专利名称：水杨梅根抗肿瘤提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别涉及一种水杨梅根抗肿瘤提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
水杨梅根为茜草科落叶灌木植物水杨梅(Adina rubella(Sieb.etZucc.)Hance)的根，具有清热解毒、散淤止痛之功效。郁仁存等人在“肿瘤常用中草药”，中医肿瘤学，1997，72页中报道，水杨梅根醇浸膏每日以5g/Kg连续灌胃或腹腔注射6天，对小鼠白血病L615有抑制作用，抑制率为21.4％；对小鼠宫颈癌细胞、小白鼠肉瘤AK、及大白鼠肉瘤均有抑制作用；这提示水杨梅根醇浸膏有广谱抗肿瘤作用。水杨梅的花果序中含儿茶素类化合物，另有熊果酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、水杨梅甲素及生物碱等，但关于水杨梅根的有效成分报道较少。何直升等人在“水杨梅化学成分的研究”，中草药，1996，26(6)285～288中报道，他们从水杨梅根中分离出数种新的Quinovic acid糖苷化合物，但未进行抗肿瘤活性研究。Quinovic acid糖苷在其它抗肿瘤植物中也被发现，曾有文献Raffauf RF，etal.Lloydia，1978，41(5)432～434提及，在金鸡纳树皮中发现了Quinovic acid糖苷化合物，该化合物具有抗肿瘤活性，后来Raffauf RF在其它具有抗肿瘤活性的植物药材中也发现了此类化合物，这表明Quinovic acid糖苷化合物有可能也是水杨梅根的主要抗肿瘤活性物质。
目前，对水杨梅根的研究仅停留在其药材的粗浅认识上，没有关于水杨梅根抗肿瘤有效部位和成分分离方法、制剂技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种可有效地纯化中药水杨梅根的有效部位，便于工业化生产的水杨梅根抗肿瘤提取物制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备的水杨梅根抗肿瘤提取物。
本发明的再一目的在于提供一种上述水杨梅根抗肿瘤提取物的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现本水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法包括下述步骤(1)用水或有机溶剂在70～100℃温度下浸提水杨梅根药材，得到浸出液；(2)在浸出液中加入絮凝剂，沉淀去杂，得到提取液；(3)将提取液的pH值调节至2～5，静置，取得上清液；(4)将上清液过大孔树脂，用溶剂洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液回收溶剂后，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；(6)将萃取液浓缩干燥，得到水杨梅根抗肿瘤提取物。
步骤(1)中，所述有机溶剂为30～70％(V/V)乙醇；所述水杨梅根药材可为水杨梅根块状物或粉碎物；所述浸提温度优选70～80℃。
步骤(1)中，所述浸提次数为1～3次；每次浸提时间为1～2小时；第一次浸提的水杨梅根与水或有机溶剂的重量比为1∶8～10；第二次和第三次浸提的水杨梅根与水或有机溶剂的重量比为1∶4～5。
步骤(2)中，可将浸出液先浓缩，然后再絮凝沉淀；所述絮凝剂可为甲壳素、ZTC絮凝剂或明胶，用量为水杨梅根药材重量的0.1～1％；所述沉淀可采用过滤或离心分离沉淀。
步骤(3)中，采用酸性试剂来调节提取液的pH值，优选盐酸、醋酸。
步骤(4)中，所述大孔树脂可为各种非极性或弱极性的大孔树脂；所述溶剂为含水溶剂，优选乙醇水或丙酮水。
步骤(5)中，所述乙酸乙酯的用量为洗脱液的1～3倍体积量。
步骤(6)中，所述干燥可为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
采用上述方法制备得到水杨梅根抗肿瘤提取物；所制备的水杨梅根抗肿瘤提取物有效成分(多酚类)含量可达80～90％。
该水杨梅根抗肿瘤提取物作为活性成分与可接受的药物载体结合制成可用于治疗各种肿瘤的口服或注射单方以及复方制剂，如以淀粉等为辅料制成的片剂、以微晶纤维素为辅料制成的胶囊剂、以甘露醇为支架制成的注射剂等。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果(1)本发明对原料药材采用高温、多次、长时间浸提，浸提效果好，原料药材中抗肿瘤有效成分转移率高；(2)工艺简单，沉淀步骤采用了絮凝沉淀法，可避免醇沉法的因沉淀不完全而造成的损失和乙醇回收而增加的工艺步骤；(3)产品纯度高，便于工业化生产，一方面采用调酸法除去酸不溶物，提高大孔树脂的吸附效果；另一方面采用大孔树脂纯化水杨梅根抗肿瘤的有效部位，并采用乙酸乙酯萃取法进一步提高有效部位的纯度，提高有效成分含量和精度。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1将1Kg的水杨梅根药材，加入10L的水，保持在100℃温度下浸提120分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入5L的水，保持在100℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第二次浸出液；合并两次浸出液。
将浸出液减压浓缩至热比重为1.05，加入甲壳素1g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用10％盐酸将提取液的pH值调至2，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂D101，然后用70％乙醇水洗脱，再将洗脱液减压回收乙醇，然后用1倍体积量的乙酸乙酯萃取3次；最后将萃取液常压浓缩、真空干燥，制得30g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为85％。
实施例2将1Kg的水杨梅根药材粉碎成粗粉，加入8L的水，保持在80℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入4L的水，保持在80℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第二次浸出液；合并两次浸出液。
将浸出液加入明胶10g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用20％醋酸将提取液的pH值调至5，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂HPD300，然后用70％丙酮水洗脱，再将洗脱液减压回收丙酮，然后用3倍体积量的乙酸乙酯萃取1次；最后将萃取液减压浓缩、冷冻干燥，制得35g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为87％。
实施例3将1Kg的水杨梅根药材粉碎成粗粉，加入9L的水，保持在90℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入5L的水，保持在90℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第二次浸出液；再在滤渣中加入5L的水，保持在90℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
将浸出液常压浓缩至热比重1.03，加入ZTC絮凝剂3g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用5％盐酸将提取液的pH值调至3，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂HPD600，然后用50％丙酮水洗脱，再将洗脱液减压回收丙酮，然后用2倍体积量的乙酸乙酯萃取3次；最后将萃取液常压浓缩、喷雾干燥，制得36g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为83％。
实施例4将1Kg的水杨梅根药材粉碎成粗粉，加入10L的70％乙醇，保持在70℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入5L的70％乙醇，保持在70℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第二次浸出液；合并两次浸出液。
将浸出液减压浓缩至热比重1.05，加入甲壳素3g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用5％盐酸将提取液的pH值调至2，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂HPD300，然后用50％乙醇水洗脱，再将洗脱液减压回收乙醇，然后用3倍体积量的乙酸乙酯萃取2次；最后将萃取液减压浓缩、冷冻干燥，制得38g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为93％。
实施例5将1Kg的水杨梅根药材粉碎成粗粉，加入8L的50％乙醇，保持在80℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入4L的50％乙醇，保持在80℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第二次浸出液；再在滤渣中加入4L的50％乙醇，保持在80℃温度下浸提60分钟，然后过滤得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
将浸出液常压浓缩至热比重1.03，加入明胶8g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用20％醋酸将提取液的pH值调至4，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂HPD600，然后用70％丙酮水洗脱，再将洗脱液减压回收丙酮，然后用2倍体积量的乙酸乙酯萃取2次；最后将萃取液常压浓缩、喷雾干燥，制得36g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为96％。
实施例6将1Kg的水杨梅根药材，加入9L的30％乙醇，保持在80℃温度下浸提120分钟，然后过滤得到第一次浸出液；再在滤渣中加入5L的30％乙醇，保持在80℃温度下浸提90分钟，然后过滤得到第二次浸出液；合并两次浸出液。
在浸出液中加入ZTC絮凝剂5g，搅拌后离心去沉淀，得到提取液；用10％盐酸将提取液的pH值调至3，然后静置、离心去沉淀，取得上清液；将上清液过大孔树脂D101，然后用70％乙醇水洗脱，再将洗脱液减压回收乙醇，然后用1倍体积量的乙酸乙酯萃取3次；最后将萃取液常压浓缩、真空干燥，制得32g的水杨梅根抗肿瘤提取物。经测定其多酚含量为90％。
实施例7水杨梅根抗肿瘤提取物的细胞实验方法将肿瘤细胞(2×106/ml)，放入无菌的96孔培养平板，每孔加肿瘤细胞悬液50μl，加含15％小牛血清的1640培养液50μl，加实施例1～3制备的水杨梅根抗肿瘤提取物的水溶液10μl，每组3孔，孔内加等量的生理盐水振荡混匀，然后放入5％的CO2培养箱(37℃)培养24h，加入四唑盐(MTT)磷酸缓冲液，每孔10μl(每ml含MTT5mg)继续培养4h，然后加二甲砜100ml，终止反应，用酶胶免疫检测仪，分别于波长570nm，630nm处测定光密度OD值，计算结果。
计算公式 结果在胃癌RF细胞株和直肠癌LS174T细胞株肿瘤细胞培养实验中发现，水杨梅根抗肿瘤提取物对两种肿瘤的抑制率显著高于其药材的水提取物(未经过沉淀、调酸、大孔树脂吸附和萃取的水提浓缩液)，且呈剂量递增。结果见附表1。
白蒺藜提取物浸膏 5～30白僵蚕提取物浸膏 5～30牡丹皮提取物浸膏 5～30白附子提取物浸膏 5～30五倍子提取物浸膏 5～30本发明的另一目的，是提供了一种化妆品物质，其中含有作为有效成分的中药提取物组合物，该化妆品物质具有抑制黑色素合成，治疗皮肤斑点、雀斑、黄褐斑和色素沉着，预防皮肤老化，保护皮肤和美白皮肤的功能。
本发明的另一目的，是提供一种果蔬保鲜剂，其中作为预防变黑的有效成分的中药提取物组合物，用于水果和蔬菜等食品中。
对本发明的详细说明本发明涉及川芎、当归、白蒺藜、白僵蚕、牡丹皮、白附子和五倍子等多种天然物质的提取物组合物对酪氨酸酶的活性的抑制。为了制备以上各种单一中药提取物浸膏，发明人采用微波辅助提取技术，考察了提取剂选择、液料质量比、提取时间、微波功率等因素对提取效果及提取物对酪氨酸酶的相对抑制率的影响，筛选出了最佳的提取工艺条件，见表1所示。
发明人按最佳提取工艺条件进行了川芎、当归、白蒺藜、白僵蚕、牡丹皮、白附子等多种天然物质的提取，并用活性炭对提取液进行脱色，过滤，滤液用旋转蒸发仪真空浓缩至膏状后，真空干燥，得到各种单一中药的提取物浸膏，如表1所示。
权利要求
1.一种水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)用水或有机溶剂在70～100℃温度下浸提水杨梅根药材，得到浸出液；(2)在浸出液中加入絮凝剂，沉淀去杂，得到提取液；(3)将提取液的pH值调节至2～5，静置，取得上清液；(4)将上清液过大孔树脂，用溶剂洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液回收溶剂后，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；(6)将萃取液浓缩干燥，得到水杨梅根抗肿瘤提取物。
2.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述有机溶剂为30～70％乙醇。
3.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，浸提温度为70～80℃。
4.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述浸提次数为1～3次；每次浸提时间为1～2小时；第一次浸提的水杨梅根与水或有机溶剂的重量比为1∶8～10；第二次和第三次浸提的水杨梅根与水或有机溶剂的重量比为1∶4～5。
5.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述絮凝剂的用量为水杨梅根药材重量的0.1～1％。
6.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(3)中，采用盐酸或醋酸来调节提取液的pH值。
7.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(4)中，所述溶剂为乙醇水或丙酮水。
8.根据权利要求1所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于步骤(5)中，所述乙酸乙酯的用量为洗脱液的1～3倍体积量。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述方法制备的水杨梅根抗肿瘤提取物。
10.根据权利要求9所述的水杨梅根抗肿瘤提取物的应用，其特征在于将水杨梅根抗肿瘤提取物作为活性成分与可接受的药物载体结合制成用于治疗各种肿瘤的口服或注射单方以及复方制剂。
全文摘要
本发明公开了一种水杨梅根抗肿瘤提取物及其制备方法和用途。该水杨梅根抗肿瘤提取物可通过水或有机溶剂在70～100℃温度下浸提、然后絮凝沉淀、调酸、过大孔树脂、回收溶剂、萃取、浓缩干燥制得。该水杨梅根抗肿瘤提取物可作为活性成分与可接受的药物载体制成用于治疗各种肿瘤的口服或注射单方以及复方制剂。本发明浸提效果好，原药材中抗肿瘤有效成分转移率高；工艺简单，沉淀步骤采用了絮凝沉淀法，可避免醇沉法的乙醇回收而增加的工艺步骤；产品纯度高，便于工业化生产。
文档编号A61P35/00GK1679795SQ20051003266
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者叶勇 申请人:华南理工大学