专利名称：一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体及其生产工艺，具体地说是阿霉素、表阿霉素和柔红霉素的脂质体和它们的硫酸铵梯度法生产工艺，属于化学制药领域。
背景技术：
蒽环类抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素和柔红霉素是临床上常用的广谱抗肿瘤药物。目前主要应用于乳腺癌、妇科肿瘤、胃肠肿瘤、头颈肿瘤、肺癌、血液系统肿瘤、恶性淋巴瘤等。其中代表药物是阿霉素，又称作多柔比星(doxorubicin)，其抗肿瘤作用原理是抑制DNA合成及依赖DNA的mRNA的合成，及影响线粒体的功能结构。虽然阿霉素作为一线用药用途广泛，但是由它引起的毒副作用是严重的。主要为限制剂量的心脏毒性，主要表现为心律失常、心电图异常，严重的会出现不可逆的心功能衰竭和心肌病；剂量限制毒性还有骨髓抑制，表现为严重的粒细胞减少；此外还有胃肠道反应、脱发、漏出血管导致局部软组织炎症坏死等。这些毒副作用极大地限制了阿霉素的临床应用，使应用累积剂量不能超过550mg/m2。产生这些毒性与阿霉素在体内代谢时间短同时全身分布有关。为有效应用阿霉素降低心脏骨髓毒性，半合成表阿霉素得到临床医生的青睐，其与阿霉素的结构不同在于氨基糖部分的4′位羟基由顺式变为反式。表阿霉素(epirubicin)也是广谱抗肿瘤药物，其引起的心脏骨髓毒性比阿霉素明显减轻。柔红霉素(daunorubicin)又称正定霉素，目前主要用于白血病和一些实体肿瘤化疗，毒性与阿霉素相类似。
脂质体为磷脂双层膜结构，主要成分是磷脂和胆固醇，与人体正常细胞膜相近，因而对人体无毒性无免疫原性，近年来被用于一些抗肿瘤药物的包裹。由于肿瘤血管内皮细胞破坏通透性增高，加上缺乏淋巴回流，脂质体非常容易漏出肿瘤血管到肿瘤间质中。当药物被投放到病灶部位后，药物从脂质体中缓慢释放出来，以单纯扩散形式进入肿瘤细胞，达到降低毒性提高疗效的目的，因此用脂质体包裹蒽环类抗肿瘤药物不失为一种理想的降低毒性提高疗效的方法。
目前国外已有脂质体阿霉素和柔红霉素产品问世。其中脂质体阿霉素为新一代隐形脂质体，美国FDA批准用于艾滋病卡波基肉瘤、卵巢癌和转移性柔腺癌的治疗，商品名为Doxil(美国)/Caelyx(欧洲)。另外，脂质体柔红霉素(商品名为DaunoXome)也得到FDA批准上市。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一种毒副作用小、稳定性高、体内循环时间长的蒽环类抗肿瘤药物脂质体。
本发明要解决的另一个技术问题是提供这种蒽环类抗肿瘤药物脂质体的生产工艺。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体，由蒽环类抗肿瘤药物、脂质体材料和抗氧化剂组成，药/脂比例(w/w)为0.05～0.2∶1；其中脂质体材料包括磷脂和胆固醇，二者的摩尔比为40～60∶30～50mol％；抗氧化剂由α-tocopherol和desferal组成，二者的浓度分别为0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。蒽环类药物被包裹于脂质体水相中。
脂质体材料中还含有DSPE-PEG2000(多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000三者的摩尔比为40～60∶30～50∶4～20mol％。所述磷脂选自神经鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)或氢化磷脂酰胆碱(hydrogenated soybeanphosphatidylcholine，HSPC)中的一种，三者均属刚性磷脂。
所述蒽环类抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素和柔红霉素中的一种，本发明使用的是它们的盐酸盐，国内厂家均可生产。
我们使用DSPC、HSPC和SM分别与胆固醇组成磷脂双层膜结构的脂质体，其中以DSPC和胆固醇组成的脂质体稳定性最好。DSPC(或者SM、HSPC)是组成双层膜的磷脂，是脂质体最基本组成成分。国外上市的Doxil/Caelyx的配方中使用的磷脂是HSPC。本发明中使用DSPC是因为DSPC的酰基链长度一致且相变温度(phase transitiontemperature，Tc)比HSPC为高，所以DSPC作为磷脂双层的脂质体应比HSPC磷脂双层的脂质体更加稳定；胆固醇的作用是降低膜的流动性提高双层膜的稳定性。它们浓度的配比原则是为取得最佳稳定性的脂质体，DSPC(或SM、HSPC)40～60mol％，胆固醇30～50mol％，高于或低于这个浓度比例脂质体都不会稳定，有文献报道胆固醇浓度不能低于30mol％，否则就不会起到任何作用，但是胆固醇浓度又不能高于50mol％，那样反而会加快包裹药物从脂质体中渗漏出来。
本发明提高药物稳定性是通过在配方中加入微量的α-tocopherol和desferal实现的。它们的作用一个是抑制磷脂和胆固醇的水解和氧化，另一个作用是抑制包裹于脂质体水相中的蒽环类药物的氧化。稳定性试验表明，在本发明配方剂量下合用这两个抗氧化剂的脂质体的渗漏率远远低于只用其中一种抗氧化剂的脂质体。合理使用这两种抗氧化剂是本发明专利的最主要特点，同时区别于国外同类产品。如国外上市的Doxil/Caelyx的配方中使用的是组氨酸(histidine)以提高脂质体阿霉素的稳定性，而我们则选择了α-tocopherol和desferal实现脂质体稳定性。试验证明(见后说明)，本发明专利所制备的阿霉素脂质体与国外产品稳定性一致。
通常情况下，药脂比越低药物的包封率会越高，稳定性也随之增加，因此很多包封率较高的脂质体药物的药脂比在0.05∶1或更低。然而药脂比越低，进入脂质体中的药物含量越少，同时制备脂质体的辅料非常昂贵，极不利于药物的临床应用。但是由于脂质体容量有限，如果再加上均匀分布于磷脂双层两侧的大分子PEG，又占用部分脂质体容量，所以提高药脂比非常困难。本发明采用上述配方，使药脂比最高能够达到0.2∶1，同时包封率不低于90％。国外文献和脂质体产品中从未见过高于此比例的，国内许多研究机构所制备的脂质体药物的药脂比远远低于此比例。
在减少药物毒副作用的同时尽量延长药物在体内循环的时间从而增加药物疗效也是脂质体药物研发所追求的目标，本发明通过在配方中加入亲水性大分子多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)来实现这个目的。对于蒽环类抗肿瘤药物而言，所用DSPE-PEG2000的较佳浓度范围是4～10mol％低于4mol％也可延长药物的体内循环时间，但效果不十分显著；而PEG的浓度超过15mol％时，会使脂质体形成泡沫状micelle而不呈现双层结构。DSPE-PEG2000能够增强脂质体膜表面亲水性，降低各种血浆蛋白对脂质体的结合，使脂质体可非常有效地躲避网状内皮系统的吞噬，稳定性及包封率得到提高，漏出率降低，使脂质体的体循环时间明显延长，体内重新分布，降低所包药物的毒性反应，同时在病灶中的浓度也显著提高，因而增加治疗指数。另外由于注射时药物仍包裹在脂质体中，消除了药物漏出后对组织的刺激造成炎症坏死。
为了便于实施，本发明选择硫酸铵梯度法作为基本生产工艺，通过试验优化其各项反应条件，最终摸索出适合于蒽环类抗肿瘤药物脂质体规模化生产的工艺路线。
一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体注射液的生产工艺，包括以下步骤(1)制备多层脂质体按照前述配方的量配制含有脂质体材料和抗氧化剂的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋转蒸发成膜，加入125～400mM，pH值为5～7硫酸铵溶液水化；(2)制备小单层脂质体将步骤(1)得到的含有多层脂质体的硫酸铵溶液进行五个冷冻-融化循环后，经挤压机挤压成粒径为80～120纳米的小单层脂质体液；随后用5～15％蔗糖液(pH5～7)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
(3)制备蒽环类抗肿瘤药物脂质体将注射级蒽环类抗肿瘤药物的盐酸盐注射液溶入浓度为5～15％的蔗糖液中(pH5～7)，在50～70℃条件下将盐酸蒽环药物蔗糖液加入到小单层脂质体液中混合，在50～70℃水浴中放置10分钟以上，使盐酸蒽环药物进入小单层脂质体中，冷却至室温，除去蔗糖和游离的蒽环类药物得到成品。
步骤(1)中使用125～400mM硫酸铵溶液的作用主要是建立硫酸铵梯度提高蒽环类药物的包封率。125～400mM可稳定脂质体渗透压，优选浓度为150～250mM；pH值采用5～7，最佳pH值是6.5。
所述步骤(2)中的五个冷冻-融化循环是指将多层脂质体用干冰(-20℃)冷冻后在室温下自然融化，然后再用干冰冷冻，如此循环五次。作用是进一步提高包封率和稳定性。在实际操作中也可省略冷冻-融化循环步骤，而直接进入挤压步骤。省略冷冻-融化循环步骤所制备的脂质体理化性质与使用冷冻-融化循环步骤所制备的脂质体差别不显著。小单层脂质体的粒径优选100纳米。
所述步骤(3)中除去游离的蒽环类药物的方法为层析法和离心分离法，属本领域公知常识，故不冗述。层析柱法可以使用Sephadex G-50柱，将脂质体蒽环类药物上柱，生理盐水洗脱即可；离心法是将脂质体蒽环药物置入离心机，在100,000g条件下离心5～10分钟，去除上清液，用生理盐水溶解pellet即可。
所述步骤(2)和(3)中使用5～15％蔗糖溶液，最佳选用10％等渗液；蔗糖液pH5～7，最佳选用pH6.5。
本发明的优点是本发明公开的配方能够制得包封率大于90％的脂质体，毒性低，稳定性高，加入DSPE-PEG2000后，进一步延长了药物的体内循环时间，有利于药物的缓释和疗效提高。使用优化后的硫酸铵梯度法操作简便、省时，制得的脂质体包封率高，回收率90％，磷脂，胆固醇及DSPE-PEG2000的回收率为85％左右。脂质体渗漏率低，粒径均匀(100±10纳米)，稳定性好，4℃放置保存一年粒径无变化，包封率仍在85％以上。同时该方法便于灭菌及除去热原，可实现规模生产。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
表1脂质体配方
以上材料来源如下阿霉素、表阿霉素和柔红霉素购于浙江海正药业。
神经鞘磷脂(SM，sphingomyelin)、DSPC(distearoylphosphatidylcholine)、HSPC(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)、胆固醇和PEG2000-DSPE购于美国Avantipolar Lipids(Alabaster，AL)公司。
α-tocopherol和desferal购于美国Sigma公司。
实施例11.制备多层脂质体将注射级DSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
本品脂质体阿霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的阿霉素仍包裹于脂质体中。
实施例21.将注射级DSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在150mM pH5.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用5％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于5％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
实施例31.制备多层脂质体注射级HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.1∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
本品脂质体长春新碱稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的阿霉素仍包裹于脂质体中(见后面试验说明)。
实施例41.制备多层脂质体注射级HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在150mM pH5.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.1∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
实施例51.制备多层脂质体将注射级SM、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.05∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
本品脂质体阿霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的阿霉素仍包裹于脂质体中。
实施例61.制备多层脂质体将注射级SM、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在150mM pH5.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.05∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
实施例71.制备多层脂质体将注射用DSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在350mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备阿霉素脂质体将注射级盐酸阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置60分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到阿霉素脂质体成品。
本品脂质体阿霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的阿霉素仍包裹于脂质体中。
实施例81.制备多层脂质体将注射用DSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备表阿霉素脂质体将注射级盐酸表阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将表阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置30分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的表阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到表阿霉素脂质体成品。
本品脂质体表阿霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的表阿霉素仍包裹于脂质体中。
实施例91.制备多层脂质体将注射用HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备表阿霉素脂质体将注射级盐酸表阿霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将表阿霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的表阿霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到表阿霉素脂质体成品。
本品脂质体表阿霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的表阿霉素仍包裹于脂质体中。
实施例101.制备多层脂质体将注射用DSPC、胆固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化剂α-tocopherol和desferal。将上述液体放入旋转蒸发瓶中旋转蒸发成膜，再将该膜浸泡在250mM pH6.5硫酸铵溶液中。
2.制备小单层脂质体五个冷冻-融化循环后，将上述液体放入挤压机中多次挤压，得到粒径100纳米的小单层脂质体。挤压使用的碳纤维膜分别为0.14及0.08纳米。随后用10％蔗糖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。
3.制备柔红霉素脂质体将注射级盐酸柔红霉素注射液溶于10％蔗糖液中。在65℃条件下，按药/脂比为0.2∶1的量将柔红霉素蔗糖液加入小单层脂质体中混合，在65℃水浴中放置15分钟。冷却至室温，经0.9％氯化钠溶液平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱蔗糖。除去游离的柔红霉素。
通过0.22纳米的微孔膜除菌、热原及其它杂质，即得到柔红霉素脂质体成品。
本品脂质体柔红霉素稳定性好，在10倍缓冲液试验以及与小牛血清培养的试验中，24小时后75-80％的柔红霉素仍包裹于脂质体中。
实施例11、急性毒性试验一.材料昆明小鼠购于中国医学科学院动物研究所盐酸阿霉素购于浙江海正药业。
盐酸阿霉素脂质体注射液，实施例3。
二.方法比较盐酸阿霉素和盐酸阿霉素脂质体注射液一次性小鼠尾静脉给药后的急性毒性反应和死亡分布。
将小鼠随机分组，每组10只，共90只。其中盐酸阿霉素注射液组为40只，盐酸阿霉素脂质体注射液组50只。分别注射盐酸阿霉素和盐酸阿霉素脂质体注射液，盐酸阿霉素注射液剂量分别为15、20、25、30毫克/公斤体重，而盐酸阿霉素脂质体注射液剂量分别为20、30、40、50、60毫克/公斤体重。观察14天，每日观察小鼠体重变化、急性中毒症状和死亡数目来确定半数致死量(LD50)。结果见表2。
三.结果表2.阿霉素和脂质体阿霉素的急性毒性试验(LD50)
结论阿霉素脂质体有效降低载荷药物的毒性，本试验中降低毒性1.88倍。
实施例12与国外同类产品比较脂质体蒽环药物稳定性渗漏试验盐酸阿霉素脂质体注射液，实施例3。
Doxil/Caelyx购自美国先灵葆雅公司(Schering-Plough)。Caelyx在中国的商品名为楷莱。
将同等量的盐酸阿霉素脂质体和Caelyx分别置入透析袋中，在37℃温度下与1,000倍的PBS缓冲液+10％小牛血清一起培养透析，在不同时间，分别自透析液中取样检测。
结论盐酸阿霉素脂质体与Caelyx的渗漏速度一致，说明两者稳定性一致。
图1是本发明实施例12本品与国外同类产品比较脂质体蒽环药物稳定性渗漏试验图
权利要求
1.一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体，其特征在于由蒽环类抗肿瘤药物、脂质体材料和抗氧化剂组成，药/脂比例(w/w)为0.05～0.2∶1；其中脂质体材料包括磷脂和胆固醇，二者的摩尔比为40～60∶30～50mol％；抗氧化剂由α-tocopherol和desferal组成，二者的浓度分别为0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种蒽环类药物脂质体，其特征在于所述脂质体材料中还含有多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)；磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000三者的摩尔比为40～60∶30～50∶4～20mol％。
3.根据权利要求1或2所述的一种蒽环类药物脂质体，其特征在于所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化磷脂酰胆碱(HSPC)或神经鞘磷脂(SM)中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种蒽环类药物脂质体，其特征在于所述蒽环类药物选自阿霉素、表阿霉素或柔红霉素中的一种。
5.一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，包括以下步骤(1)制备多层脂质体按照权利要求1或2所述配方的量配制含有脂质体材料和抗氧化剂的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋转蒸发成膜，加入125～400mM，pH值为5～7硫酸铵溶液水化；(2)制备小单层脂质体将步骤(1)得到的含有多层脂质体的硫酸铵溶液进行五个冷冻-融化循环后，经挤压机挤压成80～120纳米的小单层脂质体液；随后用5～15％蔗糖液(pH5～7)平衡的Sephadex G-50柱层析洗脱脂质体外的硫酸铵。(3)制备蒽环类药物脂质体将注射级蒽环类抗肿瘤药物的盐酸盐溶入浓度为5～15％的蔗糖液中，在50～70℃条件下将盐酸蒽环药物蔗糖液加入到小单层脂质体液中混合，在50～70℃水浴中放置10分钟以上，使盐酸蒽环药物进入小单层脂质体中，冷却至室温，除去蔗糖和游离的蒽环类药物得到成品。
6.根据权利要求5所述的一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，其特征在于所述步骤(1)中硫酸铵浓度为125-400mM；pH值为5～7。
7.根据权利要求5所述的一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，其特征在于所述步骤(2)中的五个冷冻-融化循环是指将多层脂质体用干冰冷冻后在室温下自然融化，然后再用干冰冷冻，如此循环五次。但在实际操作中也可省略冷冻-融化循环步骤，而直接进入挤压步骤。省略冷冻-融化循环步骤所制备的脂质体理化性质与使用冷冻-融化循环步骤所制备的脂质体差别不显著。
8.根据权利要求5所述的一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，其特征在于所述步骤(2)中小单层脂质体的粒径为80～120纳米，最佳为100纳米。
9.根据权利要求5所述的一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，其特征在于所述步骤(3)中除去游离的蒽环类药物的方法为层析法或离心分离法。
10.根据权利要求5所述的一种蒽环类药物脂质体的生产工艺，其特征在于所述步骤(2)和(3)中使用5～15％蔗糖溶液，最佳选用10％等渗液；蔗糖液pH5～7，最佳选用pH6.5。
全文摘要
本发明公开了一种蒽环类抗肿瘤药物脂质体及其生产工艺，属于化学制药领域。一种蒽环类药物碱脂质体，由蒽环类药物、脂质体材料和抗氧化剂组成，药/脂比例(w/w)为0.05～0.2∶1；其中脂质体材料包括磷脂和胆固醇，二者的摩尔比为40～60∶30～50mol％；抗氧化剂由α－tocopherol和desferal组成，二者的浓度分别为0.010～0.030mg/ml及0.05～0.30mg/ml。该生产工艺包括(1)制备多层脂质体；(2)制备小单层脂质体；(3)制备蒽环类药物脂质体。本发明的优点是成品毒性小、包封率高、稳定性好；方法操作简便，可工业化生产。
文档编号A61P35/00GK1813676SQ200510005250
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者曹利人 申请人:北京文卓医药生物制品技术开发有限公司