专利名称：糖尿病性心血管病变相关基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码大鼠糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related gene 3，大鼠糖尿病性心血管病变相关基因3)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术：
2型糖尿病性心血管病变不仅是患者的主要死因，也较一般人群发生率高、发展进程快、病情重，加强其发病机理的研究十分必要。
虽然人们已认识到发病过程中蛋白质非酶糖化、自由基产生过多、多元醇代谢亢进、脂蛋白的多态性、细胞因子和生长因子多种介质等的相互作用，但这方面的研究进展甚微，主要有两方面的原因，一是临床上心脏及血管标本取材困难；二是受研究方法学的限制。
疾病的发生、发展无不源于相互作用的相关基因尤其它们早期表达的差异，但迄今为止对于糖尿病性心血管病变相关基因早期的差异表达及其网络调控研究几乎处于空白。随着人类基因组草图的完善，以及生物信息学的迅速发展，用整体、动态的观点去探索疾病的发生机理势在必行，揭示疾病早期相关基因表达谱的变化不仅是生命科学研究的一个重要方向，对于指导下一步的临床研究也具有重要意义。
然而，迄今为止人们对与糖尿病性心血管病变相关基因还知之甚少，因此，本领域迫切需要寻找和开发新的糖尿病性心血管病变相关基因及其编码蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR3蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供一种分离的RDCR3多肽，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进心肌诱导分化功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述大鼠RDCR3多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有RDCR3蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达RDCR3蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有RDCR3蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的RDCR3多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗RDCR3多肽活性的化合物，以及抑制RDCR3多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是RDCR3多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在RDCR3蛋白的方法，它包括将样品与RDCR3蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RDCR3蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与RDCR3多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进RDCR3多肽活性的激动剂，或者筛选抑制RDCR3多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的RDCR3蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.01-99.99wt％)的本发明的RDCR3多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗糖尿病性心血管病变等病症。
在本发明的第十一方面，提供了一种筛选影响RDCR3蛋白表达的物质的方法，包括步骤(a)在测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为测试组，并且在无测试物质存在下，培养大鼠心肌细胞作为对照组；(b)测定测试组和对照组中RDCR3蛋白的表达情况，其中如果测试组中RDCR3蛋白的表达量显著高于对照组就表明该测试物质是促进RDCR3蛋白表达的物质，如果测试组中RDCR3蛋白的表达量显著低于对照组就表明该测试物质是抑制RDCR3蛋白表达的物质。
较佳地，步骤(b)是通过RT-PCR法或ELISA法检测RDCR3蛋白表达情况。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本图1是表达载体pGEX-4T-1-RDCR3的构建示意图。
图2显示了RDCR3的滴定曲线及等电点。
图3A显示了对RDCR3二级结构的预测分析结果，其中H表示螺旋，E表示strand，-表示无预测)图3B显示了对RDCR3二级结构的预测分析结果，其中采用Chou&Fasman和Garnier-Osguthorpe-Robson法来预测螺旋和转角。
图4显示了RDCR3不同组织中的差异表达情况。泳道1-11分别是下丘脑、垂体、肺、脾、胰脏、脂肪、肾上腺、肾、肝、主动脉、心脏、骨骼肌图5RDCR3的mRNA在不同组织中的分布图6显示了RDCR3编码区的PCR扩增结果，其中扩增片段为650bp图7显示GST-RDCR3表达和纯化的SDS-PAGE分析结果。其中各泳道如下泳道1.分子量标准品(103道尔顿)97.4，66.2，43，31，20.1，(14.4)；泳道2.在IPTG诱导前的细菌蛋白；泳道3.在IPTG诱导后的细菌总蛋白；泳道4.诱导蛋白的上清液；泳道5.诱导蛋白的沉淀物；泳道6.用亲和层析纯化的GST-RDCR3。
图8显示了重组GST-RDCR3蛋白的Western印迹分析结果，表明分子量约为50Kda。
图9显示了的基因组序列，其中省略号处为基因组未测通部分，下划线处为外显子部分。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首先从建立2型糖尿病性心血管病变的大鼠模型入手，以荧光标记的mRNA差异显示技术筛选出病变早期差异表达基因RDCR3(RatDiabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)，并应用生物信息学分析该相关基因及其蛋白的结构和功能，并用试验验证了RDCR3的确是一种与2型糖尿病性心血管病变相关的蛋白。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人成功建立了2型糖尿病性心血管病变大鼠模型并对其进行系统分析。2月龄SD大鼠高热量饮食喂养2个月后给予小剂量STZ(15mg/kg)建立2型糖尿病模型，模型建立后半个月、1.5-2个月、6个月取大鼠心肌电镜观察及胰岛素-葡萄糖耐量试验、胰岛免疫组化和其它糖代谢相关指标的检测，并与大、小剂量STZ、单纯高热量饮食等各组大鼠相应指标比较。各项指标说明，该模型具有外周胰岛素抵抗和胰岛功能仅轻微受损等特征，超微结构观察证实心肌病变随着病程延长而加重。
本发明的2型糖尿病性心血管病变模型的主要特点在于①与人类普通2型糖尿病的发生、发展过程相似。
②STZ用量小，而低剂量的STZ应用能最大限度地避免其胰腺外非选择性的作用。
③该模型动物无需治疗生命即能维持较长时间，可用于2型糖尿病慢性并发症的相关研究。
④2型糖尿病模型建立后，心肌包括线粒体的数量和质量、细胞间质在内的超微结构先后发生改变，同时也观察到电镜下主动脉内皮损伤和平滑肌增殖等。由于这种接近人类普通2型糖尿病模型的大鼠具备多个罹患心血管疾病的危险因素高血糖、高血脂、高胰岛素血症，并随着病程逐渐出现人类心血管病变的特征性改变，从而为糖尿病这种特定状态下心血管系统病变相关基因的筛选奠定了基础。
基于糖尿病性心血管病变模型，本发明人应用荧光标记的DDRT-PCR技术筛选相关基因。具体地，在2型糖尿病大鼠模型建立后半个月，抽提大鼠心肌总RNA进行荧光标记的mRNA差异显示分析，Northern印迹及半定量RT-PCR证实候选基因的差异表达。从5000多个条带中选择分离并克隆得到63个差异表达的序列，其中已知基因32个，已知EST 10个，新EST 21个，新基因若干。一种新的糖尿病性心血管病变相关基因是RDCR3，该基因在心血管病变的心肌中表达上调。
运用相同组织mRNA进行Norhern验证，和组织表达谱研究，进一步证明了DD-PCR的结果。另外，新生鼠原代心肌细胞培养，进行高糖和低糖培养干预实验。运用RT-PCR技术证实高糖情况下RDCR3基因的表达高于低糖(p＜0.05)。这表明，RDCR3可以作为早期诊断或辅助诊断糖尿病性心血管病变的一个标志物。
在本发明中，术语“RDCR3蛋白”、“RDCR3多肽”或“糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR3”可互换使用，都指具有大鼠糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR3氨基酸序列(SEQID NO2)的蛋白或多肽。应理解，该术语还包括其他哺乳动物中的同源蛋白，例如人的RDCR3蛋白。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的糖尿病性心血管病变相关蛋白RDCR3。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的RDCR3蛋白或多肽”是指RDCR3多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RDCR3蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。RDCR3多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括大鼠RDCR3蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然大鼠RDCR3蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“RDCR3多肽”指具有RDCR3蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与大鼠RDCR3蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RDCR3蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RDCR3 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RDCR3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RDCR3多肽或其片段的融合蛋白(如GST融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RDCR3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有RDCR3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供RDCR3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然大鼠RDCR3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“RDCR3蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
在本发明中，术语“RDCR3蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有RDCR3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO1中第166-798位核苷酸序列及其简并序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO1中从核苷酸第166-798位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO1中从核苷酸第166-798位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的RDCR3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RDCR3蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的RDCR3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RDCR3蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RDCR3多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码大鼠RDCR3多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，RDCR3多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RDCR3编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的RDCR3蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗RDCR3蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗RDCR3蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组RDCR3蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RDCR3蛋白功能的多肽分子。由于RDCR3在高糖条件下表达上调，因此预期可以抑制或减少RDCR3表达的物质是治疗糖尿病性心血管病变的潜在候选物。
另一方面，本发明还包括对RDCR3 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RDCR3基因产物或片段。较佳地，指那些能与RDCR3基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RDCR3蛋白的分子，也包括那些并不影响RDCR3蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RDCR3基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RDCR3基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RDCR3蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断RDCR3蛋白功能的抗体以及不影响RDCR3蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用RDCR3基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与RDCR3基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗RDCR3蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的RDCR3蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与RDCR3蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断RDCR3蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如大鼠RDCR3蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭大鼠RDCR3蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用大鼠RDCR3蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RDCR3蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于糖尿病性心血管病变方面的治疗。在使用本发明RDCR3蛋白时，还可同时使用其他治疗糖尿病性心血管病变的治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RDCR3多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的RDCR3蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
大鼠RDCR3蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于RDCR3蛋白的无表达或异常/无活性的RDCR3蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的RDCR3蛋白，以抑制内源性的RDCR3蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将RDCR3基因转移至细胞内。构建携带RDCR3基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组大鼠RDCR3基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制大鼠RDCR3 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与大鼠RDCR3蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对大鼠RDCR3蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测RDCR3蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的RDCR3蛋白水平，可以用于辅助诊断RDCR3蛋白起作用的疾病(如糖尿病性心血管病变)。
一种检测检测样品中是否存在RDCR3蛋白的方法是利用RDCR3蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与RDCR3蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RDCR3蛋白。
RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于RDCR3蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于检测RDCR3蛋白的表达与否或在疾病状态下RDCR3蛋白的异常表达。如RDCR3 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断RDCR3蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用RDCR3蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测RDCR3蛋白的转录产物。
检测RDCR3基因的突变也可用于诊断RDCR3蛋白相关的疾病。RDCR3蛋白突变的形式包括与正常野生型RDCR3 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从大鼠2型糖尿病的心肌细胞中克隆获得的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1219个碱基，其开放读框位于166-798位，编码全长为211个氨基酸的大鼠RDCR3蛋白(SEQ ID NO2)。
可为治疗糖尿病性心血管病变等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、制备糖尿病大鼠模型1.1动物和材料清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠100只，2月龄，体重(250±20)g，购自BK公司提供，动物合格证号沪动152；STZ(链脲佐菌素)购自Sigma公司提供；血糖、甘油三酯、胆固醇等生化检测试剂盒购自名典生物工程有限公司；中性单峰纯胰岛素购自万邦生化制药有限公司；胰岛素一抗及相关免疫组化试剂购自迈新公司；大鼠专用胰岛素放免试剂盒购自Linco公司。
饮食成分普通饲料平均热量3.9cal/g，其中碳水化合物占60％，蛋白质占22％，脂肪占10％(豆油为主)，包括纤维素在内的其他成分占8％；高脂饲料平均热量5.1cal/g，其中碳水化合物占50％，蛋白质占13％，脂肪占30％(动物油脂为主)，包括纤维素在内的其他成分占7％。
1.2预实验。
确定各组STZ的剂量、高脂饮食后STZ干预时间。
1.3动物分组。
大鼠随机(按随机排列表法)分为A-F共6组，A、E每组20只，其余每组15只。每日光照12h，自由饮水进食。
A组正常对照组，普通饲料喂养后2个月大鼠一次性尾静脉注射pH4.5，0.1mol/L柠檬酸缓冲液0.5mL(同以下注射液量)，。B组小剂量STZ组即15mg/kg STZ组，普通饲料喂养后2个月大鼠STZ15mg/kg一次性尾静脉注射(STZ溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中，pH4.5)。C组大剂量STZ组即50mg/kg STZ组，普通饲料喂养后2个月大鼠STZ50mg/kg一次性尾静脉注射。D组高脂组，高脂饲料喂养后2个月的大鼠一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液。E组高脂喂养2个月后15mg/kg STZ组，大鼠高脂饲料喂养2个月后一次性尾静脉注射STZ15mg/kg。F组高脂喂养一个月后15mg/kg STZ组，普通饲料和高脂先后喂养一个月后大鼠一次性尾静脉注射STZ15mg/kg。尾静脉注射后A、B、C组继续普通饲料喂养，D、E、F组继续高脂饲料喂养。
1.4标本采集及检测。
1.4.1动态观察大鼠体重、饮水量、食量。
1.4.2STZ或柠檬酸缓冲液尾静脉注射后2天(即大鼠喂养至4月龄)的标本采集。A-F组大鼠分别进行空腹状态下(禁食8h，以下同)尾静脉采血，测其血糖、血脂水平。
1.4.3STZ注射后2个月(即大鼠喂养至6月龄)A-F组的标本采集及相关糖代谢分析。
14.3.1分别测定空腹状态下血中葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胰岛素含量。
1.4.3.2通过葡萄糖-胰岛素耐量试验测胰岛素敏感性。
方法如下大鼠禁食8h后苯巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，行股静脉、股动脉插管。继股静脉注射葡萄糖0.7g/kg后注射胰岛素0.175U/kg，于0，2，4，6，8，10，20，30min股动脉抽血0.3ml，分离血清检测血糖值，胰岛素敏感性以10min内血糖下降速度来衡量，对数线性回归(Loglinear regression)程序计算，以拟合曲线的平均斜率K值表示。
1.4.3.3测定上述指标后，每组大鼠各5只，断头处死，迅速取胰腺、心脏、主动脉，一部分液氮保存，一部分备病理检查(包括本部分大鼠的形态学分析)。另外，留取A组大鼠全身不同组织液氮保存以备基因组织分布表达谱分析。
1.4.3.4胰腺的病理学观察。胰腺用10％中性甲醛溶液固定，常规包埋，5μm切片，免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，经由过氧化酶阻断、正常非免疫动物血清封闭、目的抗体湿盒内4℃过夜、生物素二抗标记、链亲和素-过氧化物酶孵育、DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分色、脱水、二甲苯透明，中型树胶封片等步骤，详见试剂手册。采用多媒体彩色病理图像分析系统(KS400)，在分辨率、对比度、亮度等相同条件下测胰岛Ins免疫组化染色阳性部分的平均吸光度。
1.5大鼠心血管系统形态学观察。
1.5.1A、C、D、E各组大鼠喂养至4.5、5.5-6、10月龄即C、D大鼠糖尿病模型建立后半个月、1.5-2个月、6个月，分别断头处死，迅速分离心脏组织(心尖部)、主动脉置液氮保存，并各留取适当大小置10％中性甲醛溶液固定以备HE染色光镜观察、1mm×1mm组织块置4℃预冷的戊二醛固定液以备电镜观察。
1.5.2透射电镜标本的制备。经2％戊二醛和1％锇酸双固定，乙醇逐级脱水，环氧丙烷两次置换，环氧树脂618包埋液包埋浸透，LKB机切片，盐酸铅染，HITACHI，H-500透射电镜观察。
1.5.3扫描电镜标本的制备。经2％戊二醛和1％锇酸双固定，乙醇和醋酸乙戊酯逐级脱水，HCP-2临界点干燥，BAL-TEC离子溅射，PHILIPS，XL30 ESEM扫描电镜观察。
1.6数据处理。测定指标采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析。数据由SPSS(10.0)统计软件包进行处理并制图，以P＜0.05为有显著性意义。
实施例2大鼠2型糖尿病早期心肌病变相关基因筛选2.1材料2.1.1主要仪器设备Genomyx LRS荧光差异显示分析系统(Beckman)，该系统包括(1)Genomyx LR电泳仪，含自动干胶装置(2)Genomyx SC扫描仪(3)分析软件系统包括Acquire SC，Clarity SC，Extend LRS，Virtual Grid System等(4)切胶工作站。分光光度仪(Beckman DU650)，9700型PCR仪(PE)，Fluor-sTMmultilmager凝胶图像分析仪(Bia-RAD)，低温高速离心机(Beckman)，杂交炉(Robbins Scientific 2000)。
2.1.2主要试剂HIEROGLPH mRNA Profile试剂盒(Beckman)包括(1)12个3’端未标记荧光的T7(dT12)锚定引物(Anchored Primer，AP)(2)20个5′M13r随机引物(Arbitrary Primer，ARP)。Fluoro-DDRT-PCR试剂盒(Beckman)包括(1)12个含与上述锚定引物相应的四甲基罗丹明(TMR)标记引物(2)dNTP混合物(3)TMR标记的DNA分子量标记(4)fluoro-DD上样缓冲液。
TRIZOL总RNA抽提试剂为Gibco-BRL公司产品；不含RNA酶的DNA酶I为Promega公司产品；pMD18-T Vector、DNA Markers2000、Ex Taq酶及RT-PCR Kit(该试剂盒包括AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)-Adaptor引物，10×RNA PCR缓冲液，MgCl2等)为TaKaRa公司产品；柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及柱离心质粒微量回收试剂盒为Qiagen公司产品；GST Purification Kit购自PIERCE公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、Xho I、中分子量标准蛋白质购自Promega公司；Exp TaqDNA聚合酶、DNA Marker2000、IPTG购自TaKaRa公司，羊抗人GST多克隆抗血清为Phamacia公司产品；HRP二抗为华美生物工程公司产品；联苯二胺(DAB)显色剂为迈新公司产品。
2.1.3质粒和菌种GST蛋白融合表达质粒pGEX4T-1为Phamacia公司产品；常规的大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)及BL21(E.coli BL21)购自北京博大泰克。
2.1.4动物同实施例1。
2.2方法2.2.1动物分组及标本采集。
大鼠分组同实施例1糖尿病大鼠模型制备。
DD-PCR分析的标本来自本研究第一部分液氮保存的组织。E组(2型糖尿病模型组)建模后半个月所取的心肌、主动脉组织，分别以A组相应组织为对照。免疫组化标本来自来自正常对照及E组模型建立后0.5、2和6个月的心肌组织。
2.2.2样品总RNA的提取。
组织捣碎后置TRIZOL液中彻底匀浆，加入氯仿、异丙醇分离RNA，乙醇洗涤沉淀，DEPC水溶解，-20℃保存备用。具体按试剂手册操作。
2.2.3不含RNA酶的DNA酶处理以去除少量基因组DNA，10×PCR缓冲液 5.0μl50mmol/L MgCl21.5μlRNasin50uDNA酶I(RNase-Free)45u总RNA 20μg加DEPC处理过的双蒸水至50μl
混匀→37℃，30min→加DEPC处理过的双蒸水至500μl→酚/氯仿抽提后溶解于20μlDEPC水中。
2.2.4采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量。
2.2.4.1比色法上述RNA溶液稀释100倍后于260nm和280nm波长处测吸光度(A)，分析RNA浓度和A260/A280比值。RNA的定量根据下列公式求出其浓度。
RNA溶液的浓度(μg/ml)＝A260×40×稀释倍数。
2.2.4.2电泳法2.2.4.2.1凝胶的制备称取琼脂糖1.2g，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液12ml，DEPC处理过的双蒸水37.3ml，加热溶解。待溶液冷却至60℃时加入12.3mol/L的甲醛贮存液10.7ml，10mg/ml的溴乙锭3.0μl，混匀，于室温中静置0.5h使凝胶凝固。
2.2.4.2.2样品的制备及电泳。在一灭菌的Eppendorf管中加入下述各成分混匀后65℃温育15min后迅速置于冰浴中，加2μl灭菌的并经EDPC处理的10×甲醛凝胶上样缓冲液，混匀。凝胶预电泳5min(5V/cm)后上样。在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中以4V/cm的场强电泳。紫外灯下观察电泳结果。
RNA样品 4.5μl5×甲醛凝胶电泳缓冲液2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺 10.0μl2.2.5样品RNA的DDRT-PCR反应。
各组RNA样品以T7(dt12)AP作为3’端引物，进行逆转录反应，反应体系20μl25mmol/L MgCl24μl，10×PCR缓冲液2μl，250μM dNTP混合物2μl，RNase抑制剂0.5μl，0.25U/μl反转录酶1μl，T7(dt12)AP各4μl，Total RNA 0.8ug，剩余容积以H2O补足。反应条件如下42℃30min，50℃30min，70℃15min，反应结束后4℃保存。以M13rARP为随机引物，TMR-T7(dt12)AP为锚定引物，对各组cDNA产物进行PCR扩增。反应体系10μl10×PCR缓冲液1.0μl，25mM MgCl21.5μl，250mM dNTPs 2.0μl，M13r-ARP各1.75μl，TMR-T7(dt12)AP各0.7μl，RT mix 1.0μl，EX Taq酶0.1μl，H2O1.95μl。条件如下(1)95℃2min(2)4个循环92℃15s，50℃30s，72℃2min(3)30个循环92℃15s，60℃30s，72℃2min(4)72℃7min(5)4℃保存。
2.2.6DD-PCR电泳流程2.2.6.1蒸馏水反复冲洗玻璃板、垫片和梳子。将无切迹玻璃板的内面用4mol/LNaOH处理，将有切迹玻璃板的内面用Glass Shield硅化，随后用乙醇处理，自然晾干。将无切迹玻璃板的内面朝上置灌胶工作台上，垫片紧贴于玻板的两侧，将另一块玻板的处理面朝下覆盖在上述玻璃板上。在70ml 5.6％变性HR-1000胶中加入560μl新鲜制备的10％APS和56μl TEMED，水平灌胶，并将梳子的水平一侧插入凝胶内，玻板的两边用夹子固定，使胶充分聚合。
2.2.6.2在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR产物和1.5μl上样缓冲液，95℃变性2min，迅速置于冰内。上样前，将胶放在扫描仪上预扫描，以减少背景干扰。
2.2.6.3DD-PCR电泳条件如下电压3000V，时间5h。
1.2.6.4电泳结束后，打开Acquire SC程序并启动扫描仪，相关分析软件进行差异条带的定位。
2.2.6.5将胶板从扫描仪取下，移走有切迹的玻璃板，干胶并用蒸馏水冲洗15min，反复操作3次。割胶工作台上操作，差异条带浸泡于50μl TE中，37℃温育1h。切割完毕后将玻璃板放入扫描仪重新扫描，检测割胶的准确性。
2.2.7差异条带的再扩增，通用引物为T7 promoter(22-mer)，5’gtaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO3)M13 reverse(24-mer)，5’agcggataacaatttcacacagga 3’(SEQ ID NO4)其它PCR条件同DD-PCR过程。
反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增出的特异条带。
2.2.8割胶和胶回收(Qiagen)按实际手册说明进行每100g琼脂糖凝胶加入300μl比例加入S1液，置55℃水浴10min每2min颠倒混匀一次；加入1/3 S1液体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1min；将溶化后的Agarose液移入吸附柱，W1液反复冲洗；在吸附膜中央加入30μl T1液后高速离心1min；过柱液-20℃保存。
2.2.7RDCR3的组织分布。
以GAPDH作为内参照，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳及辉度扫描初步预测RDCR3在不同组织中表达的差异。
RDCR3-p15’GGACCAGCACTGGGAGAATA3’(SEQ ID NO5)，RDCR3-p25’CGGCTCATGAGGTACAATGA3’(SEQ ID NO6)；GAPDH-p15’ATGATTCTACCCACGGCAAG3’(SEQ ID NO7)，GAPDH-p25’TTCAGCTCTGGGATGACCTT3’(SEQ ID NO8)。
PCR产物RDCR3为605bp，GAPDH为529bp。25μl反应体系如下10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl22μl，2.5μM dNTPs 2μl，引物RDCR3各1.5μl、GAPDH各0.5μl，RT mix 1.5μl，EX Taq酶0.2μL，H2O12.8μl。经1cycles95℃反应3min；28cycles94℃变性反应45sec，56℃退火反应45sec，72℃延伸反应1min；1cycle72℃反应7min，4℃保存。
2.2.8RDCR3基因在大肠杆菌中的融合表达2.2.8.1RDCR3序列的PCR扩增按RDCR3序列(Genebank登录号AY095481)设计并合成引物，上游引物PG15’-cgGGATCCATTGTGGACTACAAGGCAT-3’(SEQ ID NO9)，引入BamH I酶切位；下游引物PG2
5’-ccgCTCGAGTCAGTCCCATGGGACCT-3’(SEQ ID NO10)，引入Xho I酶切位，扩增可获得633bp的RDCR3序列，编码211个氨基酸；按文献设计5’端pGEX-4T-1(869-891)测序引物5’-GGGCTGGCAAGCCACCTTTGGTG-3’(SEQ ID NO11)。
反应参数为94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，28个循环；最后72℃7min。反应体系如下将抽提的大鼠心肌组织总mRNA经反转录后得到的cDNA作为模板约0.1μg，Exp Taq酶1.5μl，PG1 50pmol，PG2 50pmol，dNTP终浓度200μmol/L，Mg2+终浓度1.5mM，10×Buffer 5μl，加H2O至50μl。
2.2.8.2重组质粒pGEX-4T-RDCR3的构建，见图1。
2.2.8.3差异片断的亚克隆2.2.8.4连接反应16℃过夜按生产商的说明书，将PCR扩增获得的DNA片段与PMD 18-T载体(购自TAKARA公司)在16℃连接过夜。
2.2.8.5转化2.2.8.6感受态细菌的制备无铂丝蘸取-70℃冻存的E.coli(DH52)，在LB平板上划线接种，平板置于37℃ 16h；挑取单菌落置于5ml LB培养基中，37℃振摇16h；取1ml上述培养液接种到一含有50mlLB培养基的烧瓶中，37℃振摇培养3h，测A600，待其值达到0.3-0.4时将烧瓶取出，立即置冰浴10min；在无菌条件下将细菌转移到一消毒过的预冷的50ml离心管；4℃4000rpm离心10min，弃去上培养液，将离心管倒立于滤纸上1min使培养液流尽；向离心管中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重悬沉淀的菌体，置冰浴30min；4℃ 4000rpm离心10min，弃去上清液，将离心管倒立于滤纸上1min；加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻重悬菌体；将上述菌体置于4℃冰箱中12～24h，然后分装保存于15％的甘油中-20℃备用。
2.2.8.7质粒的转化连接产物5μl+感受态细菌200μl→冰浴30min→42℃水浴90s→加入800μlLB培养基，混匀→37℃振摇90min(120rpm)→将菌液接种于含有10μg/ml氨苄青霉素及IPTG/X-Gal的LB培养板上→培养板于37℃正放30min→37℃倒放20h→挑取白色菌斑，接种于5ml含有10μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中→37℃振摇(120rpm)将PCR产物用BamH I和Xho I双酶切获得RDCR3，定向插入载体pGEX-4T-1的MCS。用BamH I和Xho I双酶切鉴定，选取酶切鉴定的质粒送DNA测序。
2.2.8.8GST-RDCR3融合蛋白的表达纯化按PIERCE公司和Phamacia公司产品手册所述，对GST融合蛋白进行亲和纯化。
2.2.8.9.1表达鉴定及条件优化(1)将筛选获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取新鲜单个菌落于5ml2×YT液(含100μg/ml Amp)中，37℃ 200rpm振摇过夜；(2)将饱和菌液以1∶100比例转接于5ml 2×YT液中，37℃振摇培养3-4h至A6000.5；(3)加入IPTG至终浓度为300μM，37℃，250rpm下继续培养4h。4℃、7000g离心收集菌体沉淀，细菌裂解液破碎，按诱导前全菌、诱导后全菌、上清、沉淀进行SDS-PAGE。电泳胶的配制底层使用12％分离胶(10ml含30％聚丙烯胺4ml、1.5mM Tris(pH 8.8)2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％过硫酸胺0.1ml、TEMED 4μl、ddH2O 0.1ml)，灌注适当高度后，覆盖一层饱和正丁醇，胶聚合后ddH2O洗数次，吸干；配制5％成层胶(2ml含30％聚丙烯胺0.33ml、1.0mM Tris(pH 6.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％过硫酸胺0.02ml、TEMED 1μl、ddH2O 1.4ml)，聚合后拔出梳子，电泳缓冲液冲洗上样孔。蛋白样品与2×SDS凝胶加样缓冲液等体积混匀，置100℃5min后上样，于4℃，100V恒压在1×Tris-甘氨酸缓冲液中电泳0.5h后，将电压改为150V至结束。
(4)电泳结束后取出凝胶，考马斯亮兰染色，脱色。根据电泳结果，取表达最佳的单个克隆接入3ml 2×YT/Amp培养液中，37℃，250rpm培养4-5h至A6001.5，加入终浓度为15％的甘油，混匀后分装于0.5ml离心管，-70℃保存。
(5)取上述菌落，同法进行表达分析，分别在33℃、35℃、37℃三个温度段，IPTG诱导后继续培养4、6、8h，取少量样品，制备电泳样品，按全菌、上清、沉淀进行SDS-PAGE。选择最佳表达条件(包括可溶性及表达产量)。
2.2.8.9.2.原核表达及融合蛋白的纯化(1)取10ul复融的甘油菌种接入10ml 2×YT培养液于100ml三角瓶中，30℃、250rpm，振荡培养过夜；(2)按2％比例接种入250ml的2×YT培养基中，37℃培养至A600为0.5时，加入IPTG至终浓度0.3mM；(3)改35℃继续培养4h后收获菌体，7000rpm离心10min沉淀菌体；(4)将菌体重悬于细菌裂解液10ml中直至液相均一，室温下轻微振荡10min。
(5)将裂解液14000rpm离心15min，菌液上清加入1mL固化谷胱苷肽树脂室温震荡10min，2500rpm离心10min；(6)弃上清，加入0.25ml洗涤缓冲液重悬树脂，将其移入B-PERTM纯化柱中，10000rpm离心2min；(7)加入0.5ml洗涤缓冲液，孵育5min，10000rpm离心2min；(8)另取0.5ml洗涤缓冲液，配制洗脱缓冲液(含还原型谷胱苷肽15mg)；(9)将洗脱液加入B-PERTM纯化柱，孵育5min，10000rpm离心2min；收集离心洗脱液，其中含有表达产物GST-RDCR3。取10ul样品与诱导前、诱导后全菌样品进行SDS-PAGE，灰度扫描分析目的蛋白并计算其在总蛋白中的含量。
2.2.9.表达产物的免疫印迹鉴定2.2.9.1.融合蛋白GST-RDCR3进行SDS-PAGE。
2.2.9.2.转膜电泳完毕，取下凝胶，切一张和凝胶等大的硝酸纤维素膜(NC膜)和2张Whatman3MM滤纸，按滤纸、凝胶、NC膜、方向排好，排除各层气泡，前后端用海棉和多孔有机玻璃板加紧，置电转移槽中。在转移缓冲液中恒压100V，电转移1.5h，SDS-PAGE分离后的凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜。
2.2.9.3.免疫印迹实验(1)将NC膜放入可热密封塑料袋，加5ml封闭液(TTBS，0.1％(v/v)Tween20，100mM Tris.Cl(pH 7.5)，0.9％(w/v)NaCl)，室温置摇床1h；(2)将NC膜放入用封闭液以1∶1000稀释的羊抗人GST多克隆抗血清中[12]，37℃孵育1h；(3)TTBS缓冲液洗膜，5min×3次；(4)将NC膜移入用TTBS以1∶1000稀释的IgG-HRP二抗中，37℃孵育1h；(5)TBS洗膜，5min×3次；(6)置DAB(50mg DAB/100ml PBS缓冲液+10ul 30％H2O2)中显色；(7)条带显示清楚后自来水冲洗，终止反应。
结果1、基因基本信息获得的序列RDCR3经nr数据库进行查询、寻找ORF、进行全长cDNA的识别及染色体定位。
新基因RDCR3全长1219bp，GenBank登录号为AY095481，序列如SEQ ID NO1所示，其中ORF位于166-798位。
与2001年底公布的大鼠部分基因序列(长104429bp)98％同源，该基因跨度至少＞40kb，包含6个外显子，5个内含子，部分比较结果见图9所示。由于大鼠基因组草图尚未竣工，无法进一步染色体的精确定位。
RDCR3 cDNA序列所编码的211个氨基酸蛋白，命名为RDCR3(Rat DiabeticCardiomyopathy Related Gene 3)。序列如下MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMV VVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS 60GLQALVAQYG DWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP 180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 2112对蛋白质的结构和功能分析2.1同源性分析与RDCR3蛋白同源性相对高的蛋白是lysosomal/endosomal membrane protein p67(溶酶体/内体膜蛋白p67，来自锥虫，同源性37％)，和serine/threonine kinase(丝氨酸/苏氨酸，来自Arabidopsis thaliana，同源性27％)。
2.2理化特性分析RDCR3的211个氨基酸中含有73个疏水性氨基酸、59个极性氨基酸及53个带电氨基酸。RDCR3分子量为23827.26m.w，等电点为6.74(图2)。
2.3结构域及基序的功能预测。
2.3.1Spscan预测RDCR3蛋白无跨膜结构域及信号肽，因此它属于膜蛋白或分泌蛋白的可能性不大，很有可能是一种胞浆蛋白。
2.3.2结构域的检索。发现RDCR3蛋白含Rhodopsin-like GPCR超家族特征结构域，在下列序列中以下划线标示。
MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMVVVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS60GLQALVAQYGDWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 211(SEQ ID NO2)2.3.3基序分析结果表明存在以下基序
2.3.4蛋白修饰位点DCR-3有多个蛋白修饰位点1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点。
N-糖基化位点符合N[^P][ST][^P]模式，具体序列为SEQ ID NO2中137-140位的NGSY蛋白激酶C磷酸化位点符合[ST].[RK]模式，具体序列为SEQ ID NO2中第118-120为的SPK和第128-130位的SAR。
酪蛋白激酶II磷酸化位点符合[ST].{2}[DE]模式，具体序列为SEQ ID NO2中第21-24位的TILE、第89-92位的SLVE、第112-115位的SLCE、第196-199位的SQPD。
2.4蛋白质二级结构2.4.1RDCR3蛋白可能出现的α、β及混合型蛋白结构域的比例分别为10.4％、19.9％和69.7％。根据α型％H＞45、％E＜5；β型％H＜5、％E＞45；α-β型％H＞30、％E＞20；其余为混合型的标准，RDCR3应属于一种混合型蛋白。见图3A和3B。
2.4.2二级结构的免疫原性分析将编码RDCR3的N端第1个残基定义为1，以此类推，C末端的残基为211。亲水性、表面可及性、可塑性及抗原指数结果如下RDCR3的亲水性区域主要有1-18，36-52，70-92，99-109，117-153，173-198等。
可及性较高的区域有12-17，35-45，74-89，101-106，119-124，145-151，175-180，183-189等。
可塑性较高的主要区域有9-19，75-81，84-94，117-124，129-139，171-181等。
可能的蛋白质抗原表位区域12-20，75-99，102-114，117-140，145-159，173-191等。
3.RDCR3的组织分布以GAPDH为内标，半定量RT-PCR初步预测RDCR3在正常大鼠不同组织中的分布。2％琼脂糖凝胶电泳见图4。
经3次半定量RT-PCR及辉度扫描，以目的基因与内标GAPDH产物辉度比值×10表示表达丰度，柱型图表示，图5。
4.PCR产物的克隆及重组子鉴定通过PCR获得了650bp的RDCR3特异带(图6)，回收的PCR产物与pGEX-4T-1载体的连接产物转化感受态菌，在LB平板上筛选转化子，用BamH I、Xho I双酶切鉴定，获得预期大小的DNA片段。DNA测序进一步证实克隆片段确实为RDCR3序列且无发生碱基突变。
5.RDCR3蛋白在大肠杆菌中的表达pGEX-4T-1载体编码产生26kDa的GST蛋白，外源基因以融合蛋白形式表达。携有RDCR3融合表达质粒pGEX-4T-1-RDCR3在宿主菌E.coli BL21经IPTG诱导后，菌体裂解物进行SDS-PAGE电泳，结果显示携有重组表达质粒的工程菌在约50kD(GST-RDCR3)位置处有一特异条带。薄层扫描显示表达量约占菌体总蛋白的30％(图7)。表达产物约50％存在上清液中，经GST亲和层析后得到纯化的GST-RDCR3。
6.Western印迹分析结果如图8所示，表明得到单一带GST标签的RDCR3融合蛋白。
实施例3RDCR3在高糖培养条件下的表达高于低糖培养条件在本实施例中，对新生鼠原代心肌细胞，在高糖(浓度25mmol/l)和低糖(5.6mmol/l)条件下，于DMEM培养基中进行培养干预实验。在培养4天后，抽提心肌细胞的总mRNA，用SEQ ID NO5和6所示的引物，进行常规RT-PCR检测RDCR3的表达量。
结果表明，在高糖情况下，RDCR3基因的表达高于低糖(p＜0.05)实施例4抗RDCR3蛋白抗体的产生将实施例1中获得的重组大鼠RDCR3蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀大鼠RDCR3蛋白基因翻译产物的能力加以评估。
结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
实施例5筛选影响RDCR3蛋白表达的物质在本实施例中，重复实施例3的培养，不同点在高糖条件下，在培养液中加入0.001mg/L、0.01mg/L黄连素，作为测试组。另外，在无黄连素存在下，培养大鼠心肌细胞作为对照组；在培养3天，用RT-PCR法测定测试组和对照组中RDCR3蛋白的表达情况，结果显示，测试组中RDCR3蛋白的表达量低于对照组，这表明黄连素是抑制RDCR3蛋白表达的物质。
实施例6RDCR3在成心肌细胞诱导分化中的表达变化在本实施例中，大鼠成心肌细胞H9c2细胞株(购自ATCC，编号CRL-1446)在低糖DMEM 10％胎牛血清中(5.6mmol/l)中培养近融合时，降低血清浓度为1％加终浓度为10nM的全反式维甲酸(Sigma公司)，诱导七天，分别研究第1，3，5，7天的RDCR3和心肌细胞成熟的特异标志物LCAD和ANF的表达情况。
结果显示，随着ANF和LCAD表达增高，RDCR3表达也逐日增高。说明RDCR3在促进心肌诱导分化中起一定作用。可促使心肌功能衰竭情况下心肌的自我修复的代偿功能的发挥。
讨论序列的生物信息分析是从理论迈向实验或临床研究的重要部分，如果想对感兴趣的基因投入研究，那么基于生物信息学获得尽可能多的关于该基因的信息就十分必要，往往能对后继的工作起到事半功倍的效果。本研究应用生物信息学技术对RDCR3的结构/功能进行一系列分析，以期对进一步的研究工作提供有益的参考。
(a)新序列的同源性分析蛋白的不同部位其进化速率可能不同，功能重要的部分如酶的活性位点进化得慢，在不同序列中保守性好。因此在远缘的序列中有可能发现某种共同的保守序列片段，从而揭示某种结构或功能联系。RDCR3与低等动物内体/溶酶体膜蛋白、丝氨酸/苏氨酸具一定同源性。内体/溶酶体在外源性抗原的加工和递呈中发挥作用，这一过程的顺利进行都需要内体/溶酶体膜蛋白发挥信号转导作用Bonnerot C，Briken V，Amigorena S.Immunol Lett.1997，571；Hunziker W，Geuze HJ.Bioassays.1996，18379。尤为引人注目的是RDCR3与内体/溶酶体膜蛋白均含视紫质样GPCRs(Rhodopsin-like GPCRsuperfamily signature)结构域，后者是一种包括激素、神经递质和光受体在内的作用广泛的蛋白质亚家族，通过与鸟嘌呤核苷酸结合蛋白相互作用转导细胞外信号，与分泌素样GPCRs、cAMP受体同属G蛋白耦联受体(GPCRs)的蛋白大家族，发挥一系列涉及自分泌、旁分泌和内分泌过程的功能。这提示RDCR3蛋白功能与信号转导、激酶密切相关。
另外在蛋白质的基序检索中，发现RDCR3与乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶、激酶P85调节亚单位信号、高丝氨酸激酶信号、脂质-A-二糖合成酶、DAHP合成酶2以及TASK K+通道信号有着类似的基序。这些基序的发现，与预测得到的RDCR3多个磷酸化及糖基化修饰位点不谋而合，该蛋白可能接受多种信号的调控。
RDCR3在组织中分布广泛，但mRNA水平在主动脉及心脏、骨骼肌中的表达较低，似乎与这三种组织富含平滑肌细胞有关。RDCR3在糖尿病性主动脉病变早期中的表达上调，这在高糖或高脂所导致细胞结构和功能变化的多通路改变中究竟处于哪一环节，有待进一步探讨。
(b)二级结构预测在蛋白的二级结构预测中，亲水性反映了残基从水相转移到非极性相的自由能变化，亲水性残基倾向于暴露在蛋白质表面。但是，亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性，而且通常仅曲线的较高峰预测的抗原表位才相对可靠。可及性指蛋白抗原中残基被溶剂分子接触的可能性，它反映了蛋白抗原内、外各层各残基的分布组成。可塑性指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽骨架有一定程度的活动性，由于蛋白质的环区往往具有较大的自由度，用此方法预测的抗原表位多落于环区。二级结构预测也认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白抗原表面，利于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。抗原指数系综合了亲水性、表面可及性、可塑性及二级结构预测的线性组合，对于推测RDCR3蛋白质的抗原表位较有价值，最常采用的方案为Jamson-Wolf方案，采用以下公式进行计算抗原指数(A)＝0.3亲水性值(H)+0.15表面特性值(S)+0.15可塑性值(F)+0.2(Chou&Fasman值+Garnier-Osguthorpe-Robson值)Webster DM.Protein structure predictionmethods andprotocols.New Jersey.USA.Humana Press Inc.2001；来鲁华编著.蛋白质的结构预测与分子设计.第一版，北京北京大学出版社.1993。可见，抗原指数较其它算法有一定的优势。根据RDCR3抗原表位的预测，其抗原表位分部均匀，因此可以考虑全长表达该蛋白。
(c)蛋白表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1用于高效表达与GST融合的目的蛋白。菌体裂解物中的融合蛋白可通过亲和柱中的谷胱甘肽亲和纯化。蛋白的洗脱条件比较温和，较大限度地避免对蛋白的抗原性和生物活性造成不利的影响。本研究通过IPTG诱导的GST融合表达和亲和层析纯化得到了高纯度的分子量为50KDa的GST-RDCR3融合蛋白。由于pGEX-4T-1是一种融合表达载体，载体本身表达26KDa的融合蛋白氨基端部分，故本实验插入片段实际编码24KDa的重组蛋白，与RDCR3分子量的理论值相吻合。真核生物基因以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达具有以下优点Hockney RC.Recent development in heterologousprotein production in Escherichia coli.Trends in Biotech.1994，12456；Hering TM，Kollar J，Huynh TD，et al.Purification and characterization of decorin core proteinexpressed in Escherichia coli as a maltose-binding protein fusion.Anal Biochem.1996.240981.由于转录和翻译过程起始所需的RNA聚合酶结合部位(即启动子)及核糖体结合位点(SD序列)由质粒提供，因而融合蛋白通常得到高效表达；2.融合蛋白部分序列由原核细胞基因编码，可保护重组蛋白不被细菌蛋白酶降解破坏，使其比天然外源蛋白更稳定；3.表达出的融合蛋白以可溶性形式稳定存在于细菌胞浆中，有利于蛋白肽链的正确折叠，保持其构象及生物学功能；4.可通过已商品化的亲和层析纯化系统(如Amylose Resin、谷胱甘肽Sepharose等)方便地获得高纯度的非变性目的蛋白，可用于免疫动物及建立免疫学诊断方法。
本发明采用GST融合蛋白系统成功地制备并纯化新基因RDCR3表达的蛋白，为今后深入研究RDCR3的结构与功能相互作用的机理以及免疫学测定提供条件。也为治疗糖尿病性心血管病变药物筛选提供新的靶点。例如，可以将候选物质添加到高糖条件下培养的心肌细胞培养物中，观察其对RDCR3表达影响。
目前不断新开发的糖尿病治疗药物的疗效中都会有提及对糖尿病慢性并发症的作用比如对于磺脲类药物可能作用于心肌上类似胰岛细胞的钾离子通道而影响糖尿病患者的心脏功能，而噻唑皖二酮类又可能参与心肌的保护机制，任何与糖尿病性心血管病变相关的基因都可以作为糖尿病治疗药物对患者心脏影响的筛选指标。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市内分泌代谢病研究所<120>糖尿病性心血管病变相关基因及其用途<130>050053<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(166)..(798)<223>
<400>1accactgtcg gcaacaagaa cccagcgctg tggaagtacg tgcaacccca gggctgtgtg 60ctggagtgga ttcgaaacat tgtggccaac cgcctggcct tggatggggc cacctgggca120gatgtcttca ggcggttcaa tagtggcacg tataataacc agtgg atg att gtg gac177Met Ile Val Asp1tac aag gca ttc atc ccc aat ggg ccc agc cct gga agc cgg gtg ctc 225Tyr Lys Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu5 10 15 20acc atc cta gaa cag atc ccg ggc atg gtg gtg gtg gcg gac aag act 273Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr25 30 35gca gag ctc tac aag acg acc tac tgg gct agc tac aac atc ccg tac 321Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Tyr40 45 50ttt gag agt gtt ttc aac cct agt ggt ctg cag gcc ctg gta gcc cag 369Phe Glu Ser Val Phe Asn Pro Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln55 60 65tac gga gat tgg ttc tcc tac acc agg aac cct cga gcc aag atc ttc 417Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Arg Asn Pro Arg Ala Lys Ile Phe70 75 80cag agg gac caa tca cta gtg gag gac gta gac acc atg gtc cgg ctc 465Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Val Asp Thr Met Val Arg Leu85 90 95 100atg agg tac aat gac ttc ctt cat gac cct ccg tcg ttg tgt gag gcc 513Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Pro Ser Leu Cys Glu Ala105 110 115tgc agc ccg aag ccc aac gca gag aac gcc atc tct gcc cgc tct gat 561Cys Ser Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp120 125 130ctc aac cct gct aat ggc tcc tac cca ttt cag gcc ctg cgt cag cgc 609Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg135 140 145gcc cat ggc ggc att gat gtg aag gtg acc agc gtt gcg ctg gct aag 657Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Val Ala Leu Ala Lys150 155 160tac atg agc atg ctg gca gcc agt ggc ccc acg tgg gac caa ttg cca 705Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro165 170 175 180
ccg ttc cag tgg agt aaa tca cca ttc cac aac atg ctg cac atg agc 753Pro Phe Gln Trp Ser Lys Ser Pro Phe His Asn Met Leu His Met Ser185 190 195cag cct gat ctt tgg atg ttc tca cct gtc aag gtc cca tgg gac 798Gln Pro Asp Leu Trp Met Phe Ser Pro Val Lys Val Pro Trp Asp200 205 210tgagaatctg cctccgccca gctgccttca ttttgtgtga ccagtggggt cccacacctg858ctgtccaccc attggggttc tgtcttcact ggactctgat tctggtggtt tctttcgcaa918ggacacaacc cagtgggctc tgagctgcct ccgtccctct gccccttcgt ggctcttcct978ccctgtccct gtcaccagca ggctgggact tatgcttggc tgtgggcctg gtgggaccct 1038gggtggtatt ctcccagtgc tggtccctca gcatgtgtgt gaactgatgg ggctcctggt 1098gtcactactg gctgcgggcc tatcgcctca gagcagccct ggtgtcccct tctctggcag 1158cttccctaag tcaggagctt gaaaataaaa accaaagttt ctgctcttga aaaaaaaaaa 1218a 1219<210>2<211>211<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly1 5 10 15Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val20 25 30Ala Asp Lys Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr35 40 45Asn Ile Pro Tyr Phe Glu Ser Val Phe Asn Pro Ser Gly Leu Gln Ala50 55 60Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Arg Asn Pro Arg65 70 75 80Ala Lys Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Val Asp Thr85 90 95Met Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Pro Ser100 105 110Leu Cys Glu Ala Cys Ser Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser115 120 125Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala130 135 140Leu Arg Gln Arg Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Val145 150 155 160Ala Leu Ala Lys Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp165 170 175Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Lys Ser Pro Phe His Asn Met180 185 190Leu His Met Ser Gln Pro Asp Leu Trp Met Phe Ser Pro Val Lys Val195 200 205Pro Trp Asp210<210>3<211>22<212>DNA<213>引物<400>3gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>4<211>24<212>DNA
<213>引物<400>4agcggataac aatttcacac agga 24<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5ggaccagcac tgggagaata 20<210>6<211>20<212>DNA<213>引物<400>6cggctcatga ggtacaatga 20<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7atgattctac ccacggcaag 20<210>8<211>20<212>DNA<213>引物<400>8ttcagctctg ggatgacctt 20<210>9<211>27<212>DNA<213>引物<400>9cgggatccat tgtggactac aaggcat 27<210>10<211>26<212>DNA<213>引物<400>10ccgctcgagt cagtcccatg ggacct 26<210>11<211>23<212>DNA<213>引物<400>11gggctggcaa gccacctttg gtg 2权利要求
1.一种分离的RDCR3多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进心肌诱导分化功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出RDCR3蛋白多肽。
9.一种检测样品中是否存在RDCR3蛋白的方法，其特征在于，包括将样品与RDCR3蛋白特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RDCR3蛋白。
10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或其拮抗剂或激动剂以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的糖尿病性心血管病变相关蛋白－RDCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)蛋白，编码RDCR3蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种RDCR3蛋白的方法。本发明还公开了编码这种RDCR3蛋白的多核苷酸的用途。RDCR3蛋白具有Laminin A结构域，与心脏发育及心肌病发病相关。
文档编号A61K38/17GK1916022SQ20051002893
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者罗敏 申请人:上海市内分泌代谢病研究所