一种重组融合蛋白衍生物及其制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种重组融合蛋白衍生物及其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、生物、食品、饮料技术领域，具体地说是涉及生物技术产品及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种重组融合蛋白衍生物及其制备方法和用途。
背景技术：
(一)自身免疫性疾病的研究进展1、概况人体免疫系统有分辨“自己”和“非己”的功能，它对自己的组织和细胞不会产生免疫反应。但是，人体免疫系统出现异常时，也可能对自己的组织和细胞产生免疫反应，从而破坏或损伤自己的组织或细胞，即自身免疫病，其重要标志之一是形成抗自身组织成分的自身抗体，该自身抗体的检查和控制是自身免疫病的重要诊断手段和临床治疗的基础。
自身免疫性疾病是严重危害人类健康的一类重要疾病。自身免疫性疾病的典型疾病是系统性自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(简称SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthrtis，简称RA)、硬皮病(简称PSS)、皮肌炎、多动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、多发性肌炎、系统(多发)性硬化、CREST综合征、强直性脊柱炎、骨关节炎、成人斯蒂尔病、白塞病、特赖综合征、银屑病、复发性多软骨炎、系统性血管炎等。此外，自身免疫性疾病还包括器官特异性自身免疫性疾病，如内分泌系统自身免疫病、血液系统自身免疫病、心血管系统自身免疫病、呼吸系统自身免疫病、消化系统自身免疫病、泌尿系统自身免疫病、神经系统自身免疫病、自身免疫性眼病、自身免疫性皮肤病等。
系统性自身免疫性疾病中的系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎、多动脉炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、银屑病、复发性多软骨炎等疾病曾被命名为“结缔组织病”，后来国际和国内均将它们与风湿性疾病统一归为风湿病。
2、发病机理自身免疫性疾病是严重危害人类健康的一类重要疾病，它是人体免疫系统错误地把自身细胞当成外来入侵物质进行攻击而产生的疾病。
自身免疫病产生的原因非常复杂，主要是人体免疫识别功能和自身稳定功能发生紊乱；或是自身的组织和细胞因感染而发生结构或组分的改变，使免疫系统误认为“非己”而加以攻击；或是原来隐蔽的或被包围的组织或细胞(如眼球内容物，男性睾丸中的精子等)显现，被免疫系统认为是“非己”；也可能是上述情况同时存在。
也就是说，自身免疫性疾病的发病机制在于自我耐受的破坏以致于自身抗体或/和致敏淋巴细胞损伤含有相应自身抗原的器官组织而引起临床症状；病理过程中，自身反应性T细胞的活化是免疫病理损伤的关键。
而探讨其中的重要一大类疾病——风湿病的复杂的发病机制、寻找早期诊断方法、确定疗效肯定而副作用小的治疗方法一直是整个风湿病学界的奋斗目标。
总之，发生自身免疫的更深层次原因及其对策研究仍是医学研究的难点和热点。
3、流行病学情况及临床表现自身免疫性疾病患者遍及世界各地，患病率以10万分之几计算；以其中系统性红斑狼疮病为例，在中国患病率为70.41/10万，女性患病率为113.33/10万(黄铭新等.系统性红斑狼疮流行病学调查.中华内科杂志，1985，14451.)。
该类疾病临床表现多为慢性病，任何年龄、性别、种族均可发病，一般发病年龄多在青壮年，女性见多。例如，RA是一种最常见的以慢性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病，病程长，易反复，给患者造成很大痛苦；该病在中国的发病率约为0.36％。患者发病年龄多在20～50岁，女性多于男性，男女之比为1∶3；其突出的早期临床表现为对称性多关节红肿热痛，常见四肢小关节，指间近端关节肿胀，掌指(跖趾)、腕、肘、踝甚至颞颌等关节肿痛及活动困难，晨间关节僵硬，午后逐渐减轻，关节外症状约有20％患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状，则有不同程度的关节畸形和强直，关节功能丧失等，可损伤脏器、多组织器官，造成股骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。
4、诊断与治疗的现状和前景目前，对自身免疫性疾病尚无根治方法，治疗均是应用非特异性免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、中药等，其疗效不肯定且常同时影响机体正常的免疫应答，长期应用后可抑制骨髓，造成贫血，白细胞下降，降低机体抗感染能力，诱发条件致病性微生物和寄生虫感染，并且由于免疫监视能力的抑制，易患肿瘤。
自身免疫性疾病防治的最佳选择就是诱导机体对自身抗原重新产生特异性免疫耐受，因此，人们一直探索具抗原特异性的免疫抑制剂。
而风湿病学是一门年轻的、多学科交叉的边缘学科，近年来发展非常迅速。风湿病患者的体内都存在自身抗体，其中的“标志性抗体”可用于检测、诊断和治疗，对于风湿性疾病的诊断、治疗及预后判断意义重大；其检查、治疗方法几经改进，价值越来越大，因此生物制剂在风湿病中的应用有着良好的发展前景。
以类风湿性关节炎(RA)的诊断为例。
由于RA的病因至今不十分清楚，而且早期临床表现不典型，加之缺乏特异性的诊断方法，给疾病早期诊断及治疗带来一定困难。现已证明RA患者关节病变在发病后第一年发展最快，发病第二年即可出现不可逆的骨关节破坏，早期使用改变病情的药物可控制疾病的进展。因此，RA的治疗关键在于早期治疗，而早期治疗的前提是早期诊断，所以早期诊断就成为大家所关注的热点问题。
关于早期RA的定义一直是风湿病学界争论的问题，2003年EULAR会议提出了非常早期RA和早期RA的定义，将病程少于12周的RA定义为非常早期RA，病程在12周和2年之间的RA定义为早期RA，并强调无论非常早期还是早期RA均需一经诊断即给予缓解病情的抗风湿药(简称DMARD)治疗。
美国关节炎基金会主席和CEO Klippel认为，抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，简称CCP)抗体对RA的意义，与前列腺特异性抗原(简称PSA)对筛查前列腺癌的意义相当，该基金会2003年首次对关节炎研究领域的年度重大进展进行总结，RA新标志物抗CCP抗体就被评为关节炎研究十大进展之一。欧洲等风湿病学界也肯定了抗CCP抗体在RA早期诊断中的价值，研究结果显示预测RA的独立参数是抗CCP抗体、关节肿胀数、握力和AKA阳性，最好的预测指标为抗CCP抗体，有助于在临床症状出现前数年准确检出RA，并已将此抗体列入常规检测。
近年来，国际上许多风湿病学家致力于RA早期诊断的研究，包括建立早期关节炎门诊、重视早期临床表现，提出早期RA的大体诊断标准、建立RA早期诊断的自身抗体检测方法，及将CT、MRI和B超等敏感的影像学检查手段应用于RA的早期诊断等，这是指导早期开始有效治疗RA、改善预后的重要环节。
(二)器官移植的研究进展器官移植是指通过外科手段，将他人的具有活力的器官移植给病人以代替其病损的器官的手术。器官移植是现代临床医学科学发展最快的学科之一，其产生、应用和发展带动和促进了免疫学、药理学、遗传学和分子生物学等一系列基础学科的研究发展。而这些基础学科的研究进展反过来又促进了器官移植的更深入全面和有效地应用于临床治疗患各种器官终末性疾病病人。可以说，现今除了头颅和脊髓不能移植外，全身各器官组织均可移植置换，甚至多个器官可同时联合移植，使许多以往认为的“不治之症”得以根治。据统计到1989年全球肾移植已超过16万人次，心、肝移植均超过4000人次，骨髓移植每年以2500～3000例次的速度前进，胰移植已达1500例次。可以预见，不久的将来器官移植术会逐渐成为越来越多的致命性疾病的常规治疗手段。
但是，移植手术技术方法的提高和完善并未能保证术后移植器官的长期有功能存活，除非是孪生子间的移植。原因在于人不同个体间存在着血型和组织配型的差异，这种差异导致受体对移植入体内的供器官不接受，即免疫排斥反应。
移植物长期存活的关键在于选择与受者组织相容性抗原及其他相关抗原有高度一致性的供者，但是在临床实际应用中却极难达到，因为主要组织相容性抗原及其他相关抗原系统的复杂性及多样性，而且目前用于移植的器官、组织和细胞主要来源于同种尸体或活亲属供者，所以移植术后必然会发生免疫排斥反应。因此排斥反应成为器官移植获得成功的主要障碍。为了预防和治疗排斥反应，使移植物长期存活，必须采用免疫抑制的措施。
(三)免疫抑制剂的研究进展1、分类目前，临床使用的免疫抑制措施包括使用免疫抑制剂和使用其他免疫抑制措施。其中，以免疫抑制剂的应用最为广泛，免疫抑制剂包括化学药物免疫抑制剂、生物免疫抑制剂即抗淋巴细胞抗体。
免疫抑制剂的应用为上述器官移植获得长期良好疗效创造了条件，如肾移植一年存活率达95％以上，心、肝移植存活率分达90％和80％以上。因而，免疫抑制剂被公认为是现代临床器官移植成功的一项有力保证(夏穗生.临床移植医学.浙江科学技术出版社.1999，8～9.)。
2、发展历史免疫抑制剂治疗的发展经历了四个阶段第一阶段(1908年～1967年)长达70年，采用放射线或化学药物不加选择地破坏所有分化的细胞，这种免疫抑制剂导致严重感染死亡的发生率高，故未广泛应用于临床。
第二个阶段(1967年～1976年)主要着重于对T细胞的抑制研究，采用对T细胞免疫抑制作用的多克隆血清制剂，虽然这种免疫抑制剂能使多种T细胞活性减低，改进移植物存活效果，但却增加了受者抵抗力的副作用。
第三个阶段(1976年～至今)是研究药物抑制参与免疫反应的细胞，采用化学免疫抑制剂，其代表是环孢素A。环孢素A的出现为近20年来器官移植的发展起到了巨大的推动作用。迄今，环孢素A仍是主要的免疫抑制剂。
环孢素A为代表的第三代免疫抑制剂导致的感染发病率减少、肿瘤发生率不高于其他免疫抑制剂，其缺点是药物引起的器官毒性和并发症，例如，肝毒性、肾毒性、消化道并发症、内分泌并发症、神经系统并发症。
第四代免疫抑制剂，也就是正在准备研究的更理想的免疫抑制剂的时期。
3、临床应用效果及研发前景免疫抑制剂在临床器官移植中使用经历了近50年的历史，每一个新的进展都推动了临床器官移植的发展；然而，并没有达到满意的效果。虽然移植物一年存活率如肾移植已达95％，但急性排斥反应的发生率仍高达50％，慢性排斥反应的发生率达10％，且现有免疫抑制剂无法防治；一旦发生，只能再次移植，但再次移植的成功率仅50％(陈实.移植免疫学.湖北科学技术出版社.1998)。
迄今，应用于临床的每一种防治排斥反应的免疫抑制剂都是非特异的，它们会降低受者全身免疫功能，从而减低了受体对感染和肿瘤的抵抗能力且还有药物的毒副作用；如果不能耐受，常被迫停药，影响移植物长期存活。排斥反应防治的最佳选择就是诱导宿主对供体抗原重新产生特异性免疫耐受，因此，具有抗原特异性免疫抑制剂是最理想的选择。
尽管免疫抑制剂的研究有了很大进展，但是，理想的免疫抑制剂应该是只抑制由供体抗原引起的特异免疫反应的T淋巴细胞克隆和B淋巴细胞克隆，然而目前的所有免疫抑制剂均未达到这个要求。
今后长期的目标是长期使用免疫抑制剂，要达到既能治疗疾病，又不造成患者的免疫缺陷和引起其它的并发症。所以，寻找新型、有特异性抑制功能且毒副作用小的免疫抑制剂是十分必要的。从经济学角度来说，由于免疫抑制剂的应用范围广阔，且价格昂贵；仅在器官移植方面的应用每年的产值就以数十亿美元计，因而研制新型免疫抑制剂的经济效益也是十分可观的。
(四)共刺激分子免疫抑制剂的研究进展共刺激分子是一类参与免疫反应的辅助性分子，存在于T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗原提呈细胞(简称APC)和靶细胞的表面。共刺激分子与其受体结合所产生的共刺激信号在T细胞活化、辅助T细胞分化、信号转导及效应性细胞因子分泌中起着非常重要的作用。如果没有共刺激分子的参与，识别了抗原的T淋巴细胞通常无法活化或是活化后很快凋亡而表现出克隆无能或免疫耐受。
初始T细胞的活化需要B7-CD28、CTLA-4和CD40-CD154的共刺激信号，但是效应T细胞功能的发挥在很大程度上是不依赖于这些共刺激途径。
最近发现，在记忆T细胞的活化过程中，存在着一种新的共刺激分子——可诱导共刺激分子(Inducible costimulator，简称ICOS)。ICOS基因位于人染色体2q33上，与CD28和CTLA-4的基因紧密相连，排列在一个长度为252000个碱基(简称bp)的区域内，以CD28的起始密码子开始，ICOS的终止密码子结束，彼此分离；ICOS基因含5个外显子、4个内含子(Hutloff A，Dittrich A M，Beier K C et al.ICOS is an inducible T-cell co-stimulatorstructurally and functionally related to CD28.Nature，1999，397263-266.)。
ICOS是B7/CD28超家族成员，优势表达在激活的T细胞上，可以促进激活T细胞的增殖和分化、增强细胞因子分泌和杀伤活性、调节抗T辅助淋巴细胞亚群(简称TH1/Th2)的极化，促进T细胞依赖的抗体产生(Hutloff，A.(1999)Nature 397263-266)。CD28-CTLA-4-ICOS基因区与许多疾病的自身免疫型相连并且相关，如I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病、多发性硬化症、腹腔疾病等，这使它们对于自身免疫病的研究十分重要。
目前的研究已证实T效应细胞的激活和功能发挥必需ICOS的共刺激(参见例如Tafurl，A.(2001)Nature，409(6816)105-109.)，ICOS可以促进激活T细胞的增殖和分泌，调节Th1/Th2细胞的极化、增强依赖T细胞的B细胞功能等。ICOS为已激活记忆T细胞提供共刺激信号，阻断ICOS共刺激途径可以增加记忆、活化T细胞的凋亡。体内外实验均报道，阻断ICOS共刺激信号，导致IL-4、IL-10、IFN-γ、CC和CXC趋化因子等细胞因子表达减少、免疫球蛋白类型转换受损；ICOS能够减轻实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(简称EAE)的临床症状；ICOS能够延长同种异体移植心脏、肝脏的存活期；ICOS能够减轻利什曼原虫感染的炎性(参见例如Rottman，JB.(2001)Nature Immunology(2)；605-611.；Guo，L.(2002)Transplantation，73；1027-1032.；Greenwald，RJ.(2002)J Immunol 168(3)991-995.)。
以ICOS共刺激途径为靶点的重组融合蛋白作为免疫抑制物及其制备方法和用途方面的研究，已有初步研究结果。
但经文献检索等，到目前为止，尚未发现以ICOS共刺激途径为靶点的高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物作为免疫抑制物及其制备方法和用途方面的有关报道。

发明内容
本发明所需要解决的技术问题是公开一种以ICOS共刺激途径为靶点的高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物及其制备方法和用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。
也就是说，本发明意在研究一种以ICOS共刺激途径为靶点的高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物及其制备方法和用途，进而将其作为新的免疫抑制物、诊断试剂、检测试剂等，用于制备相应的产品如药物、试剂等；即发明目的之一是提供该重组融合蛋白衍生物；目的之二是提供该重组融合蛋白衍生物的制备方法；目的之三是提供该重组融合蛋白衍生物的用途，以提供科学研究、疾病治疗、疾病诊断、疾病检测等方面的使用和应用。本发明重点提供一种以ICOS共刺激通路为作用靶点的一种新型、高效、特异性的免疫抑制物，即ICOS120重组融合蛋白衍生物。
(一)有关概念与定义为便于叙述，本发明就有关内容作如下定义①将人ICOS的全部氨基酸分子的第120位氨基酸进行氨基酸置换后得到的修饰后的新的人ICOS的全部氨基酸分子、或其变体、片段或衍生物，或者是将含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段的第120位赖氨酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种，在本文中统一简称为ICOS120；其中，优选的氨基酸置换是保守氨基酸置换。②人ICOS的N端第21～140位片段的氨基酸，在本文中统一简称为ICOS21～140。③将ICOS21～140的第120位氨基酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的ICOS21～140，在本文中统一简称为ICOS120多肽，亦称ICOS120配体结合区。④优选的保守氨基酸置换是将ICOS21～140的第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸后所得到的修饰后的新的ICOS21～140，即ICOS120多肽中一种特殊的ICOS120多肽类型，在本文中统一简称为ICOS120R多肽，其核苷酸序列见序列表3，其氨基酸序列见序列表4。⑤将ICOS120与功能分子如免疫球蛋白(简称Ig)的恒定片段(简称Fc)、或其变体、片段或衍生物进行融合形成的重组蛋白衍生物，在本文中统一简称为重组融合蛋白衍生物，又称ICOS120重组融合蛋白衍生物，亦称ICOS120重组融合蛋白。
本文使用的“保守氨基酸置换”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基是包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸等)、中性侧链(例如甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等)、分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等)或芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸等)等中的一种或多种。
(二)技术构思本发明的技术构思是这样的1、概述中国药物研发具有悠久的历史，在预防、诊断、治疗等各方面都积累了丰富的经验，自主开发创新药物是中国医药界目前的一项紧迫任务，而抓紧寻找有效的活性成分或者产品是一条有效的途径。因此，本发明通过对共刺激分子免疫抑制剂以及相关内容的系统研究，并筛选和证明该相关产品的活性和用途。
从共刺激分子免疫抑制剂的理论研究和科学实验结果上均反映出，阻断ICOS共刺激途径可望成为治疗、诊断、检测和研究自身免疫性疾病和移植排异的一种有效的途径。存在于活化或记忆T细胞表面的ICOS，与其配体表达细胞表面的配体分子结合形成复合物后，才能发挥其生物学功能。如果，阻断ICOS与其配体的结合，则可以抑制活化了的T细胞的功能，而不影响其他淋巴细胞的功能，不会导致机体免疫功能缺陷，因而是特异性免疫抑制剂的理想选择。因此，以ICOS活性抑制为靶点的免疫抑制剂，有可能成为自身免疫性疾病和移植排异免疫调控等疾病治疗、诊断、检测和研究的理想免疫抑制药物。
所述的阻断ICOS与其配体的结合的方法，本发明人认为有四种基本途径；通过这四种基本途径，研究人员能够得到具有特异性针对ICOS的免疫抑制剂，也就是说发明人研究开发的具有特异性针对ICOS的免疫抑制剂可以有四种基本类型。所述的四种基本途径如下一是摧毁或破坏ICOS，二是遮蔽ICOS上与配体结合的位点或区域或者是功能活性位点或区域，三是摧毁或破坏ICOS的配体，四是遮蔽ICOS的配体上对应的结合位点或区域或者是功能活性位点或区域；这四种基本途径均能够成功阻碍ICOS与其配体结合，不能够形成预期的复合物。这种研究开发的思路对生物技术领域内其他类似的抗体或抑制剂研究开发也具有普遍的指导作用，当然对生命科学研究领域特别是医药领域中其他涉及到如抗体等类似的研究开发，也是具有重要指导意义的，如抗体化学药物的研究。
2、研究开发的手段目前，如果要得到能特异性针对ICOS的免疫抑制剂的最常见方法是，寻找或制备具有ICOS特异性抑制作用的治疗性抗体。
至今为止，用于治疗作用的抗体共三大类最早的第一类治疗用抗体，是由用相应抗原免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体，这类抗体与相应抗原有很高的亲和力能够结合相应抗原达到治疗目的，但它们给与人类体内使用，会导致人体内产生抗小鼠抗体并且引起一系列相关问题，例如血清半衰期短、不能产生人体效应物的功能和引起有害的人体内抗该小鼠抗体的免疫应答。第二类治疗性抗体，是利用基因工程方法对鼠抗体进行人源化改造，以克服在人体内使用圈鼠抗体引起的各种问题，但由于这些人源化抗体仍然保留了一些鼠序列，因此它们仍然会引起一些不想要的免疫反应，例如人抗人源化抗体反应。第三类治疗性抗体是完全人类抗体，这类抗体是利用人类外周血中自然存在的产生抗原特异性自身抗体的淋巴细胞通过人杂交瘤技术生产而成，但目前认为这些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对相应抗原的亲和性太低无法达到治疗作用。
除寻找或制备具有ICOS特异性抑制作用的治疗性抗体以外，还可以采用基因工程的手段或技术、化学方法等来制备具有ICOS特异性抑制作用的重组融合蛋白，甚至可以利用这些手段或技术、化学方法等来制备以ICOS共刺激途径为靶点的高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物。其中，采用基因工程的手段或技术制备的这类高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物，是指在基因水平上，通过ICOS的蛋白质结构分析，改变与其生物学活性相关的关键性氨基酸位点或区域，将其置换，从而获得高亲和力/高生物学活性的ICOS的全部氨基酸分子、部分氨基酸片段、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种，如ICOS120；然后将ICOS120与功能分子融合，如与免疫球蛋白部分片段的基因相连、并在真核细胞或原核细胞等中表达，从而得到具有上述两部分结构域的重组融合蛋白衍生物。
为降低生产成本，减少产品尤其是药物使用时的副作用等不良反应的发生几率，并减少其使用的频率和剂量等，从而节约和降低社会和个人的成本支出，提高社会效益和经济效益，本发明通过制备一种能够遮蔽ICOS的配体上对应的结合位点或区域或者是功能活性位点或区域的、并且具有高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物，以达到预期的免疫抑制等效果。本发明研发的产品以及实验结果也进一步验证和证实了发明人在产品研究开发思路上的正确性。
3、设计过程发明人在该重组融合蛋白衍生物产品研发的具体设计上，以人源的ICOS为例，思考的内容如下通过目的蛋白如ICOS120同功能分子特别是免疫球蛋白的恒定区结构域相融合，可使重组蛋白获得新的特性①保留有抗原或配体/受体的结合能力。②通过以抗免疫球蛋白恒定片段的抗体进行亲和层析，葡萄球菌A蛋白或葡萄球菌G蛋白可方便地纯化Ig的Fc片段，使制备成本和使用成本明显减低。③利用抗Fc段抗体，可使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。④Fc段可穿过胎盘、结合补体介导补体依赖的细胞毒作用，介导抗体依赖的细胞毒作用(简称ADCC)效应等，可用于某些疾病的靶向治疗。⑤IgG、IgM、IgA的Fc可形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。⑥具有更长的半衰期，更适合于体内的应用。⑦直接用哺乳动物工程细胞生产，不仅更接近天然分子的状况适合机体吸收，而且避免了艾滋病(简称AIDS)、肝炎病毒及其它病源微生物的污染。
来源于人的ICOS(即人源的ICOS，简称hICOS)如来源于人活化的外周血淋巴细胞的hICOS，其mRNA序列编码为NM-012092，全长2610bp，编码区为26～625，可翻译产生长度为199aa的多肽链。ICOS是由二硫键连接的同源二聚体蛋白，相对分子量为55,000～60,000。ICOS的27千道尔顿(简称kDa)和29kDa两条肽链的序列一致，仅在转录后修饰过程的糖基化中产生了一些差别。ICOS与CD28分子有24％的序列完全相同，有39％的序列相似；ICOS与CTLA-4分子有17％的序列完全相同，有39％的序列相似。
ICOS的氨基酸序列分析显示，人源的ICOS(氨基酸序列号S78540)多肽链全长199个氨基酸，其中1～21为其信号序列，22～199为ICOS的多肽序列，其中22～138为胞外区，26～132免疫球蛋白样区域，139～164为其穿膜区，165～199为其胞内区。这种结构说明，成熟的ICOS是I型转膜分子，即在胞质部分有ICOS的肽链；ICOS在表达细胞表面有一条免疫球蛋白样的单链，该结构由42和109位上的保守半胱氨酸而得以稳定；穿膜区由26个氨基酸组成；胞质区是一条35个氨基酸残基的肽尾；这种结构与CD28和CTLA-4很相似。定位于ICOS第136位的半胱氨酸残基是参与同源二聚体间二硫键形成的位置(同样的结构在CD28是141位；在CTLA-4上也有)。ICOS上没有CD28和CTLA-4的配体结合基序MYPPY；ICOS的配体结合基序是FDPPPF。
我们知道，理想的免疫抑制剂应只抑制特定的抗原引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的克隆，如移植抗原引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的克隆。ICOS在幼稚T细胞上不表达，而仅在记忆或活化的T细胞上特异性表达，因而阻断ICOS共刺激途径，可以达到特异性抑制记忆T细胞和活化T细胞功能的作用，而不会影响到其他淋巴细胞的功能，这是免疫抑制剂作用的理想靶点，可以起到特异性免疫抑制的作用。
ICOS是记忆和活化T细胞上的共刺激分子，ICOS生物学活性的抑制可以导致记忆或活化T细胞的功能抑制甚至凋亡，从而诱导出免疫耐受。ICOS生物学活性的发挥是通过ICOS与其配体分子的结合构成ICOS共刺激分子通路来实现的，如果采取某种手段阻止ICOS与其配体的结合则ICOS的活性就被抑制了。
天然的ICOS是一个全长为199个氨基酸的膜蛋白分子，T淋巴细胞活化后，将ICOS表达在T淋巴细胞的表面即细胞膜上，利用基因工程技术对ICOS进行计算机模建技术和缺失突变研究发现，ICOS的N端21～140个氨基酸片段具有其配体结合功能域，具有完全的天然ICOS配体结合生物活性；如果应用基因工程技术合成该片段，则可以竞争结合ICOS的天然配体，达到拮抗ICOS生物学活性的作用。应用基因工程技术，在哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母菌中均可以表达制备ICOS的N端21～140个氨基酸片段，但存在表达量不高、后续纯化困难、体内外容易降解、半衰期短的困难。而如果利用重组融合蛋白作为这种特异性免疫抑制剂，则不仅使其具有免疫拮抗的功能还可以使其具有免疫球蛋白恒定片段的特征，例如增加药物在体内的半衰期、避免了药物在生产过程中由病原微生物引起的污染，而且还可以简化制备的过程达到降低成本的效果等优点。
天然的ICOS的N端1～21氨基酸是信号肽片段，21～140氨基酸片段是天然ICOS的配体结合部位，其中第42/83、63/109位的氨基酸对维持天然ICOS配体结合部位的结构至关重要，115～121位的7个氨基酸是其配体识别位点，对ICOS活性至关重要。应用基因工程技术，人工合成的人ICOS的N端第21～140氨基酸片段即ICOS21～140，可以起到竞争结合ICOS配体抑制ICOS生物学活性的作用。对115～121位的7个氨基酸进行点突变研究，发现这七个氨基酸的变化对ICOS活性的影响很大，其中第120位氨基酸进行氨基酸置换特别是将第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸后得到的ICOS120多肽特别是ICOS120R多肽，与ICOS21～140相比，可以明显提高其抑制ICOS生物学活性的作用。另外，将ICOS120的氨基酸编码基因与功能分子如免疫球蛋白恒定区的编码基因融合，即得到ICOS120重组融合蛋白衍生物如ICOS120-Ig重组融合蛋白衍生物，可避免ICOS120易降解和难纯化的缺点。
所以，以此为依据，发明人设计了一种针对ICOS共刺激途径进行阻断的新型的免疫抑制物——以ICOS共刺激途径为靶点的高亲和力/高生物学活性的重组融合蛋白衍生物，即ICOS120重组融合蛋白；在此基础上，研究开发ICOS120与免疫球蛋白的恒定片段、或其变体或片段或衍生物融合的重组蛋白，其中R2-R1类型的重组融合蛋白衍生物，在本文中统一简称为ICOS120-Ig；并进一步研究开发ICOS120多肽或ICOS120R多肽与人免疫球蛋白G1的恒定片段、或其变体或片段或衍生物融合的重组蛋白，其中具有R2-R1结构类型的该重组融合蛋白衍生物，在本文中分别简称为ICOS120-IgG1或ICOS120R-IgG1。也就是说，本发明从多方面、多角度验证与证实了本技术构思的正确性。
(三)重组融合蛋白衍生物本发明提供的重组融合蛋白衍生物是一种用基因工程方法(包括基因工程的手段或技术)、化学方法等方法制备的一种新型免疫抑制物。
对于人ICOS而言，其中ICOS120多肽是人ICOS的配体结合区，可以竞争结合ICOS的天然配体，抑制ICOS的活性。也就是说，本发明提供的重组融合蛋白衍生物是在对ICOS120进行修饰而得到的一种高抑制活性和/或配体高亲和性的重组融合蛋白，并且还包括在保持ICOS120的高抑制活性和/或配体高亲和性的情况下，在ICOS120配体结合区的其它氨基酸置换也是可能的，优选将ICOS120配体结合区的第42、83、63、109、52、115～119、121、136、137位的氨基酸的置换是用氨基酸置换，进一步优选将ICOS120配体结合区的第52、115～119、121、136、137位的氨基酸的置换是用氨基酸置换，再优选将ICOS120配体结合区的第115～119、121、136、137位的氨基酸的置换是用氨基酸置换，再优选将ICOS120配体结合区的第121、136、137位的氨基酸的置换是用氨基酸置换，最优选将ICOS120配体结合区的第136位的氨基酸的置换是用氨基酸置换。
所述的氨基酸置换优选保守氨基酸置换。
本发明所述的ICOS120重组融合蛋白衍生物是对ICOS120进行修饰所得到的重组融合蛋白衍生物，即功能分子(用代码R1表示)与ICOS120(用代码R2表示)进行融合形成的重组蛋白。
所述的ICOS120重组融合蛋白衍生物，其结构如下该重组融合蛋白衍生物具有选自以下组成形式中的一种或多种重组蛋白衍生物R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1；优选R2-L-R1、R2-R1，进一步优选R2-R1。其中所述的L为连接片段。
所述的R1为任一功能分子，是包括多肽、蛋白等中的一种或多种；优选Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，抗生蛋白链菌素，多组氨酸或绿色荧光蛋白(简称GFP)等中的一种或多种；继续优选Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种；再继续优选IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD等中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种；进一步优选IgG1、IgG2、IgG4、IgA或IgM等中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种，继续进一步优选IgG1、IgG2或IgM等中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种，再进一步优选的是IgG1或IgG2等中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种，最优选的是IgG1中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物等中的一种或多种。
所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，选自以下的一种或多种(1)Fc氨基酸序列，优选序列表1所示的Fc氨基酸序列，即人IgG1的Fc氨基酸序列；(2)Fc氨基酸序列，优选序列表1所示的Fc氨基酸序列，即人IgG1的Fc氨基酸序列；在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸①一个或多个半胱氨酸残基；②一个或多个酪氨酸残基；③缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；④缺失或用谷氨酸取代位置20的亮氨酸；⑤缺失或用丙氨酸取代位103的谷氨酸；⑥缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；⑦缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；⑧缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；⑨取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；⑩取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点的；和(11)亚部分①～⑩的组合；(3)上文亚部分(1)或(2)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；(4)上文亚部分(1)或(3)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(5)上文亚部分(4)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(6)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和(7)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
所述的R2即ICOS120，来源于人，是包括将人ICOS的全部氨基酸分子的第120位氨基酸进行氨基酸置换后得到的修饰后的新的人ICOS的全部氨基酸分子、或其变体、片段或衍生物，或者是将含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段的第120位氨基酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种；优选的氨基酸置换是保守氨基酸置换；进一步优选ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种，即将ICOS21～140的第120位氨基酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的ICOS21～140、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种；所述的ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物，优选自以下中的一种或多种(a)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第42位氨基酸置换所得的任何残基；(b)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第83位氨基酸置换所得的任何残基；(c)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第63位氨基酸置换所得的任何残基；(d)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第109位氨基酸置换所得的任何残基；(e)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第52位氨基酸置换所得的任何残基；(f)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第115～119位氨基酸置换所得的任何残基；(g)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第121位氨基酸置换所得的任何残基；(h)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第136位氨基酸置换所得的任何残基；(i)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第137位氨基酸置换所得的任何残基；(j)上文亚部分(a)至(i)中任何一个所述的ICOS蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(k)上文亚部分(j)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(l)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；(m)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚氨基酸部分；和(n)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
再进一步优选ICOS120R多肽、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种，即将ICOS21～140的第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸后所得到的修饰后的新的ICOS21～140、或其变体、片段或衍生物等中的一种或多种；最优选ICOS120R多肽，即将ICOS21～140的第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸后所得到的修饰后的新的ICOS21～140，其核苷酸序列见序列表3，其氨基酸序列见序列表4。
所述的连接片段是包括甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸等中的一个或多个氨基酸。优选如下中的一种或多种(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；
(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(l)gly-gly-ser-gly-ser-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化学部分；和(n)上文亚部分(a)～(m)的任何组合。
从以上内容，可以看出当R1为Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，R2为ICOS120时，R2-R1类型的重组融合蛋白衍生物，即ICOS120-Ig。
当R1为人源的IgG1的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，R2为ICOS120多肽时，R2-R1类型的重组融合蛋白衍生物，即ICOS120-IgG1；当R1为人源的IgG1的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，R2为ICOS120R多肽时，R2-R1类型的重组融合蛋白衍生物，即ICOS120R-IgG1，其核苷酸序列见序列表5，其氨基酸序列见序列表6；也就是说，其结构具体是N端为可诱导共刺激分子全长199个氨基酸中的第21～140位片段的氨基酸，但是第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸，其C端是人免疫球蛋白G1恒定片段的氨基酸。
在序列表1、序列表2、序列表3、序列表4、序列表5、序列表6中A代表Ala，英文全名Alanine，中文全名丙氨酸；M代表Met，英文全名Methionine，中文全名甲硫氨酸(或称蛋氨酸)；B代表Asx，英文全名Asparalne，中文全名天冬酰胺；或英文全名Aspartic acid，中文全名天冬氨酸；N代表Asn，英文全名Asparagine，中文全名天冬酰胺；C代表Cys，英文全名Cysteine，中文全名半胱氨酸；P代表Pro，英文全名Proline，中文全名脯氨酸；D代表Asp，英文全名Aspartic，中文全名天冬氨酸；Q代表Gin，英文全名Glutamine，中文全名谷氨酰胺；E代表Glu，英文全名Glutamic acid，中文全名谷氨酸；F代表Phe，英文全名Phenylalanine，中文全名苯丙氨酸；
R代表Arg，英文全名Arginine，中文全名精氨酸；S代表Ser，英文全名Serine，中文全名丝氨酸；G代表Gly，英文全名Glycine，中文全名苷氨酸；T代表Thr，英文全名Threonine，中文全名苏氨酸；H代表His，英文全名Histidine，中文全名组氨酸；V代表Val，英文全名Valine，中文全名缬氨酸；I代表Ile，英文全名Isoleucine，中文全名异亮氨酸；W代表Trp，英文全名Tryptophan，中文全名色氨酸；K代表Lys，英文全名Lysine，中文全名赖氨酸；Y代表Tyr，英文全名Tyrosine，中文全名脯氨酸；L代表Leu，英文全名Leucme，中文全名亮氨酸；Z代表Glz，英文全名Glutamine，中文全名谷氨酰胺；或英文全名Glutamic acid，中文全名谷氨酸。
所述的融合方法是指通过本领域公知的现有技术，将ICOS120与功能分子进行结合的方法，包括基因工程的手段或技术、化学方法等方法中的一种或多种，优选基因工程的手段或技术直接或通过连接物间接进行连接，进一步优选基因工程的手段或技术直接连接。
例如，以各种不同的方法可将ICOS120多肽与功能分子诸如Fc结构域融合，以使产生的ICOS重组融合蛋白衍生物具有作为治疗、诊断、检测和研究产品如药物、试剂等的可变生物特性和潜在的可变功效。再例如，可将Fc结构域与ICOS120多肽的氨基端(简称N端)或羧基端(简称C端)融合，可直接融合或通过连接片段融合，和/或根据其天然形式可修饰的Fc或ICOS120多肽部分之一或之二者。这些不同的ICOS重组融合蛋白构成物可以在表达水平、易于分离和/或纯化、生物活性等方面的各不相同。
本发明提供抑制哺乳动物的ICOS分子活性的ICOS120重组融合蛋白，而非抑制其它共刺激分子活性的ICOS120重组融合蛋白。
本发明提供抑制人ICOS分子的活性而非其它共刺激分子的重组融合蛋白衍生物，最好是ICOS120重组融合蛋白衍生物亦抑制不包括人的其它哺乳动物ICOS的活性。
所述的哺乳动物，是包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、黑猩猩、羊、猴、牛或猪等中的一种或多种，进一步优选人、小鼠、大鼠或黑猩猩等中的一种或多种，最优选人。
本发明所提供的重组融合蛋白衍生物具有高效ICOS活性的阻断作用和免疫球蛋白恒定区域的特性。
本发明提供的ICOS120-Ig包含一恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区。优选的是ICOS120R-IgG1融合的IgG1的恒定区。
可以将本发明ICOS120重组融合蛋白衍生为或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白)。因此，本发明ICOS120重组融合蛋白包括本文描述的ICOS120重组融合蛋白衍生的和其它修饰的形式。例如，本发明ICOS120重组融合蛋白可以功能性地连接(通过化学偶连、遗传融合、非共价结合或其它)至一个或多个其它分子实体，例如另一抗体(例如双特意性抗体或双抗体)、可检测剂、细胞毒药剂、药用药剂和/或可以介导该重组融合蛋白与另一分子结合的蛋白或肽(例如抗生蛋白链菌素核心区或多组氨酸标记)等。
可以用于衍生本发明ICOS120重组融合蛋白的可检测剂，包括荧光化合物等；典型的荧光可检测剂，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等等。亦可以用可检测酶衍生ICOS120重组融合蛋白，所述酶为包括碱性磷酸酶(简称AKP或者ALP)、辣根过氧化物酶(简称HRP)、葡糖氧化酶(简称GOD)等等。当用可检测酶衍生ICOS120重组融合蛋白时，通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外的试剂检测该抗体。例如，当有可检测剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。亦可以用生物素衍生ICOS120重组融合蛋白，并通过间接测定抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合检测。
一种类型的衍生本发明重组融合蛋白是通过交联两个或多个抗体(同一类型或不同类型、例如创造双特异性抗体)制备。适当的交联剂包括那些杂双官能的、具有两个有适当隔离物分隔的独特反应基团(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。
(四)重组融合蛋白衍生物的制备方法本发明所提供的重组融合蛋白衍生物，是通过对天然ICOS分子的配体结合位点进行氨基酸置换使其对ICOS配体具有很高的亲和力和/或高事物活性，可作为ICOS活性的高效阻断剂，具有用量小、药效持久的特点，是有特异性免疫抑制作用的新型免疫抑制剂，具有良好的治疗前景。
该重组融合蛋白衍生物的制备方法，包括以下步骤①融合合成能转录并能翻译成重组融合蛋白的重组DNA片段；②表达将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；③纯化分离纯化，即可得到所述的重组融合蛋白。
所述的术语“表达载体”是指有能力运送与其连接的另一核酸的核酸分子，并能够指导上述另一核酸分子的基因表达。表达载体的一种类型是“质粒”，是指其中可以连接其它DNA片段的环状双链DNA环。表达载体的另一种类型是病毒载体，其中在病毒基因组中可以连接其它DNA片段。某些表达载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制，例如，具有细菌复制起点的细菌表达载体和附加体哺乳动物载体。其它表达载体如非附加体哺乳动物载体，可以在导入该宿主细胞时被整合入宿主细胞的基因组，由此可以与该宿主基因组一起复制。另外，某些表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这种表达载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体的常见形式为质粒。在本说明包括具有相同的功能的其它形式的表达载体，例如哺乳动物真核表达载体(例如pSEC Tag2/Hygro A、pcDNA4/His Max、pcDNA3等)、病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)、细菌表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体等。
所述的术语“宿主细胞”是指用于表达目的蛋白的细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(简称CHO细胞)、二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞(简称dhfr-CHO细胞)、非洲绿猴肾成纤维样细胞(简称COS细胞)或人胚肾细胞(简称293细胞)等中的一种或多种。应理解这种术语不仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为在后续世代中，由于突变或者环境影响等可能发生某些修饰，事实上这种后代可以与亲本细胞不同，但却仍然包含于本文所使用的术语“宿主细胞”的范围之内。优选CHO细胞或dhfr-CHO细胞及其后代细胞等中的一种或多种，进一步优选CHO细胞及其后代细胞。
以ICOS120-Ig为例，其制备方法，包括如下步骤①融合合成能转录并能翻译成ICOS120-Ig的重组DNA片段；②表达将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；③纯化分离纯化，即可得到所述的ICOS120-Ig。
以ICOS120R-IgG1为例，其制备方法，包括如下步骤①融合合成能转录并能翻译成ICOS120R-IgG1的重组DNA片段；②表达将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；③纯化分离纯化，即可得到所述的ICOS120R-IgG1。
可以通过在宿主细胞中重组表达以制备本发明的ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。为制备ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，用携带编码该重组融合蛋白的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使所述重组融合蛋白在该宿主细胞中表达并最好分泌至培养所述宿主细胞的培养基中，可以从该培养基回收所述重组融合蛋白。使用了诸如萨姆布鲁克的《分子克隆实验室手册》(第三版，冷泉港，纽约，2001年)所描述的标准重组DNA方法，以获得重组融合蛋白基因、将这些基因加入重组表达载体并将所述载体导入宿主细胞。
为表达ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，首先获得编码所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的DNA片段。可以通过使用聚合酶链式反应(简称PCR)扩增和修饰ICOS基因序列及免疫球蛋白恒定区(IgGFc)序列制备重组DNA。为获得编码ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的特异性配体结合区的DNA片段，通过计算机模建技术与缺失突变技术确定ICOS分子的特异性配体结合区域，并用标准PCR扩增ICOS基因的特异性配体结合区域。为获得编码ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的免疫球蛋白恒定区的DNA片段，通过标准PCR扩增免疫球蛋白恒定区域。
一旦得到所述ICOS基因的特异性配体结合区域和兔疫球蛋白恒定区的DNA片段后，可以修饰这些序列以得到编码本文公开的所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1氨基酸序列。首先将由ICOS的DNA序列编码的氨基酸序列运用同源模建方法分别模拟ICOS分子的空间构象，并搭建ICOS分子与其配体相互作用的复合物模型，据此模型推测ICOS分子配体结合域，以得到编码ICOS分子配体结合域的氨基酸序列或其衍生物的氨基酸序列。通过标准方法例如PCR介导的诱变(其中将所述突变核甘酸加入所述PCR引物，使得所述PCR产物含有所述突变)或定点诱变。
一旦得到所述人免疫球蛋白恒定区的DNA片段后，可以通过标准重组DNA技术连接这些DNA片段，得到重组融合蛋白的DNA片段。首先将由ICOS基因的特异性配体结合区域可操作地连接至编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。免疫球蛋白恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD等中的恒定区中的一个或多个，优选是IgG1、IgG4、IgA或IgM等中的恒定区中的一个或多个，进一步优选是IgG1恒定区。本文使用的术语“可操作地连接”，是指连接这两个DNA片段，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在蛋白质翻译的框架中。
为表达ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，将上述得到的ICOS-Ig的基因片段DNA插入表达载体，使得所述基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作地连接”是指ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1等的基因片连接至载体中，使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节该ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1等基因转录和翻译的即定功能。选择该表达载体和表达控制序列使之与所用的表达宿主细胞相容。通过标准方法(例如连接该ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的基因和载体上的互补限制位点、或如果没有限制位点就进行平端连接)将所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的基因插入该表达载体。另外，该ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的基因可以插入使该重组融合蛋白从宿主细胞分泌的信号肽基因或将ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1克隆入能编码上述信号肽的重组表达载体中，使得该信号肽在转录翻译框架内连接至该重组融合蛋白基因的氨基末端。该信号肽可以是ICOS分子自身的信号肽或免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1基因之外，本发明的重组表达载体还携带控制所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1基因转录或翻译的其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这种调节序列，例如描述于MichaleCarey等Transcriptional Regulation in EukaryotesConcepts，Strategies and Techniques355，Cole Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA(2000)。该表达载体的选择可以取决于种种因素，例如选择欲转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等。优选的哺乳动物细胞表达调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(简称CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(简称SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(简称AdMLP)和多形瘤的启动子和/或增强子)。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，例如Schaffner等的美国专利4,968,615号。
除所述重组融合蛋白基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带其它序列，例如在宿主细胞中调节该载体复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。该选择标记基因便于选择已导入该载体的宿主细胞。例如，一般该选择标记基因赋予已导入该载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(简称DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为表达所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，将编码所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的重组表达载体通过标准技术转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式涵盖了众多的各种用于将外源基因导入原核或真核宿主细胞的常用技术。例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质体等。尽管理论上可以在原核宿主细胞或者真核宿主细胞中表达本发明的ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，但最优选在真核细胞中、最优选在哺乳动物细胞中表达ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，因为这种真核细胞、特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配和分泌正确折叠和具免疫抑制活性的ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。优选的表达本发明重组融合蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(简称CHO)、二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞(简称dhfr-CHO细胞)、非洲绿猴肾成纤维样细胞(简称COS细胞)或人胚肾细胞(简称293细胞)等中的一种或多种。将编码ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养所述宿主细胞足够时间以在所述宿主细胞中表达该重组融合蛋白，或更优选地将该重组融合蛋白分泌到所述宿主细胞生长的培养基中生产所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。使用标准蛋白纯化方法可以从该培养基中回收ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。
在一重组表达本发明ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的推荐系统中，通过脂质体介导的转染将既编码该重组融合蛋白的重组表达载体导入CHO细胞。在该重组表达载体中，所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1基因可操作地连接至增强子/启动子调节元件(例如来自SV40、CMV等以驱动所述基因的高水平转录，该重组表达载体亦携带二氢叶酸还原酶基因(简称DHFR基因)，可以用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用该载体转染的CHO细胞，培养该选出的转化体宿主细胞以表达所述ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1，并从该培养基中回收ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。使用标准分子生物学方法制备该重组表达载体、转染所述宿主细胞、选择转化体、培养所述宿主细胞并从该培养基中回收该ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1。
鉴于前述，本发明的另一方面还涉及到可以用于重组表达本发明ICOS120-Ig或ICOS120R-IgG1的核酸、载体和宿主细胞组合等。
(五)重组融合蛋白衍生物的作用与用途1、概述本发明的进一步目的是提供一种用于制备具有免疫抑制作用以及预防、检测、诊断、治疗和研究自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的产品的原料，所述的产品是包括药物、检测试剂或诊断试剂等中的一种或多种，尤其是一种药物。
本发明ICOS120重组融合蛋白可用于动物尤其是哺乳动物预防、检测、诊断、治疗和研究“其中ICOS活性是有害的紊乱”。这种“其中ICOS活性是有害的紊乱”可因ICOS的存在而发展和恶化，抑制ICOS活性就可以预防、检测、诊断、治疗和研究这种紊乱。所述哺乳动物包括人与非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物包括小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。可以将本发明的ICOS120重组融合蛋白以预防、检测、诊断、治疗和研究目的给予人受预防、检测、诊断、治疗和研究者。将本发明的ICOS120重组融合蛋白给予非人类哺乳动物，以达到兽医目的或做为人类疾病的动物模型。有关后者，这种动物模型可以用于评价本发明重组融合蛋白的治疗效力(例如测试药效、给药剂量和时间过程)。
本文使用的术语“其中ICOS活性是有害的紊乱”包括疾病和其它紊乱。其中，在患该紊乱的受治疗者中，ICOS的存在已显示出或被怀疑或者对该病的病理生理学负责或足以造成该病加重的因子。因此，其中ICOS是有害的紊乱就是这样一种紊乱，其中ICOS活性的抑制预期将减轻该紊乱的症状和/或进程。这种紊乱可以通过例如患该病的受治疗者的生物体中ICOS表达的增加(例如，细胞、脾脏细胞上表达增加)而证实。有许多其中ICOS是有害的紊乱的例子。
以下进一步讨论本发明ICOS120重组融合蛋白在预防、检测、诊断、治疗和研究具体紊孔中的用途。
本文所述的紊乱包括自身免疫性疾病包括系统性自身免疫性疾病及其相关病症(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、强直性脊柱炎、骨关节炎、成人斯蒂尔病、白塞病、特赖综合征、银屑病、复发性多软骨炎、系统性血管炎、多动脉炎或自身免疫性溶血性贫血及其相关病症等)；器官特异性自身免疫病及其相关病症(如内分泌系统自身免疫病、血液系统自身免疫病、心血管系统自身免疫病、呼吸系统自身免疫病、消化系统自身免疫病自身免疫病、泌尿系统自身免疫病、神经系统自身免疫病、自身免疫性眼病或自身免疫性皮肤病及其相关病症等)等；移植排斥及其相关病症等；经皮冠状动脉成形术后血管肥大或闭合、PTCA/斯滕特氏印模/旁路外科术后血管再闭合/再狭窄、介入后血管肥大或闭合、植入移植所引起的血管障碍和排斥及其相关病症等；变应性疾病包括哮喘、变应性鼻炎、结膜炎、消化道变态反应、花粉病或过敏反应及其相关病症等中的一种或多种；炎性疾病包括咽喉炎、膀胱炎、肺炎、心肌炎、心肌病、脑膜炎、炎性眼病、肺炎、矽肺结核、肺结节病、肺结核、关节炎及其相关病症(如骨关节炎、类风湿脊髓炎和骨膜瘤形成及其相关病症等)、术后/外伤后炎症或特应性皮炎及其相关病症等中的一种或多种；糖尿病及其并发症包括视网膜病、肾病、神经病和大血管疾病、糖尿病肾病或异常葡糖耐量症及其相关病症等中的一种或多种；炎性肠内疾病包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎及其相关病症等中的一种或多种；循环疾病包括慢性心衰、心率失常、心绞痛、心肌梗塞、心功能不全和充血性心衰、动脉硬化、动脉粥样硬化、高血压、深部静脉血栓形成、闭塞性周围循环衰竭、局部缺血性循环衰竭、弥散性血管内凝血综合征、雷诺氏病、伯格氏病、门脉高压症、肺性高血压或透析性高血压及其相关病症等中的一种或多种；牛皮癣及其相关病症等；肝病包括肝炎、慢性肝病或肝硬化及其相关病症等中的一种或多种；胰腺疾病包括胰腺炎及其相关病症等；神经变性疾病包括早老性痴呆(Alzheimei)、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化或AIDS脑病及其相关病症等中的一种或多种；中枢神经系统障碍包括脑血管障碍、脑出血、脑梗塞及其后遗症、颅外伤、脊柱损伤、脑水肿、痴呆、记忆障碍、意识障碍或多发性硬化及其相关病症等中的一种或多种；毒血症包括败血症、脓毒性休克、革兰氏阴性浓度症或毒素休克综合征及其相关病症等中的一种或多种；妊娠中毒及其相关病症；肥胖症及其相关病症；高脂血症包括高血脂症或高胆甾醇症及其相关病症等中的一种或多种；肿瘤包括恶性淋巴瘤、胃和肠癌症、癌症和伴随的恶病质或实体瘤及其相关病症等中的一种或多种；内分泌疾病包括阿狄森氏病、库兴氏综合征、黑素细胞瘤或原发性醛固酮增多症及其相关病症等中的一种或多种；Creutzfeldt-Jacob病及其相关病症；病毒性感染包括巨细胞病毒感染或流行性感冒病毒及其相关病症等中的一种或多种；眼病包括青光眼或高眼压及其相关病症等中的一种或多种；肌无力及其相关病症等；慢性疲劳及其相关病症等；骨疾病包括骨折、再骨折、骨质疏松症、骨质软化症、骨Behet病、强直性脊柱炎或骨关节炎以及相关疾病中的关节组织破坏及其相关病症等中的一种或多种。另外，本发明ICOS120重组融合蛋白可以单独或与其他活性组分联合用于治疗。
已知本发明ICOS120重组融合蛋白结合ICOS配体的能力，可以将其用于在诸如酶联兔疫吸附检测(简称ELISA)方法、放射免疫检测(简称RIA)方法或组织免疫组织化学方法等常规免疫检测方法中，从诸如血清或血浆的生物样品中检测出ICOS配体。本发明提供在生物样品中检测ICOS活性的方法，该方法包括用本发明的重组融合蛋白接触生物样品并检测或者结合至ICOS配体由此检测生物样品中ICOS的活性及ICOS配体的含量。为了便于检测配体结合的重组融合蛋白，用可检测物质直接或间接标记该重组融合蛋白。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质或放射性物质等中的一种或多种。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶等中的一种或多种；合适的辅基复合体例子包括抗生蛋白链菌素/生物素或抗生物素蛋白/生物素等中的一种或多种；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等中的一种或多种；发光物质的例子包括鲁米诺等；而合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H等中的一种或多种。
亦可以用本发明ICOS120重组融合蛋白检测来自除人类之外的其它物种的ICOS配体，例如小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种的ICOS配体，因为重组融合蛋白可以与这些ICOS配体的每一种结合。
本发明ICOS120重组融合蛋白在体外和在体内均能抑制ICOS活性；另外，还可以抑制其它物种的ICOS活性。因此，本发明ICOS120重组融合蛋白可以用于例如在含有ICOS配体的细胞培养物、在人类受治疗者或在其它具有本发明的重组融合蛋白可以交叉反应的ICOS配体的哺乳动物受治疗者中抑制ICOS活性，所述的哺乳动物受治疗者包括小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。
2、重组融合蛋白衍生物的联合用药本发明重组融合蛋白衍生物可以单独或与其它活性组分联合用于科学研究、疾病预防、疾病检测、或疾病诊断、疾病治疗等领域。
可以与本发明重组融合蛋白衍生物联用的自身免疫性疾病治疗药物的非限制性例子包括以下非类固醇抗炎药(如NSAID)、细胞因子抑制抗炎药(如CSAID)、CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗体Celltech/Bayer公司产品)、抗Tac(人化抗IL-2RαProtein Design Labs/Roche公司产品)、IL-4(是一种抗炎细胞因子)、布洛芬(属于非类因醇抗炎药)、毗罗昔康(属于非类因醇抗炎药)、双氦芬酸、环磷酰胺、环孢菌素、氨甲蝶呤、保泰松、静脉注射免疫球蛋白、干扰素-β la(商品名Avonex7M；Biogen公司产品)、干扰素-β、甲基强的松龙、强的松龙、硫唑嘌呤、皮质类固醇或雷公藤等中的一种或多种。
可以与本发明ICOS120重组融合蛋白联用的器官移植排斥和/或移植物抗宿主病治疗药物的非限制性例子包括以下硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、肾上腺糖皮质激素、Prograf(如Tacrolimus，FK506)、霉酚酸酯、雷帕霉素、15-脱氧精胍素、雷公藤多甙、BrequinarSodium(简称BQR)、Mizoribine(简称MZ)、抗淋巴细胞抗体、基因工程共刺激分子抑制剂或各类抗菌药等中的一种或多种。
可以与本发明ICOS120重组融合蛋白联用其它疾病治疗药物的非限制性例子包括以下炎性肠病治疗药物，包括表皮生长因子、皮质类固醇、环袍菌素、柳氮磺胺吡啶、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、甲硝唑、氨基水杨酸、抗氧化剂、强的松龙、地塞米松、缓释氨水杨酸、氨甲蝶吟、环丙沙星或利多卡因等中的一种或多种；心血管疾病的治疗剂，包括强心剂、利尿剂、钙拮抗剂或β受体阻断剂等中的一种或多种；糖尿病治疗剂，包括胰岛素、Actos、Rosigilidazone、Kinedak、BENFIL、Humulin、Euglucon、Glimicron、Daonil、Nobolin、Monotard、Glucobay、Dimelin、Rastinon、BASILCON、Deamelin S或Iszilin等中的一种或多种；肾病治疗剂，包括泼尼松龙(Predonine)、琥钠甲强龙(Solu-medrol)、倍他米松(Rinderon)、盐酸地拉卓(Comelian)或tyropidine Fxa抑制剂等中的一种或多种；骨疾病治疗剂，包括钙制剂例如碳酸钙等；降钙素制剂；活性维生素D3制剂；激素制剂；性激素包括雌激素等；前列腺素A1；成骨蛋白(简称BMP)；细胞生长因子；转化生长因子；甲状旁腺激素(简称PTH)等等；以及其它疾病治疗剂。
3、重组融合蛋白衍生物及其组合物的使用方法与要求本发明重组融合蛋白衍生物可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于预防、治疗、诊断、检测和研究相关疾病的产品，包括药物、检测试剂或诊断试剂等中的一种或多种，尤其是药物。
在具体使用方面，本发明所述的ICOS120重组融合蛋白能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解ICOS120重组融合蛋白的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物、兽用药或人类用药等中的一种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种；进一步优选医药学上可接受的载体。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合物。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇、或氯化钠。药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它们增强了该ICOS120重组融合蛋白的有效期或效力。
从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如甘油、硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉、乳糖等；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇等；稀释剂，如水等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土和皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。
例如，将活性组分ICOS120重组融合蛋白溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油和玉米油、丙二醇等)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇、苯酚等)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠、醋酸钠等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)或止痛剂(例如，苯甲醇等)等中的一种或多种。
本发明所述及的ICOS120重组融合蛋白还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明ICOS120重组融合蛋白加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明ICOS120重组融合蛋白和药学上可接受的载体。
本发明ICOS120重组融合蛋白的组合物特别是药物组合物可以有各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂量形式；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的ICOS120重组融合蛋白为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。所述的本发明ICOS120重组融合蛋白的组合物的各种形式，例如液体溶液(例如注射液和输注液)、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。推荐的形式取决于给药方式和治疗用途。典型的推荐组合物是注射液或输注液的形式，例如与用其它基因工程药物对人进行治疗所用的组合物类似的组合物。推荐的给药方式是非肠道的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。
最优选通过肌肉内注射或皮下注射给与该ICOS120重组融合蛋白。
ICOS120重组融合蛋白的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该ICOS120重组融合蛋白与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该ICOS120重组融合蛋白加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。
4、重组融合蛋白衍生物及其组合物的药物剂型和给药途径本发明所述的重组融合蛋白衍生物及其组合物制备的用于免疫抑制以及自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究的产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够进行免疫抑制以及治疗或诊断自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、诊断、检测或保健，既能够单独直接用于制备治疗、诊断、检测或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗、诊断、检测或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。
在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。
ICOS120重组融合蛋白的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂等，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射等)、粘膜透析等给药途径进行免疫抑制作用的治疗、诊断、检测或科学研究以及治疗自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究。
本发明的ICOS120重组融合蛋白可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是静脉内注射或输液。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些实施方案中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物、透皮贴和微囊传递系统。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸等。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978)。
在某些实施方案中，本发明ICOS120重组融合蛋白可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该化合物(和其他成分，如果需要的话)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述化合物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等等形式使用。为了以非肠道给药之外给与本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料对该化合物包衣或与该化合物一同给与。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在某些实施方案中，将本发明ICOS120重组融合蛋白与一种或多种可以用于治疗、诊断、检测ICOS活性为有害的疾病的其它治疗药物共配制和/或共给与。例如，本发明ICOS120重组融合蛋白可以与一种或多种结合其它靶的治疗、诊断、检测产品如药物或试剂(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的重组融合蛋白或抗体等)、一种或多种细胞因子、抗ICOS抑制性抗体和/或多种抑制药剂化学抑制ICOS产生或活性的药物共配制和/或共给与。另外，可以将一种或多种本发明ICOS120重组融合蛋白与二种或多种前述治疗药物联用。这种联合使用可以优越地利用较低剂量的该给与的治疗、诊断、检测产品如药物或试剂，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。
制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等。
以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂和注射剂，进一步优选胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂和注射剂，特别优选混悬剂、乳剂、溶液剂和注射剂。
根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明ICOS120重组融合蛋白的每日剂量。例如，经静脉给予哺乳动物、尤其是成年人(60kg体重)，所述重组融合蛋白衍生物的单剂量约为1～1000mg，优选约80mg，优选每周给药1～2次。可以调整剂量单位以提供最佳所需反应(例如治疗或预防应答等)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给与几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下确定并直接取决于以下①该活性化合物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和②在混合这种用于治疗个体敏感性活性化合物的技术中的内在限制。
本发明的药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明ICOS120重组融合蛋白。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。ICOS120重组融合蛋白的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该ICOS120重组融合蛋白在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该ICOS120重组融合蛋白的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明ICOS120重组融合蛋白的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0～20mg/kg，更优选为1～8mg/kg。应注意剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的ICOS120重组融合蛋白的剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。
综上所述，本发明ICOS120重组融合蛋白及其组合物可用于制备免疫抑制以及自身免疫性疾病或移植排斥及其相关病症的治疗、诊断、检测或科学研究的产品，优选药物、试剂和食品，进一步优选药物和试剂，最优选药物。
(六)技术特长本发明的研究结果，可深入开发为具有临床应用前景的防治自身免疫性疾病及移植排斥等方面的产品如新药、试剂等，具有疗效确切、有效剂量低、无毒副作用的优点，与国内外同类产品相比具有显著的优势。自身免疫性疾病及移植排斥为临床常见病、多发病，随着人民生活水平的提高，预计自身免疫性疾病及移植排斥疾病的发病率将不断攀升。因此，本发明可以为后续的新药等产品研究打下良好的基础，并进一步产生较大的经济效益和社会效益。
本发明提供抑制哺乳动物的ICOS分子活性的重组融合蛋白衍生物，而非抑制其它共刺激分子活性的重组融合蛋白衍生物。所述的哺乳动物，与上文相同。
重组融合蛋白衍生物特别是ICOS120-Ig，具有以下优点①能特异性地抑制记忆和活化T细胞的功能，免疫抑制功能强而且特异；②能大规模制备，通过以抗Fc段抗体进行亲和层析，葡萄球菌A蛋白可方便地纯化，且融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感，使制备成本和使用成本明显减低。③直接用哺乳动物工程细胞生产，不仅更接近天然分子的状况适合机体吸收，而且避免了AIDS、肝炎病毒及其它病源微生物的污染；④根据人源基因设计，不会导致体内抗体产生，安全可靠；⑤融合了免疫球蛋白的Fc段后，使融合蛋白不仅具备与ICOS配体分子结合的所有位点，且能形成二聚体分子，与配体结合能力强，半衰期更长，更适合于体内的应用，甚至可穿过胎盘发挥药效。
目前，临床上使用的免疫抑制剂均为非特异性抑制剂毒副作用强，本发明人所制备的重组融合蛋白衍生物可以起特异性地免疫抑制作用，毒副作用小，安全可靠，而且可以在体外进行大规模制备，生产成本较低，有利于推广应用，具有良好的临床应用和科学研究的价值及良好的社会效益和经济效益。
综上所述，经过长期的药理学试验，该重组融合蛋白衍生物具有免疫抑制作用以及治疗自身免疫性疾病及移植排斥及其相关病症的活性，直接使用该重组融合蛋白衍生物，无须经过胃肠道细菌的代谢，使作用更直接，避免个体之间的胃肠道菌群活性有差异造成代谢产物的差异而产生药效上的差异，从而克服了给药剂量难以控制的问题，并提高了生物利用度。
本发明重组融合蛋白衍生物药理作用较强，其原料来源丰富，制备工艺简单，得率高。此外，该重组融合蛋白衍生物化学性质稳定，制备的免疫抑制产品如药物以及治疗自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症的效果明显，故其更适于制备免疫抑制产品尤其是药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品如药物的工业化生产。
该重组融合蛋白衍生物在胃肠道生物转化中的活性形式，直接使用该重组融合蛋白衍生物，药物的生物利用度高，可以准确控制用药剂量。该重组融合蛋白衍生物性质稳定，使用重组融合蛋白衍生物制备的制剂质量稳定。
本发明有针对性地研究该重组融合蛋白衍生物，该原料使用安全，互为兼顾，一物多用，最大限度地发挥了作用，而且使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
总之，本发明积极适应了现代医疗、食品、饮料和科研等领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于制备免疫抑制产品如药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品尤其是药物的安全原料。
具体实施例方式
本发明研究和公开一种新的重组融合蛋白及其制备方法和用途，提供了一种能够用于制备能够用于免疫抑制的产品尤其是药物以及治疗、诊断、检测自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症药物的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。
也就是说，本发明重点提供一种基因工程能生产的、表达量高、易于纯化、具有抑制ICOS的生物学活性和具有高度生物安全性的重组融合蛋白，这是一种新的生物免疫抑制物。并公布其主要的制备方法，以及该产品的用途。
下面以ICOS120-Ig为例，详细阐述重组融合蛋白衍生物的具体制备方法及用途。
1.配体高亲和性结合位点的筛选利用MSI/Biosym公司的Insight II(98.0)Homology程序完成ICOS配体结合区域的同源模建及受体/配体复合物模型的建立和突变位点的计算机理论筛选，并用缺失突变和定点突变的基因工程技术进行生物学验证，筛选出ICOS配体高亲和力的ICOS120-Ig。
该序列的特点如下(1)N端序列为携带第120位上氨基酸置换的ICOS配体结合区序列，后接免疫球蛋白恒定片段的序列。
(2)ICOS120序列后融合人免疫球蛋白恒定片段是为了增加重组蛋白的稳定性、半衰期及方便后续纯化和分离。
(3)为了便于克隆，在N端的头部加一个sfiI酶切位点，最后终止密码子后加一个NotI酶切位点。
该序列克隆于载体pMD18-T。
2.ICOS120-Ig表达体的构建(1)选用pSecTag2 Hygro为表达载体，该载体哺乳动物真核细胞表达载体，其特征是克隆选择抗性标记为Ampr，表达选择抗性标记为Hygromycin，信号肽为免疫球蛋白κ链的分泌信号肽，插入位点为sfiI-NotI。
(2)以sfiI-NotI从pMD18-T质粒中切出ICOS120-Ig片段，克隆至pSecTag2Hygro的sfiI-NotI位点，构建重组质粒；(3)将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞接种于含100ug/ml Amp的LB培养板上，并从中挑选单个克隆菌落，抽提出质粒经sfiI-NotI酶切，筛选携带重组基因表达载体的细菌克隆；经过序列测定鉴定核酸序列的正确性。
(4)从上述携带重组基因表达载体的细菌克隆中抽取质粒，用脂质体法转染CHO细胞，用500～800ug/ml的Hygromycin筛选出表达ICOS120-Ig的CHO细胞克隆，ELISA检测所得细胞分泌表达一种带有免疫球蛋白恒定区的蛋白，表达量达100ug/ml以上。
3.ICOS120-Ig的获得(1)目的蛋白表达细胞经大规模培养，收集上清液。上清液经过Protein A亲和层析柱、离子交换层析柱、分子筛层析柱，洗涤、洗脱，收集洗脱峰。洗脱液经过超滤器浓缩，加入生理盐水复溶后，取样分析，得到了ICOS120-Ig，经SDS-PAGE和HPLC检测，其纯度大于95％。
(2)体外试验表明，该ICOS120-Ig可以明显抑制异基因混合淋巴细胞增殖试验，其抑制活性强于其它类似免疫抑制剂。
用本方法设计并制备的ICOS120-Ig对配体的亲和力高、抑制性生物学活性强，制备效率高，产物纯度高，具有很高的ICOS活性抑制作用。
4.实施方案用以说明ICOS120-Ig与ICOS配体结合原理ICOS120-Ig可与其配体表达细胞表面的ICOS配体特异性结合，在配体数量一定的情况下，随着ICOS120-Ig含量的增加，与其配体结合量也增加。荧光标记的抗Ig抗体可以与配体结合的ICOS120-Ig相结合，通过流式细胞仪检测结合抗Ig抗体发出的荧光可以反应ICOS120-Ig与其配体的结合。
操作步骤用20％兔血清封闭Daudi细胞的FcR后，取Daudi细胞1×106个，用PBS洗涤二次后分别加入2ug/ml、10ug/ml两个浓度的ICOS120-Ig及空白对照，37℃孵育1小时，用HRP标记的抗人IgG为检测抗体，用流式细胞仪分析配体结合活性。
结果计数1×104个细胞发出的荧光强度，随ICOS120-Ig浓度增加(1ug/ml，5ug/ml)，检测的荧光强度增加，提示ICOS120-Ig与其配体有结合。
5.本实施方案用以说明ICOS120-Ig的生物学活性原理淋巴细胞受到抗原刺激后，在共刺激分子的参与下，淋巴细胞活化并表现出增生、分泌细胞因子等生物学活性。如果没有ICOS共刺激分子的参与，活化的淋巴细胞很快失活，甚至凋亡。在异基因淋巴细胞相互作用的过程中加入ICOS120-Ig，如果淋巴细胞增生受到抑制或细胞因子分泌受到抑制，反映了ICOS的共刺激通路受到阻断，说明ICOS120-Ig具有阻断ICOS共刺激通路的作用并可以抑制异基因淋巴细胞间的增殖反应。
操作步骤取两个不同性别健康献血员的外周血单个核细胞(2×106/ml)各50ul，加入含10％小牛血清的1640培养液稀释的ICOS120-Ig 100ul(终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、0ug/ml)，每个浓度重复三次，在96孔板中混合培养96小时，终止培养前16～18小时，加入3H-TdR，计数cpm值。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其IL-2含量。
结果ICOS120-Ig可以抑制人异基因混合淋巴细胞的增殖反应，亦可抑制IL-2、IFN-γ细胞因子水平。
6.本实施方案用以说明ICOS120-Ig的药效学活性原理致敏性T辅助细胞亚群Th2/Th1失衡是卵蛋白过敏性哮喘小鼠模型主要的致病机理。ICOS共刺激通路参与调节T辅助细胞亚群Th2/Th1平衡。用ICOS120-Ig治疗卵蛋白(OVA)过敏性哮喘小鼠是通过体内试验研究ICOS120-Ig对ICOS共刺激通路的抑制作用。
操作步骤取体重约为20mg、约6周龄的雌性健康BALB/c小鼠作为试验动物(每组8只)。于第0、7、14天腹腔注射20ug OVA与200ul 1.36％Al(OH)3的混悬液以致敏BALB/c小鼠。
第21天起连续3天，IgG/OVA组(疾病组)尾静脉注射200ug对照抗体人IgG(IgG)，ICOS/OVA组(治疗组)尾静脉注射200ug ICOS120-Ig，10分钟后2mg/ml OVA气雾激发；IgG/Saline组(对照组)和ICOS/Saline组(对照组)分别同样给予IgG或ICOS120-Ig尾静脉注射和生理盐水气雾激发。末次气雾激发24小时后检测各组小鼠的肺灌洗液(BALF)、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群。用1mL生理盐水灌洗鼠肺；收集的BALF液离心，分离上清液；双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。小鼠眼球取抗凝血，取血浆检测总IgE含量；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，37℃5％CO2与100ng/ml PMA、1ug/ml ionomycin和0.7ul Golgistop共孵育6小时，收集细胞，加入5ulCYC-antiCD4室温放置20分钟、裂解红细胞、分离出细胞加入Cytofix/Cytoperm液，4℃放置20分钟，加入Perm/Wash液1ml，离心分离出细胞，加入FITC-antiIFN-γ、PE-antiIL-4，4℃避光放置20分钟，Perm/Wash液洗涤两次，PBS重悬细胞。以同型对照抗体为对照样品。用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞，分析CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IFN-γ+(Th1)阳性细胞百分率。
结果ICOS120-Ig治疗组的血清IgE水平、BALF的炎性细胞数和IL-4水平、外周血Th2比例均较疾病组明显减低(见图3)。
7.ICOS120-Ig制剂的几个具体应用本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为取ICOS120-Ig，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含ICOS120-Ig 10～100mg。
本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为取ICOS120-Ig，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含ICOS120-Ig 10～100mg。
本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每支含ICOS120-Ig 10～100mg。
本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每瓶含ICOS120-Ig 10～100mg。
本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。
在本发明中，以上所述的具体实施方式
和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。
实施例1、ICOS120R-IgG1的制备方法①根据人源ICOS配体结合区序列，设计引物，用标准PCR方法从人外周血单个核细胞的DNA中克隆出所需的ICOS片段，用定点突变试剂盒将上述ICOS片段中第120位氨基酸置换为精氨酸，用同样的标准PCR方法从含人IgG Fc的质粒(pIgplus)中克隆出免疫球蛋白恒定片段；用SOC-PCR法将所需的ICOS片段与免疫球蛋白恒定片段连接成ICOS120R-IgG1重组基因片段，并用sfiI和NotI双酶消化上述重组基因片段和哺乳动物真核表达载体pSecTag2/Hygro A，利用sfiI和NotI双酶的粘性末端将所需的ICOS片段插入pSecTag2/Hygro A中，构成pSecTag2/Hygro A-ICOS120R-IgG1重组表达载体。
②将pSecTag2/Hygro A-ICOS120R-IgG1重组表达载体用脂质体法用脂质体(或磷酸钙或电转化法)转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)宿主细胞(或其它哺乳动物宿主细胞)中，用药物抗生素潮霉素筛选单个表达本发明ICOS120R-IgG1的CHO宿主细胞，用无血清培养基大量培养筛选出的上述细胞，收集细胞培养上清液，用亲和层析法从上述细胞培养上清液中纯化出ICOS120R-IgG1。
③用高压液相检测仪器(HPLC)检测ICOS120R-IgG1纯度，用聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测ICOS120R-IgG1分子量，用Western-blot法检测ICOS120R-IgG1的表达。
④生物学活性检测发现ICOS120R-IgG1可以抑制异基因人混合淋巴细胞的增殖反应，还可以抑制抗CD3抗体对人淋巴细胞的刺激反应。
实施例2、ICOS120R-IgG1与ICOS配体结合试验(1)原理ICOS120R-IgG1可与其配体表达细胞表面的ICOS配体特异性结合，在配体数量一定的情况下，随着ICOS120R-IgG1含量的增加，与其配体结合量也增加。荧光标记的抗IgGFc抗体可以与配体结合的ICOS120R-IgG1相结合，通过流式细胞仪检测结合抗IgGFc抗体发出的荧光可以反应ICOS120R-IgG1与其配体的结合。
(2)操作步骤用20％兔血清封闭Daudi细胞的FcR后，取Daudi细胞1×106个，用PBS洗涤二次后分别加入2ug/ml、10ug/ml两个浓度的ICOS120R-IgG1及空白对照，37℃孵育1小时，用HRP标记的抗人IgG为检测抗体，用流式细胞仪分析配体结合活性。
(3)结果计数1×104个细胞发出的荧光强度，随ICOS120R-IgG1浓度增加(1ug/ml，5ug/ml)，检测的荧光强度增加，提示ICOS120R-IgG1与其配体有结合。
实施例3、ICOS120R-IgG1生物学活性测定(1)原理淋巴细胞受到抗原刺激后，在共刺激分子的参与下，淋巴细胞活化并表现出增生、分泌细胞因子等生物学活性。如果没有ICOS共刺激分子的参与，活化的淋巴细胞很快失活，甚至凋亡。在异基因淋巴细胞相互作用的过程中加入ICOS120R-IgG1，如果淋巴细胞增生受到抑制或细胞因子分泌受到抑制，反映了ICOS的共刺激通路受到阻断，说明ICOS120R-IgG1具有阻断ICOS共刺激通路的作用并可以抑制异基因淋巴细胞间的增殖反应。
(2)操作步骤取两个不同性别健康献血员的外周血单个核细胞(2×106/ml)各50ul，加入含10％小牛血清的1640培养液稀释的ICOS120R-IgG1 100ul(终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、0ug/ml)，每个浓度重复三次，在96孔板中混合培养96小时，终止培养前16～18小时，加入3H-TdR，计数cpm值。取上述混合培养细胞的上清液，ELISA双抗体夹心法测其IL-2含量。
(3)结果ICOS120R-IgG1可以抑制人异基因混合淋巴细胞的增殖反应，亦可抑制IL-2、IFN-γ细胞因子水平。
实施例4、ICOS120R-IgG1药效学活性测定(1)原理致敏性T辅助细胞亚群Th2/Th1失衡是卵蛋白过敏性哮喘小鼠模型主要的致病机理。ICOS共刺激通路参与调节T辅助细胞亚群Th2/Th1平衡。用ICOS120R-IgG1治疗卵蛋白(OVA)过敏性哮喘小鼠是通过体内试验研究ICOS120R-IgG1对ICOS共刺激通路的抑制作用。
(2)操作步骤取体重约为20mg、约6周龄的雌性健康BALB/c小鼠作为试验动物(每组8只)。于第0、7、14天腹腔注射20ug OVA与200ul 1.36％Al(OH)3的混悬液以致敏BALB/c小鼠。
第21天起连续3天，IgG/OVA组(疾病组)尾静脉注射200ug对照抗体人IgG(IgG)，ICOS/OVA组(治疗组)尾静脉注射200ug ICOS120R-IgG1，10分钟后2mg/ml OVA气雾激发；IgG/Saline组(对照组)和ICOS/Saline组(对照组)分别同样给予IgG或ICOS120R-IgG1尾静脉注射和生理盐水气雾激发。末次气雾激发24小时后检测各组小鼠的肺灌洗液(BALF)、外周血细胞因子、免疫球蛋白、Th亚群。用预温至37℃的1mL生理盐水灌洗鼠肺；收集的BALF液进行离心，分离上清液，-70℃保存待测；双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。小鼠眼球取抗凝血，取血浆检测总IgE含量；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调节细胞浓度至106/ml，37℃ 5％CO2与100ng/mlPMA、1ug/ml ionomycin和0.7ul Golgistop共孵育6小时，收集细胞，加入5ul CYC-antiCD4室温放置20分钟、裂解红细胞、分离出细胞加入Cytofix/Cytopern液，4℃放置20分钟，加入Perm/Wash液1ml，离心分离出细胞，加入FITC-antiIFN-γ、PE-antiIL-4，4℃避光放置20分钟，Perm/Wash液洗涤两次，PBS重悬细胞。以同型对照抗体为对照样品。用流式细胞仪检测，Cellqueat软件获取细胞，分析CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IFN-γ+(Th1)阳性细胞百分率。
(3)结果ICOS120R-IgG1治疗组的血清IgE水平、BALF的炎性细胞数和IL-4水平、外周血Th2比例均较疾病组明显减低。
实施例5、粉针剂的制备取100g的ICOS120R-IgG1，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；冷冻干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。
实施例6、粉针剂的制备取100g的ICOS120R-IgG1，加入乳糖50g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；喷雾干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。
实施例7、小针剂的制备取10g的ICOS120R-IgG1，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml，灭菌即可。
实施例8、小针剂的制备取20g的ICOS120R-IgG1，加入丙二醇30g，加200ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml，灭菌即可。
实施例9、葡萄糖输液的制备取5g的ICOS120R-IgG1，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加2000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶100ml，灭菌即可。
实施例10、葡萄糖输液的制备取2g的ICOS120R-IgG1，加入葡萄糖250g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。
实施例11、氯化钠输液的制备取4g的ICOS120R-IgG1，加入氯化钠90g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。
实施例12、ICOS120R-IgG1制备方法1按照本发明的方法构建ICOS120R-IgG1表达细胞，选用pSecTag2 Hygro为表达载体，用脂质体法转染CHO细胞，经大规模细胞培养，收集培养上清液。上清液中加入1.5M的NaCl过以含1.5M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(平衡液)预平衡的protein A柱，与前述平衡液洗涤5倍柱体积后，用含0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.5)(洗脱液)洗脱，收集洗脱峰，洗脱液用3M Tris缓冲液(pH8.0)平衡后，过经缓冲液(20mM PBS，1.5M NaCl(Ph7.4)预平衡的Sepharoes柱，经洗脱后，取样分析，即获得了ICOS120R-IgG1。经SDS-PAGE和HPLC检测，所得的ICOS120R-IgG1纯度大于95％。
表1、重组融合蛋白衍生物的抑制活性

注
①所述的MLR为异基因混合淋巴细胞增殖反应。
②所述的hICOS-IgG1是指天然的人ICOS第21～140位的氨基酸片段与人IgG1的恒定片段融合后形成的重组蛋白。
ICOS120R-IgG1用异基因混合淋巴细胞增殖试验，所得ICOS120R-IgG1明显抑制淋巴细胞的增殖和细胞因子分泌，与hICOS-IgG1相比抑制活性增加5倍(见表1)。
实施例13、ICOS120R-IgG1制备方法2按照本发明的方法将序列两端的酶切位点分别更换为KpnI和XbalI，将该序列克隆于载体pMD18-T。选用pcDNA4 His Max为表达载体，构建ICOS120R-IgG1的表达体，从上述携带重组基因表达体中抽取质粒，用脂质体法转染CHO细胞，筛选出表达ICOS120R-IgG1的CHO细胞克隆。
目的蛋白表达细胞经大规模培养，离心收集细胞，裂解细胞后，离心取上清液。上清液中加入1.5M的NaCl过以含1.5M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(平衡液)预平衡的protein A柱，与前述平衡液洗涤5倍柱体积后，用含0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.5)(洗脱液)洗脱，收集洗脱峰，洗脱液用3M Tris缓冲液(pH8.0)平衡后，加10ug/ml肠激酶，反应2-24小时。反应液过经缓冲液(20mM PBS，1.5M NaCl(Ph7.4)预平衡的Sepharoes柱，经洗脱后，取样分析，即获得了ICOS120R-IgG1。经SDS-PAGE和HPLC检测，所得的ICOS120R-IgG1纯度大于95％。
ICOS120R-IgG1用异基因混合淋巴细胞增殖试验，所得ICOS120R-IgG1明显抑制淋巴细胞的增殖和细胞因子分泌，与hICOS-IgG1相比抑制活性增加5倍。
序列表1本发明所述的人IgG1的Fc的核苷酸序列如下GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCTGAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GACACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTGAGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAGGTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TACCGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAGGAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAAACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTGCCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTGGTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGGCAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGCTCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAGGGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TACACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA序列表2本发明所述的人IgG1的Fc的氨基酸序列如下E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C VV V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V LT V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T LP P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P VL D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S LS L S P G K
序列表3本发明所述的ICOS120R多肽的第21～140位的核苷酸序列如下GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGTGTA CAA ATT TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA TTT AAA ATG CAGTTG CTG AAA GGG GGG CAA ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA AGTGGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCCAAC AAC AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC CAT TCT CAT GCC AAC TATTAC TTC TGC AAC CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT GTA ACT CTT ACAGGA GGA TAT TTG CAT ATT TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG序列表4本发明所述的ICOS120R多肽的第21～140位的氨基酸序列如下E I N G S A N Y E M F I F H N G G V Q I L C K Y P D I V Q Q F K M Q L L K G G Q T L CD L T K T K G S G N T V S I K S L K F C H S Q L S N N S V S F F L Y N L D H S H A N Y YF C N L S I F D P P P F V T L T G G Y L H I Y E S Q L C C Q L K
序列表5本发明所述的重组融合蛋白中的一种ICOS120R-IgG1的核苷酸序列如下GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGTGTA CAA ATT TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA TTT AAA ATG CAGTTG CTG AAA GGG GGG CAA ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA AGTGGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCCAAC AAC AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC CAT TCT CAT GCC AAC TATTAC TTC TGC AAC CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT GTA ACT CTT ACAGGA GGA TAT TTG CAT ATT TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG GAGCCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAACTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACCCTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGCCAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTGCAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGTGTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAGTAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACCATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCCCCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTCAAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAGCCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCCTTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGGAAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACGCAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA序列表6本发明所述的重组融合蛋白中的一种ICOS120R-IgG1的氨基酸序列如下E I N G S A N Y E M F I F H N G G V Q I L C K Y P D I V Q Q F K M Q L L K G G Q T L C DL T K T K G S G N T V S I K S L K F C H S Q L S N N S V S F F L Y N L D H S H A N Y Y F CN L S I F D P P P F V T L T G G Y L H I Y E S Q L C C Q L K E P K S C D K T H T C P P C PA P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F NW Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y KC K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L TC L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T VD K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
权利要求
1.一种重组融合蛋白衍生物，其特征在于，该重组融合蛋白衍生物是功能分子与ICOS120进行融合形成的重组蛋白，所述的ICOS120是包括将人ICOS的全部氨基酸分子的第120位氨基酸进行氨基酸置换后得到的修饰后的新的人ICOS的全部氨基酸分子、或其变体、片段或衍生物，或者是将含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段的第120位赖氨酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的含有第120位氨基酸的人ICOS的部分氨基酸片段、或其变体、片段或衍生物中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的氨基酸置换是保守氨基酸置换。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的保守氨基酸置换是将ICOS21～140的第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸的保守氨基酸置换；所述的ICOS21～140是指人ICOS的N端第21～140位片段的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的重组融合蛋白衍生物是具有选自以下组成形式中的一种或多种重组蛋白R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1，其中R1是功能分子，R2是ICOS120，L是连接片段。
5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的重组融合蛋白衍生物是具有R2-L-R1或R2-R1组成形式中的一种或多种重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的重组融合蛋白衍生物是具有R2-R1组成形式中的重组蛋白。
7.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的R1是包括多肽或蛋白中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的多肽或蛋白是包括Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，抗生蛋白链菌素，多组氨酸或绿色荧光蛋白中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的多肽或蛋白是Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物是包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物是包括IgG1、IgG2、IgG4、IgA或IgM中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物是包括IgG1、IgG2或IgM中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物是包括IgG1或IgG2中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
14.根据权利要求13所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物是IgG1中的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，选自以下中的一种或多种(1)人IgG1的Fc氨基酸序列；(2)人IgG1的Fc氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸①一个或多个半胱氨酸残基；②一个或多个酪氨酸残基；③缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；④缺失或用谷氨酸取代位置20的亮氨酸；⑤缺失或用丙氨酸取代位103的谷氨酸；⑥缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；⑦缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；⑧缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；⑨取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；⑩取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点的；和(11)亚部分①～⑩的组合；(3)上文亚部分(1)或(2)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；(4)上文亚部分(1)或(3)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(5)上文亚部分(4)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(6)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和(7)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
16.根据权利要求9所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，选自以下中的一种或多种(1)Fc氨基酸序列；(2)Fc氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸①一个或多个半胱氨酸残基；②一个或多个酪氨酸残基；③缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；④缺失或用谷氨酸取代位置20的亮氨酸；⑤缺失或用丙氨酸取代位103的谷氨酸；⑥缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；⑦缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；⑧缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；⑨取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；⑩取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点的；和(11)亚部分①～⑩的组合；(3)上文亚部分(1)或(2)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；(4)上文亚部分(1)或(3)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(5)上文亚部分(4)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(6)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和(7)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
17.根据权利要求10所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的Fc蛋白、或其变体或片段或衍生物，选自以下中的一种或多种(1)Fc氨基酸序列；(2)Fc氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸①一个或多个半胱氨酸残基；②一个或多个酪氨酸残基；③缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；④缺失或用谷氨酸取代位置20的亮氨酸；⑤缺失或用丙氨酸取代位103的谷氨酸；⑥缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；⑦缺失或用丙氨酸取代位置107的赖氨酸；⑧缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一个或多个氨基酸；⑨取代或缺失一个或多个残基以消除所述Fc受体结合位点；⑩取代或缺失一个或多个残基以消除所述补体(Clq)结合位点的；和(11)亚部分①～⑩的组合；(3)上文亚部分(1)或(2)的氨基酸序列，在N端具有一个甲硫氨酰残基；(4)上文亚部分(1)或(3)中任何一种的Fc蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(5)上文亚部分(4)的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(6)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；和(7)上文亚部分(5)的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
18.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的R2是ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物中的一种或多种，即将ICOS21～140的第120位氨基酸进行氨基酸置换后所得到的修饰后的新的ICOS21～140、或其变体、片段或衍生物中的一种或多种中的一种或多种。
19.根据权利要求18所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物，选自以下中的一种或多种(a)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第42位氨基酸置换所得的任何残基；(b)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第83位氨基酸置换所得的任何残基；(c)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第63位氨基酸置换所得的任何残基；(d)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第109位氨基酸置换所得的任何残基；(e)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第52位氨基酸置换所得的任何残基；(f)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第115～119位氨基酸置换所得的任何残基；(g)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第121位氨基酸置换所得的任何残基；(h)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第136位氨基酸置换所得的任何残基；(i)ICOS120多肽的氨基酸序列所示的第137位氨基酸置换所得的任何残基；(j)上文亚部分(a)至(i)中任何一个所述的ICOS蛋白、或其变体、片段或衍生物，包含连接到所述蛋白部分的化学部分；(k)上文亚部分(j)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述化学部分为水溶性聚合物部分；(l)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚乙二醇；(m)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分为聚氨基酸部分；和(n)上文亚部分(k)所述的ICOS蛋白的一种衍生物，其中所述水溶性聚合物部分连接在所述蛋白部分的唯一N端。
20.根据权利要求18所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物是ICOS120R多肽、或其变体、片段或衍生物中的一种或多种；所述的ICOS120R多肽是指将ICOS21～140的第120位氨基酸由赖氨酸置换为精氨酸后所得到的修饰后的新的ICOS21～140。
21.根据权利要求20所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的ICOS120多肽、或其变体、片段或衍生物是ICOS120R多肽。
22.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的连接片段是包括甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸中的一个或多个氨基酸。
23.根据权利要求22所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的连接片段是选自如下中的一种或多种(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(l)gly-gly-ser-gly-ser-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化学部分；和(n)上文亚部分(a)～(m)的任何组合。
24.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的融合是将ICOS120与功能分子进行结合的方法，包括基因工程的手段或技术，或化学方法中的一种或多种。
25.根据权利要求24所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的融合方法是基因工程的手段或技术直接或通过连接物间接进行连接。
26.根据权利要求25所述的重组融合蛋白衍生物，其特征在于，所述的融合方法是基因工程的手段或技术直接连接。
27.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤①融合合成能转录并能翻译成重组融合蛋白衍生物的重组DNA片段；②表达将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；③纯化分离纯化，即可得到所述的重组融合蛋白衍生物。
28.根据权利要求27所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的表达载体是包括质粒或病毒载体中的一种或多种。
29.根据权利要求28所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的病毒载体是包括复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒中的一种或多种。
30.根据权利要求28所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的表达载体是包括哺乳动物真核表达载体、细菌表达载体、酵母表达载体或昆虫表达载体中的一种或多种。
31.根据权利要求30所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物真核表达载体是包括pSEC Tag2/Hygro A、pcDNA4/His Max或pcDNA3中的一种或多种。
32.根据权利要求27所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是用于表达目的蛋白的细胞。
33.根据权利要求32所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是包括中国仓鼠卵巢细胞、二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞、非洲绿猴肾成纤维样细胞或人胚肾细胞及其后代细胞中的一种或多种。
34.根据权利要求33所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞或二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞及其后代细胞中的一种或多种。
35.根据权利要求34所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞及其后代细胞。
36.根据权利要求18所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤①融合合成能转录并能翻译成ICOS120与免疫球蛋白融合后得到的重组蛋白的重组DNA片段；②表达将所述重组DNA片段克隆到表达载体上，然后将携带重组DNA片段的重组表达载体在宿主细胞中进行表达；③纯化分离纯化，即可得到所述的ICOS120与免疫球蛋白融合后得到的重组蛋白。
37.根据权利要求36所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的ICOS120是ICOS120多肽。
38.根据权利要求37所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的ICOS120多肽是ICOS120R多肽。
39.根据权利要求36所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的表达载体是包括质粒或病毒载体中的一种或多种。
40.根据权利要求39所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的病毒载体是包括复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒中的一种或多种。
41.根据权利要求39所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的表达载体是包括哺乳动物真核表达载体、细菌表达载体、酵母表达载体或昆虫表达载体中的一种或多种。
42.根据权利要求41所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物真核表达载体是包括pSEC Tag2/Hygro A、pcDNA4/His Max或pcDNA3中的一种或多种。
43.根据权利要求36所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是用于表达目的蛋白的细胞。
44.根据权利要求43所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是包括中国仓鼠卵巢细胞、二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞、非洲绿猴肾成纤维样细胞或人胚肾细胞及其后代细胞中的一种或多种。
45.根据权利要求44所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞或二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞及其后代细胞中的一种或多种。
46.根据权利要求45所述的重组融合蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞及其后代细胞。
47.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究自身免疫性疾病及其相关病症产品中的应用。
48.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究自身免疫性疾病及其相关病症产品中的应用。
49.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究移植排斥及其相关病症产品中的应用。
50.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究移植排斥及其相关病症产品中的应用。
51.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究经皮冠状动脉成形术后血管肥大或闭合、PTCA/斯滕特氏印模/旁路外科术后血管再闭合/再狭窄、介入后血管肥大或闭合、植入移植所引起的血管障碍和排斥及其相关病症产品中的应用。
52.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究经皮冠状动脉成形术后血管肥大或闭合、PTCA/斯滕特氏印模/旁路外科术后血管再闭合/再狭窄、介入后血管肥大或闭合、植入移植所引起的血管障碍和排斥及其相关病症产品中的应用。
53.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究变应性疾病及其相关病症产品中的应用。
54.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究变应性疾病及其相关病症产品中的应用。
55.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究炎性疾病及其相关病症产品中的应用。
56.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究炎性疾病及其相关病症产品中的应用。
57.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究糖尿病及其并发症及其相关病症产品中的应用。
58.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究糖尿病及其并发症及其相关病症产品中的应用。
59.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究炎性肠内疾病及其相关病症产品中的应用。
60.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究炎性肠内疾病及其相关病症产品中的应用。
61.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究循环疾病及其相关病症产品中的应用。
62.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究循环疾病及其相关病症产品中的应用。
63.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究牛皮癣及其相关病症产品中的应用。
64.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究牛皮癣及其相关病症产品中的应用。
65.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究肝病及其相关病症产品中的应用。
66.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究肝病及其相关病症产品中的应用。
67.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究胰腺疾病及其相关病症产品中的应用。
68.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究胰腺疾病及其相关病症产品中的应用。
69.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究神经变性疾病及其相关病症产品中的应用。
70.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究神经变性疾病及其相关病症产品中的应用。
71.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究中枢神经系统障碍及其相关病症产品中的应用。
72.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究中枢神经系统障碍及其相关病症产品中的应用。
73.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究毒血症及其相关病症产品中的应用。
74.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究毒血症及其相关病症产品中的应用。
75.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究妊娠中毒及其相关病症产品中的应用。
76.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究妊娠中毒及其相关病症产品中的应用。
77.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究肥胖症及其相关病症产品中的应用。
78.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究肥胖症及其相关病症产品中的应用。
79.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究高脂血症及其相关病症产品中的应用。
80.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究高脂血症及其相关病症产品中的应用。
81.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究肿瘤及其相关病症产品中的应用。
82.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究肿瘤及其相关病症产品中的应用。
83.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究内分泌疾病及其相关病症产品中的应用。
84.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究内分泌疾病及其相关病症产品中的应用。
85.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究病毒性感染及其相关病症产品中的应用。
86.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究病毒性感染及其相关病症产品中的应用。
87.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究眼病及其相关病症产品中的应用。
88.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究眼病及其相关病症产品中的应用。
89.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究肌无力及其相关病症产品中的应用。
90.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究肌无力及其相关病症产品中的应用。
91.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究慢性疲劳及其相关病症产品中的应用。
92.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究慢性疲劳及其相关病症产品中的应用。
93.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物在制备治疗、诊断、检测或研究骨疾病及其相关病症产品中的应用。
94.根据权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白衍生物的组合物在制备治疗、诊断、检测或研究骨疾病及其相关病症产品中的应用。
全文摘要
本发明涉及可诱导共刺激分子的重组融合蛋白衍生物，是对第120位氨基酸进行氨基酸置换后得到的人可诱导共刺激分子或其部分氨基酸片段与功能分子如Ig融合形成的重组蛋白。本发明可采用基因工程方法、化学方法等常规方法按融合、表达、纯化等基本步骤，即可制备该重组融合蛋白衍生物。本发明能特异性地抑制记忆和活化T细胞的功能，对抑制哺乳动物的ICOS分子活性具有明显且特异的抑制作用，使可诱导共刺激分子更加稳定，半衰期延长，并能够大规模制备，是用于制备高亲和力、高生物学活性和高度生物安全性的免疫抑制产品及治疗、诊断、检测和研究自身免疫性疾病和移植排斥及其相关病症产品的安全原料，市场应用开发前景广阔。
文档编号A61K38/17GK1817908SQ20051002381
公开日2006年8月16日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者沈茜, 王健, 张鹏, 杨佳荟, 张军 申请人:上海长海医院