专利名称：禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种疫苗的制备方法，具体地说，是一种禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法。用于生物工程技术领域。
背景技术：
多杀性巴氏杆菌CVCC458是《中国菌种目录》在编菌种(英文版，1992年10月机械工业出版社出版，中国微生物菌种保藏管理委员会编著)，中国兽医微生物保藏中心作为中国微生物菌种保藏管理委员会下设机构保证常年为国内外教学、科研、生产单位提供《中国菌种目录》中的微生物，列入《中国菌种目录》的微生物将长期保存，一直对外供应，公众能从中国兽医微生物保藏中心买到的微生物菌种(CVCC中国兽医微生物保藏中心，该中心20多年来为生产、科研、教学提供了6万多株各类兽医微生物菌种)。多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的病源，能引起感染禽的急性死亡，死亡率可达100％。CVCC458是列入《中国菌种目录》的微生物，1987年从发病鸡中分离，血清型A组。禽霍乱常规的灭活疫苗是采用禽多杀性巴氏杆菌标准株或从自然病死禽分离鉴定的菌株中筛选出毒力强、免疫原性好的毒株，按人工培养方法研制成不同佐剂的灭活疫苗。研究发现活体培养的多杀性巴氏杆菌具交叉保护特性，而以普通培养基培养的多杀性巴氏杆菌则不能产生交叉保护。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号CN1205897Y，
公开日为1999年1月27日，发明名称为禽霍乱油乳剂灭活苗及其制备方法，该专利自述为将禽源的多杀性巴氏杆菌接种血琼脂斜面，37℃培养24小时，检验纯正，作为种子菌液接种鸡胚，回收尿囊液和胚体，经甲醛灭活后制成水相(抗原)再与复方矿物油(10号白油)充分混合制成油包水乳剂。该苗使用后产生抗体的时间长，一般2周以后。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，使其免疫鸡后副作用小，免疫产生时间早，免疫力强，免疫期长。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体步骤如下1)将禽多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续3次传代接种11日龄鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；2)将菌种通过禽胚增殖细菌，使培养物的含菌量高达1011CFU/ml以上(CFU为菌落形成单位)，通过活体培养可使巴氏杆菌产生交叉保护因子，提高了抗原质量；3)菌体灭活后，按液体总量(水相)5％加入盐酸左旋咪唑和按液体总量(水相)20％加入亚硒酸钠维生素E注射液；4)在高压乳化泵中将水相与油相按4∶6比例混合乳化，即成禽霍乱强化灭活疫苗，每0.5ml含菌体100亿。
本发明的基本原理是，使用禽胚作为菌体的增殖材料，使巴氏杆菌获得了传统马丁肉汤所没有的而活体中存在的必需因子，一方面使巴氏杆菌生长得更为粗壮，荚膜部分特别肥厚，导致抗原质量的提高；另一方面，细菌在活体中生长，能产生所有血清型的保护性免疫原，从而产生交叉免疫力。左旋咪唑和硒在免疫调节上有重要作用，能提高免疫原的抗体效价。在本苗中同时加入左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E，通过提高机体的细胞免疫功能，激活辅助性T细胞，产生B细胞活化因子，协助B细胞产生抗体，依靠细胞免疫和体液免疫，使机体在免疫早期产生高滴度抗体。
本发明的有益效果是强化灭活苗免疫鸡后7天产生坚强免疫力，免疫期6个月，免疫期内攻毒保护率94.4％～97.6％。特别是在发病鸡场，可用本苗进行紧急接种。本苗适用于各养禽场，安全可靠。
具体实施例方式
实施例1将禽多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续3次传代接种11日龄鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；将菌种回归鸡2次，分离细菌接种于改良BPY培养基18小时，镜检无杂菌后作为种子液，行尿囊腔接种11日龄鸡胚，孵化30小时，收获鸡胚、尿囊液和少量卵黄囊，组织捣碎机捣碎，对倍加入含有0.5％福尔马林的灭菌生理盐水，摇匀后灭活18小时。在菌体灭活前，按部颁标准进行培养物细菌总数测定，含菌量一般为1011CFU/ml以上。取灭活菌液接种于鲜血培养基培养48小时，无细菌生长时备用。在灭菌液中加入无菌4％吐温-80，按5％加入无菌盐酸左旋咪唑，20％加入亚硒酸钠维生素E注射液，调pH7.0为水相；在10号白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸铝，灭菌后为油相。在高压乳化泵中将水相与油相按4∶6比例混合乳化，即成禽霍乱强化灭活疫苗，每0.5ml含菌体100亿。
该苗经性状测定和安全性试验表明，为油包水类型，稳定性良好，粘度适中，安全可靠。疫苗在20℃保存3个月，4℃保存9个月不出现分层。试验鸡接种本苗后4天产生免疫应答，7天产生坚强的免疫力，免疫期6个月，免疫期内的攻毒保护率为94.4％～97.6％。
实施例2将禽多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续3次传代接种11日龄鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；将菌种回归鸡2次，分离细菌接种于改良BPY培养基18小时，镜检无杂菌后作为种子液，行尿囊腔接种14日龄鸭胚，以后制备过程同实施例1。
强化灭活疫苗免疫鸡后7天产生坚强免疫力，免疫期6个月，免疫期内攻毒保护率94.4％～97.6％。特别是发病鸡场可用本苗进行紧急接种，克服了弱毒苗发病后和用药后不能使用的缺点。
权利要求
1.一种禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下1)将禽多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续传代接种鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；2)将菌种通过禽胚增殖细菌，使培养物的含菌量高达1011CFU/ml以上；3)菌体灭活后，在水相中加入盐酸左旋咪唑和亚硒酸钠维生素E注射液；4)在高压乳化泵中将水相与油相按比例混合乳化，即成禽霍乱强化灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，其特征是，所述的多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续3次传代接种11日龄鸡胚。
3.根据权利要求1所述的禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，其特征是，所述的盐酸左旋咪唑的浓度是按水相5％，亚硒酸钠维生素E注射液的浓度是按水相20％。
4.根据权利要求1所述的禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，其特征是，所述的水相与油相的比例为4∶6。
5.根据权利要求1所述的禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，其特征是，所述的禽霍乱强化灭活疫苗，每0.5ml含菌体100亿。
全文摘要
一种用于生物工程技术领域的禽霍乱强化灭活疫苗的制备方法，本发明步骤为1)将禽多杀性巴氏杆菌CVCC458复苏后连续传代接种鸡胚，分离鉴定细菌作菌种；2)将菌种通过禽胚增殖细菌，使培养物的含菌量高达10
文档编号A61P31/00GK1724068SQ20051002733
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者刘永德, 叶陈梁, 吴祖立, 严亚贤 申请人:上海交通大学