专利名称：一种口腔鳞状细胞癌体外癌变模型的制作方法
技术领域：
本发明关于建立口腔鳞状细胞癌体外癌变模型，为研究鳞状细胞癌多因素、多阶段、多步骤癌变提供实验模型。
背景技术：
口腔鳞状细胞癌占全身恶性肿瘤的4％，由于口腔位于呼吸道与消化道的重要位置，病变结果严重影响患者的生活和生存质量。研究口腔鳞癌的发生发展机制是从根本上防治肿瘤的关键。
目前研究肿瘤发生发展机制的常用方法之一是检测临床标本中的一些分子标记物的表达情况，从而推测这些分子标记物和肿瘤的相关性；这种方法从静态的情况下研究肿瘤的发生机制，受到肿瘤发生发展动态观察的限制。方法二是以已经建立的肿瘤细胞系为研究对象，也不能观察肿瘤发生发展的动态过程。有学者也通过化学诱导等方法建立体外的恶变肿瘤细胞系，但其诱变过程描述不够详细，只采用单一的化学致癌剂诱导。
虽然癌症的发生机制目前还不十分清楚，但是比较一致的观点认为癌的形成是一个多步骤的过程，包括始发突变、潜伏、促癌和演进4个阶段。以往的研究表明，人乳头状瘤病毒在口腔正常黏膜、癌前病变和口腔鳞癌标本中多有较高的阳性率，且癌前病变和口腔鳞癌标本中阳性率明显高于正常黏膜，提示HPV感染可能在口腔鳞癌的早期发生中起到重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口腔鳞状细胞癌体外癌变模型包括以下步骤(1)HPV16 E6/E7永生化HIOEC细胞；(2)苯丙芘体外诱导培养HIOEC细胞；(3)HIOEC-B(a)P细胞筛选；(4)HIOEC-B(a)P细胞形态学观察；(5)HIOEC-B(a)P细胞恶性表型鉴定。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的通过递增浓度的化学致癌剂苯丙芘体外诱导HIOEC细胞，以及与促癌剂佛波酯共培养，筛选得到具有恶性表型的鳞状细胞癌细胞系HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA。通过相差显微镜、HE染色观察HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA细胞形态；通过软琼脂集落形成率、裸小鼠异体皮下成瘤性鉴定HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA细胞的恶性表型。
本发明的发明原理利用逆转录病毒载体转染HPV 16 E6/E7可以在体外永生化正常口腔上皮细胞，永生化细胞系的建立可以作为癌变早期的研究模型。
苯丙芘是一种多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)，主要存在于煤烟，香烟，原油和烟熏、烤肉中，是已知的间接致癌物。PAH的代谢中间产物是二醇-环氧化物，由细胞色素P-450多功能氧化系统(cytochrome P450，CYPs)经过两轮循环产生。这些中间体相当稳定，能够进入细胞核并与DNA快速反应，引起基因突变。由于苯丙芘是香烟或油煎、烤焦食品中常见的间接致癌物质，需要通过CYPs代谢而成为致癌物；而在口腔组织中，舌部上皮细胞中的CYPs含量高，活性强，可以被烟草致癌剂诱导表达，这也可能是舌鳞状细胞癌好发的原因之一。因此，本研究选择苯丙芘为口腔化学致癌物的典型代表，在体外模拟口腔粘膜细胞接触致癌因素的可能情况，从而模拟细胞癌变的可能启动阶段。
启动化合物产生的遗传性改变需要借助于促癌物激发的细胞增殖过程，从单个具有瘤性潜能的细胞转变成多细胞肿瘤。因为促癌物质本身引起细胞增殖的变化，不能产生癌症，所以细胞除了扩增被激活外，还需要进一步的变化。佛波酯(tetradecanoyl phorbol acetate，TPA)是巴豆油中的一种成份，是一种促癌剂。它的作用机制是可依次与细胞膜上的表皮生长因子受体和蛋白激酶C结合，模拟表皮生长因子的致有丝分裂活性，激活胞浆中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶级联反应，最终导致基因转录增强和细胞增殖。虽然TPA在口腔环境中不常见，但其作用机理同表皮生长因子等相同，可模拟该信号传导通路起作用。因此，TPA在本研究中起到促癌的作用；同时体外连续传代培养和血清中生长因子的作用也可能起到促癌作用。
因此通过HPV16 E6/E7永生化正常口腔上皮细胞，口腔常见的化学致癌剂B(a)P诱导，启动肿瘤发生，再通过TPA促癌和连续传代培养，逐步筛选得到具有恶性表型的HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA细胞。这个过程中包含了生物因素(HPV)、化学因素(BaP、TPA)和可能的生长因子(FBS)作用因素；经历了从正常到永生化，到逐步恶变的过程。这样一个多因素、多步骤、多阶段的长期体外恶变过程可以在一定程度上反映口腔上皮细胞的癌变发生、发展，可以为进一步研究口腔鳞癌的发生发展机制提供实验模型。
本发明所公开一种口腔鳞状细胞癌多步骤、多阶段癌变的体外模型其优点表现在(1)首先通过转染HPV 16 E6/E7使口腔上皮细胞永生化，采用化学致癌剂苯丙芘诱导永生化细胞，同时复合促癌剂佛波酯诱导细胞恶变；这样在生物因素(人乳头状瘤病毒)，化学致癌因素(苯丙芘)，促癌因素(佛波酯)以及含血清培养液培养等方面体现了癌变过程中多因素作用的过程；(2)苯丙芘诱导培养过程中采用递增浓度，不仅避免了细胞在诱导过程中受细胞毒性死亡，而且充分发挥了诱导剂的作用效果；(3)通过连续接种不同培养时期的细胞至裸鼠皮下观察到细胞在逐步恶变过程中的成瘤能力的不同，反映了细胞恶变过程中的多阶段、多步骤现象。
图1显示永生化上皮细胞在化学致癌剂诱导早期细胞形态学。
图2显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂诱导早期细胞形态学。
图3显示永生化上皮细胞在化学致癌剂作用后细胞形态学。
图4显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂作用后细胞形态学。
图5显示HIOEC-B(a)P细胞软琼脂集落形成能力。
图6显示HIOEC-B(a)P-TPA细胞软琼脂集落形成能力。
图7显示显微镜放大200倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图8显示显微镜放大400倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图9显示显微镜放大200倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图10显示显微镜放大400倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图11显示显微镜放大200倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图12显示显微镜放大400倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1.HPV16 E6/E7永生化HIOEC细胞1.1无血清改良低钙MCDB153培养基MCDB153基础培养基(Sigma，USA)中补充10mg/L人重组表皮生长因子(Sigma，USA)，5mg/L胰岛素(Novo Nordisk,USA)，0.5mg/L氢化可的松，Ca2+浓度为0.1mmol/L。
1.2正常口腔粘膜上皮细胞原代培养正常口腔粘膜取自6个月龄唇裂术中切除的口腔粘膜，PBS冲洗，II型分散酶4℃消化24小时。分离上皮层，胰蛋白酶消化，收集细胞，以1×106/30000mm2的密度接种培养。
1.3正常口腔上皮细胞转染HPV16E6、E7开放读码框架重组逆转录病毒LXSNE6/LXSNE7以及LXSN空白在体由哈佛大学馈赠。正常口腔上皮细胞首次传代，待细胞生长至50-70％汇合，转染HPV16E7，G418筛选，同样的方法再转染HPV16E6，连续传代培养建系。以转染空白逆转录载体和未转染的正常口腔上皮细胞为对照。
1.4细胞传代细胞长至70％-80％汇合，0.05％胰蛋白和0.02％EDTA消化，按1∶2传代培养。
2.HIOEC细胞体外诱导培养与筛选2.1 HIOEC细胞采用Defined keratinocyte-SFM培养液(GIBOCO，USA)培养。苯丙芘(benzo(a)pyrene，B(a)P)(Sigma，USA)溶解于二甲基亚砜DMSO(Sigma，USA)中，诱导培养液中B(a)P的浓度为0.1-1.2μg/ml，DMSO终浓度均为0.01％；TPA溶解于DMSO中，诱导浓度为0.1μg/ml，DMSO终浓度均为0.01％。体外递增浓度、间歇诱导培养(间歇、递增溶度培养细胞在诱导培养过程中，诱导剂会对细胞产生细胞毒性，由此细胞会受到不同程度的损伤。HIOEC细胞在诱导培养过程中，B(a)P总体的诱导溶度是从0.2-1.2μg/ml递增的，当细胞生长受损，就适当调整诱导剂溶度(降低溶度或改用正常培养液培养)，待细胞生长状态恢复后继续诱导培养6个月；在第4代、第10代分别与佛波酯(tetradecanoyl phorbol acetate，TPA)共培养，每次作用时间24小时；诱导细胞第18代克隆培养，第21代改用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium GIBOCO，USA)培养液培养。体外连续传代培养1年。分别命名为HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA。
HIOEC细胞在B(a)P以及TPA诱导培养过程中生长缓慢，细胞形态、生长特性均发生多次改变。在第18代筛选到一生长旺盛的克隆，改用10％胎牛血清的DMEM培养液筛选培养，得到可以在正常生理钙离子浓度1.5Mm、含10％FBS DMEM培养液中生长的细胞，连续传代培养1年后命名为HIOEC-B(a)P。第4代、第10代HIOEC-B(a)P细胞分别与TPA共培养，细胞在第23代开始改用10％胎牛血清的DMEM培养液筛选培养，得到可以在正常生理钙离子浓度1.5Mm、含10％FBS DMEM培养液中生长的细胞，连续传代培养1年。
3.HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA细胞形态学观察3.1通过相差显微镜观察HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA细胞形态；细胞形态在诱导过程中发生多种变化，HIOEC-B(a)P细胞最后HIOEC-B(a)P稳定为多角形铺路石样上皮细胞，HIOEC-B(a)P-TPA细胞则以成纤维样细胞为主；细胞均表现为核浆比例增加，有多个核仁，核分裂多，可见散在瘤巨细胞。
3.2制备无菌盖玻片细胞爬片，预冷10％中性甲醛固定30min，按常规HE染色，光镜下观察HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA细胞形态。永生化上皮细胞在化学致癌剂诱导早期细胞形态学(永生化细胞B(a)P诱导早期)见图1；永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂诱导早期细胞形态学(永生化细胞B(a)P复合TPA诱导早期)见图2；永生化上皮细胞在化学致癌剂作用后细胞形态学(HIOEC-B(a)P细胞)见图3；永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂作用后细胞形态学(HIOEC-B(a)P-TPA细胞见图4。
4.HIOEC-B(a)P、HIOEC-B(a)P-TPA细胞恶性表型鉴定4.1软琼脂集落形成率2×DMEM培养液40℃保温，收集HIOEC细胞、HIOEC-B(a)P和HIOEC-B(a)P-TPA细胞，细胞计数；待1.2％琼脂(Sigma，USA)冷却至50-60℃，以1∶1比例与2×DMEM培养液混匀，铺于培养皿内；待培养皿内的琼脂凝固后，同上方法将0.7％琼脂冷却至50-60℃，以1∶1比例与2×DMEM培养液混匀，加入10,000细胞/培养皿，混匀，铺于下层已凝固的琼脂上，室温凝固后，放置37℃培养箱中继续培养24天。加入MTT共培养24小时，集落显示蓝色终止培养，分别计数集落数，根据公式(集落形成率＝集落数/10,000×100％)计算各细胞系的软琼脂集落形成率。上述实验重复3次。
第70代HIOEC-B(a)P-TPA细胞在软琼脂中培养至第8天可见有散在集落形成，生长至第12代形成较大集落，而Tca8113细胞(是一株人舌鳞状细胞癌细胞系，由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物学实验室建立并保存)第8天即形成明显的集落；第93代HIOEC-B(a)P细胞开始具有软琼脂集落形成能力。HIOEC-B(a)P细胞软琼脂集落形成能力见图5；HIOEC-B(a)P-TPA细胞软琼脂集落形成能力见图6。
4.2免疫缺陷小鼠皮下成瘤性同细胞传代分别消化、离心、收集HIOEC细胞、第38、50、55、69、74、96代HIOEC-B(a)P细胞和第40、49、60、65、70代HIOEC-B(a)P-TPA细胞，PBS洗涤细胞2次，血球计数板上计数，制备细胞悬液，分别接种至6只SPF级nu/nu裸小鼠腋下皮下，每只裸鼠接种2点，每点接种8×106细胞/0.2ml。每周观察裸鼠1次，连续观察3个月，处死裸鼠，解剖肿瘤，计算成瘤率；标本用10％中性甲醛固定，按常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。
HIOEC-B(a)P细胞在第55代之前接种到裸小鼠皮下均无肿块生长，第55代细胞有肿块形成，质硬，直径0.3cm左右，HE染色镜下表现为有完整包膜肿块，由大量角化物和角化细胞组成，部分细胞角化不全，包膜下有2-3层上皮细胞，局部细胞增生成团，细胞表现一定的异型性；第69代细胞形成肿块直径0.5cm左右，HE染色镜下表现为鳞状细胞癌，肿瘤界限清楚，周边由数层上皮细胞组成，局部细胞增生成乳头状，细胞分化较好，异型性明显，病理核分裂像多见，角化部分细胞成分多，多为角化不全。第74代细胞形成的肿瘤大小与第69代无明显差异，镜下表现为典型鳞状细胞癌，细胞分化较差，增生活跃，异型性明显，核分裂像多见。第96代细胞接种15天后形成直径1cm肿瘤，HE染色镜下表现为典型鳞状细胞癌，细胞分化较差，增生活跃，异型性明显，核分裂像多见。显微镜放大200倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞可以形成角化肿块，细胞多为角化不全见图7；显微镜放大400倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞可以形成角化肿块，细胞多为角化不全见图8；显微镜放大200倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞形成乳头状增生的肿瘤，细胞异型性明显，核分裂像较多，其余为角化不全见图9；显微镜放大400倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞形成乳头状增生的肿瘤，细胞异型性明显，核分裂像较多，其余为角化不全见图10；显微镜放大200倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞形成典型鳞状细胞癌，角化成分明显减少，异型性明显，核分裂像多见图11；显微镜放大400倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞形成典型鳞状细胞癌，角化成分明显减少，异型性明显，核分裂像多见图12。HIOEC-B(a)P-TPA细胞目前尚未观察到裸鼠皮下成瘤性。
权利要求
1.一种口腔鳞状细胞癌体外癌变模型包括以下步骤(1)HPV16E6/E7永生化HIOEC细胞；(2)苯丙芘体外诱导培养HIOEC细胞；(3)HIOEC-B(a)P细胞筛选；(4)HIOEC-B(a)P细胞形态学观察；(5)HIOEC-B(a)P细胞恶性表型鉴定。
2.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于(2)步骤诱导培养液中苯丙芘的浓度为0.1-1.2μg/ml。
3.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于(3)步骤用10％胎牛血清的DMEM培养液筛选培养。
4.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于(5)步骤用软琼脂集落形成率鉴定HIOEC-B(a)P细胞恶性表型。
5.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于(5)步骤用免疫缺陷裸小鼠皮下成瘤性鉴定HIOEC-B(a)P细胞恶性表型。
6.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于(4)步骤中HIOEC-B(a)P稳定为多角形铺路石样上皮细胞。
7.根据权利要求4所述的体外模型，其特征在于第93代HIOEC-B(a)P细胞开始具有软琼脂集落形成能力。
8.根据权利要求5所述的体外模型，其特征在于HIOEC-B(a)P细胞在第55代有肿块形成。
9.根据权利要求5所述的体外模型，其特征在于HIOEC-B(a)P细胞在第69代有肿块，HE染色镜下表现为鳞状细胞癌。
全文摘要
本发明的提供一种口腔鳞状细胞癌体外癌变模型包括以下步骤(1)HPV16 E6/E7永生化HIOEC细胞；(2)苯丙芘体外诱导培养HIOEC细胞；(3)HIOEC－B(a)P细胞筛选；(4)HIOEC－B(a)P细胞形态学观察；(5)HIOEC－B(a)P细胞恶性表型鉴定。本发明在体外模拟口腔鳞状细胞癌发生建立癌变模型；为进一步研究口腔鳞状细胞癌发生发展机制提供良好的实验模型。
文档编号A61K49/00GK1730102SQ200510028308
公开日2006年2月8日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者潘红芽, 张志愿, 曹俊, 帕提曼, 周晓健, 陈万涛, 李江, 张萍, 何荣根 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院