注意，这种作用与用阳性对照载体pDEST12.2hIL-6-SII获得的作用相似，甚至更重要(图7和8)。
注射ConA之前先给予纯化的INSP052EC-6His重组蛋白质，并测试了它的保护作用。当以皮下方式注射时，在ConA攻击后8小时后，INSP052EC蛋白质(1mg/kg，或0.3mg/kg)使ASAT和ALAT水平大幅降低(图9)。
6.6结论我们的实验已经表明，INSP052EC在ConA刺激的hPBMC试验中能体外导致诸如TNF-α、IL-4和IL-2等细胞因子的表达和/或分泌下调。另外，在暴发型肝炎体内模型中输入INSP052EC cDNA能减低TNF-α和m-IL-6血清水平，而且对转氨酶在血清中的减低有明显作用，这已经由皮下注射INSP052EC蛋白质证实了。
天冬氨酸氨基转氨酶(ASAT)和丙氨酸氨基转氨酶(ALAT)水平的降低可能是由于TNF-α和IL-4水平降低所致。TNF-α和IL-4是重要的细胞因子，在注射ConA后参与诱导肝脏损伤。在此肝炎小鼠模型中，TNF-α主要由肝巨噬细胞(也叫Kupfer细胞)产生，而IL-4由肝(天然杀伤T)NKT细胞产生。抗TNF-α抗体能保护免于致病(Seino等，2001，Annals of surgery 234，681)，抑制NKT细胞产生IL-4也被证实在T细胞介导的小鼠肝炎中保护肝脏(Ajuebor等，2003 J.Immunology 170，5252-9)。
INSP052EC可用于治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病以及酒精性肝衰竭。它治疗其它炎症疾病也是有效的。
实施例7INSP052EC-6His在LPS诱导小鼠释放细胞因子中的细胞因子表达调节性质7.1简介在LPS诱导小鼠释放TNF-α和IL-6的模型中，注射重组蛋白质或者表达INSP052EC-6His的胶囊瞬时转染HEK293细胞，测试INSP052EC阻止细胞因子在体内释放的能力。
使表达重组蛋白质的细胞胶囊化，可以弄清楚连续体内给予蛋白质的潜在治疗作用，如具有肿瘤抑制功能的蛋白质所示那样(Visted T等，2003，Hum Gene Ther.，14，1429-40).。
LPS(脂多糖)是革兰氏阴性细菌外膜的重要组分，其列举的最好特性是先天识别能力，它通过与CD14和Toll受体4结合可使巨噬细胞或小胶质细胞产生可靠的炎症反应(Lehnardt S等，2002，J Neurosci.，22，2478-2486)。现有文献普遍采用LPS来激活各种细胞，譬如说巨噬细胞、小胶质细胞和内皮细胞，特别是与肝病有关的细胞(Jirillo E等，2002，J Endotoxin Res.，8，319-327)。
7.2材料和方法7.2.1表达INSP052EC-6His的瞬时转染HEK293细胞的胶囊化7.2.1.1细胞的维持将表达埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎肾293细胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)维持在不含Ex-cell VPRO血清的培养基悬浮液中(维持培养基，JRH，UK)，所述培养基装在旋转烧瓶(Techne，UK)中，加入了4mM L-谷酰胺(Invitrogen)和1ml/L酚红溶液(0.5％ w/v，溶剂为水，酚红Sigma，USA)。
7.2.1.2细胞转染在转染当日，将细胞离心，重悬于旋转瓶(DasGip，D)中250mLDMEM/F12(1∶1)培养基，该培养基含有1％ FBS和4ml/l ITS-X补充物(移种培养基，全部来自Invitrogen)，重悬密度为1×106细胞/ml。运用PEI方法以PEIDNA之比为2∶1转染细胞。将500μg相应的质粒(pDEST12.2-INSP052EC)与1mg PEI(Polysciences，USA)在100mL移种培养基中混合，室温培育10分钟。将该混合物加在细胞悬浮液中，37℃培养90分钟。培育后将细胞悬浮液离心(200xg，10分钟，4℃)，细胞沉淀重悬于500ml维持培养基中。在潮湿大气、5％ CO2和37℃条件下培育细胞直至进行胶囊化。
7.2.1.3细胞胶囊化运用Inotech研究胶囊包装系统(Inotech，CH)对以pDEST12.2-INSP052EC转染的HEK293EBNA细胞或者未转染的HEK293EBNA细胞(对照细胞)进行胶囊化，使其成为海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐(APA)胶囊。细胞离心(200xg 10分钟，4℃)并重悬于2ml洗涤缓冲液(全部化学物质来自Inotech，CH)中。向该悬浮液缓慢加入1.5％海藻酸盐溶液，获得了细胞终浓度是2.5×106细胞/ml的溶液。将海藻酸盐-细胞悬浮液充入与胶囊包装机连接的注射器中(Braun Omnifit，Braun，D)。
按照下列参数进行胶囊化-注射泵275(50ml注射器)或456(20ml注射器)-阳极电压1.16kV-振动频率1943Hz-振幅3胶囊化方案如下-聚合缓冲液10分钟(体积250ml)-聚赖氨酸10分钟(体积150ml)-洗涤缓冲液1分钟(体积150ml)-洗涤缓冲液5分钟(体积150ml)-0.03％海藻酸盐5分钟(体积150ml)-洗涤缓冲液1分钟(体积150ml)-脱聚合缓冲液10分钟(体积300ml)-洗涤缓冲液1分钟(体积150ml)-洗涤缓冲液5分钟(体积150ml)-培养基(Excell-V-Pro)体积100ml全部缓冲液的制备都按照制造商的手册，在无菌条件下用无菌蒸馏水制成。在胶囊化最后一步中，将胶囊重悬100ml维持培养基中并转移到一个无菌旋转瓶(Dasgip，D)。使胶囊在潮湿大气、5％ CO2和37℃条件下培育，过夜，或者培育至注射给动物。
7.2.2LPS诱导的细胞因子释放体内模型按照WO98/38179的方法，建立LPS-诱导TNF-α和IL-6释放的小鼠模型。采用雄性C57/BL6或C3H/HeN小鼠(8周龄；Charles River，France)。一般地，每个实验组有10只动物。在标准条件和12小时光暗循环中饲养小鼠，随意提供辐照食物和饮水。
向小鼠皮下注射LPS(O111B4(Sigma，Switzerland)，0.3mg/kg)。90分钟后，抽取血液样品，用ELISA试剂盒(R&D Duoset ref.DY206)测量TNF-α。150分钟后，用市售ELISA试剂盒(R&D Duoset ref.DY206)测量IL-6水平。将参考化合物地塞米松溶解在PBS中，给予LPS之前15分钟注射地塞米松(0.1mg/kg，皮下)。
从培育器皿中取出含有HEK293细胞(对照细胞或瞬时表达INSP052EC-6His的细胞)的微胶囊悬浮液，在层流净化器中静置几分钟，让胶囊沉降。除去澄清上清液，小心地将浓缩胶囊放入注射器内。用0.7mm号针(ref53158.01 Polylabo，CH)给每只小鼠缓慢地注射700μl胶囊。注射胶囊后第3天，注射LPS。
7.3结果两个给予INSP052EC的模型都证实了，INSP052EC具有减少LPS诱导血液释放TNF-α或IL-6的能力。
给予LPS之前15分钟注射INSP052EC-6His能减少LPS诱导释放IL-6(如果INSP052EC-6His的给予量至少为0.1mg/kg)和TNF-α(如果INSP052EC-6His的给予量至少为1mg/kg)，具有统计学意义，与参考化合物地塞米松相似。以注射了注射溶液(PBS-BSA，含有0.02％甘油)的小鼠为阴性对照(图10)。
当瞬时表达INSP052EC-6His的HEK293细胞以所示的全部测试胶囊体积注射时，也获得了类似阳性效果(图11)。
实施例8INSP052EC-6His在接触超敏性模型中的性质8.1简介在半抗原诱导的接触超敏性行(CHS，一种炎症皮肤疾病小鼠模型)中测试了INSP052EC。CHS是一种由T细胞介导的皮肤炎症模型，为过敏性接触皮炎或牛皮癣等相似炎症疾病(这些疾病都是与细胞因子过度产生有关的皮肤问题，医学上仍未得到解决)的成熟模型(Nakae S等，2003，IntImmunol.，15251-260；Gorbachev AV and Fairchild RL，2001，Crit RevImmunol.，21451-72).。
8.2材料和方法使用前才用丙酮/橄榄油(4∶1)稀释半抗原DNFB(2，4-二硝基氟苯；Sigma Chemical Co.)。用30μl 0.5％ DNFB溶液涂在刮过的背部皮肤上或者未作处理的左边，使小鼠致敏。5天后攻击小鼠，即将非刺激剂量10μl0.2％ DNFB加在右耳两侧，并将相同量的溶剂单独加在左耳上，引发CHS。第6天用卡尺(Mitutoya)测量耳朵厚度。
按下式计算耳朵肿胀((T6-T5)右耳)-((T6-T5)左耳)其中，T6和T5分别代表致敏攻击后第6天和第5天的耳朵厚度值。为了确保测到的肿胀是由对DNFB特异的炎症而不是非特异性刺激所引起，每组实验还包括一只未致敏但受到攻击的小鼠。
第5天对小鼠作如下处理皮下注射所示数量的INSP052EC-6His、地塞米松(1mg/kg)或仅给予PBS(对照组)。
8.3结果我们表明，INSP052EC以剂量依赖方式明显地减轻耳朵肿胀，提示白细胞浸润减少，随后发生炎症的机会也减少，所以证明了INSP052EC能够用来治疗T细胞介导的皮肤炎症，如过敏性接触皮炎和牛皮癣。
这些实验清楚地表明，INSP052(INSP052EC)的分离的胞外结构域(同样地，含有这种蛋白质序列或全长蛋白质的变体或融合蛋白)可用来调节细胞因子活性，特别是用作细胞因子分泌和/或表达的拮抗剂，可以在与先天或后天免疫反应有直接或间接关系的疾病中发挥治疗作用。
由被测试的INSP052EC基分子在采用不同细胞的试验和动物模型中所显示的抑制活性的范围确定，使用此类分子可以阻断细胞因子由于过度或不适当地局部产生而引致的病理-生理作用。通过INSP052EC基分子可以控制与促炎细胞因子延长产生相关的细胞事件，所以这些分子可用来拮抗异常的炎症状态，尤其是累及各种组织和器官(例如肝脏、皮肤、肺、中枢神经系统)的自身免疫疾病和炎症疾病相关的异常状态，并且为肿瘤、神经系统障碍、心血管疾病和传染性疾病提供了一个全新治疗机会。采用细胞因子试验，其中抽取自感染了其它疾病的病人的样品显示细胞因子过度表达和/或分泌，也可以鉴定INSP052EC基分子的其它临床应用(Wong CK和LamCW，Adv Clin Chem.2003，371-46；Whiteside TL，Biotechniques，2002，Oct.Suppl4-8，10，12-5)，由此论证了INSP052EC基分子作为细胞因子拮抗剂的治疗用途。
序列信息备注对于外显子-外显子连接编码的氨基酸，它们将被指定为more 5’外显子。
SEQ ID NO 1(INSP052外显子1核苷酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGSEQ ID NO 2(INSP052外显子1多肽序列)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDSEQ ID NO 3(INSP052外显子2核苷酸序列2)1ACCCCCTGGA GGGGGTGAAC ATCACCAGCC CCGTGCGCCT GATCCATGGC ACCGTGGGGA61AGTCGGCTCT GCTTTCTGTG CAGTACAGCA GTACCAGCAG CGACAGGCCT GTAGTGAAGT121GGCAGCTGAA GCGGGACAAG CCAGTGACCG TGGTGCAGTC CATTGGCACA GAGGTCATCG181GCACCCTGCG GCCTGACTAT CGAGACCGTA TCCGACTCTT TGAAAATGGC TCCCTGCTTC241TCAGCGACCT GCAGCTGGCC GATGAGGGCA CCTATGAGGT CGAGATCTCC ATCACCGACG301ACACCTTCAC TGGGGAGAAG ACCATCAACC TTACTGTAGA TGSEQ ID NO 4(INSP052外显子2蛋白质序列)1PLEGVNITSP VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG61TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL TVDVSEQ ID NO 5(INSP052外显子3核苷酸序列)1TGCCCATTTC GAGGCCACAG GTGTTGGTGG CTTCAACCAC TGTGCTGGAG CTCAGCGAGG61CCTTCACCTT GAACTGCTCA CATGAGAATG GCACCAAGCC CAGCTACACC TGGCTGAAGG121ATGGCAAGCC CCTCCTCAAT GACTCGAGAA TGCTCCTGTC CCCCGACCAA AAGGTGCTCA181CCATCACCCG CGTGCTCATG GAGGATGACG ACCTGTACAG CTGCATGGTG GAGAACCCCA241TCAGCCAGGG CCGCAGCCTG CCTGTCAAGA TCACCGTATA CASEQ ID NO 6(INSP052外显子3多肽序列)1PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT61ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI TVYRSEQ ID NO 7(INSP052外显子4核苷酸序列)1GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT CTTCCTCCTT GTGACCTTGG61TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA AAAGSEQ ID NO 8(INSP052外显子4多肽序列)1RSSLYIILST GGIFLLVTLV TVCACWKPSK RSEQ ID NO 9(INSP052外显子5核苷酸序列)1GAAACAGAAG AAGCTAGAAA AGCAAAACTC CCTGGAATAC ATGGATCAGA ATGATGACCG
61CCTGAAACCA GAAGSEQ ID NO 10(INSP052外显子5多肽序列)1KQKKLEKQNS LEYMDQNDDR LKPEASEQ ID NO 11(INSP052外显子6核苷酸序列)1CAGACACCCT CCCTCGAAGT GGTGAGCAGG AACGGAAGAA CCCCATGGCA CTCTATATCC61TGAAGGACAA GSEQ ID NO 12(INSP052外显子6多肽序列)1DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDKSEQ ID NO 13(INSP052外显子7核苷酸序列)1GACTCCCCGG AGACCGAGGA GAACCCGGCC CCGGAGCCTC GAAGCGCGAC GGAGCCCGGC61CCGCCCGGCT ACTCCGTGTC TCCCGCCGTG CCCGGCCGCT CGCCGGGGCT GCCCATCCGC121TCTGCCCGCC GCTACCCGCG CTCCCCAGCG CGCTCCCCAG CCACCGGCCG GACACACTCG181TCGCCGCCCA GGGCCCCGAG CTCGCCCGGC CGCTCGCGCA GCGCCTCGCG CACACTGCGG241ACTGCGGGCG TGCACATAAT CCGCGAGCAA GACGAGGCCG GCCCGGTGGA GATCAGCGCC301TGASEQ ID NO 14(INSP052外显子7多肽序列)1DSPETEENPA PEPRSATEPG PPGYSVSPAV PGRSPGLPIR SARRYPRSPA RSPATGRTHS61SPPRAPSSPG RSRSASRTLR TAGVHIIREQ DEAGPVEISASEQ ID NO15(INSP052外显子1，2，3，4，5，6和7组合的核苷酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG121CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC181AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA301CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT361GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT421GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG541CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCC721CTTTACATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCTTGGT GACAGTCTGT781GCCTGCTGGA AACCCTCCAA AAGGAAACAG AAGAAGCTAG AAAAGCAAAA CTCCCTGGAA841TACATGGATC AGAATGATGA CCGCCTGAAA CCAGAAGCAG ACACCCTCCC TCGAAGTGGT901GAGCAGGAAC GGAAGAACCC CATGGCACTC TATATCCTGA AGGACAAGGA CTCCCCGGAG961ACCGAGGAGA ACCCGGCCCC GGAGCCTCGA AGCGCGACGG AGCCCGGCCC GCCCGGCTAC1021TCCGTGTCTC CCGCCGTGCC CGGCCGCTCG CCGGGGCTGC CCATCCGCTC TGCCCGCCGC1081TACCCGCGCT CCCCAGCGCG CTCCCCAGCC ACCGGCCGGA CACACTCGTC GCCGCCCAGG
1141GCCCCGAGCT CGCCCGGCCG CTCGCGCAGC GCCTCGCGCA CACTGCGGAC TGCGGGCGTG1201CACATAATCC GCGAGCAAGA CGAGGCCGGC CCGGTGGAGA TCAGCGCCTG ASEQ ID NO16(INSP052外显子1，2，3，4，5，6和7组合的多肽序列)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSS241LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKRKQ KKLEKQNSLE YMDQNDDRLK PEADTLPRSG301EQERKNPMAL YILKDKDSPE TEENPAPEPR SATEPGPPGY SVSPAVPGRS PGLPIRSARR361YPRSPARSPA TGRTHSSPPR APSSPGRSRS ASRTLRTAGV HIIREQDEAG PVEISASEQ ID NO17(INSP055小鼠病毒性cDNA)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCAAGA GCCTCCAGGG CTCTGCGCCT CTCTCCTTTT61GTCTACCTGC TTCTCATCCA GCCAGTCCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCAGTA121CGTCTGATCC ACGGCACAGT GGGGAAGTCG GCCCTGCTTT CCGTGCAGTA CAGTAGCACC181AGCAGCGACA AGCCCGTGGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGTG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCTATAG GCACAGAGGT CATTGGCACT CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGG301CTCTTTGAAA ATGGCTCCTT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCGGATGA GGGAACCTAT361GAAGTGGAGA TTTCCATCAC TGACGACACC TTCACCGGGG AGAAGACCAT CAACCTCACC421GTGGATGTGC CCATTTCAAG GCCGCAGGTA TTAGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGTGAGGCCT TCACCCTCAA CTGCTCCCAT GAGAATGGCA CCAAGCCTAG CTACACGTGG541CTGAAGGATG GCAAACCCCT CCTCAATGAC TCCCGAATGC TCCTGTCCCC TGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGAGT ACTCATGGAA GATGACGACC TGTACAGCTG TGTGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGTCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CTGTGTATAG AAGAAGCTCC721CTCTATATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCCTGGT GACAGTTTGT781GCCTGCTGGA AACCCTCAAA AAAGTCTAGG AAGAAGAGGA AGTTGGAGAA GCAAAACTCC841TTGGAATACA TGGATCAGAA TGATGACCGC CTAAAATCAG AAGCAGATAC CCTACCCCGA901AGTGGAGAAC AGGAGCGGAA GAACCCAATG GCACTCTATA TCCTGAAGGA TAAGGATTCC961TCAGAGCCAG ATGAAAACCC TGCTACAGAG CCACGGAGCA CCACAGAACC CGGTCCCCCT1021GGCTACTCCG TGTCGCCGCC CGTGCCCGGC CGCTCTCCGG GGCTTCCCAT CCGCTCAGCC1081CGCCGCTACC CGCGCTCCCC AGCACGTTCC CCTGCCACTG GCCGGACGCA CACGTCGCCA1141CCGCGGGCCC CGAGCTCGCC AGGCCGCTCG CGCAGCTCTT CGCGCTCACT GCGGACTGCA1201GGCGTGCAGA GAATCCGGGA GCAGGACGAG TCAGGGCAGG TGGAGATCAG TGCCTGASEQ ID NO18(INSP055小鼠预测蛋白质)1MKRERGALSR ASRALRLSPF VYLLLIQPVP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDKPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCVVE NPISQVRSLP VKITVYRRSS241LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKKSR KKRKLEKQNS LEYMDQNDDR LKSEADTLPR301SGEQERKNPM ALYILKDKDS SEPDENPATE PRSTTEPGPP GYSVSPPVPG RSPGLPIRSA361RRYPRSPARS PATGRTHTSP PRAPSSPGRS RSSSRSLRTA GVQRIREQDE SGQVEISA
SEQ ID NO19(编码INSP052胞外结构域的核酸序列)1ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT61GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG121CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC181AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG241CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA301CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT361GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT421GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC481AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG541CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG601GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG661AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCCSEQ ID NO20(NSP052的胞外结构域)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST61SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY121EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW181LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSSSEQ ID NO21(编码成熟INSP052胞外结构域的核酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT351GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA401ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT451GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA501GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT551GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC601ACCGTATACA GAAGAAGCTC CSEQ ID NO22(成熟INSP052的胞外结构域)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSSEQ ID NO 23(编码成熟INSP052外显子2的核苷酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC
51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGSEQ ID NO 24(成熟INSP052外显子2的蛋白质序列)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDVSEQ ID NO25(编码成熟INSP052多肽的核苷酸序列)1GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC51GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG101TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT151GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG201ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG251AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG301GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT351GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA401ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT451GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA501GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT551GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC601ACCGTATACA GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT651CTTCCTCCTT GTGACCTTGG TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA701AAAGGAAACA GAAGAAGCTA GAAAAGCAAA ACTCCCTGGA ATACATGGAT751CAGAATGATG ACCGCCTGAA ACCAGAAGCA GACACCCTCC CTCGAAGTGG801TGAGCAGGAA CGGAAGAACC CCATGGCACT CTATATCCTG AAGGACAAGG851ACTCCCCGGA GACCGAGGAG AACCCGGCCC CGGAGCCTCG AAGCGCGACG901GAGCCCGGCC CGCCCGGCTA CTCCGTGTCT CCCGCCGTGC CCGGCCGCTC951GCCGGGGCTG CCCATCCGCT CTGCCCGCCG CTACCCGCGC TCCCCAGCGC1001GCTCCCCAGC CACCGGCCGG ACACACTCGT CGCCGCCCAG GGCCCCGAGC1051TCGCCCGGCC GCTCGCGCAG CGCCTCGCGC ACACTGCGGA CTGCGGGCGT1101GCACATAATC CGCGAGCAAG ACGAGGCCGG CCCGGTGGAG ATCAGCGCCT1151GASEQ ID NO26(INSP052成熟多肽序列)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSLYI ILSTGGIFLL VTLVTVCACW KPSKRKQKKL EKQNSLEYMD
251QNDDRLKPEA DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDKDSPETEE NPAPEPRSAT301EPGPPGYSVS PAVPGRSPGL PIRSARRYPR SPARSPATGR THSSPPRAPS351SPGRSRSASR TLRTAGVHII REQDEAGPVE ISASEQ ID NO27(SEQIDNO880)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS51ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR101LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV151LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK201VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS LSSIWLQEAF251SSLGPWSEQ ID NO28(SEQIDNO434)1MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS51ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR101LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV151LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK201VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS FYIICLKEAS251SSFGPWSEQ ID NO29(带组氨酸标签的成熟INSP052胞外结构域)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSHHH HHHSEQ ID NO30(成熟INSP052胞外结构域的Fc融合子)1VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI51GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG101EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD151GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI201TVYRRSSEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE251VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV301LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM351TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS401KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGKSEQ ID NO31(INSP052Ig2)1VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG51TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL101TVDVPISRPQ VLVASTTVLE LSEAFTLNCS HENGTKPSYT WLKDGKPLLN151DSRMLLSPDQ KVLTITRVLM EDDDLYSCMV ENPISQ
权利要求
1.一种多肽，所述多肽包括或者由两个序列(a)和(b)组成，其中(a)是与以下物质具有至少90％同一性的氨基酸序列i)如SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列；ii)是其片段，该片段具有(i)的多肽的活性；或者iii)是(i)或(ii)的功能等同物；以及(b)是选自以下组内的异源氨基酸序列信号序列、纯化标签、膜结合蛋白质的胞外结构域、分泌蛋白质、起始甲硫氨酸、含有内肽酶识别位点的接头区、或者来自免疫球蛋白分子的Fc区。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括SEQ IDNO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28所示的氨基酸序列。
3.一种多肽，它是权利要求1所述的功能等同物，其特征在于，所述多肽与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列同源，并且具有细胞因子表达和/或分泌拮抗剂的活性。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括或者由SEQID NO29或SEQ ID NO30组成。
5.一种编码上述权利要求中任一项所述的多肽的纯化核酸分子。
6.如权利要求5所述的纯化核酸分子，其特征在于，所述纯化核酸分子包括SEQ ID NO19、SEQ ID NO21所示的核酸序列，或者是其冗余等同物或片段。
7.一种在高度严谨条件下与权利要求5或6所述的核酸分子杂交的纯化核酸分子。
8.一种含有权利要求5至7中任一项所述的核酸分子的载体。
9.一种用权利要求8所述的载体转化的宿主细胞。
10.一种多肽，它包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，用于治疗或诊断疾病。
11.如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞，用于治疗或诊断疾病。
12.一种多肽作为细胞因子表达和/或分泌拮抗剂的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
13.如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞作为细胞因子表达和/或分泌拮抗剂的用途。
14.一种药物组合物，其特征在于所述组合物含有一种多肽，所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
15.一种药物组合物，其特征在于所述组合物含有如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于所述组合物还含有一种附加治疗剂，所述治疗剂是细胞因子拮抗剂或者抗炎药。
17.一种多肽在制备治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
18.如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞在制备治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途。
19.i)一种多肽，它包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，以及ii)一种细胞因子拮抗剂或抗炎药在制备治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途。
20.一种多肽在制备给予病人以治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途，其中所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，所述病人先前已接受了细胞因子拮抗剂或者抗炎药。
21.一种细胞因子拮抗剂或者抗炎药在制备给予病人以治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途，其中所述病人先前已接受了一种多肽，所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ ID NO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
22.i)如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞，以及ii)一种细胞因子拮抗剂或抗炎药在制备治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途。
23.如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞在制备给予病人以治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途，其中所述病人先前已接受了细胞因子拮抗剂或者抗炎药。
24.一种细胞因子拮抗剂或者抗炎药在制备给予病人以治疗自身免疫疾病、病毒性或急性肝病包括酒精性肝脏衰竭、皮肤疾病或炎症的药物中的用途，其中所述病人先前已接受了如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞。
25.一种治疗病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括把一种多肽给予该病人，所述多肽包括的氨基酸序列与SEQ ID NO20或SEQ IDNO22所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还给予一种细胞因子拮抗剂或者抗炎药。
27.一种治疗病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括把如权利要求1至4中任一项所述的多肽、权利要求5至7中任一项所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或者权利要求14至16中任一项所述的药物组合物给予该病人。
28.一种鉴定化合物的方法，所述化合物是SEQ ID NO20或SEQ IDNO22的配体，其特征在于所述方法包括将如权利要求1至4中任一项所述的多肽与推断对所述多肽具有结合亲和性的一或多个化合物接触，以及选择与所述多肽特异性结合的化合物。
29.一种转基因非人动物，所述动物已经转化成表达如权利要求1至4中任一项所述的多肽。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质序列(INSP052EC)在诊断、预防和治疗疾病，特别是与细胞因子过度表达和/或分泌相关的疾病中的新用途，所述蛋白质经本发明鉴定为一种含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子。
文档编号A61P1/16GK1901932SQ200480039777
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者R·J·法根, A·R·戴维斯, C·B·菲尔普斯, C·鲍尔, U·博斯切特, Y·奇韦提克 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司