专利名称：促血管化的组织工程骨及其体外构建方法
技术领域：
本发明涉及一种骨组织的生物替代物即组织工程骨，具体来说是促血管化处理的组织工程骨以及体外构建方法。
背景技术：
由于因创伤或骨病所致的骨缺损在骨科临床十分常见，而现有治疗手段均存在明显缺陷，使得近年来应用组织工程学技术修复骨缺损的研究进展迅速。自1993年Vacanti等利用牛成骨细胞与聚羟基乙酸构建组织工程化骨以来，对骨组织工程中的种子细胞、支架材料、生长因子、培养条件、体内修复等实验项目的研究已经取得阶段性成果，Quarto、杨志明等将此技术试用于临床，获得初步成功。组织工程骨的构建基本方法为将体外培养的种子细胞-成骨细胞复合接种到作为细胞外基质的支架材料上，经过体内或体外培养构建成组织工程骨，植入体内进行骨缺损的修复。
骨缺损的良好修复必须依赖充分的血供，新生血管不仅是氧气、营养物质及代谢废物运输的通道，而且是参与骨修复调控的细胞、信号分子通过的重要路径，即血管化和骨再生是骨愈合过程中的两个最基本环节。体外构建的组织工程化骨，植入体内后同样必须迅速建立充分的血供，为种子细胞功能活动提供充足的营养，只有这样才能保证组织工程化骨的活性和促进骨缺损修复，这在完成较大骨缺损修复时显得尤为重要。
目前促人工骨血管化的技术措施主要有6种。①用血管束包裹复合成骨细胞的可降解支架材料，新血管以枝芽方式长入材料内；②将人工骨植入带有轴心血管的肌肉组织内，预构带血管蒂的组织工程化骨肌骨瓣；③植入组织工程化骨时，就近选择带血管蒂的筋膜瓣包裹移植物；这些是借用体内已经存在的血管条件来促进人工骨的血管化，存在增加创伤、受局部血管条件限制等缺点，从而限制了其临床推广应用。④血管内皮细胞联合成骨细胞与支架材料复合；存在自体血管内皮细胞不易获取、体外扩增能力有限的不足。⑤应用促血管生成的生长因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)，采用均匀吸附于支架材料内的生长因子缓释技术，或者通过基因转染技术促进细胞分泌；这类方法也存在缺点，如由于生长因子对血管生成的作用是网络式的序贯作用，单一因子低浓度作用效果是有限的，而高浓度VEGF作用有诱发血管瘤的危险。⑥尝试上述方法的联合应用。所以，上述六种仍然不能获得令人满意的人工骨的血管化效果。
发明内容
针对现有的组织工程化骨促血管化技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的促血管化的组织工程骨，这种组织工程骨移植后具有持续、局限和缓慢释放促血管生长因子，实现血管生成与骨再生的同时快速启动，从而明显加速骨愈合的优点。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案在体外构建的组织化工程骨上有多个孔隙，在孔隙内有嵌有胶原凝胶，在胶原凝胶中含有促血管生成的生长因子。
所述的促血管生成的生长因子可以采用血管内皮细胞生长因子，在胶原凝胶中的重量含量为50～200μg/ml。
所述的胶原凝胶中的还可以含有10～100μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子，与所述的血管内皮细胞生长因子形成双生长因子共同作用，比采用单一的血管内皮细胞生长因子能够更好的促进血管组织的生成。
在胶原凝胶中还可以含有400～2000U/ml的肝素(U医学上常用的标准单位，125U相当于1mg的剂量)，作为缓释剂控制生长因子释放速率，根据需要通过采用不同的肝素用量以方便地设计血管组织的生成速率。
所述的血管内皮细胞生长因子在胶原凝胶中的最佳含量为100μg/ml。
所述的碱性成纤维细胞生长因子在胶原凝胶中的最佳含量为50μg/ml。
所述的肝素在胶原凝胶中的最佳含量为500U/ml。
本发明还提供了这种促血管化的组织工程骨的体外构建方法，包括(1)体外制备用于组织构建的支架材料制备用于组织工程骨构建的支架材料，在将复合生长因子的部位预留多个孔隙；(2)组织工程骨的体外构建将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；
(3)生长因子的缓释处理将促血管生成的生长因子复合入胶原凝胶中；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
上述方法中，所述的促血管生成的生长因子可以为血管内皮细胞生长因子，其在胶原凝胶中的含量为50～200μg/ml；或血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合成的双生长因子，其中血管内皮细胞生长因子在胶原凝胶中含量为50～200μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子在胶原凝胶中的含量为10～100μg/ml。
在所述的胶原凝胶中还可以含有400～2000U/ml的肝素。
上述方法中，所述的血管内皮细胞生长因子在胶原凝胶中的最佳含量为100μg/ml。
上述方法中，所述的碱性成纤维细胞生长因子在胶原凝胶中的最佳含量为50μg/ml。
上述方法中，所述的肝素在胶原凝胶中的最佳含量为500U/ml。
本发明的促血管化的组织工程骨由于在组织化工程骨的一些局部区域孔隙内复合有促血管生成的生长因子，具有如下有益效果(1)生长因子在组织工程骨中复合的区域为多点的局部方式，避免了均匀复合时对组织工程骨中成骨反应的不利影响。
(2)当将碱性成纤维细胞生长因子引入时，使其与血管内皮细胞生长因子联合应用，协调促进血管生成，避免了单一因子剂量过低时疗效不足，而剂量过高时并发症较多的缺陷。
(3)胶原凝胶即作为生长因子的载体，同时作为缓释材料，延长了生长因子局部释放和作用时间，当胶原凝胶中还复合有作为缓释剂的肝素时，通过肝素用量的变化可以更加方便地设计生长因子局部释放和作用的时间，使血管组织更好的生长。
(4)应用本发明的血管化的组织工程骨的构建方法，使组织工程骨在体外构建，与生长因子的局部复合方式结合，通过控制生产因子的局部浓度和复合位置，可以有效控制血管化的形成。
(5)同现有技术相比，通过该技术构建的血管化组织工程骨在移植时对患者创伤反应小，不损伤局部的其它重要血管。
(6)组织工程骨在移植后，随着组织修复改建的完成，局部血管在初期大量增加后，可以在后期逐渐减少，从而与局部组织功能相协调。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的促血管化的组织工程骨及其体外构建方法作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1(1)体外处理用于骨组织构建的支架材料制备或购买成骨性支架材料(脱蛋白骨衍生材料、羟基磷灰石、磷酸三钙等)，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建利用现有的组织工程技术将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后利用已有技术在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；
(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子与肝素按调和，然后复合入胶原凝胶中，使复合后的胶原凝胶中生长因子及肝素的含量为VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml、肝素500U/ml；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
实施例2(1)体外制备用于组织构建的支架材料制备用于组织工程骨构建的支架材料，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子与肝素按调和，然后复合入胶原凝胶中，使胶原凝胶中生长因子及肝素的含量为VEGF200μg/ml、bFGF10μg/ml、肝素400U/ml；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
实施例3(1)体外制备用于组织构建的支架材料制备用于组织工程骨构建的支架材料，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子与肝素按调和，然后复合入胶原凝胶中，使胶原凝胶中生长因子及肝素的含量为VEGF200μg/ml、bFGF100μg/ml、肝素2000U/ml；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
实施例4(1)体外制备用于组织构建的支架材料制备用于组织工程骨构建的支架材料，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子与肝素按调和，然后复合入胶原凝胶中，使胶原凝胶中生长因子及肝素的含量为VEGF50μg/ml、bFGF30μg/ml、肝素600U/ml；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
将实施例1～4中的组织工程骨移植入兔尺骨中段或羊胫骨中段骨缺损区域，经过术后3天、2周、4周、12周、18周的X线摄片、和移植区域的病理组织分析、血管灌注实验等，发现术后2周内大量的具有血管内皮细胞表型的细胞聚集在胶原凝胶区域，并产生大量的网状血管，术后4～12周血管直径增大，但数量逐渐减少，术后12～18周该区域的血管分布与邻近的组织无明显差异；复合促血管生成物质的组织工程骨与单一的组织工程骨比较骨修复效果，可见前者在术后2周时成骨活动就比后者强，术后4周开始其骨痂和骨修复效果均优于移植单一的组织工程骨。
实施例5(1)体外处理用于骨组织构建的支架材料制备或购买成骨性支架材料(脱蛋白骨衍生材料、羟基磷灰石、磷酸三钙等)，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建利用现有的组织工程技术将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后利用已有技术在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子复合入胶原凝胶中，使复合后的胶原凝胶中生长因子的含量为200μg/m；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
实施例6
(1)体外处理用于骨组织构建的支架材料制备或购买成骨性支架材料(脱蛋白骨衍生材料、羟基磷灰石、磷酸三钙等)，在将复合生长因子的部位钻孔而预留多个孔隙，孔隙直径为2～8mm；(2)组织工程骨的体外构建利用现有的组织工程技术将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后利用已有技术在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子调和，然后复合入胶原凝胶中，使复合后的胶原凝胶中生长因子的含量为VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
将实施例5，6中的组织工程骨移植入兔尺骨中段骨缺损区域，经过术后3天、2周、4周、12周、18周的X线摄片、和移植区域的病理组织分析、血管灌注实验等，发现其促经血管生成的速度和微血管密度均低于实施1～4的效果，但是比未复合促血管生成生长因子的单一组织工程骨显示出更强的促血管生成作用，当大量提高血管内皮细胞生长因子的浓度后，则局部血管生成的质量下降，有时可产生血管瘤、组织水肿等副作用。
权利要求
1.一种促血管化的组织工程骨，其特征在于在体外构建的组织化工程骨上有多个孔隙，在孔隙内嵌有胶原凝胶，在胶原凝胶中含有促血管生成的生长因子。
2.如权利要求1所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于所述的胶原凝胶中含有的促血管生成的生长因子为血管内皮细胞生长因子，其在胶原凝胶中的含量为50～200μg/ml。
3.如权利要求2所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于在所述的促血管生成的生长因子还包括碱性成纤维细胞生长因子，其在胶原凝胶中的含量为10～100μg/ml。
4.如权利要求3所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于所述的胶原凝胶中还含有400～2000U/ml的肝素。
5.如权利要求2或3或4所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于所述的血管内皮细胞生长因子在胶原凝胶中的含量为100μg/ml。
6.如权利要求3或4所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于所述的碱性成纤维细胞生长因子在胶原凝胶中的含量为50μg/ml。
7.如权利要求4所述的促血管化的组织工程骨，其特征在于所述的肝素在胶原凝胶中的含量为500U/ml。
8.一种权利要求1中所述的促血管化的组织工程骨的体外构建方法，包括(1)体外制备用于组织构建的支架材料制备用于组织工程骨构建的支架材料，在将复合生长因子的部位预留多个孔隙；(2)组织工程骨的体外构建将体外大量扩增的相应种子细胞与支架材料复合，然后在体外静态或动态培养一定时间，得到组织工程化骨组织；(3)生长因子的缓释处理将促血管生成的生长因子复合入胶原凝胶中；(4)生长因子的嵌入将含有生长因子的多块凝胶嵌入体外构建的组织工程化骨组织的预留孔隙中。
9.如权利要求8所述的促血管化的组织工程骨的体外构建方法，其特征在于所述的促血管生成的生长因子为血管内皮细胞生长因子，其在胶原凝胶中的含量为50～200μg/ml；或血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子混合成的双生长因子，其中血管内皮细胞生长因子在胶原凝胶中含量为50～200μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子在胶原凝胶中的含量为10～100μg/ml。
10.如权利要求9所述的促血管化的组织工程骨的体外构建方法，其特征在于在所述的胶原凝胶中还含有400～2000U/ml的肝素。
全文摘要
本发明公开了一种新型的促血管化的组织工程骨，在体外构建的组织化工程骨上有多个孔隙，在孔隙内有嵌有胶原凝胶，在胶原凝胶中含有50～200μg/ml的血管内皮细胞生长因子、10～100μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子、400～2000U/ml的肝素。这种体外构建的组织工程骨移植后在早期能够促进移植物内和移植物周围的血管生成，从而为骨再生创造有利条件，使骨愈合效果良好。
文档编号A61L27/00GK1631455SQ200510002378
公开日2005年6月29日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月19日
发明者段小军, 杨柳 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院