专利名称：胶原蛋白海绵的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备工艺，尤其涉及制备一种纯化冻干的胶原蛋白海绵，可以用于各类烧伤、创伤及手术创口的止血、修复，以及溃疡、残腔的填充。
背景技术：
胶原蛋白是一组由多种糖蛋白分子组成的大家族，是结缔组织的主要蛋白质成分，约占机体总蛋白的25％。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，胶原蛋白分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白是一类蛋白质家族，现在已发现的16种以上不同类型的胶原蛋白，I型、II型、III型以及IV型胶原蛋白是通过蛋白质水平上的一级结构分析发现的，其他则是通过在核酸水平上的胶原域的相似性分析发现的。胶原蛋白与其他蛋白质一样，也是由α-氨基酸组成的，并且具有1～4级结构和典型的三螺旋结构。
各型胶原蛋白广泛分布于机体的所有组织中，但各型胶原蛋白的分布以及含量因组织不同而有很大差异。因而，有目的地选择富含所需胶原蛋白分子类型的组织，对于获取大量且高纯度的胶原蛋白制品是相当重要的。虽然I型胶原蛋白能从许多的组织或器官中制备，但制备I型胶原蛋白最合适的原料是皮肤、跟腱和年轻的器官骨骼。跟腱和骨骼的纤维几乎都是I型胶原蛋白，从而大大简化了纯化I型胶原蛋白所需的程序。要提高胶原蛋白的提纯效率，除了选择合适的组织作为原材料外，恰当的前处理也是极其重要的。所用的原材料所含有的非胶原成分，特别是脂肪组织等，应充分除去。在制备各型胶原蛋白通常使用的溶剂是中性盐溶液和酸性溶剂，中性盐溶剂一般采用NaCl溶液，酸性溶剂多采用醋酸或枸橼酸溶液。无论选择何种方法提取胶原蛋白，提取物中可能含有大量的杂质。一般的，在中性或接近中性pH的溶液中，天然的胶原蛋白分子在高(3.5～4.0MNaCl)或低(低于0.15M NaCl)的盐浓度下能被定量的沉淀。在稀酸溶剂中，胶原蛋白分子在1.0～2.0M NaCl时能被沉淀。所以从中性盐或稀酸溶剂中反复沉淀是回收和纯化提取胶原蛋白分子的首选方法。
我们生产的胶原蛋白海绵过去是以牛跟腱为原料，以0.05mol/l的柠檬酸为溶剂用胃蛋白酶消化提取的酸性可溶性胶原，然后采用10mol/l氢氧化钠调节溶液pH至中性，加氯化钠盐析至胶原蛋白完全析出、离心收集沉淀用柠檬酸溶解，然后柠檬酸透析2天，用磷酸盐氯化钠缓冲液透析至pH达到5.0以上，最后48小时冷冻干燥。用此工艺生产的胶原蛋白蛋白含量低、盐分含量高、而且由于在透析后胶原蛋白大量析出而使冻干后的产品外观差、质地硬与伤口表面粘附性较差、易从伤口表面脱落从而影响止血效果。
发明内容
本发明的目的是发明一种胶原蛋白海绵质地柔韧、粘附性好、盐分含量低，提高临床应用效果的胶原蛋白海绵的制备工艺。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种胶原蛋白海绵的制备工艺，其特征在于，以醋酸为溶剂，其工艺为第一步.牛跟腱碎片的准备将洗净的牛跟腱切片放入组织捣碎机中，加入适量的冷蒸馏水，开机使牛跟腱捣成碎片，挑出筋膜，并用冷蒸馏水洗涤，用生理盐水浸洗1-2小时，取出置于绢丝中挤干；第二步.胶原蛋白的提取将1份挤干的牛跟腱碎片置于玻璃缸中，加入1～5％醋酸4～8份，让其溶胀，再加入含氯化钠10～15g的1～5％醋酸5～10份，并用搅拌机搅拌15-30min，再加入含有2-10克胃蛋白酶的1～5％醋酸5～10份，使其搅拌均匀；消化开始后，根据消化的情况再适当加入醋酸溶液，继续消化，整个消化过程时间为2-5天；第三步 过滤将消化液用不锈钢过滤器过滤两次，第一次用粗过滤网过滤，去掉粗的沉淀物，将经过粗过滤后的胶原溶液再进行精过滤；第四步 盐析首先将胶原消化液用5～12mol/L的NaOH溶液调节PH到7-9，在调节过程中必须充分搅拌，使整个溶液均匀；
然后加入NaCl溶液，至氯化钠浓度达到2～3mol/l，边加氯化钠边搅拌，在加入完毕后搅拌待沉淀析出后，静止过夜；最后取出沉淀离心，去除上清液，将沉淀用1％的醋酸溶液洗涤，并作1-5分钟的停留，用绢丝挤干；洗涤的次数和程度可根据沉淀物的膨胀和透明度来判断，一般以胶原沉淀开始溶解为标准；第五步 溶解将沉淀物溶解在1％的醋酸溶液中；第六步 透析首先将胶原溶液装入透析袋中，用0.1％的醋酸溶液作为透析外液，每次透析外液的体积是内液体积的4～6倍，一天至少更换一次，透析两天；然后将透析袋外面用冷的蒸馏水冲洗后置于磷酸氢二钠透析外液中透析至胶原蛋白溶液的PH为5.0以上，同时在透析过程中每次所用的透析外液体积必须是内液的4～6倍，每天必须更换外液；第七步 冷冻干燥将透析好的胶原溶液用注射器注入无热原的冻干用的不锈钢盘中，每盘15～20ml，用冻干机冷冻干燥24～48小时，制得胶原蛋白海绵；第八步 包装在出柜前开启冻干出柜间的去湿机，使得在出柜时的湿度低于40％，将胶原海绵装入泡罩中，盖铝泊纸用泡罩热合机热合，然后装入铝泊袋中，用封口机封口，最后进行60Co辐照灭菌；所述的胶原蛋白海绵的制备工艺从提取到透析的过程都是在0～15℃的温度条件下进行。
本发明采用醋酸替代柠檬酸，醋酸也是酸性胶原提取的良好溶剂，其提取效果优于柠檬酸；胶原海绵中的盐分主要是透析过程中没有完全被透析掉或透析外液中的盐透析进入制品中，因此，降低盐分含量就可以从透析外液着手，降低透析外液中的盐浓度；再者，柠檬酸分子量远远大于醋酸，其透析速度慢于醋酸，柠檬酸溶解的胶原在透析至pH4.0以上时易产生白色丝状的胶原析出，而醋酸溶解的胶原一般在pH5.0以上也不会有丝状物析出。
本发明的优点是
(1)降低了生产周期；(2)降低了胶原海绵中盐含量，提高胶原蛋白含量；(3)改善了胶原海绵的外观，增加柔韧性和粘附性，从而改善止血作用，提高临床应用效果。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例胶原蛋白海绵的制备工艺从提取到透析的过程都是在0～15℃的温度条件下进行，其工艺为第一步.牛跟腱碎片的准备将洗净的牛跟腱切片放入组织捣碎机中，加入适量的冷蒸馏水，开机使牛跟腱捣成碎片，挑出筋膜，并用冷蒸馏水洗涤，用生理盐水浸洗1-2小时，取出置于绢丝中挤干；第二步.胶原蛋白的提取首先将100g挤干的牛跟腱碎片置于玻璃缸中，加入1％醋酸500ml，让其溶胀。再加入含氯化钠10g的1％醋酸500ml，并用搅拌机搅拌30min以上。再加入含有5克胃蛋白酶的1％醋酸1000ml中，使其搅拌均匀；然后消化开始后，根据消化的情况再适当加入醋酸溶液，继续消化，整个消化过程时间为3天；第三步 过滤将消化液用不锈钢过滤器过滤两次，第一次用粗过滤网过滤，去掉粗的沉淀物，将经过粗过滤后的胶原溶液再进行精过滤；第四步 盐析首先将胶原消化液用10mol/L的NaOH溶液调节PH到8，在调节过程中必须充分搅拌，使整个溶液均匀；然后加入NaCl溶液，至氯化钠浓度达到2mol/l，边加氯化钠边搅拌，在加入完毕后搅拌待沉淀析出后，静止过夜；最后取出沉淀离心，去除上清液，将沉淀用1％的醋酸溶液洗涤，并作2分钟的停留，用绢丝挤干；洗涤的次数和程度可根据沉淀物的膨胀和透明度来判断，
一般以胶原沉淀开始溶解为标准；第五步 溶解将沉淀物溶解在1％的醋酸溶液中；第六步 透析首先将胶原溶液装入透析袋中，用0.1％的醋酸溶液作为透析外液，每次透析外液的体积是内液体积的5倍，一天至少更换一次，透析两天；然后将透析袋外面用冷的蒸馏水冲洗后置于磷酸氢二钠透析外液中透析至胶原蛋白溶液的PH为5.0以上，同时在透析过程中每次所用的透析外液体积必须是内液的5倍，每天必须更换外液；第七步 冷冻干燥将透析好的胶原溶液用注射器注入无热原的冻干用的不锈钢盘中，每盘15ml，用冻干机冷冻干燥36小时，制得胶原蛋白海绵；第八步 包装在出柜前开启冻干出柜间的去湿机，使得在出柜时的湿度低于40％，将胶原海绵装入泡罩中，盖铝泊纸用泡罩热合机热合，然后装入铝泊袋中，用封口机封口，最后进行60Co辐照灭菌。
下表是发明前和发明后采用不同工艺流程生产的产品质量比较表。
发明前后胶原蛋白海绵质量比较表
权利要求
1.一种胶原蛋白海绵的制备工艺，其特征在于，以醋酸为溶剂，其工艺为第一步.牛跟腱碎片的准备将洗净的牛跟腱切片放入组织捣碎机中，加入适量的冷蒸馏水，开机使牛跟腱捣成碎片，挑出筋膜，并用冷蒸馏水洗涤，用生理盐水浸洗1-2小时，取出置于绢丝中挤干；第二步.胶原蛋白的提取将1份挤干的牛跟腱碎片置于玻璃缸中，加入1～5％醋酸4～8份，让其溶胀，再加入含氯化钠10～15g的1～5％醋酸5～10份，并用搅拌机搅拌15-30min，再加入含有2-10克胃蛋白酶的1～5％醋酸5～10份，使其搅拌均匀；消化开始后，根据消化的情况再适当加入醋酸溶液，继续消化，整个消化过程时间为2-5天；第三步 过滤将消化液用不锈钢过滤器过滤两次，第一次用粗过滤网过滤，去掉粗的沉淀物，将经过粗过滤后的胶原溶液再进行精过滤；第四步 盐析首先将胶原消化液用5～12mol/L的NaOH溶液调节PH到7-9，在调节过程中必须充分搅拌，使整个溶液均匀；然后加入NaCl溶液，至氯化钠浓度达到2～3mol/l，边加氯化钠边搅拌，在加入完毕后搅拌待沉淀析出后，静止过夜；最后取出沉淀离心，去除上清液，将沉淀用1％的醋酸溶液洗涤，并作1-5分钟的停留，用绢丝挤干；洗涤的次数和程度可根据沉淀物的膨胀和透明度来判断，一般以胶原沉淀开始溶解为标准；第五步 溶解将沉淀物溶解在1％的醋酸溶液中；第六步 透析首先将胶原溶液装入透析袋中，用0.1％的醋酸溶液作为透析外液，每次透析外液的体积是内液体积的4～6倍，一天至少更换一次，透析两天；然后将透析袋外面用冷的蒸馏水冲洗后置于磷酸氢二钠透析外液中透析至胶原蛋白溶液的PH为5.0以上，同时在透析过程中每次所用的透析外液体积必须是内液的4～6倍，每天必须更换外液；第七步 冷冻干燥将透析好的胶原溶液用注射器注入无热原的冻干用的不锈钢盘中，每盘15～20ml，用冻干机冷冻干燥24～48小时，制得胶原蛋白海绵；第八步 包装在出柜前开启冻干出柜间的去湿机，使得在出柜时的湿度低于40％，将胶原海绵装入泡罩中，盖铝泊纸用泡罩热合机热合，然后装入铝泊袋中，用封口机封口，最后进行60Co辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备工艺，其特征在于，所述的胶原蛋白海绵的制备工艺从提取到透析的过程都是在0～15℃的温度条件下进行。
全文摘要
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备工艺，从提取到透析的过程都是在0～15℃的温度条件下进行，用1～5％的醋酸为溶剂用胃蛋白酶消化24～72小时提取胶原蛋白，过滤后取上清液，用10mol/l的氢氧化钠中和，然后加氯化钠溶液至1.25～5mol/l将胶原蛋白盐析，离心取沉淀物，用0.5～2％醋酸溶解，待完全溶解后，用0.01～0.1％醋酸作为透析外液透析2天，再用pH为5～7左右的磷酸氢二钠溶液作为透析外液透析至pH达到5.0以上，然后用冻干机冷冻干燥24～36小时左右制得胶原蛋白海绵。本发明的优点是胶原蛋白海绵质地柔韧、粘附性好、盐分含量低，提高了临床应用效果。
文档编号A61L15/16GK1915437SQ200510028759
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者顾其胜, 蒋丽霞 申请人:上海其胜生物制剂有限公司