专利名称：一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及体外抗癌药物的筛选，具体地说是一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法。
背景技术：
选择合理抗癌药物筛选模型是制药工业和临床应用所为面临的重要课题。为增加筛选工作的可靠性和预见性，减少筛选结果的假阳性和假阴性，需进一步改进现有的筛选模型和筛选方法。
动物移植性肿瘤(人癌裸鼠模型和人癌小鼠肾包膜下移植模型)是目前药物筛选实验常用的体内模型。即接种适量肿瘤细胞后产生肿瘤，肿瘤呈三维方式生长，肿瘤细胞所处的微环境与人体基本一致，易于客观判断疗效。体外药物筛选多选用相应肿瘤细胞做平板培养，然后加入筛选药物作用不同时间，通过测定细胞毒活性来判断结果，是目前实验室和临床前常用的体外检测方法。其操作简便，快捷，灵敏度较高，实验周期短。
两种筛选方法各有利弊，但未能很好结合。现主要存在的问题是1.体外单层细胞筛选中细胞呈二维生长，与体内肿瘤细胞的实际生存环境和生长状况相差较大，不能真实反映药物体内应用的实际敏感状态；2.动物筛选中裸鼠饲养条件苛刻，价格昂贵，实验周期较长，实验结果常与临床反应不一致；3.近年有报道应用旋转培养或培养容器包被琼脂等物质可得到肿瘤细胞球用以药物筛选，这种模型也达到细胞三维生长的状态，但此模型相对生存时间较短且与药物直接接触。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、有效、操作简便、合理模拟肿瘤细胞生长微环境的体外抗癌药物筛选模型的制备方法。本发明以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备微囊化肿瘤细胞，通过体外培养形成肿瘤细胞球，实现微囊化肿瘤细胞与体内肿瘤类似的三维生长。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法，以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化肿瘤细胞；经过培养，微囊内细胞聚集成球并逐渐增大，形成类似于体内的三维生长方式，即为体外抗癌药物筛选模型，其可用于药物筛选，提高药筛准确性。
所述制备APA微囊化肿瘤细胞的方法为静电液滴发生法，具体步骤如下，①通过大功率微胶囊制备仪，将均匀混合有肿瘤细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；海藻酸钠的w/v浓度为1.5％-1.8％；液滴的粒径为250-600μm可控，分布均匀，且具有良好的单分散性；②将步骤①的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸微胶囊膜；钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L(如浓度在0.05-0.3mol/L的氯化钙溶液)；聚赖氨酸w/v浓度为0.05-0.1％，分子量为2-10万，海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10；反应成膜时间为8-15分钟，膜厚在5-50μm范围内可控；②步骤①的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸微胶囊膜；③用柠檬酸钠溶液将步骤②制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。本发明方法是在全生理条件下制备，其制备过程条件温和pH7.0-7.4；室温；无剪切及振荡；肿瘤细胞存活率＞96％，肿瘤细胞含量150-200cells/个微胶囊，微胶囊粒径可在255-650μm精确可控。
所述步骤①中液滴的尺寸是通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整的，其操作条件为电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#。
所述的肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞以及食道癌细胞等实体瘤细胞。
所述培养在37℃，含5％CO2的空气，饱和湿度条件下培养微囊化肿瘤细胞，培养时间3-10天，培养基的种类(如RPMI-1640；DMEM)根据所选定的肿瘤细胞确定，得到不同大小的50-300μm微囊化肿瘤细胞球。
加入药物作用一定时间后，利用MTT法检测微囊内细胞的活性。
该方法可以实现同时对多种肿瘤、多种药物、不同浓度、不同作用时间的高通量筛选。
将本发明模型进行药物筛选过程时，在加入药物作用一定时间后，利用MTT法检测微囊内细胞的活性，通过检测细胞活性来确定药物的有效性。
本发明具有如下优点1.提高了药物筛选的准确率。本发明通过肿瘤细胞的微囊化培养，实现了肿瘤细胞体外三维生长方式，更好的模拟了在体肿瘤，从而提高了体外抗癌药物筛选的准确率。
2.为肿瘤生物学特性研究提供良好的模型。本发明制备微囊化肿瘤细胞，通过一种体外三维培养方式的建立，使其更好的模拟了在体非血管形成时期实体瘤的生长状态，不但为实验室和临床应用提供一个经济快捷、方便有效的抗癌药物筛选模型，也为肿瘤生物学特性研究提供良好的模型。
3.可合理模拟肿瘤细胞生长微环境。体内肿瘤细胞具有异质性，呈三维立体方式生长，即不同位置的肿瘤细胞其结构和增殖、分化、代谢等生物学特性有差异，所以对药物作用的反映也不相同。微囊化肿瘤细胞在体外经培养后可形成多细胞肿瘤球，研究发现球体内部细胞具有异质性，且具有相关基因的表达。因此，微囊化肿瘤细胞球有望成为药物筛选的合理模型。
图1为微囊化肿瘤细胞球的相差显微镜照片。相差显微镜下观察微囊化肿瘤细胞球，可见微囊化人乳腺癌细胞经培养7天后可形成三维肿瘤球；图2为体外培养微囊化肿瘤细胞球与在体肿瘤比较的结构示意图，可见微囊化肿瘤细胞球在结构上与体内肿瘤组织；图3为本发明一个实施例的相差显微镜照片。可见药物作用微囊化肿瘤细胞球后，其直径缩小且细胞欠饱满，加入MTT反应后蓝紫色结晶明显减少；图4为本发明一个实施例的肿瘤抑制率曲线；可见随作用时间和药物浓度的增加，肿瘤细胞的抑制率增大且微囊化肿瘤细胞球模型的抑制率低于平面培养模型，更接近于体内真实状况；图5为本发明一个实施例的共聚焦显微镜照片；图6为本发明一个实施例的H&E染色和免疫组化染色照片。可见药物作用微囊化肿瘤细胞后，细胞呈凋亡趋势且增殖活性代偿性增强。
具体实施例方式
实施例1
如图1所示微囊化肿瘤细胞球的制备。
具体方法如下1、用静电液滴法在生理条件下制备海藻酸钠-聚赖氨酸微囊化人乳腺癌细胞。海藻酸钠浓度为1.5％(w/v)；聚赖氨酸浓度为0.05％(w/v)；氯化钙浓度在0.05mol/L；海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10；反应成膜时间为15分钟，膜厚为50μm；柠檬酸钠溶液浓度在0.01mol/L；制备过程条件pH7.0；室温；无剪切及振荡；肿瘤细胞存活率96％。电压50V及频率120Hz；泵速5.08ml/h；针头孔径的大小4#，微胶囊粒径为255μm。
2、在37℃，含5％CO2的空气，饱和湿度条件下培养微囊化人乳腺癌细胞，培养时间7天，培养基为RPMI-1640；可得到直径为200μm微囊化肿瘤细胞球，如图1所示，肿瘤细胞在微囊内正常生长，并可长成细胞球。
3、微囊膜为一层半透膜，在结构和功能上也部分模拟了血管壁或肿瘤包膜，如图2。
4为微囊化肿瘤细胞提供营养的培养液与体内血管有类似功能，如图2。
如图3-6所示，以微囊化人乳腺癌细胞球为模型进行药物筛选实验。选用药物为丝裂霉素。
具体实施办法如下1、选取丝裂霉素(MC)为模型药物。微囊化人乳腺癌细胞经MC作用一定时间后，用MTT法检测微囊化肿瘤细胞的活性MTT可通过微囊膜并与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶结合形成蓝紫色甲臜，经二甲基亚砜溶解后，通过测培养液的OD值来评价细胞的活性。
2、如图3所示，微囊化肿瘤细胞加药前(a、c)和加药后(b、d)相差显微镜照片，可见经药物作用后微囊化肿瘤细胞团与对照组相比明显变小，且细胞活性降低(蓝紫色结晶生成减少)；3、10PPC(血浆峰值浓度)MC分别作用细胞球和单层培养细胞24、48和72小时，微囊化细胞球模型和平面培养模型细胞活性抑制率分别为58.3％、67.4％、68.1％和63.48％、90.1％、95.1％，如图4所示以微囊化人乳腺癌细胞球(S)和单层培养细胞(M)为模型的抗肿瘤药物(丝裂霉素)筛选实验，药物对微囊化肿瘤细胞的抑制率低于单层培养细胞；4、药物作用后，微囊化肿瘤细胞大部分以被抑制或死亡，如图5所示，微囊化肿瘤细胞加药前(a)和加药后(b)活死染色，绿色代表活细胞，红色代表死细胞，可见经药物作用后，微囊化肿瘤细胞球体积缩小且活细胞减少，死细胞增加。
5、药物作用后，微囊化肿瘤细胞核浓缩，出现凋亡；且经药物诱导后，细胞增殖活性增加，如图6所示，微囊化肿瘤细胞加药前(a、c)和加药后(b、d)形态学观察；HE染色，可见加药后细胞和浓缩，有凋亡趋势(b)；BrdU染色，可见未加药组有增殖活性细胞集中边缘(c棕色细胞核)，实验组无此现象(d)。
实施例2与实施例一不同之处在于1、用静电液滴法在生理条件下制备海藻酸钠-聚赖氨酸微囊化人肺癌细胞。海藻酸钠浓度为1.6％(w/v)；聚赖氨酸浓度为0.07％(w/v)；氯化钙浓度在0.18mol/L；反应成膜时间为8分钟，膜厚为5μm；柠檬酸钠溶液浓度在0.055mol/L；制备过程条件pH7.2；无剪切及振荡；肿瘤细胞存活率97％。电压60V及频率130Hz；泵速12.2ml/h；针头孔径的大小5#，微胶囊粒径为400μm。
2、人肺癌细胞在微囊内正常生长，培养时间3天，培养基为RPMI-1640；得到直径为50μm微囊化肿瘤细胞球。
其余实施内容同实施例一。
实施例3与实施例一不同之处在于1、用静电液滴法在生理条件下制备海藻酸钠-聚赖氨酸微囊化人膀胱癌细胞。海藻酸钠浓度为1.8％(w/v)；聚赖氨酸浓度为0.1％(w/v)；氯化钙浓度在0.30mol/L；反应成膜时间为12分钟，膜厚为25μm；柠檬酸钠溶液浓度在0.10mol/L；制备过程条件pH7.4；无剪切及振荡；肿瘤细胞存活率98％。电压75V及频率140Hz；泵速15.9ml/h；针头孔径的大小7#，微胶囊粒径为600μm。
2、人膀胱癌细胞在微囊内正常生长，培养时间10天，培养基为DMEM；得到直径为300μm微囊化肿瘤细胞球。
其余实施内容同实施例一。
权利要求
1.一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化肿瘤细胞；经过培养，微囊内细胞聚集成球并逐渐增大，形成类似于体内的三维生长方式，即为体外抗癌药物筛选模型。
2.按照权利要求1所述体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于所述制备APA微囊化肿瘤细胞的方法为静电液滴发生法，具体步骤如下，①通过微胶囊制备仪，将均匀混合有肿瘤细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；海藻酸钠的w/v浓度为1.5％-1.8％；液滴的粒径为250-600μm；②将步骤①的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸微胶囊膜；钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L；聚赖氨酸w/v浓度为0.05-0.1％，海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10；反应成膜时间为8-15分钟，膜厚在5-50μm范围内；③用柠檬酸钠溶液将步骤②制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。
3.按照权利要求2所述体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于步骤①中液滴的尺寸是通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整的，其操作条件为电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#。
4.按照权利要求1或2所述体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于所述肿瘤细胞为实体瘤细胞。
5.按照权利要求4所述体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞和/或食道癌细胞。
6.按照权利要求4所述体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于所述培养在37℃，含5％CO2的空气，饱和湿度条件下培养微囊化肿瘤细胞，培养时间3-10天，培养基的种类根据所选定的肿瘤细胞确定，得到不同大小的50-300μm微囊化肿瘤细胞球。
全文摘要
本发明涉及体外抗癌药物的筛选，具体地说是一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法，以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化肿瘤细胞；经过培养，微囊内细胞聚集成球并逐渐增大，形成类似于体内的三维生长方式，即为体外抗癌药物筛选模型；本发明提高了抗癌药物筛选的准确率，从而可推动肿瘤治疗的发展。
文档编号A61K49/00GK1954887SQ200510047578
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者马小军, 张旭朗, 王为 申请人:中国科学院大连化学物理研究所