专利名称：一种可防治妇女更年期综合征或骨质疏松症的中药提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于防治妇女更年期综合征或骨质疏松症的中药提取物。
背景技术：
淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、当归和巴戟天六味中药组成的处方，具有温肾益精，滋阴降火的双重调节功能，通常用于治疗妇女更年期综合征、不孕症。疗效确切，已广为应用。但通常是将该中药煎煮后作为汤剂服用，不仅煎煮不方便，而且存在服用量大、质量标准不稳定等缺陷。至今未见有关将其制备成中药提取物并用于防治骨质疏松的报道。
发明内容
本发明将淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、当归和巴戟天制备成中药提取物，除了可用于治疗妇女更年期综合征外，还可用于抗骨质疏松。
本发明中药提取物的制备方法如下一、配方与配比 (重量)淫羊藿 8-15份仙茅8-15份知母8-15份黄柏8-15份当归8-15份巴戟天 8-15份二、操作步骤1.制备提取液根据常规将上述药材按配比用提取溶剂浸泡后分次煎煮提取，得提取液。
提取溶剂选自水或是乙醇与水的任意比例混合物，优选60-70％乙醇，其用量可以是药材的6-15倍(重量/体积)，优选8-10倍。
药材先用提取溶剂浸泡1-3小时，或者浸泡过夜。泡润后按常规加热提取不少于2次，提取时间为1-3小时，优选2小时。合并提取液。
2.浓缩纯化按常规将上述提取液减压浓缩，浓缩液用大孔树脂纯化，先用去离子水冲洗，弃去洗脱液，再用30-70％含水乙醇洗脱，优选50％乙醇，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得本发明提取物。
所说大孔树脂选自AB-8、D-101、ZTC-1及SP 905等型号，优选ZTC-1和SP-905。
本发明提取物经检测分析，总黄酮含量以淫羊藿苷计不少于35％，其中淫羊藿苷含量不低于4％；总生物碱含量以小檗碱计不少于10％，其中小檗碱含量不少于2％；总皂苷含量以菝葜皂苷元计不少于10％；仙茅苷含量不少于2％，本发明提取物符合药品注册管理办法中对5类中药提取物有效部位群的要求。
经实验，本发明提取物还具有明显的抗骨质疏松作用，因而可与药学上适宜的载体混合，用于制备防治妇女更年期综合征或骨质疏松的中药制剂。
具体实施例方式现结合实施例，对本发明作详细的描述实施例1.制备本发明提取物取淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、当归和巴戟天药材各10kg，加480kg 70％乙醇，煎煮提取三次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液60℃减压浓缩至其相对密度为1.05g/ml(25℃)。使浓缩后的液体通过活化处理后的大孔树脂柱(每公斤药材用已处理好的湿树脂1kg)，使液体中的活性成分被树脂柱吸附，并弃去流出液。用水洗脱大孔树脂柱，弃去洗脱液；继用50％乙醇洗脱大孔树脂柱，收集洗脱液，60℃减压回收溶剂至干，得提取物2.35kg。总黄酮含量以淫羊藿苷计为35.5％，其中淫羊藿苷含量为4.64％；总皂苷含量以菝葜皂苷元计为13.9％；总生物碱含量以小檗碱计为15％，其中小檗碱含量为2.37％；仙茅苷含量为2.56％。
实施例2.取淫羊藿12kg、仙茅12kg、知母10kg、黄柏10kg、当归和巴戟天药材各8kg，加600kg水，煎煮提取三次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液60℃减压浓缩至其相对密度为1.08g/ml。使浓缩后的液体通过活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的活性成分被树脂柱吸附，并弃去流出液。用水洗脱大孔树脂柱，弃去洗脱液；继用60％乙醇洗脱大孔树脂柱，收集洗脱液，60℃减压回收溶剂至干，得提取物2.303kg。总黄酮含量以淫羊藿苷计为33.0％，其中淫羊藿苷含量为4.16％；总皂苷含量以菝葜皂苷元计为15.8％；总生物碱含量以小檗碱计为10.5％，其中小檗碱含量为1.19％；仙茅苷含量为2.58％。
实施例3.取淫羊藿15kg、仙茅15kg、知母8kg、黄柏8kg、当归和巴戟天药材各7kg，加600kg 50％乙醇，煎煮提取三次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液60℃减压浓缩至其相对密度为1.02g/ml。使浓缩后的液体通过活化处理后的大孔树脂柱(每公斤药材用已处理好的湿树脂1kg)，使液体中的活性成分被树脂柱吸附，并弃去流出液。用水洗脱大孔树脂柱，弃去洗脱液；继用40％乙醇洗脱大孔树脂柱，收集洗脱液，60℃减压回收溶剂至干，得提取物2.412kg。总黄酮含量以淫羊藿苷计为38.4％，其中淫羊藿苷含量为4.41％；总皂苷含量以菝葜皂苷元计为11.5％；总生物碱含量以小檗碱计为10.8％，其中小檗碱含量为2.16％；仙茅苷含量为2.34％。
本发明提取物的质量标准分析方法如下1.鉴别(1)取本发明提取物0.1g，加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和含淫羊藿苷10μg/ml对照品溶液各10μl，分别点于以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)的上层液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品淫羊藿苷色谱相应的位置上，显示相同的暗红色斑点。说明本发明提取物中含有药材淫羊藿提取物。
(2)照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和含仙茅苷10μg/ml的对照品溶液各10μl，分别点于以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)的上层液为展开剂展开，取出，晾干，喷以2％铁氰化钾-2％三氯化铁溶液(1∶1)。供试品色谱中，在与对照品仙茅苷色谱相应的位置上，显示相同的蓝色斑点。说明本发明提取物中含有药材仙茅提取物。
(3)照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和含小檗碱10μg/ml的对照品溶液各10μl，分别点于以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)的上层液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品小檗碱色谱相应的位置上，显示相同的黄色斑点。说明本发明提取物中含有药材黄柏提取物。
(4)取本发明提取物0.5g，加乙醇5ml溶解，加盐酸1ml，加热回流1小时后，浓缩至约3ml，加水5ml，用苯10ml振摇提取，挥干提取液，残渣加苯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取菝葜皂苷元对照品，加苯制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于硅胶G薄层板上，以苯-丙酮为展开剂展开、取出、晾干，喷以8％香草醛无水乙醇溶液与硫酸溶液的混合液，在100℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品菝葜皂苷元色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。说明本发明提取物中含有药材知母提取物。
(5)取本发明提取物0.1g，加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1g，加70％乙醇提取，减压浓缩至相对密度约1.05g/ml，通过大孔树脂柱，用蒸馏水洗脱至molish反应为阴性，用50％乙醇洗脱，至薄层检测无阿魏酸为止。减压浓缩蒸干乙醇液，得到当归对照药材提取物；取当归对照药材提取物0.1g，加乙醇1ml溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液和含阿魏酸10μg/ml对照品溶液各10μl，分别点于硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(8∶2)为展开剂展开、取出、晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材提取物、对照品阿魏酸色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。说明本发明提取物含有药材当归的提取物。
(6)取样品0.1g，加乙醇1ml溶解，作为供试品溶液。另取巴戟天对照药材1g，加70％乙醇提取，减压浓缩至相对密度约1.05g/ml，通过大孔树脂柱，用蒸馏水洗脱至molish反应为阴性，用50％乙醇洗脱，至无色。减压浓缩蒸干乙醇液，得到巴戟天对照药材提取物，取巴戟天对照药材提取物0.1g，加乙醇1ml溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材提取物色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。说明本发明提取物含有药材巴戟天提取物。
2.检查以气相色谱法检查有机溶剂残留物色谱条件与系统适用性试验用SIMPLICITY-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；FID检测器；毛细管初始温度60℃，进样口温度180℃，检测器温度220℃。以高纯氮(99.99％)为载气，柱前压力7psi，分流比30∶1。
所测残留乙醇、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯内标乙基苯溶剂N N-二甲基甲酰胺测定进样量1μl。进样分析开始毛细管60℃恒温4min，而后程序升温20℃/min至90℃，并维持0.1min；再程序升温40℃/min至200℃，并维持0.5min。
本发明提取物未测出正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯残留。符合药品注册管理办法中对大孔树脂中有机溶剂残留物检测的有关规定。
3.含量测定(1)总黄酮标准品溶液制备精密称取淫羊藿苷标准品5.00mg，置25.0ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得0.2mg/ml淫羊藿苷标准液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物5.00mg，用甲醇溶解后定容至25.0ml量瓶，摇匀。
标准曲线绘制精密吸取0.2mg/ml淫羊藿苷标准液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，置10.0ml量瓶中，加入0.1mol/L三氯化铝溶液1.0ml，用甲醇定容至10.0ml，70℃恒温水浴放置10min，取出后室温放置15min，411nm波长测定吸收度。以吸收度A值对标准品浓度回归得线性方程A＝13.513C+0.0009，r＝0.9998；线性范围0.008～0.04mg/ml。
样品测定精密吸取样品液1.5ml，分别置10.0ml量瓶中，加入0.1mol/L三氯化铝溶液1.0ml，用甲醇定容至10.0ml，70℃恒温水浴放置10min，取出后室温放置15min，以试剂为空白，以分光光度法，在411nm波长测定吸光度。
本发明提取物按干燥品计算，总黄酮含量以淫羊藿苷计，不得少于35％。
(2)淫羊藿苷以高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验SHIMADZU高效液相色谱仪，LC-10ATVP恒流泵，SPD-10Auv-vis检测器；色谱柱为Hypersil-RDS C18(4.6mm*200mm)；流动相甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶70∶2，检测波长为270nm。
标准品溶液制备精密称取淫羊藿苷标准品适量，加流动相制成每1ml含1mg的溶液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物10mg，加甲醇溶解，定容至10ml。
样品测定分别精密吸取标准品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定。
本品按干燥品计算，含淫羊藿苷不得少于4％。
(3)总生物碱标准品溶液制备精密称取盐酸小檗碱2.00mg置10ml容量瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.75)溶解并定容至刻度，即得0.2mg/ml的盐酸小檗碱标准溶液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物50.00mg用缓冲溶液溶解后定容至25.0ml量瓶，摇匀。
标准曲线绘制精密吸取0.2mg/ml的盐酸小檗碱标准液0.5、0.9、1.3、1.7、2.1ml分别置于具塞的三角锥瓶中，均用缓冲液稀释至4.0ml，加入0.0125％溴麝香草酚蓝指示剂2ml和10ml缓冲溶液，摇匀，加入氯仿10ml，盖好瓶塞，充分振荡2min，移入分液漏斗中，静置20min，分层，收集氯仿层，以同样的方法取5ml氯仿再萃取一次，合并氯仿液，加0.5g无水硫酸钠脱水，以随行溶剂空白为对照，测定420nm波长吸收度，以吸收度A值对标准品浓度回归，得线性方程A＝0.0006112C+0.1121，γ＝0.9968；线性范围0.004～0.02mg/ml。
样品测定精密吸取样品溶液1ml，分别置容量瓶中，照标准曲线项下方法测定。
本发明提取物按干燥品计算，总生物碱含量以小檗碱计不得少于10％。
(4)小檗碱以高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验SHIMADZU高效液相色谱仪，LC-10ATVP恒流泵，SPD-10Auv-vis检测器；色谱柱为Hypersil-RDS C18(4.6mm*200mm)；流动相甲醇∶0.02ml/L NaH2PO4∶0.1ml/L三乙胺＝40∶60∶2；检测波长为345nm。
标准品溶液制备精密称取小檗碱标准品适量，加流动相制成每1ml含1mg的溶液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物10mg，加甲醇溶解，定容至10ml。
样品测定分别精密吸取标准品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定。
本发明提取物按干燥品计算，含小檗碱不得少于2％。
(5)总皂苷标准品溶液制备精密称取菝葜皂苷元5.00mg，加氯仿溶解，定容至25.0ml，得0.200mg/ml菝葜皂苷元标准溶液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物0.5000g，加入2mol/L盐酸20ml回流提取3hr，用60ml氯仿分3次萃取，收集萃取液，回收至干，再用氯仿定容至50ml。精密吸取氯仿萃取液1.0ml，用氯仿稀释定容至10ml，摇匀，备用。
标准曲线绘制精密吸取0.200mg/ml菝葜皂苷元标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，置10ml刻度试管中，吹干。加入0.2ml 5％香兰素-冰醋酸和0.8ml高氯酸，涡旋，于70℃恒温水浴加热20min，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸9.0ml，摇匀，590nm波长测定吸收度，以吸收度A值对标准品浓度回归，得线性方程A＝18.615C+0.0281，r＝0.9996；线性范围0.0816～0.408mg/ml。
样品测定精密吸取样品溶液2.0ml，置于10ml刻度试管中，吹干。加入0.2ml 5％香兰素-冰醋酸和0.8ml高氯酸，涡旋，于70℃恒温水浴加热20min，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸9.0ml，摇匀，以试剂为空白，照分光光度法，在590nm波长下测定吸收度。
本发明提取物按干燥品计算，总皂苷含量以菝葜皂苷元计不得少于10％。
(6)仙茅苷以高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验SHIMADZU高效液相色谱仪，LC-10ATVP恒流泵，SPD-10Auv-vis检测器；色谱柱为Hypersil-RDS C18(4.6mm*200mm)；流动相甲醇∶水∶冰醋酸＝50∶80∶2；检测波长为283nm标准品溶液制备精密称取仙茅苷标准品适量，加流动相制成每1ml含1mg的溶液。
供试品溶液制备精密称取本发明提取物10mg，加甲醇溶解，定容至10ml。
样品测定分别精密吸取标准品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定。
本发明提取物按干燥品计算，含仙茅苷不得少于2％。
本发明提取物用于抗骨质疏松的药效学实验如下一、本发明提取物对去卵巢大鼠骨质疏松模型的影响1.实验材料与方法1.1动物 SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于上海西普尔比凯实验动物有限公司。
1.2药材及试剂 由实施例1制备的中药提取物，仙灵骨葆，贵州同济堂制药股份有限公司(批号03070407)；尼尔雌醇，上海华联制药有限公司(批号031008)；血清Ca、P、碱性磷酸酶测定试剂盒购于上海复星长征医学科学有限公司；血清骨钙素、降钙素、雌二醇测定试剂盒购于中国科学院原子能研究所。
1.3仪器 双能X线骨密度仪，岛津万能材料试验机，γ-射线计数仪。
1.4实验分组及给药 将大鼠随机分为7组，每组10只，包括假手术组，模型组，尼尔雌醇组，仙灵骨葆组，本发明提取物低剂量组，中剂量组，高剂量组。各组大鼠在2％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下，腹部切开皮肤、肌肉，暴露腹腔，找出双侧卵巢，假手术组保留，其余各组切除。所有动物在24～28℃通风良好的清洁级动物房内饲养，每周称体重一次。假手术组，模型组灌胃给予0.5％CMC-Na，5ml/kg/d，每周6次，尼尔雌醇组灌胃给药，1mg/kg/次，每周1次；仙灵骨葆组灌胃给药270mg/kg/d，每周6次；本发明提取物低、中、高剂量组灌胃给药分别为54mg/kg/d、108mg/kg/d，216mg/kg/d，每周6次。连续给药3个月。
1.5血清生化指标测定 将大鼠麻醉，眼眶取血，分离血清，测定血清钙、无机磷含量、碱性磷酸酶活性和雌二醇、骨钙素、降钙素含量。
1.6骨生物力学指标测定 末次给药后次日，处死大鼠，迅速剥离其左侧股骨，用游标卡尺测量左侧股骨的长度、短轴宽度和长轴宽度后，以岛津万能材料试验机进行三点弯曲试验，测定左侧股骨的生物力学参数。
1.7骨密度测定 末次给药后次日，处死大鼠，迅速剥离其右侧股骨，以双能X线骨密度仪测定右侧股骨的骨密度。
1.8统计学处理 组间均值比较采用方差检验。
2.实验结果2.1本发明提取物对去卵巢大鼠子宫重量及血清雌二醇水平的影响(结果见表1)由表1可见，大鼠去卵巢后，子宫发育受到抑制，与假手术组比较子宫重量减轻62％，具有显著性差异。尼尔雌醇增加去卵巢大鼠的子宫重量，与模型组比较具有显著性差异。仙灵骨葆和本发明提取物均使去卵巢大鼠的子宫重量增加。但与模型组比较无显著性差异。模型组大鼠血清雌二醇含量比假手术组下降了40％，各给药组均使去卵巢大鼠血清雌二醇含量增加，与模型组比较无显著性差异。说明本发明提取物对去卵巢大鼠子宫重量和血清雌二醇水平没有显著的影响。
表1 本发明提取物对去卵巢大鼠子宫重量及血清雌二醇水平的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.052.2本发明提取物对去卵巢大鼠血清生化指标的影响(结果见表2)由表2可见，去卵巢及各给药组大鼠之间血清中磷的含量无显著性差异。模型组与假手术组比较，血清钙含量没有显著性变化，但各个药物组均可显著增加去卵巢骨质疏松大鼠血清钙的水平。大鼠去卵巢后，碱性磷酸酶显著升高，尼尔雌醇和仙灵骨葆可以降低去卵巢引起的血清碱性磷酸酶升高，但与模型组比较无显著性差异。不同剂量的本发明提取物均可降低去卵巢引起的血清碱性磷酸酶的升高，高剂量组与模型组比较具有显著性差异。去卵巢后，血清骨钙素含量升高，与假手术组比较具有显著性差异。尼尔雌醇在一定程度上可以降低去卵巢引起的血清骨钙素的升高，仙灵骨葆能显著增加去卵巢大鼠血清骨钙素的水平，不同剂量的提取物对去卵巢大鼠血清骨钙素的水平无显著性的影响。大鼠去卵巢后，血中降钙素水平维持正常，各个药物组对去卵巢大鼠血清降钙素的水平无显著影响。说明本发明提取物可以抑制去卵巢引起的骨高转换。
表2本发明提取物对去卵巢大鼠血清生化指标的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.052.3本发明提取物对去卵巢大鼠骨生物力学指标的影响(结果见表3)由表3可见，大鼠去卵巢后，股骨的最大载荷没有显著性变化，尼尔雌醇、仙灵骨葆和本发明提取物对股骨的最大载荷也没有显著性的影响。但尼尔雌醇、仙灵骨葆和高剂量的本发明提取物均能显著提高去卵巢大鼠股骨三点弯曲试验的最大挠度、最大应变和能量吸收。说明本发明提取物可增加骨基质的胶原蛋白含量，增强其抗骨折的能力。
表3本发明提取物对去卵巢大鼠骨生物力学指标的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.052.4本发明提取物对去卵巢大鼠骨密度的影响(结果见表4)由表4可见，大鼠去卵巢后，骨密度显著下降，尼尔雌醇和仙灵骨葆能够显著增加去卵巢大鼠的骨密度；不同剂量的本发明提取物均能不同程度的提高去卵巢大鼠的骨密度，高剂量药物组大鼠的骨密度与模型组比较具有显著性差异。说明本发明提取物可以提高去卵巢大鼠的骨密度，所以具有防治骨质疏松的作用。
表4本发明提取物对去卵巢大鼠骨密度的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.05二、本发明提取物对新生大鼠颅盖骨成骨细胞和由骨髓单核细胞诱导的破骨细胞的作用。
1实验材料与方法1.1动物及试剂 新生Wistar大鼠由第二军医大学实验动物中心提供；胰蛋白酶和I型胶原酶为Worthington公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品；MTT(四甲基偶氮噻唑蓝)购自上海生物工程有限公司；RPMI-1640培养基为Gibco公司产品，α-MEM培养基，新生胎牛血清，均为Gibco公司产品；1α，25-(OH)2VitaminD3，地塞米松，萘酚AS-BI磷酸盐，六偶氮副品红，均为sigma公司产品；对硝基苯酚磷酸二钠、对硝基苯酚、二乙醇胺均购自上海生化试剂公司，乙二醇单甲醚，酒石酸钾钠等均为国产分析纯试剂。
1.2细胞培养 取新生Wistar大鼠，在无菌条件下，分离颅盖骨，剔除骨膜及其他组织，用D-Hank′s液冲洗3次，用眼科剪将骨片剪成1mm×1mm的小块，加入0.25％的胰蛋白酶，于37℃消化30分钟，弃上清液，D-Hank′s冲洗3次，加入含0.05％胰蛋白酶及1mg/ml的I型胶原酶的消化液，37℃消化1小时，吸取消化液，经140目尼龙网过滤，再用RPMI-1640培养液冲洗消化的骨残片，收集冲洗液，过滤后与消化液混合，以1000r/min离心10分钟，收集细胞，即为新鲜的成骨细胞，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，调整密度为1×105细胞/ml，接种于100ml的培养瓶中，置37℃，5％CO2的培养箱中培养。24小时后换液。以后视细胞生长情况2～3天换液一次。通过形态观察，HE染色和碱性磷酸酶染色对成骨细胞进行鉴定。将骨髓细胞和成骨细胞共同悬浮在含10-8M 1α，25(OH)2Vitamin D3，10-7M的地塞米松和10％胎牛血清的α-MEM培养基中，使成骨细胞的浓度为105细胞/ml，骨髓单核细胞的浓度为106细胞/ml，接种于培养瓶中，以破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶染色和在牛皮质骨骨片上形成吸收陷窝对破骨细胞进行形态及功能鉴定。
1.3成骨细胞增殖检测 取第二代培养结束术的成骨细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，将细胞悬浮在含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×105细胞/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，于37℃，5％CO2的培养箱中培养，24小时后，换含不同浓度的本发明提取物的10％小牛血清的RPMI-1640培养基，并设不含药物的阴性对照，继续培养48小时，于培养结束前4小时，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，培养结束后，弃上清液，每孔加入150μl DMSO，放置，使形成的甲臜颗粒完全溶解，于550nm处测吸收值。
1.4成骨细胞碱性磷酸酶活性测定 取第二代培养结束末的成骨细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，将细胞悬浮在含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×105细胞/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，培养24小时，细胞贴壁后，换含不同浓度的本发明提取物的10％小牛血清的RPMI-1640培养基，并设不加药物的阴性对照，继续培养8天，每2天换液1次。本发明提取物作用设定时间后，用PBS洗涤细胞3次，加入50mmol/L的二乙醇胺200μl，2.5mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠100μl，37℃反应30分钟，0.3mol/L的NaOH 100μl终止反应，取150μl加入96孔板内，于405nm处测其吸光度。标准曲线为不同浓度的对硝基苯酚溶液在405nm处的吸收值与浓度所作的标准曲线。
1.5破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞的检测 将成骨细胞和骨髓单核细胞共同悬浮于含有10-8M的1，25(OH)2维生素D3和10-7M的地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培养基中，使成骨细胞浓度为105细胞/ml，骨髓单核细胞浓度为106细胞/ml，将细胞悬液加到96孔培养板中，每孔100μl，培养于37℃，5％CO2的培养箱中，细胞培养24h后，换含不同浓度的本发明提取物的α-MEM培养基，并不加药物的阴性对照，培养液中含有10-8M的1，25(OH)2维生素D3和10-7M的地塞米松及10％的胎牛血清。以后，每3天换液一次。培养10天后，进行TRAP染色，对每孔TRAP阳性细胞进行计数。
1.6破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定 如前所述培养破骨细胞，8天后，破骨细胞分化成熟，换含不同浓度本发明提取物的α-MEM培养基100μl，并设不含药物的阴性对照，继续培养48小时，弃上清液，用PBS洗涤两次，用10μl 0.1％的区拉通破碎细胞，15分钟后加入反应液(反应液的配制称取对硝基苯基磷酸二钠0.4g，用去离子水溶解，加入酒石酸钾2.0g，加水溶解至150ml，用1N HCl调节PH至3.5，再加去离子水至200ml。)100μl，于37℃反应30分钟，迅速加入100μl 1N的氢氧化钠溶液终止反应，于波长410nm处测定其吸收值，以对硝基苯酚溶液作标准曲线，以每孔生成的对硝基苯酚的纳摩尔数表示抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。
2.结果2.1对成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性的影响(结果见表5)由表5可见，本发明提取物在1-10μg/ml的浓度范围内能够浓度依赖地增加成骨细胞的增殖，但只有在5μg/ml和10μg/ml的浓度作用下，成骨细胞的增殖和对照相比具有显著性差异。本发明提取物2-10μg/ml的浓度范围内能够浓度依赖地增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，并与对照相比具有显著性差异。说明本发明提取物是通过增加成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的活性促进骨形成的。
表5.本发明提取物对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响n＝6
注与对照组比*P＜0.05，**P＜0.012.2对破骨细胞的形成、分化及抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响(结果见表6)由表6可见，本发明提取物在1-20μg/ml的浓度范围内剂量依赖地抑制破骨细胞的形成、分化和抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，但只有5-20μg/ml的浓度作用下，与对照相比较具有显著性差异。说明本发明提取物通过抑制破骨细胞的形成、分化和降低抗酒石酸酸性磷酸酶的活性而减少骨吸收的。
表6.本发明提取物对破骨细胞的形成、分化及抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响n＝6
注与对照组比*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.一种中药提取物，制备方法如下(一)配方与配比(重量)淫羊藿8-15份仙 茅8-15份知 母8-15份黄 柏8-15份当 归8-15份巴戟天8-15份(二)操作步骤(1)制备提取液根据常规，将上述药材按配比用提取溶剂浸泡后分次煎煮提取，得提取液，提取溶剂选自水或乙醇与水的任意比例混合物；(2)浓缩纯化按常规将上述提取液减压浓缩，浓缩液用大孔树脂纯化，大孔树脂用去离子水洗脱，弃去洗脱液，再用30-70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得本发明提取物，其总黄酮含量以淫羊藿苷计不低于35％，其中淫羊藿苷含量不低于4％；总生物碱含量以小檗碱计不低于10％，其中小檗碱含量不低于2％；总皂苷含量以菝葜皂苷元计不低于10％；仙茅苷含量不低于2％。
2.按权利要求1所述的中药提取物，其特征在于配比为淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、巴戟天和当归各10kg，以70％乙醇为提取溶剂，煎煮提取3次，合并提取液，过滤，60℃下减压浓缩至滤液相对密度为1.05g/ml，用活化处理后的大孔树脂ZTC-1纯化，大孔树脂柱用水洗脱后，再用50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，60℃减压回收溶剂至干，得本发明提取物。
3.按权利要求1或2所述中药提取物在制备防治妇女更年期综合征或骨质疏松药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是将淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、当归和巴戟天按一定比例煎煮提取制成的中药提取物，不仅可用于制备妇女更年期综合征的药物，而且经大量实验证明其具有抗骨质疏松的作用，因此，也可用于制备抗骨质疏松的药物。
文档编号A61P15/12GK1679765SQ20051002343
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月19日
发明者张巧艳, 王寅, 秦路平 申请人:中国人民解放军第二军医大学