专利名称：核仁素辅助的癌症诊断与治疗方法
技术领域：
本项发明提出了一种新方法，可以用来寻找适于接受抗新生血管生成癌症疗法的癌症主体，特别是人类患者。本发明还提出一种能够搜索并筛选新生血管生成抑制剂的方法。新生血管生成抑制剂可以有效抑制细胞恶性增殖，尤其对新生血管生成依赖型的癌症效果更为显著。本项发明建立了用Nucleolin(以下简称“NL”)筛选新生血管生成抑制剂的方法。特别指出的是，该方法可以筛选出与Endostatin(血管内皮抑制素，以下简称“ES”)作用机理相似的新生血管生成抑制剂。本项发明基于下列事实NL是ES的特异性受体，并参与ES抑制新生血管生成活性相关的信号传导途径。
背景技术：
对于不同的患者来说，癌症疗法的效果差异很大，这取决于一系列内在或外在因素。外在因素包括实施治疗时癌症的发展阶段，越早发现越有利于治疗和恢复，以及疗法相对强度，例如手术，化疗或放疗。内在因素包括病人免疫系统的健康程度，强健的免疫系统可以支撑时间长和强度大的疗法，从而帮助病人快速康复。在癌症疗法中，甚至整个医学界中，正在被探讨的一个关键问题是个体化用药。不同个体可能对同样的癌症药物有不同的忍耐度和敏感度，上述认识促使人们去努力寻找提高特定癌症疗法效果的方法。因此，由于个体差异，对某一个病人有效的药物未必对另外一个病人也有效。
在癌症疗法领域中，人们试图通过病人的基因型来了解某一特定的药物是否对具有特定遗传特征的病人有效。一种新近发现的癌症疗法是通过ES来抑制肿瘤新生血管生成，阻断肿瘤供血从而达到抑制肿瘤生长的目的。为了实现ES疗法的个体化应用，最近有人试图通过基因芯片技术获得基因表达谱来研究ES为什么能够抑制内皮细胞新生血管生成，参考M.Mazzanti，et al.，Genome Research，141585-1593(2004)。
ES被认为是一种有效的癌症治疗药物，因为ES通过抑制新生血管生成来杀死肿瘤。肿瘤细胞需要通过新生血管进行扩散。肿瘤细胞群体的每一次增长都必须是汇集在肿瘤处的新毛细血管生成之后方可发生。这一现象几乎是普遍的多数人类的固体肿瘤或者血癌都是新生血管生成依赖型的。抗新生血管生成疗法还有其他的优势，包括低毒性，极小的耐药性，以及反复使用该疗法后可能会有较长时期的肿瘤休眠，在此期间便不需要继续治疗，参考Boehm et al.，Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drugresistance.Nature(1997)390404-407。然而，ES的作用机理至今仍不明确。因此，ES疗法被同样地用在每一个癌症病人身上，而并未考虑到个体对该疗法的敏感性。人们进行了很多临床实验以期望找到有效的抗新生血管生成药物。如果能够以客观的标准选择出适合接受ES疗法的病人，那将是一个显著的进步。本项发明提出的一些方法和诊断试剂盒正是为了达到这一目标。
发明内容
本项发明提供了一种可以确定癌症主体对ES癌症疗法敏感度的试剂盒，包括可以标记NL的试剂以及使用说明。该试剂盒可以通过标记从主体身上采集的样品中的NL来检测样品中NL的含量。合适的主体应当是哺乳动物，更理想的选择是人类。在本发明的具体实现中，被标记的NL是细胞表面NL。一种情况下，用来标记NL的试剂是抗体，可以是多克隆抗体，若是单克隆抗体则更为理想。另外一种情况下，标记NL的试剂是核酸探针，可以是DNA探针，若是RNA探针则更为理想。
本发明进一步提供了一种方法，可以用来确定对主体实行ES癌症疗法成功的可能性，包括检测从该主体采集的样品中NL的表达水平。确定该主体是否对ES癌症疗法敏感主要是依据上述检测到的NL的表达水平。
本项发明提供了筛选血管生成抑制剂的方法，尤其是筛选那些与ES作用机理相似的分子。本项发明是以NL作为靶分子，运用传统的方法学，鉴定出可以和NL特异性结合的分子，同时该分子有抗新生血管生成的活性。基于NL是ES在细胞表面的受体这一事实，用上述方法发现的分子应该具有与ES相似的作用机理。
本项发明还提出了可以增加内皮细胞对ES的敏感度的方法。该方法是将外源的NL引入靶向内皮细胞，使得NL在内皮细胞中相对于野生型过量表达，理想的靶向细胞应当是在正常情况下没有高水平的内源NL表达。该方法进一步提出，向靶向细胞中引入NL，可以使这些细胞对ES的抗新生血管生成活性更敏感而被ES有效杀伤。本项发明还提出可以用NL的抗体去检测细胞表面表达大量NL的靶向癌细胞(或内皮细胞)，这种癌症适宜用ES去治疗。
一个具体体现是，本项发明提供了一种得到有效的特异性针对NL的新生血管生成抑制剂的方法，包括如下步骤运用合适的结合试验在候选的分子库中筛出一系列能与NL特异性结合的分子；用抑制新生血管生成的分析方法去验证这些分子对于抑制新生血管生成的有效性；最后，根据活性试验的结果在这些能与NL特异性结合的分子中筛选出能有效抑制新生血管生成的分子。
另一个具体体现是，本项发明提供了一个筛选可以在体外抑制内皮细胞增殖的新生血管生成抑制剂的方法，包括如下步骤运用药学手段去发现特异性以NL作为靶向的分子；验证上一步获得的分子在抑制内皮细胞增殖中的有效性；确定上述步骤获得的能够抑制内皮细胞增殖的分子，并与ES比较它们在抑制新生血管生成中的效果。
更进一步的体现是，本项发明提供一种可以增强靶细胞对新生血管生成抑制剂敏感度的方法，包括如下步骤将外源的NL导入靶细胞，从而获得一些能够表达外源NL的改造过的细胞，并且检测ES对这些细胞的致死率。
另外一个体现是，本项发明提供了一种增强新生血管生成抑制剂针对内皮靶细胞的抗新生血管生成效果的方法，包括如下步骤将有效剂量的外源NL基因导入上述的靶细胞，NL就可以在细胞中表达，同时将上述新生血管生成抑制剂与经转化的靶细胞一起孵育，就可以抑制靶细胞的生长。
一个具体体现是，本项发明提供一种方法可以提高新生血管生成抑制剂控制病人肿瘤生长的效果，包括如下步骤用可行的手段，检测癌症病人内源NL的表达水平；根据该病人的NL表达水平来评价新生血管生成抑制剂对其有效程度，NL表达水平越高表明新生血管生成抑制剂疗法越有可能取得成功的治疗效果。该新生血管生成抑制剂的理想选择是ES。
另一个具体体现是，本项发明提供一种诊断试剂盒，可以确定对新生血管生成抑制剂疗法敏感的靶向癌细胞，试剂盒包括NL的抗体和制药学上有效的载体。
还有一个具体体现是，本项发明提供了一种诊断试剂盒，可以确定对新生血管生成抑制剂疗法敏感的癌症主体，包括可以结合并显示NL的标记物以及说明书，可以用来测试从癌症主体收集的样品中NL的水平。
图1显示Human Microvascular Endothelial Cell(人微血管内皮细胞，以下简称“HMEC”)是一株迁移和增殖对ES敏感的细胞系。a，在标示浓度的ES的处理下，进行HMEC迁移试验，PBS作为对照。b，在标示浓度的ES的处理下，进行HMEC增殖试验，PBS作为对照。细胞的数目用MTT法进行分析。结果的误差±s.e.m.，n＝3(a)，以及n＝5(b)。
图2ES结合细胞表面的NL。a，从HMEC表面中分离出来的ES结合蛋白经鉴定为NL和它的片段。如方法部分描述的那样，ES结合蛋白用预载有ES的Ni-NTA亲和柱从HMEC细胞膜中分离出来。用含500mM氯化钠的PBS缓冲液洗脱下来的组分进行SDS-PAGE分析(左)并用NL的单克隆抗体做免疫印迹(右)。b，在体外ES特异性地结合NL。用重组NL和ES做免疫共沉淀。c，肝素干扰ES-NL的复合物形成，在体外加入或不加肝素(200nM)的情况下，用重组NL和ES进行免疫共沉淀。d，ES通过细胞表面NL特异性结合HMEC。HMEC与ES，以及不同浓度的NL抗体在室温下孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗三遍。将细胞进行SDS-PAGE分析并用ES的抗体做免疫印迹。β-actin作为对照。e，将HEMC与ES(60μg/ml)在37℃和5％CO2下孵育不同长短的时间。用新鲜培养基冲洗后，分别用NL和ES的抗体做免疫共沉淀和免疫印迹。β-actin作为对照.i-k，在HMEC细胞表面NL和ES共定位。完整的HEMC用鼠抗NL，兔抗ES染色，并用激光共聚焦显微镜检测间接免疫荧光。标尺，20μm。
图3显示NL是ES的受体。a，在Human Umbilical Vascular Endothelial Cells(人脐带血管内皮细胞，以下简称“HUVEC”)迁移试验中，用标示浓度的重组NL解除ES的抑制活性，PBS作为对照。b，重组NL本身对细胞的迁移没有作用。在HUVEC的迁移试验中分别加入标示浓度的ES、NL和两者的混合物。PBS作为对照。c，在HUVEC的增殖试验中分别加入标示浓度的ES、NL和NL的抗体，PBS作为对照。用MTT法分析细胞数目。d，用NL缺陷型和对照组HMEC做细胞粘附试验。用pBS/U6/1356质粒介导的RNA干扰的方法抑制NL的表达来获得NL缺陷型细胞。空白的pBS/U6质粒转染的细胞作为对照。结果误差±s.e.m.，n＝4(a，d)，n＝5(b，c)。e，用NL的抗体进行免疫印迹以验证RNA干扰质粒对NL表达的抑制作用。BS/U6/1356可以抑制NL的表达，而BS/U6/263却没有作用，myosin的免疫印迹作为上样对照。f，用NL缺陷型和对照组HMEC做细胞增殖试验。用pBS/U6/1356质粒介导的RNA干扰的方法抑制NL的表达来获得NL缺陷型细胞。空白的pBS/U6质粒转染的细胞作为对照。ES的加入浓度如图中所示。细胞的数目用MTT法进行分析。
图4显示NL介导ES的信号网络。a-f，ES被HMEC内吞。HMEC加入或不加入(a)10μg/ml生物素标记的ES分别孵育0.5小时(b)，1小时(c)，2小时(d)，3小时(e)，和7小时(f)。内吞的ES用TRITC标记的抗生物素蛋白染色。g，把细胞和NL的抗体一起孵育可以阻断ES的内吞。标尺，25μm.，h，在核中，ES可以抑制casein kinase-2(酪蛋白激酶，以下简称“CK2”)介导的NL磷酸化。磷酸化分析按照方法部分所进行的描述。磷酸化的NL用SDS-PAGE和放射性自显影检测。NL的免疫印迹作为上样对照。i-k，在HMEC细胞表面NL和integrin β1共定位。完整的HEMC用鼠抗NL，兔抗integrin β1染色，并用激光共聚焦显微镜检测间接免疫荧光。标尺，10μm。
图5显示细胞表面的NL分布依赖于细胞的生长状态。a-h，HEMC细胞表面NL的分布。增殖细胞和静止细胞表面的NL用兔抗NL进行间接免疫荧光检测。DAPI标明视野中细胞核的位置。标尺，20μm。增殖细胞所处的细胞周期(g)和静止细胞(h)的分别用流式细胞仪检测，相对静止期的细胞通过血清饥饿24小时获得。i-l，在荷瘤裸鼠中细胞表面NL的分布。按方法部分所描述的进行免疫组化染色。心脏(i)，、肾脏(j)、肺(k)、和肿瘤(l)的血管用箭头指示。表达细胞表面NL的内皮细胞被染成棕色。标尺，50μm。
图6显示由NL介导的ES信号网络的模式图。一个包含细胞表面NL，integrin(例如integrin α5β1)和其它蛋白的大复合物参与到ES的信号网络中。NL结合myosin，并通过它与actin纤维相连。与之相似，integrin就是通过一些胞内锚定蛋白talin，α-actinin，filamin，和vinculin与actin纤维束相连。没有发现NL和integrin有直接的相互作用。ES可以与细胞外基质竞争结合这个复合物，以此来抑制细胞的粘附和迁移。这种结合还可以触发integrin介导的信号传导。另一方面，这个复合物可以介导ES的内吞，在这个过程中myosin起到转运的作用。然后，ES可能在胞浆中释放出来，并抑制胞内NL稳定化Bcl-2的mRNA的作用。剩下的ES被转运到核内，并在其中抑制CK2介导的NL磷酸化以及一些下游事件。
图7显示体内ES和NL的共定位。标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体分别先后被静脉注射到荷有黑色素瘤B16/F10的小鼠体内。对照组注射标记有生物素的ES和纯化的兔多克隆抗体。在心脏(a-c)、肝脏(d-f)、肾脏(g-i)、肿瘤(j-l)及其对照组(m-o)中，标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体通过TRITC标记的抗生物素蛋白和FITC标记的二抗检测。标尺50μm。
图8如图中所示的ES与NL的浓度，测定二者的结合动力学曲线。ES与NL的解离常数由这些曲线计算得出。
具体实施例方式
本项发明部分来源于如下发现NL是ES的特异性受体并介导ES的抑制新生血管生成功能。
NL是一个广泛存在的非组蛋白，最初是从核仁中分离出来的。NL的量受Granzyme A和自我切割能力的调控，有趣的是，它还和细胞的增殖有关系。NL也可以自切，它的自切割随细胞进入增殖速度的加快而减少，与此同时，它还被细胞毒淋巴细胞释放的一种酯酶Granzyme A切割(Chen et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，7754-7758；Fang and Yeh，Exp.Cell.Res.，1993，208，48-53；Pasternack et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，14703-14708)。这些切割以及相伴的降解构成了NL的翻译后调控。
作为一个多功能蛋白，NL在细胞增殖中起关键且基础的作用，包括核仁染色质的排列，pre-RNA的包装，rDNA的转录以及核糖体的组装。NL的这些活性被某些蛋白激酶如CK2和cdc2所调控，而后者又受到其它细胞周期蛋白的严格调控。此外，NL还可以在细胞表面、细胞浆、细胞核中穿梭，并且具有细胞表面受体的功能。作为很多病毒和细胞因子的受体，当配体结合它时，NL可以触发配体的内吞。
Orrick et al(1973)曾经报道NL分子量大约100-110kDa，主要存在于增殖细胞的细胞核中，NL可以自降解，并在免疫印迹中呈现70和50kDa的两条带。NL被高度的磷酸化及甲基化，并且可以被二磷酸腺苷核糖基化。由于NL的合成与细胞分裂速度的增加正相关，肿瘤细胞以及旺盛分裂的细胞中含有更大量的NL。NL的序列早先由Srivastava，et al.在Cloning and sequencing of the human nucleolin cDNA.FEBS Lett.250(1)，99-105(1989)中报道。
NL(亦称作P92或C23)是活跃生长的细胞核仁内最丰富的磷酸化蛋白(Srivastava etal.，FEBS Lett.，1989，250，99-105；Srivastava et al.，J.Biol.Chem.，1990，265，14922-14931)。数个研究小组报导过NL主要参与核糖体的生物合成(Ghisolfi et al.，Mol.Biol.Rep.，1990，14，113-114；Sipos and Olson，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1991，177，673-678)。NL通过自身的核糖核酸蛋白共有序列与核糖体前体短暂结合，从而参与了核糖体的合成(Bugler et al.，J.Biol.Chem.，1987，262，10922-10925；Ghisolfi-Nieto et al.，J.Mol.Biol.，1996，260，34-53；Sappet al.，Eur.J.Biochem.，1989，179，541-548)。NL可以占总核仁蛋白的5％(Lapeyre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1987，84，1472-1476；Sapp et al.，Eur.J.Biochem.，1989，179，541-548)。然后，有证据显示NL还参与了胞浆运动，核的形成，细胞增殖和生长，转录抑制，DNA复制，信号传导和染色质去压缩化，可参考综述(Tuteja and Tuteja，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，1998，33，407-436)。
上述NL的多功能的性质来源于它若干结构和功能上独立的结构域(Creancier et al.，Mol.Biol.Cell.，1993，4，1239-1250；Sapp et al.，Eur.J.Biochem.，1989，179，541-548)。NL的三个结构域已经被报导N端结构域，中间结构域以及C端结构域。N端结构域中包含与HMG蛋白同源的序列，可以与染色质相互作用(Erard et al.，Eur.J.Biochem.，1988，175，525-530)。中间结构域含有四个可以识别RNA的折叠子，可以特异性结合18S和28S核糖体RNA的短茎环结构(Bugler et al.，J.Biol.Chem.，1987，262，10922-10925)。C端结构域含有可以结合RNA内非堆积碱基的区域(Ghisolfi et al.，Mol.Biol.Rep.，1990，14，113-114；Ghisolfi-Nieto et al.，J.Mol.Biol.，1996，260，34-53)。NL含有两处核定位序列，分布于蛋白N端以及中部。该序列帮助NL定位到核内。NL通过和其他蛋白相互作用在核内积累(Schmidt-Zachmann and Nigg，J.Cell Sci.，1993，105，799-806)。
人们根据NL的结构域组成特点将其归类为Ag-NOR蛋白(即定位于核仁组织区域的活跃核糖体基因)，也称为活跃核糖体基因的标志(Roussel et al.，Exp.Cell.Res.，1992，203，259-269)。有证据表明核糖体基因的转录需要Ag-NOR蛋白，Ag-NOR蛋白的表达也被用来预测肿瘤生长的速率。
NL曾经作为基质附属区域(MAR)结合蛋白从人红白血病细胞中被纯化出来。研究发现，NL参与了将染色质环状结构锚定到核基质的过程(Dickinson and Kohwi-Shigematsu，Mol.Cell.Biol.，1995，15，456-465)。
NL可以被高度磷酸化，研究表明它是酪蛋白激酶II(以下简称CK2)的底物(Csermely et al.，J.Biol.Chem.，1993，268，9747-9752；Schneider and Issinger，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1988，156，1390-1397)，蛋白激酶C-.xi.(Zhou et al.，J.Biol.Chem.，1997，272，31130-31137)，以及cdc2(Belenguer et al.，Mol.Cell.Biol.，1990，10，3607-3618)。此外，研究表明NL的磷酸化状态调控NL的亚细胞定位。
NL可以自切割或者被细胞毒淋巴细胞分泌的酯酶，Granzyme A切割，并且当细胞进入旺盛增殖阶段时自切活性降低(Chen et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，7754-7758；Fang and Yeh，Exp.Cell.Res.，1993，208，48-53；Pasternack et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，14703-14708)。上述切割过程以及随之而来的降解构成了NL的翻译后调控。
抗NL的抗体可以在患有系统性结缔组织疾病，包括红斑狼疮(SLE)，的病人血清中发现(Minota et al.，J.Immunol.，1990，144，1263-1269；Minota et al.，J.Immunol.，1991，146，2249-2252)，此外还包括硬皮病状慢性移植抗宿主疾病(Bell et al.，Br.J.Dermatol.，1996，134，848-854)。因此，对NL的表达进行药理学调控可能是病理状态下合适的治疗手段。
目前尚未有有效抑制NL合成的药物，而对抑制NL功能药物的需求由来已久。
NL的表达量被认为与细胞增殖速度有关，NL的含量在肿瘤细胞中最高，其次是在旺盛分裂的细胞中。NL可以在研究不同肿瘤细胞系中作为一个有用细胞增殖的标志物。因为NL在肿瘤细胞的增殖中起关键作用，本项发明提供了一种通过抑制NL表达来抑制肿瘤细胞增殖的策略。
ES是胶原蛋白XVIII的C端球状结构域，分子量20kDa。最初它是从鼠内皮瘤细胞培养基上清中分离出来的，因为它可以抑制毛细血管内皮细胞的增殖。在动物实验中，反复使用ES可以促使肿瘤消亡并且不产生抗药性。此外，在动物实验和临床中都显示ES毒性很低。ES有显著的抑制内皮细胞增殖、迁移、黏附、生存的能力并且可以诱导细胞凋亡。虽然integrins，tropomyosin，glypicans，和E-selectin被猜测作为ES的受体调控细胞的迁移，β-catenin和Shb则与ES诱导的G1期捕获和凋亡相关，但是对于ES的确切分子机理仍然存在很大的争论，ES在动物实验和临床治疗中表现出来低毒型的具体原因还不清楚。另一方面，在动物实验及临床中必须使用高浓度的ES才能有抑瘤效果，对这一事实现在还缺少充分的解释。
本项发明提出的新发现，即NL作为ES的受体介导ES作为新生血管生成抑制剂，为下一步筛选出更多的有抑制新生血管生成活性的小分子提供了基础，它们还可能具有一些新的性质，使得它们成为比ES更理想的选择。
研究发现要让ES有效地发挥其新生血管生成抑制剂的功能而达到预期的抗癌效果，必须制备大量的ES并注射给患癌症的哺乳动物或人类。由于该过程中需要高剂量的ES，其价格可能会昂贵得让患者承受不起。因而，迫切需要找出其它方法以发现新的血管生成抑制剂，可以经济、有效地用于治疗肿瘤。
此外，为了使肿瘤细胞对ES更加敏感，本项发明提出了一种方法将外源NL基因导入靶细胞，从而使其能够表达超过正常水平的细胞表面NL。这些改造过的细胞由于NL水平的升高，会对ES的攻击变得更敏感。
本项发明的另一方面是，用NL的抗体去筛选具有大量表面NL表达的肿瘤细胞或内皮细胞。找到这样一组病人对于有效施行新生血管生成相关的癌症疗法是有益的，因为具有高水平表达细胞表面NL的病人是接受ES抑瘤疗法的理想对象。
为了研究ES的作用机理，我们用固定化的ES从HMEC膜中分离能够结合ES的蛋白。NL就是这些蛋白中很有趣的一个，随后即被证明是ES信号网络中的一个关键的成员。NL是一个广泛存在的非组蛋白，最初是从核仁中分离出来的。在指数增长期的真核细胞中，NL主要是一个核仁蛋白。NL的量受Granzyme A和自我切割能力的调控，有趣的是，它还和细胞的增殖有关系。作为一个多功能蛋白，NL在细胞增殖中起关键且基础的作用，包括核仁染色质的排列，pre-RNA的包装，rRNA的转录以及核糖体的组装。NL的这些活性被蛋白激酶如CK2和cdc2所调控，而后者又受到其它细胞周期蛋白的严格调控。此外，NL还可以在细胞表面、细胞浆、细胞核中穿梭，并且具有细胞表面受体的功能。作为很多病毒和细胞因子的受体，当配体结合它时，NL可以触发配体的内吞。NL的这些功能提供了一种可以从细胞外调节细胞核活动的机制。我们这里报道NL也作为ES的受体并介导其在抑制新生血管生成方面的活性。
在这里，名词“endostatin”指一个在非还原或还原电泳中分子量分别表现为18到20kDa的蛋白；“endostatin”还包括这个18到20kDa蛋白的前体形式，片断形式，以及修饰后的蛋白或多肽形式，只要是具有充分类似的氨基酸序列，并具有抑制内皮细胞生长的功能均包括在“endostatin”的含义范围之内。例如，文献中经常报道的氨基酸序列的保守突变，即把原来的氨基酸用一个结构、化学性质相似的氨基酸替换，但是这种替换对原来蛋白的结构，构象和活性没有明显的改变。此类保守突变也在我们附加的权利要求之内。“endostatin”这个词还包括在原来蛋白的两端或者内部缺失一个或多个氨基酸而得到缩短的蛋白或者多肽，但是仍然保留了原来蛋白抑制内皮细胞增殖的活性。“endostatin”的含义还包括在原来蛋白的两端或者内部增加了一个或多个氨基酸而得到的增长的蛋白或多肽，但是仍然保留了原来蛋白抑制内皮细胞增殖的活性。这些分子可以用来进行标记实验，例如在第一位增加一个酪氨酸残基并进行125I标记。用其它的放射性同位素标记还可以提供一个分子工具来杀死具有ES受体的靶细胞。
类似的，名词“nucleolin”也包括了前体形式，片断形式，以及修饰后的蛋白或多肽形式，只要是具有充分类似的氨基酸序列，并具有抑制内皮细胞生长的功能均包括在“endostatin”的含义范围之内。例如，文献中经常报道的氨基酸序列的保守突变，即把原来的氨基酸用一个结构、化学性质相似的氨基酸替换，但是这种替换对原来蛋白的结构，构象和活性没有明显的改变。这些分子可以用来进行标记实验，例如在第一位增加一个酪氨酸残基并进行125I标记。此类保守突变也在我们附加的权利要求之内。
名词“NL-特异性”指NL结合新生血管生成抑制剂并介导该抑制剂抑制活性的能力。
名词“新生血管生成依赖型”指那些生长或迁移需要新生血管生成的肿瘤，包括那些体积或质量(或二者兼有)的增加需要供血的血管的数量和密度的增加的肿瘤。
此处所说的“主体”指任何动物，例如哺乳动物，包括但是不限于人，非人灵长类，啮齿动物，猪，兔之类。主体接受特定的治疗，或者接受某种特定的处理，例如检测某种分子的存在水平。
此处所说的“样品”是一个最广泛的概念，包括但是不限于生物样品和环境样品。一种情形下，它指由生物或环境来源获得的标本或者培养物。生物样品可从动物(包括人)处获得，包括液体，固体，组织和气体。生物样品包括血产品，例如血浆，血清之类。环境样品包括环境物质，例如表面物质，土壤，水，矿物质，晶体或者工业样品。上述所列样品并不意味着限定本发明所包括的样品范围。
此处所说的“标记”包括了化学的或者生物分子，它们可以通过与目标分子相互作用而显示目标分子的存在以及数量。此类标记分子包括但是不限于，核酸探针，例如DNA探针或RNA探针，抗体，放射性同位素，荧光染料之类。
此处所说的“使用说明”包括了试剂盒的使用说明，用来指导对样品中目标分子，例如NL的检测。对于在美国使用的试剂盒，美国食品药品管理局(FDA)要求具有包括使用目的的使用说明。FDA将体外诊断归类为医疗设备并要求其必须经过510(k)程序许可。申请510(k)需要的信息包括1.体外诊断产品名称，包括商业名或专利商品名，通用名或俗名，以及该设备的分类名；2.该产品的使用目的；3.如果可行的话，所有者或经营者提交510(k)申请的注册号；根据《食品，药品和化妆品法案》的第513部分体外诊断产品所属于的类别，并且如果已知的话，所属于的板块，或者，如果所有者或经营者认为该设备不属于任何已有的分类，则提交一份关于为何该产品未被归类的声明；4.建议的标志和广告，足以用来描述该体外诊断试剂盒，它的使用目的以及使用方法。如果可行，照片或工程绘图应当被提供；5.一份说明该设备与已经在美国商业化的同类产品相似或不同点的声明，且需要相关数据支持该声明；6.一份关于安全以及有效性的510(k)总结，基于此总结FDA将作出实质性的等价决定；或者一份声明，指出支持FDA决定的关于上述安全及有效性的信息将在30天内到达任何提出要求的人；7.提交者认为在其所知范围内，所有提交的数据和信息是真实和准确的，并且无实质性事实被忽略；8.任何FDA要求的额外的关于该诊断试剂盒的信息以使FDA作出实质性的等价决定。附加的信息可以在FDA的网页上找到。
如本发明中所用，合适的筛选特异性NL相关新生血管生成抑制剂的实验方法包括高压液相色谱，免疫沉淀，荧光结合检测，毛细管电泳等等。
如本发明中所用，抗新生血管生成试验是指通过筛选一系列候选分子以发现它们抑制新生血管生成的有效程度。为了验证某个分子是否具有抑制新生血管生长的性质，有多种方法可供使用。例如，不同来源包括天然的或者人工(手动或自动)合成的蛋白或者多肽，可以通过牛毛细血管内皮细胞增殖试验等测活方法来方便、快捷地检验其抑制内皮细胞增殖的活性。其他的生物检测包括鸡胚尿囊膜，小鼠角膜新生血管生长抑制试验，以及检测分离的或者合成的蛋白对移植肿瘤的抑制作用。鸡胚尿囊膜最早由O′Reilly等在″AngiogenicRegulation of Metastatic Growth″Cell，vol.79(2)，Oct.21，1994，pp.315-328中报道，我们在这里引用了他的实验方法。更多的用来筛选新生血管生成抑制剂的抗新生血管生成试验可以在Yu，et al.，PNAS，Vol.101，No.21，pp 8005-8010(2004)中找到，该文献也被完整引用。
NL分子可以用来制备多克隆和单克隆的抗体，然后用来定性甚至定量检测特定靶细胞中的NL。适当标记的NL，例如放射性同位素或者荧光标记，可以用来探测体液和组织中的ES。该方法可以应用于以新生血管生成相关疾病如癌症的诊断和预后。本发明还包括一些方法，可以通过提高ES对新生血管生成依赖型肿瘤效果来治疗或者预防新生血管生成相关的疾病或者过程，包括但是不限于关节炎、肿瘤等。
在本发明的一些体现中，诸如流式细胞术和ELISA之类的方法被用来定量NL。
对NL相关的核酸分子的检测可以利用标准的分子生物学手段，例如DNA探针杂交，PCR等。此处描述的各类PCR和克隆步骤可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook et al.，eds.Cold Spring Harbor Lab Publ.1989，latest edition)。对NL RNA的检测可以利用Northern印迹。Northern印迹包括RNA的分离以及互补探针的杂交。在一些具体体现中，RNA(或相应的cDNA)由寡聚核苷酸探针杂交检测。一系列运用不同杂交和检测手段的试验都是可行的。例如，某些体现中使用了TaqMan试验(PE Biosystems，Foster City，Calif.；See e.g.，U.S.Pat.Nos.5,962,233以及5,538,848，均被收录于参考文献)。此试验是在PCR过程中进行的。TaqMan试验利用了AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性。一个带有5’报告染料(例如一种荧光染料)以及一个3’淬火染料的寡聚核苷酸探针被引入PCR体系。在PCR过程中，如果探针与目标序列结合，AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′便发挥其5′-3′外切酶活性将报告染料与淬火染料之间的序列降解。报告染料与淬火染料的分离使得荧光信号增强。随着每轮PCR的进行，荧光信号逐渐累积并可以通过荧光计进行监测。
在某些其他的体现中，反转录PCR(RT-PCR)也被用来检测RNA的表达。在RT-PCR中，RNA由反转录酶转化为互补的DNA，或“cDNA”。该cDNA即作为PCR的模板。PCR产物可以用任何合适的方法检测，包括但不限于凝胶电泳以及DNA特异性染色或者标记探针杂交。在一些体现中也使用了定量RT-PCR，此方法引入了标准化混合的竞争性模板，并在U.S.Pat.Nos.5,639,606，5,643,765，以及5,876,978中有描述(均列入参考文献)。
NL蛋白分子的试验可通过普遍采用的方法进行，例如放射性免疫试验，ELISA，夹心法免疫试验，免疫辐射度试验，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散试验，原位免疫试验(例如利用胶体金，酶或放射性同位素标记)，Western印迹，沉淀反应，凝集反应，免疫荧光试验，蛋白A试验以及免疫电泳试验等。
例如，抗体的结合通过检测一抗上的标记进行。在另外一个体现中，通过检测可以结合一抗的二抗或其他试剂来间接检测一抗。更进一步的体现中，二抗本身是标记的。很多检测结合作用的免疫试验已经被广泛采用并被包括在本发明的范围之内。
某些情形下，可以利用自动化的检测手段。这些自动化的方法在U.S.Pat.Nos.5,885,530，4,981,785，6,159,750，以及5,358,691(均被列入参考文献)中有描述。在一些体现中，结果的分析及呈现也是自动化的。例如，一些体现中使用了基于某些癌症标记蛋白存在与否来判断疾病可能的后果的软件。
被动的抗体疗法通过NL特异性抗体来调节内皮细胞依赖性的过程如繁殖、发育、愈伤和组织修复等。另外，NL的抗体还可以用来筛选含有丰富内源性NL分子的细胞使其成为ES疗法中的理想靶标。
NL或NL类似物的特异性抗体采用已经广泛报道的技术方法制备，可以是多克隆也可以是单克隆抗体。该抗体可以用来进行一些成熟的实验，例如竞争性、非竞争性的免疫分析包括ELISA，夹心法免疫分析以及放射性免疫分析等来判定体液中是否有本发明中提到的内皮细胞增殖抑制因子。体液样品包括但是不限于血液、血清、腹水、胸腔液、脑脊液、尿液、唾液和其他粘液。
本发明提供了分离好的抗体，可以用于检测NL的试剂盒。在理想的体现中，本发明提供能够特异性结合NL的单克隆抗体。
本发明中抗NL的抗体可以是任何单克隆或者多克隆抗体，只要它能识别NL。抗体可由NL或其类似物作为抗原经常规手段制备。
本发明预期同时使用单克隆和多克隆抗体。任何合适的方法都可以用来制备本发明中需要使用的抗体，包括但不限于下面所描述的方法。例如，为制备单克隆抗体，将目标蛋白，或连同适当的载体或稀释剂，在允许产生抗体的条件下注射入动物(例如哺乳动物)。为了提高动物产生抗体的能力，可以使用完全或不完全弗氏佐剂。通常，目标蛋白每二到六周注射一次，共注射二到十次。适于本方法的动物包括但不限于灵长类，兔子，狗，猪，小鼠，大鼠，绵羊，山羊等。
为了制备产生单克隆抗体的细胞，选定已经确定了所产生抗体滴度的动物(例如小鼠)，最后一次免疫后二至五天，取其脾脏或淋巴结，其中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合从而得到能够产生抗体的杂交瘤细胞。测量抗血清中抗体的滴度可以采用如下方法将抗血清与标记的目标蛋白反应，进而测量与抗体结合的标记试剂的活性。细胞融合可以根据已知的方法进行，例如，由Koehler和Milstein所描述的方法(Nature 256495 )。仙台病毒(HVJ)，或更理想的聚乙二醇(PEG)可以作为融合的促进剂。
多克隆抗体可由任何已知的方法或经修改的方法，包括从病人身上获得，来制备。例如，制备载体蛋白与免疫原的复合物并用来免疫动物，方法与上面描述的单克隆抗体的制备过程中的相关部分相同。从被免疫动物体内获得含有抗体的部分，并将抗体从中分离纯化出来。
本发明还提供了用于癌症诊断的NL检测与鉴定试剂盒。某些体现中，试剂盒除了用于检测的试剂和缓冲液之外，还包括NL的特异性的抗体。其他体现中，试剂盒包括特异性探测NL mRNA或者cDNA的试剂(例如寡聚核苷酸探针或引物)。理想的体现中，试剂盒包括了进行检测试验的所有部分，包括对照，试验指导，以及必要的分析及呈现结果的软件。
本发明还包括了如下试剂盒该试剂盒包含了可以检测NL的标记的NL抗体。配制好的含NL抗体溶液可以从血浆、尿液、组织液以及细胞培养基里检测NL及其肽段。这些试剂盒使用的技术包括但是不限于竞争性、非竞争性分析，放射性免疫分析，生物及化学发光分析，荧光分析，点杂交，酶联免疫分析例如ELISA，微量滴定技术，抗体包被的量油计(dipstick)或快速检测尿样和血样的量油计(dipstick)，免疫细胞化学技术等。每种试剂盒的检测范围，灵敏性，清晰度，可靠性，专一性和重现性均按照为一般熟练程度的技术人员所熟悉及遵照的行业要求被确定下来。
类似的，本发明中提出的一个试剂盒也可以被用来定位组织和细胞中的ES。该NL免疫组化试剂盒包括使用说明，由荧光分子如荧光素或其他方式标记的NL分子。免疫组织化学是专业人士所熟知的技术。该试剂盒可以利用光学和电子显微镜来对组织或细胞中的ES进行定位。它既可以用于科研也可以应用于临床。例如，通过检测活体组织肿瘤切片来确定ES生成的位点。这一信息对于肿瘤临床诊断和治疗有很重要的意义。
本发明通过以下的实例进一步进行阐述。本发明的应用并不局限于这些实例。正相反，必须清楚地说明本发明的实现手段可以有不同的体现方式，修饰形式以及多种等价形式。通过阅读以下的描述，专业人士可以更好地理解这些实例，但并不背离本发明的主题以及/或者超出后面权利要求的内容。
实例一NL是一个ES结合蛋白方法学研究NL和ES相互作用的方法均为已经广泛报道的成熟方法。这些方法的详细描述如下细胞迁移试验HMEC或者HUVEC(每孔2×104个细胞)接种到TranswellTM板(8μm孔径，Costar)的上层含0.5％胎牛血清以及10ng/ml VEGF(PeproTech EC)的DMEM培养基中。同时在板的上层和下层加入一定浓度的ES(Protgen公司提供)和其它试剂(NL和NL抗体)。在37℃和5％CO2中继续培养6小时使细胞进行迁移。用乙醇固定和曙红染色后，每个孔随机选取5个高倍放大(400倍)视野，计算其中完全穿过膜迁移到板下层的细胞数并取平均值，每一组重复三个孔。
细胞增殖试验接种内皮细胞，如HMEC或者HUVEC(每孔1×103个细胞)到96孔板，其中有含有0.5％胎牛血清和10ng/ml的bFGF的DMEM培养基。在试验之初向每个孔中添加不同浓度的ES和其他试剂至终体积200微升。内皮细胞在37℃和5％CO2中增殖48小时。然后用100微升不含酚红和含有0.5mg/ml MTT的DMEM培养基替换原有培养基。继续在37℃和5％CO2中培养4小时后，用含有0.05M盐酸的异丙醇裂解细胞并检测在570nm下的光吸收。
利用MALDI-TOF鉴定所分离的蛋白收集从结合有ES的Ni-NTA亲和柱洗脱下的组分并用12％SDS-PAGE电泳分析，主带用测序级的经过修饰的猪胰蛋白酶酶切(Promega)后，得到的肽段用MALTI-TOF进行分析，所用仪器为Bruker Biflex线性飞行时间质谱(Bruker Franzen)，装有多探针SCOUT源，超氮激光(337nm)以及双微通道盘检测器。质谱数据在Swiss-Prot蛋白数据库中进行比对分析以鉴定蛋白。
间接免疫荧光HMEC与ES(20μg/ml)一起于37℃和5％CO2孵育1个小时。细胞不经过通透化即用一抗处理，然后分别加入FITC标记的羊抗鼠二抗和TRITC标记的羊抗兔的二抗处理。在Olympus Fluoview激光扫描共聚焦成像系统(Olympus Inc.)上观察并照相。图像用由Fluoview 2.0软件(Olympus)调节的多重光电倍增管捕获。
重组NL的制备我们使总RNA分离以及反转录系统(Promega)从HMEC中得到NL的cDNA。NL的序列与多聚组氨酸(His)6融合后，克隆到甲醇酵母表达载体pPIC9K中(Invitrogen)。该重组质粒经限制性内切酶SalI(Promega)线性化后电转化至甲醇酵母菌株GS115。经G418筛选得到的稳定转化子并按Invitrogen公司的手册中描述的方法于30℃，BMMY培养基中摇瓶培养3天。培养基上清经Ni-NTA亲和柱(Qiagen)纯化得到NL。
NL多克隆抗体的制备用上述甲醇酵母表达系统制备的NL 50微克免疫新西兰大白兔。初次免疫混合弗氏完全佐剂皮下注射，14天后，肌肉注射含有50微克NL的弗氏不完全佐剂作为加强针。此后，分别在第4，10，22周皮下注射加强针。最后一次免疫1周后，取血清，用蛋白A柱(Amersham Biosciences)纯化抗体。用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.15M，pH 2.5)洗脱，立即用0.15M Tris调pH到6.8-7.2。合并的组分用0.2微米孔径的滤膜过滤除菌，分装储存在-80℃。
细胞粘附试验待检测的细胞采用血清饥饿法处理30分钟后，接种到用ES(20μg/ml)和多聚赖氨酸(50μg/ml)包被的96孔板上。在37℃和5％CO2中培养1个小时后，用新鲜培养基小心洗掉没有粘附的细胞。剩下的细胞用结晶紫(0.1％溶于双蒸水)室温染色25分钟。用干净的水洗，剩下的结晶紫用0.5％的Triton X-100溶解，检测570nm的光吸收。
作为多种新生血管生成抑制因子的靶标，内皮细胞成为体外研究新生血管生成抑制作用的模型。然而结果往往变化很大且重复性较差，原因可能是检测方法不完善或者细胞株不稳定。有鉴于此，我们选用了HMEC，此细胞株符合作为一个良好的抗新生血管生成试验模型。细胞迁移试验中，ES能够剂量依赖型地抑制VEGF诱导的HMEC迁移，其半数抑制浓度(IC50)为4μg/ml(图1a)，甚至浓度低至(4ng/ml)的ES都可以对HMEC有15％的抑制率。在用bFGF刺激的HMEC增殖试验中也可以得到类似的结果(图1b)。细胞增殖和迁移实验的结果表明HMEC是一株对ES敏感的细胞株，利用它进行的实验结果可靠且重复性好。
HMEC对ES的敏感性提示我们，在这株细胞上可能存在ES潜在的受体。进一步的实验表明，ES可以在生理条件下结合HMEC(见图2d)。因此我们选择从HMEC上分离ES受体。重组ES用其自带的组氨酸标签预先结合在镍柱上，制备成ES亲和柱。粗提的HMEC细胞质膜组分按照Marshak等人的报道用1％Triton X-100处理以释放膜蛋白。处理后的膜蛋白样品通过制备好的ES亲和柱，不结合ES的蛋白用PBS缓冲液从柱上洗下，结合ES的蛋白挂在ES亲和柱上。收集每一组分并进行还原SDS-PAGE分析。对照组的实验平行进行，唯一的区别是使用未载有ES的镍柱。表观分子量为110kDa和80kDa的两个蛋白特异性地结合ES亲和柱(图2a)，并随后用MALDI-TOF结合肽段指纹图谱鉴定为NL(110kDa)和它降解的片段(80kDa)，此结果又通过NL的单克隆抗体的免疫印迹得到进一步确证。为了验证ES和NL的相互作用，我们进行了如下研究。体外免疫沉淀结果显示ES和重组NL的相互作用具有特异性(图2b)，并且二者形成一个复合物，该过程可以被200mM肝素所干扰(图2c)。ES还可以通过NL结合HMEC，因为NL的多克隆抗体可以阻断此结合(图2d)。用经ES预孵育的HMEC进行的免疫沉淀的结果进一步证实了上述结论(图2e)。结果显示ES与总内源性NL(细胞表面，细胞质和细胞核)在活细胞内形成复合物。此外，我们还利用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察到了ES和NL在HMEC表面的共定位(图2f-I)。总而言之，ES在体外或体内均特异性地结合NL，说明NL是ES的一个潜在受体。
例二NL是ES的一个新受体如果NL是ES的受体，它应该能够介导ES在抗新生血管生成方面的活性，例如抑制内皮细胞的迁移、增殖和粘附。为了鉴定NL在介导ES发挥活性过程中的作用，我们分别使用ES，重组NL，以及NL的多克隆抗体进行了竞争性细胞迁移和增殖试验。由于NL是从HMEC中分离出来的ES受体，它是否在其他被广泛接受的内皮细胞上具有类似的作用还需要证明。有鉴于此，我们还在从脐带静脉中直接分离的人HUVEC进行了竞争性细胞迁移和增殖试验。这种细胞可以在VEGF的刺激下穿过一种孔径8μm的膜，而ES抑制这种迁移。重组NL可以以剂量依赖性的方式消除ES的抑制作用(图.3a)，显示了重组NL与ES的抗新生血管活性有关。如图3b所示重组NL本身对细胞迁移没有作用，这就排除了NL本身可以刺激内皮细胞的迁移的可能。HUVEC增殖试验也得到了类似的结果(图3c)。正如所预期的，NL的多克隆抗体可以拮抗ES对细胞增殖的抑制作用(图3c)。这些研究结果强有力的证明了NL是ES抗新生血管生成过程中的受体。
为了进一步确定NL是ES的受体，我们使用RNA干扰(RNAi)对NL的表达进行了抑制，随后检测了这种表达变化对ES在抗新生血管生成方面的一个重要活性——细胞粘附的影响。结果表明，当NL的表达被以基于DNA载体的RNA干扰抑制时，HMEC在固定化ES和多聚赖氨酸(一种人工合成的细胞外基质)上的粘附显著降低(图3d)，尽管这种抑制是不完全的(图3e)。Rehn等人报道，内皮细胞在固定化ES上的粘附对ES的活性例如粘着斑的形成和FAK的磷酸化是关键的，而这种粘附的丧失意味着ES在内皮细胞上的功能的丧失。通过这一系列的研究，我们的结果证明了NL是ES发挥活性和内皮细胞对细胞外基质(ECM)粘附所必需的。此外，我们还检测了当NL的表达被以基于DNA载体的RNA干扰抑制后，HMEC对ES在抗新生血管生成方面的另一重要活性——细胞增殖的影响。当HMEC细胞没中的NL的表达被抑制后，HMEC细胞的增殖不能被ES抑制，而NL的表达没有被抑制的HMEC细胞的增殖可以被ES抑制(图3f)。总之，我们得到的结论是NL是ES的一个新受体，并在ES的信号传导通路中发挥了重要的作用。
例三NL介导ES的信号传导通路为了揭示NL在ES的信号传导通路中的确切地位，我们研究了其下游事件。注意到当ES与HMEC孵育时，ES-NL复合物的量随时间变化，且在2小时左右达到最大值(图2e)，ES可能通过细胞表面NL被内吞，如HMEC，随后一些内吞的ES被细胞降解。似乎存在一个ES内吞与降解之间的平衡(图2e)。
为证实ES的内吞是通过细胞表面NL进行的，我们利用生物素标记的ES进行免疫荧光定位。HMEC与生物素标记的ES孵育不同时间后，生物素标记的ES被TRITC标记的抗生物素蛋白(Pierce)染色，进而用荧光显微镜观察ES的内吞过程(图4a-f)。孵育30分钟时，多数内吞的ES分布在胞质内且量较少(图4b)。孵育1小时，内吞的ES量增加并且开始在核内积累(图4c)。内吞的ES的量在孵育2小时左右达到最大值(图4d)。3小时的时候，积累在核内的ES开始消失(图4e)。7小时的时候，核内几乎看不到ES(图4f)。相比于免疫共沉淀的结果，荧光实验中，内吞的ES的量到达最大值的时间有一个延迟，可能是因为生物素标记的ES降解速率较慢。重要的是，当HMEC预先与NL的多克隆抗体孵育后，内吞的生物素标记ES的量显著减少，说明ES是通过细胞表面NL被内吞的(图4d，g)。此外，荧光显微镜下还可观察到细胞内一些小的亮点，可能意味着ES的内吞是通过膜泡进行的。这些现象与Wickstrom和Christian等人先前的报道是一致的。
为解释NL如何介导ES的内吞，我们分别进行了交联和免疫共沉淀实验。首先，我们希望通过交联试剂从活的HMEC中分离到ES，NL，以及其它蛋白质的复合物。利用BS3(PIERCE有限公司的一种交联试剂)我们得到了分子量远远大于300kDa的巨大复合物(数据未显示)。尽管该复合物可以被ES或者NL的抗体染色，但是其组成部分却无法鉴定。另外一种方法是用NL的多克隆抗体在HMEC裂解液中进行免疫共沉淀以分离与NL相互作用的蛋白。如此我们找到了一个分子量200kDa左右的蛋白，并经MALDI-TOF鉴定为非肌肉myosin。Myosin组成一个很大的超家族，参与到膜动力学过程以及膜下区域内肌动蛋白的组织，由此影响细胞迁移，吸附以及内吞。在这个超家族中，拥有两个“头”结构域的第五类myosin可以沿肌动蛋白纤维运送膜泡，细胞器和mRNA颗粒。我们还发现细胞表面NL可以结合ES并将ES运输到细胞核(图4a-f)。因为myosin是细胞内蛋白，它必然要与细胞表面NL的细胞内结构域结合。我们推测这个NL-myosin复合物在ES的内吞过程中起到了运载体的作用。Shibata等人报道过相似的过程一种神经细胞的生长因子，midkine，也可以经NL被内吞并定位于细胞核。有趣的是，NL的N端抗体可以经细胞表面NL被内吞到Hep-2细胞内。因此，内吞似乎是一种普遍现象而且当配体结合细胞表面NL后变得不可避免。区别在于ES可以抑制细胞增殖而NL的抗体则不能(图3c)。
上述现象说明了尽管很多配体可以特异性结合到细胞表面NL并且引发它们的内吞，它们后续的命运却是不同。我们随后考察了ES被运送到细胞核后的功能。Bouche等人报道了NL可以促进一些对于细胞生存和增殖很重要的事件，例如DNA的转录以及核内核糖体的生成，只要其N端的丝氨酸残基在bFGF刺激下被某些激酶，例如CK2所磷酸化。Folkman和他的同事们也报道了bFGF所刺激的内皮细胞的迁移可以被ES所抑制。根据Bouche等人的研究，bFGF刺激的NL的磷酸化是由CK2介导而非其它激酶，例如封闭的核内的cdc2。因此，我们推测ES通过抑制bFGF刺激的CK2介导的NL磷酸化来抑制细胞增殖。为了证实这个猜想，我们分离出处于静止状态的HMEC的核并在ES存在或不存在的条件下进行了磷酸化实验。结果显示当ES与HMEC核预先孵育后，NL的磷酸化被抑制(图4h)。此外，bFGF而非VEGF可以刺激NL的磷酸化(图4h)，这可能可以解释以前的报道中bFGF可以刺激内皮细胞的增殖而VEGF可以刺激内皮细胞的迁移。我们观察到的现象表明ES可以抑制bFGF刺激的CK2所介导的NL磷酸化，结果抑制了细胞的生存和增殖。
例四ES通过NL-myosin复合物影响细胞迁移和粘附到目前为止，我们已经证明了NL是ES的一个新受体，并介导ES对细胞迁移、增殖和粘附的抑制作用。由于integrin也被报道是ES的受体，因此我们很感兴趣NL和integrin之间是否存在相互作用。在integrin家族中，Rehn和Sudhakar等人报道integrin α5β1是ES的受体，因此，我们使用integrin β1的鼠抗和NL的兔抗来做间接免疫荧光试验来研究细胞表面的NL和integrin α5β1是否定位在一起。通过激光扫描共聚焦显微镜，我们观察到了细胞表面NL和integrin β1在特定部位的共定位(图4i-k)，暗示NL和integrin β1在细胞表面有某种相互作用。由此，我们尝试引入免疫共沉淀的方法，使用NL的多克隆抗体来捕捉NL和integrin β1的复合体。但不幸的是在沉淀中没有检测到integrin β1，这暗示NL和integrin β1之间的相互作用是间接的。过去的研究结果证明，myosin参与膜的运动和肌动蛋白在细胞皮层的组织装配，进而影响到细胞迁移、粘附和内吞。同时，我们还证明了NL和非肌肉myosin在细胞皮层形成一个复合物，并且这种复合物对于内皮细胞的运动性和粘附起着关键的作用。因此，我们推测ES可能通过NL-myosin复合物干扰细胞的运动性和粘附。有可能的是，细胞表面的NL和integrin α5β1连同其他蛋白如myosin一起形成一个大的复合物来作为ES的受体(见图6)。
例五NL的分布为ES的低毒性提供了基础ES特异性地抑制新生血管生成和肿瘤生长，并且我们观察到ES在动物实验中没有毒性，在临床试验中仅显示低毒性。但这种现象背后的具体分子机理却还不清楚。我们的结论是NL介导ES在抗新生血管生成中的特异性的活性，这似乎与过去所报道的NL是细胞中的一种普遍存在的蛋白相矛盾。为了解释这一矛盾，我们考察了不同生长状态下HMEC表面NL的丰度。正如我们所预料的，结果显示在旺盛增殖的细胞表面NL的丰度要远远高于在相对静止的细胞表面(图5a-f)。相对静止的细胞是通过血清饥饿24小时得到的，它们所处的细胞周期通过流式细胞仪进行了检测(图5g-h)。流式细胞仪的检测结果显示血清饥饿后处于G1期的细胞比例增加了24％，S期的减少了30％(图5g-h)。尽管细胞没有完全处于G1期，细胞表面的NL的量在血清饥饿24小时后显著减少。我们推测这种细胞膜表面NL丰度的不同导致了内皮细胞对ES敏感度的不同。
为了研究是否类似的细胞学现象也会在动物体内的研究中发现，我们检测了肿瘤组织和正常器官细胞表面NL的丰度。首先，我们在接种了Hela肿瘤的裸鼠的背部皮下注射了NL的多克隆抗体，注射部位远离接种的肿瘤，然后使用免疫组织化学的手段去观察这些抗体的分布(图5i-1)。结果显示NL的抗体只在肿瘤诱生的内皮细胞上积累，而在正常组织例如心脏、肾和肺中没有发现(图5i-1)。这些发现与Folkman的抗新生血管生成理论非常的一致在成年人中，除非血管内皮细胞被一些内源性的血管生成刺激因子所上调，否则它们会处于一种静止的状态而几乎不进行增殖，；而正在增殖中的内皮细胞出现在某些生理或病理的血管生成过程中如肿瘤生长和转移。总之，NL，也就是ES的受体在内皮细胞表面的不同丰度为ES在动物和临床试验中的低毒性提供了一种解释。因为在肿瘤诱生的血管内皮细胞膜表面的NL比正常组织的丰富的多，因此ES特异性的结合NL从而选择性的在肿瘤组织上发挥其抗新生血管生成的活性；另一方面，ES很少与正常器官结合，因为正常器官细胞表面NL较少，这反过来也使得在用ES治疗肿瘤时不会带来毒性。
例六重组NL在细胞迁移实验中调节ES的功能我们使用SV总RNA分离以及反转录系统(Promega)按照制造商建议的操作规程从HMEC中得到NL的cDNA。PCR得到NL与多聚组氨酸(His)6的融合序列后，继而亚克隆到表达载体pPIC9K(Invitrogen)。按照制造商手册上的建议，该载体经限制性内切酶Sal I(Promega)线性化后电转化甲醇酵母菌株GS115。经G418筛选得到的稳定转化子于30℃，BMMY培养基(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；100mmol/L磷酸钾，pH 6.0；13.4g/L酵母基础氮源；40mg/L生物素以及每日补加至终浓度0.5％的甲醇)中摇瓶培养3天。培养基上清经镍离子亲和柱(Qiagen)纯化得到NL。我们将1L培养基上清pH调到8.0后上6ml Ni-NTA柱并按照制造商的建议进行洗涤和洗脱。最终可从每升培养基获得约3mgNL。我们利用该方法得到的NL制备了NL的多克隆抗体。
HUVEC(2×104每孔))接种到含有DMEM培养基，0.5％胎牛血清，以及10ng/mlbFGF(PeproTech EC)的Transwell滤膜(8μm孔，Costar)的上室中。ES(5μg/ml，Protgen)以及重组NL(20μg/ml)，或NL的抗体(20μg/ml)于迁移实验开始时添加。PBS亦作为对照加入此迁移实验系统。同样的DMEM培养基与其它试剂也加在下室中。内皮细胞在37℃，5％CO2的条件下迁移6h。经乙醇和曙红固定染色后，在光学显微镜下选择五个不同的视野对完全迁移过滤膜的细胞进行计数并取其平均值。结果显示重组人NL以剂量依赖的方式削弱ES对细胞迁移的抑制作用，说明重组NL与ES的抗新生血管生成活性相关。类似地，NL的多克隆抗体阻断了ES对细胞增殖的抑制作用。
例七癌细胞表面NL被其抗体封闭后生长加速我们使用SV总RNA分离以及反转录系统(Promega)按照制造商建议的操作规程从HMEC中得到NL的cDNA。PCR得到NL与多聚组氨酸(His)6的融合序列后，继而亚克隆到表达载体pPIC9K(Invitrogen)。按照制造商的建议，该载体经限制性内切酶Sal I(Promega)线性化后电转化甲醇酵母菌株GS115。经G418筛选得到的稳定转化子于30℃，BMMY培养基(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；100mmol/L磷酸钾，pH 6.0；13.4g/L酵母基础氮源；40mg/L生物素以及每日补加至终浓度0.5％的甲醇)中摇瓶培养3天。培养基上清经镍离子亲和柱(Qiagen)纯化得到NL。我们将1L培养基上清pH调到8.0后上6ml Ni-NTA柱并按照制造商的建议进行洗涤和洗脱。最终可从每升培养基获得约3mgNL。我们利用该方法得到的NL制备了NL的多克隆抗体。
Hela细胞接种至裸鼠皮下。从次日起，NL的抗体每三天一次缓慢注射到远离肿瘤接种部位的鼠背部皮下。第七次注射后，裸鼠被处死，称重肿瘤并测量三次其大小。这些动物实验的结果显示当细胞表面NL被抗体封闭后肿瘤生长显著加快，说明NL在调节肿瘤生长和新生血管生成中扮演重要角色。
例八利用ES-Ni-NTA亲和层析柱筛选NL-特异性新生血管生成抑制剂我们使用SV总RNA分离以及反转录系统(Promega)按照制造商建议的操作规程从HMEC中得到NL的cDNA。PCR得到NL与多聚组氨酸(His)6的融合序列后，继而亚克隆到表达载体pPIC9K(Invitrogen)。按照制造商的建议，该载体经限制性内切酶Sal I(Promega))线性化后电转化甲醇酵母菌株GS115。经G418筛选得到的稳定转化子于30℃，BMMY培养基(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；100mmol/L磷酸钾，pH 6.0；13.4g/L酵母基础氮源；40mg/L生物素以及每日补加至终浓度0.5％的甲醇)中摇瓶培养3天。培养基上清经镍离子亲和柱(Qiagen)纯化得到NL。我们将1L培养基上清pH调到8.0后上6ml Ni-NTA柱并按照制造商的建议进行洗涤和洗脱。最终可从每升培养基获得约3mgNL。NL经其N端融合的组氨酸标签固定在Ni-NTA镍离子亲和柱上。此柱料可以用来高通量筛选与NL结合的蛋白。所得到的NL结合蛋白可以利用MALDI-TOF结合肽段指纹图谱鉴定。它们在抗新生血管生成过程中的生物活性可由细胞实验，例如上面描述的细胞迁移与增殖实验，来检测。
例九ES与NL的体内共定位SPR(Surface plasmon resonance)ES与NL的结合动力学通过SPR方法测定，仪器是Amersham生物技术公司的BIAcore 2000TM生物传感系统。纯化后的ES用20mM醋酸钠缓冲液(pH 6.5)稀释成100μg/ml，并按照使用手册上的方法，通过使用氨基偶联试剂盒(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide，(N-hydroxysuccinimide)共价固定在研究用CM5传感芯片上。100μg/ml的ES(20mM醋酸钠缓冲液，pH 6.5)注射到活化的研究用CM5传感芯片上，直到在SPR仪器上响应值达到9000个单位。没有反应的芯片表面用pH 8.5的乙醇氨封闭(Amersham生物技术公司)。ES与NL的结合动力学SPR在25℃进行，溶解在流动相HBS(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，and 0.005％surfactant P20，pH 7.4)中的NL以10μl/min的流速注射进SPR 20μl。ES与NL的结合动力学曲线就是在流动相中NL的浓度随时间变化的值。原始数据通过Amersham生物技术公司的分析软件BIAevaluation3.1分析。ES与NL的结合率常数ka，解离率常数kb和解离平衡常数KD通过Langmuir结合模型计算(化学计量比1∶1)。
实时SPR是一种快速灵敏的测定两个分子间相互作用的实验方法。我们用它来测定ES与NL之间的亲和力。通过对这些ES与NL的结合动力学曲线的分析，我们计算出ES与NL的解离常数KD＝2.32×10-8M。
ES与NL的体内共定位我们将旺盛增殖期的小鼠黑色素瘤细胞B16/F10(2×106cells in 200μl of PBS)种植在2个月大的Balb/c小鼠的皮下。八天后，进行ES与NL在小鼠体内的共定位实验。标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体分别先后被静脉注射到荷瘤小鼠体内。对照组注射标记有生物素的ES和纯化的兔多克隆抗体。一小时后，小鼠被麻醉，用20ml PBS从心脏灌流，然后处死。小鼠的一些正常组织和肿瘤被取出、固定、切片。切片同时用TRITC标记的抗生物素蛋白(Pierce)和FITC标记的二抗检测，在Olympus Fluoview激光扫描共聚焦成像系统下进行观察(Olympus Inc.)。
在体内我们也观测到了ES和NL的共定位。标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体分别先后被静脉注射到荷瘤小鼠体内。对照组注射标记有生物素的ES和纯化的兔多克隆抗体。一小时后，小鼠的一些正常组织和肿瘤用于免疫荧光检测。标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体选择性地在肿瘤地血管表面聚集(图7j-1)。在心脏(图7a-c)、肝脏(图7d-f)、肾脏(图7g-i)的血管壁上并没有发现标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体。在小鼠地肿瘤组织中，标记有生物素的ES和NL的兔多克隆抗体很好地重叠在了一起。在对照肿瘤组织中，并没有发现对照的NL的兔多克隆抗体(图7m-o)。这些结果表明，ES和NL只在肿瘤血管表面共定位，在正常组织内没有共定位。
所有上述提到的论文，著作，专利，专利申请，网站以及其它印刷的文档，都被包括在但不仅限于以下的参考文献列表中。
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权利要求
1.一种评估是否使用ES进行癌症治疗的诊断试剂盒；包括a.一种对NL进行标记的标签；以及b.提供一种通过对样本进行上述的标记后，来测定样本中NL含量的使用指导。
2.要求1中提到的诊断试剂盒适用于哺乳动物。
3.要求1中提到的诊断试剂盒适用于人类。
4.要求1中提到的诊断试剂盒标记的是细胞膜表面的NL。
5.要求1中提到的诊断试剂盒标记的是全细胞中的NL。
6.要求1中提到的诊断试剂盒使用的标记物是抗体。
7.要求6中提到的诊断试剂盒所使用的标记抗体是单克隆抗体。
8.要求6中提到的诊断试剂盒所使用的标记抗体是多克隆抗体。
9.要求1中提到的诊断试剂盒标记的是一种核酸分子。
10.要求9中提到核酸分子是脱氧核糖核酸分子。
11.要求9中提到核酸分子是核糖核酸分子。
12.一种和上述方法类似的方法用于评估是否使用ES进行癌症治疗的科目；包括a.根据上述方法，通过对NL表达的水平的检测筛选出样本；并且b.通过上述的方法对NL表达量进行检测，从而决定是否使用ES进行癌症治疗。
13.一种获得以NL为特异性靶点的有效的新生血管生成抑制剂的方法；包括a.对待筛选的分子使用合适的结合实验，从而得到一些NL特异性结合的分子；b.利用抗新生血管生成试验检验上步骤得到的各种分子抑制新生血管生成的效果；并且c.挑选出能在抗新生血管试验中有效抑制新生血管生成的NL特异性分子。
14.要求13中的方法提到的NL特异性新生血管生成抑制剂是蛋白质或肽。
15.要求13中的方法提到的NL特异性新生血管生成抑制剂是小分子。
16.要求13中的方法提到的NL特异性新生血管生成抑制剂用来治疗新生血管生成依赖性疾病。
17.要求16中的方法提到的新生血管生成依赖性疾病是癌症。
18.要求16中的方法提到的新生血管生成依赖性疾病是内皮细胞疾病。
19.一种选择具有体外抑制内皮细胞增殖效果的新生血管生成抑制剂的方法包括如此步骤a.使用制药学上可接受的方法去发现与NL有特异性相互作用的分子；b.检测a步骤中得到的分子抑制内皮细胞增殖的效果；并且c.确定所得到的能有效抑制内皮细胞增殖的是何种分子，同时对比该分子与ES的抗新生血管生成的功能。
20.要求19中的方法提到的NL特异性新生血管生成抑制剂是蛋白质或肽。
21.要求19中的方法提到的NL特异性新生血管生成抑制剂是小分子。
22.一种提高靶细胞对新生血管生成抑制剂的响应能力的方法包括a.导入外源性NL至靶细胞，从而使修饰后的靶细胞表达更多的NL；b.检验ES对这些修饰过的癌细胞的杀伤率。
23.要求22中的方法提到的靶细胞是癌细胞。
24.要求22中的方法提到的靶细胞是内皮细胞。
25.要求22中的方法提到的新生血管生成抑制剂是ES。
26.要求22中的方法提到的将外源NL导入靶细胞是通过病毒载体。
27.一种增强新生血管生成抑制剂对目标内皮细胞的效果的方法包括a.导入靶细胞制药学上有效剂量的外源NL，上述NL能够在靶细胞中得到表达；以及b.将上述靶细胞与上述新生血管生成抑制剂共孵育，从而获得对上述靶细胞生长的抑制。
28.要求27中的方法提到的新生血管生成抑制剂是ES。
29.要求27中的方法提到的目标内皮细胞是癌细胞。
30.一种检验个体靶细胞对于新生血管生成抑制剂敏感度的诊断试剂盒包括a.特异性结合NL的分子；以及b.一种制药学上可接受的载体。
31.要求30中的诊断试剂盒提到的新生血管生成抑制剂是ES。
32.要求30中的诊断试剂盒提到的靶细胞是癌细胞。
33.一种确定对新生血管生成抑制剂治疗敏感的目标肿瘤新生脉管内皮细胞的诊断试剂盒包括a.一种NL的抗体；以及b.一种制药学上可以接受的载体。
34.要求33中的方法提到的NL的抗体是多克隆抗体。
35.要求33中的方法提到的NL的抗体是单克隆抗体。
36.一种确定癌症患者对ES治疗敏感程度的方法；包括取患者的一个样本，用NL抗体处理，检测样本中NL与其抗体形成的复合物，复合物的量越多患者对ES治疗越敏感。
37.一种提高新生血管生成抑制剂控制病人携带的肿瘤生长的效果的方法包括a.用合适的方法确定上述病人肿瘤样品中存在的内源性NL水平；并且b.利用上述病人NL表达水平确定新生血管生成抑制剂对上述病人有抑瘤效果的可能性，较高水平的NL说明使用新生血管生成抑制剂治疗更容易成功。
38.要求37中的方法提到的新生血管生成抑制剂是ES或其拟似物。
39.要求37中的方法提到的检验病人肿瘤样品中NL表达水平是通过NL的抗体与NL的免疫沉淀来进行的。
40.一种确定对新生血管生成抑制剂治疗敏感的肿瘤新生血管内皮细胞的方法包括a.制备一种抗NL的抗体；b.使用上述抗体从上述目标肿瘤细胞样本中筛选；并且c.根据抗NL抗体与目标癌细胞之间的特异性相互作用确定目标癌细胞对新生血管生成抑制剂治疗的敏感程度，相互作用越强目标癌细胞对新生血管生成抑制剂治疗越敏感。
41.要求40中的方法提到的NL的抗体是多克隆抗体。
42.要求40中的方法提到的NL的抗体是单克隆抗体。
43.要求40中的方法提到的新生血管生成抑制剂是ES。
全文摘要
本发明提供了一种设计试剂盒，用于检测和筛选那些适于使用ES和其他新生血管生成抑制剂类药物治疗的癌症种类或癌症个体。本发明同时提供了筛选新生血管生成抑制剂的方法，特别是作用与ES相似的抑制剂。此外本发明提供了通过导入外源性NL至目标内皮细胞使它们更易被新生血管生成抑制剂(例如ES)杀死，从而增加内皮细胞对于新生血管生成抑制剂(例如ES)的敏感度的方法。
文档编号A61P35/00GK1862258SQ20051001170
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月12日 优先权日2005年5月12日
发明者罗永章, 石虎兵, 张卓兵 申请人:清华大学, 北京普罗吉生物科技发展有限公司