专利名称：一种黄芩提取物质量标准及其含量测定方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。具体涉及黄芩提取物质量标准及其含量测定方法。
背景技术：
黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的根。味苦，性寒。入心、肺、胆、大肠经。功能清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎。主治壮热烦渴、肺热咳嗽、湿热泻痢、黄疸、热淋、吐衄、崩漏、目赤肿痛、胎动不安、痈肿疔疮。现代药理学研究证明，黄芩具有抗病原微生物作用，解热作用，抗变态反应和抗炎作用，保肝、利胆、解痉作用以及降压、利尿、镇静等作用。
黄芩主要成分为黄酮类、挥发油和氨基酸等。黄酮类以黄芩素(Baicalein)、黄芩苷(Baicalin)为主要成分，并含少量汉黄芩素(Wogonin)、汉黄芩苷(Wogonoside)、和黄芩新素(Neobaicalein)等黄酮类化合物。挥发油中含有多种萜类、酸、酮、酚、内酯、醛、醚等，其中以苯乙酮(Aceto-phenone)、1-苯基-1，3-丁二酮(1-Phenyl-1，3-butanedion)、棕榈酸(Palmitic acid)、油酸(Oleicacid)等含量较高。尚含14种氨基酸，其中脯氨酸(Proline)含量最高，约占80％。其它还含有苯甲酸、黄芩酶、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、葡萄糖(Glucose)、蔗糖(Sucrose)、淀粉等。
本发明人曾成功地向国家药典委员会申报了黄芩提取物质量标准，该标准现已收载于2005年版中国药典一部中新增的植物油脂和提取物目录项下。现收载于2005版药典的黄芩提取物的关键指标是黄芩苷含量不得低于85％，炽灼残渣低于0.8％，重金属低于20ppm。提取所用的药材为正品黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，药材中黄芩甙含量(HPLC法)要求不得少于9.0％。理化特征与正品较相近的非正品黄芩主要有同属的粘毛黄芩与甘肃黄芩，但无品种混淆现象，作为标准提取物原料，就必须用正品黄芩。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在上述国家标准基础上，对黄芩提取物中黄芩苷以外的成分进行含量限定，要求黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷三者含量之和达到要求。本发明提供了黄芩提取物的具体标准为黄芩苷含量85～92％，黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷三者含量之和为6～10％。重金属低于20ppm外，铅、汞、砷、镉四个主要重金属元素的含量分别低于或等于5、0.2、2和0.3ppm。农药残留物六六六(BHC)、DDT、五氯硝基苯(PCNB)和艾氏剂(Aldrin)分别小于或等于0.1、0.1、0.1和0.02ppm。
本发明提供了黄芩提取含量的检测方法。
本发明人对黄芩提取物的含量测定进行了下列方法学研究(1)方法重现性试验按样品测定方法对同一样品一式5份，在给定的色谱条件下进行测定。4种所测成分的RSD均小于2％。
(2)稳定性试验对样品溶液在0、4、8、24小时各分析一次，测得黄芩苷对照品保留时间以及峰面积的RSD均小于2％，试验结果表明样品在24小时内稳定。
(3)色谱分析时间的确定在确定色谱条件延长分析时间至120min，根据样品图谱可知90min以后没有成分被洗脱出来，故设定梯度洗脱的时间为90min。
方法重现性试验(4)按样品测定方法对同一样品一式5份，在给定的色谱条件下进行测定。所测黄芩苷含量的RSD均小于1.7％。
(5)重金属与农药残留测定重金属按《中国药典》2000年版一部(附录VD)测定；农药残留按《中国药典》2000年版一部(附录IXQ)进行测定。发明的方法所需的黄芩提取物和汉黄芩苷对照品是通过一列方法制备的(1)制备黄芩提取物取黄芩，加8～15倍水煎煮或用水加热回流提取二次，合并煎液或提取液，部分浓缩至生药量的5～12倍，用盐酸调节pH值至1.0～2.0，80℃保温30～90分钟，静置，滤过，沉淀物加4～8倍水搅匀，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1.0～2.0，60℃保温20～60分钟，静置，滤过，沉淀依次用适量水及不同浓度的乙醇洗至pH值7.0，挥尽乙醇，真空干燥，即得黄芩提取物；(2)制备黄芩苷对照品在黄芩提取物质量标准研究中，需要用到的对照品主要为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素，其中汉黄芩苷对照品在国内外试剂市场无货供应，对此需要自行研究制备。
I仪器与试剂微量熔点仪Yanaco MP-(温度计未校正)；紫外分光光度仪Shimaza UV2100；质谱仪Einnigan LCQ-Deca；核磁共振仪BrukerDPX-300，Varian Inova 600；高效液相色谱仪HP-1100 AgilentTechnologies，柱Discovery SH5μ2.1*50mm；HPD-100大孔树脂河北沧洲宝恩化工有限公司；凝胶Sephadex LH-20 Pharmacia；反相预制层析柱LiChroprep RP-18Merck；硅胶板烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂；甲醇、乙醇、乙腈等系光谱纯或分析纯；紫外分析仪北京市新技术应用研究所。
II提取分离取黄芩药材，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水、20％乙醇洗涤，然后用乙醇梯度(30％～80％)洗脱，以TLC为检出手段，收集富含苷类的流份，终点控制仍以TLC为手段。流份经浓缩、干燥，得到粉末浸膏，备用；取上述浸膏粉末，用75％乙醇溶解，反复上上凝胶柱层析数次，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩后再行反相制备层析柱，以甲醇-水系统梯度(30∶70～50∶50)洗脱，以TLC为检出手段，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩至干，以甲醇重结晶，得到汉黄芩苷纯品。
III鉴定汉黄芩苷为已知化合物，其化学结构可通过综合光谱测定并与文献中关键的光谱数据对比而加以确认。
a.纯度测定取少量汉黄芩苷纯品，用甲醇溶解，制成样品溶液，照高效液相色谱归一法测定样品纯度，结果显示，自制的对照品纯度为96.42％，尚能满足黄芩提取物质量标准中有关指纹图谱探索研究的基本要求。
b.分子量测定在传统的电子流轰击(EI)质谱中，黄酮苷类化合物质谱特征往往是以苷元信号最强，苷元裂分碎片次之，而分子离子峰信号往往最弱，因此通过EI获取样品的分子量信息不太可靠。电喷雾(ESI)质谱能克服EI局限性，经ESI测定，受试样品的一价负电离分子离子峰为459.1，正电离分子离子峰为461.1，以二者离子峰为基准，本样品的分子量均为460.1，而汉黄芩苷分子量理论值为460.4，二者数据比较接近。
c.氢核磁共振测定1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)3.4-3.7(mH，brm，糖质子)、3.98(3H，s，C8-OCH3)、5.18(1H，d，C1”-H)、6.68(1H，s，C6-H)、6.84(1H，s，C3-H)、7.60(3H，d，C’3、4、5-H)、8.06(2H，dd，C’2、6-H)。鉴于样品化合物A、B、C环上质子归属非常清晰，并且其数据与汉黄芩苷文献值[1]对应一致，可以基本确认被测样品为汉黄芩苷。汉黄芩苷的化学结构如下
经1H-NMR的质子归属分析，结合MS的分子量测定旁证，可以确认所分析的样品是汉黄芩苷。
IV讨论在黄芩药材中黄芩苷含量在8～20％，而汉黄芩苷含量一般在1～3％；常规黄芩提取物中，汉黄芩苷所占的比例一般不超过6％。黄芩苷与汉黄芩苷为同系物，后者比前者在8位上多了一个甲氧基，在正相的TLC检测中发现，二者的Rf值比较接近，同时二者均为极性化合物，用正相柱层分离比较困难，同时每次上柱后样品成分存在着无法抗拒的损耗，不利于汉黄芩苷对照品的制备。
根据汉黄芩苷上述特点，本次分离使用了成分损耗比较小的大孔树脂和凝胶柱层析，其中凝胶对汉黄芩苷富集有较大作用，最后纯品的获取需要使用反相柱层析。
本发明提供的黄芩提取物测定方法为(1)仪器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A检测器，G1313A自动进样器，色谱工作站Agilent 1100 series。
(2)色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID检测波长280nm柱温40℃流动相A乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脱时间90min进样量10μl梯度条件0-30 min A(100-70％)，B(0-30％)
30-70minA(70-0％)，B(30-100％)70-90minA(0-0％)， B(100-100％)(3)对照品溶液的配制用甲醇配置单标溶液，混合制得混标溶液，其中含黄芩苷(0.16mg/ml)、汉黄芩苷(0.04mg/ml)、黄芩素(0.08mg/ml)、汉黄芩素(0.01mg/ml)。
样品溶液的制备方法取黄芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超声30min，放冷，定容至100mL。
(4)测定取各样品在确定条件下进样10μL进行梯度洗脱，测得样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量，结果见下表。
具体实施例方式实例1.黄芩提取物制备取黄芩5kg，加10倍水，加热回流提取二次，合并提取液，部分浓缩至生药量的8倍，用盐酸调节pH值至1.0～2.0，80℃保温60分钟，静置，滤过，沉淀物加6倍水搅匀，用40％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至1.0～2.0，60℃保温30分钟，静置，滤过，沉淀依次用适量水及不同浓度的乙醇洗至pH值7.0，挥尽乙醇，真空干燥，即得黄芩提取物2kg。
实例2.制备黄芩苷对照品取黄芩药材500g，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水、20％乙醇洗涤，然后用乙醇梯度(30％～80％)洗脱，以TLC为检出手段，收集富含苷类的流份，终点控制仍以TLC为手段。流份经浓缩、干燥，得到粉末浸膏，备用。取上述浸膏粉末5g，用75％乙醇溶解，反复上凝胶柱层析数次，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩后再行反相制备层析柱，以甲醇-水系统梯度(30∶70～50∶50)洗脱，以TLC为检出手段，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩至干，以甲醇重结晶，得到汉黄芩苷纯品。
实例3.黄芩提取物测定方法(1)仪器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A检测器，G1313A自动进样器，色谱工作站Agilent 1100 series。
(2)色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID检测波长280nm柱温40℃流动相A乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脱时间90min进样量10μl梯度条件0-30min A(100-70％)，B(0-30％)30-70min A(70-0％)，B(30-100％)70-90min A(0-0％)，B(100-100％)(3)对照品溶液的配制
用甲醇配置单标溶液，混合制得混标溶液，其中含黄芩苷(0.16mg/ml)、汉黄芩苷(0.04mg/ml)、黄芩素(0.08mg/ml)、汉黄芩素(0.01mg/ml)。
样品溶液的制备方法取黄芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超声30min，放冷，定容至100mL。
(4)测定取各样品在确定条件下进样10μL进行梯度洗脱，测得样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量。
权利要求
1.一种黄芩提取物质量标准的含量测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)仪器Agilent G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD G1315A检测器，G1313A自动进样器，色谱工作站Agilent 1100 series；(2)色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3(4.6×250mm 5μm)保护柱phenomenex C18(ODS)，4mmL*3.0mmID检测波长280nm柱温40℃流动相A∶乙腈∶水∶甲酸＝17∶83∶1，B∶乙腈∶水∶甲酸＝80∶20∶1流速1.0ml*min-1洗脱时间90min进样量10μl梯度条件0-30min A(100-70％)，B(0-30％)30-70min A(70-0％)，B(30-100％)70-90min A(0-0％)，B(100-100％)；(3)对照品溶液的配制用甲醇配置单标溶液，混合制得混标溶液，其中含黄芩苷(0.16mg/ml)、汉黄芩苷(0.04mg/ml)、黄芩素(0.08mg/ml)、汉黄芩素(0.01mg/ml)；样品溶液的制备方法取黄芩提取物粉末0.04g，加70％乙醇90mL，超声30min，放冷，定容至100mL；(4)测定取各样品在确定条件下进样10μL进行梯度洗脱，测得样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量。
2.根据权利要求1所述的一种黄芩提取物质量标准及其含量测定方法，其特征在于其中所述的黄芩提取物苷、汉黄芩苷和黄芩素的测定标准为黄芩苷含量85～91％，黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷三者含量之和为6～12％，重金属低于20ppm外，铅、汞、砷、镉四个主要重金属元素的含量分别低于或等于5、0.2、2和0.3ppm，农药残留物六六六、DDT、五氯硝基苯和艾氏剂分别小于或等于0.1、0.1、0.1和0.02ppm。
3.根据权利要求1所述的一种黄芩提取物的含量测定方法，其特征在于其中所述的对照品汉黄芩苷是通过下列方法制备的取黄芩药材，切成片段，用50％乙醇回流提取，真空浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水、20％乙醇洗涤，然后用乙醇梯度洗脱，以TLC为检出手段，收集富含苷类的流份，浓缩、干燥，得到粉末浸膏，备用；取上述浸膏粉末，用75％乙醇溶解，反复上凝胶柱层析数次，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩后再行反相制备层析柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，以TLC为检出手段，收集富含汉黄芩苷的流份，浓缩至干，以甲醇重结晶，得到汉黄芩苷纯品。
全文摘要
本发明提供了一种黄芩提取物质量标准及其含量测定方法。本发明的质量标准及其测定方法是在2005年版中国药典基础上的改进，提出的新标准为黄芩苷含量85－91％，黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷三者含量之和为6－12％。本发明还提供了对照品汉黄芩苷的制备方法。
文档编号A61K125/00GK1919256SQ20051002901
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月23日 优先权日2005年8月23日
发明者张国明, 王新宏, 谢德隆, 安睿, 华菊根, 徐晓英, 袁华梁 申请人:上海市中药研究所