专利名称：：抗猴sv40病毒感染灭活疫苗及制备方法
技术领域：
：本发明属于动物疫苗。
背景技术：
：SV40病毒厲于猴空泡病毒40在自然状态下感染恒河壤，感染SV40病毒可引起包括肺炎和肾病等致死性相关疾病，对人类和猴都具有非常大的潜在威胁.对此，国外集中在SV40的致胖瘤机制和抗胂瘤免疫上的研究，通过表达SV40T抗原和构建SV40T的DNA疫苗作为胂瘤疫苗，进行免疫抑制肿癩，特别是去除T基因Rb与和P53的结合位点，提高疫苗安全性，疫苗已进入临床研究。国内研究集中在利用SV40病毒启动子构建真核表达载体等方面.对于猴用SV40灭活疫苗和其他形式的疫苗研究国内外报遒均较少.至今，还没有用于预防SV40感染的疫苗.因此，有必要深入研究SV40免疫学特性及研制疫苗。灭活疫苗具有较强的免疫原性和安全性.上世纪六十年代，人们应用紫外线高溢来进行灭活SV40,应用紫外线照射12h不能完全灭活病毒，应用IOSIC灭活lOmhi，检测证明SV40还残存一小部分毒力(Le，iePN，Reesinkhw，1LucasCJ.I股ctivationof12virussesbyheatingstepsappliedduringma肌fac加reofahepatitisBvaccine[J].JMedVirol，1987,23:297-301)。但目前国内外尚无抗猴SV40瘵染的疫苗及其免疫学报道.为了保护和应用云南省良好的实验用猴，制备MSV40感染的疫苗成为一项紧迫任务。此前，本发明申请人在Vero细胞上培养、增殖SV40株病毒，并在收获病毒后，应用PCR、免疫荧光以及特异性片段进行瀕序比较鉴定SV40病毒。这些工作，建立了病毒在细胞上的培养方法和相应的病毒检拥方法，为灭活疫苗的制备奠定了良好基础(SV40病毒的培养、增殖及鉴定曹增孙强明孙娟等生物技术2005年6月第15巻第3期46)。0-丙内脂广泛应用于多种人和动物疫苗的生产，国内采用0-丙内脂灭活的SARS-CoV灭活疫苗应用于人体实验后尚未见任何副作用。P-丙内脂是一种烷化试剂，能邇过与核酸嘌呤碱中的鸟嘌呤反应破坏核酸的结构，它不直接作用于蛋白，已应用于DNA和RNA病毒的灭活。
发明内容本发明的目的是建立SV40病毒培养、灭活、纯化等步猓，根据灭活病毒的免疫学特性，提供抗猴SV40病毒感染灭活疫苗制备方法.本发明抗猴SV40病毒感染灭活疫苗由以下成分组成(1)收集感染滴度达到0""TCID5o/iiil的SV40病毒经初步纯化后，使用p-丙内脂灭活后与佐剂及缓冲液混匀，SV40病毒和佐剂两者体积比为2:i3:2。(2)与上述成分混均后终浓度0.03^).05mg/ral的Tween-20和2.(M.0mg/ml的甘氨酸，根据P-丙内脂灭活的作用机理，选择P-丙内脂作为SV40病毒的灭活剂.进行病毒灭活的SV糾病毒失去了致病力，但保留有诱导主动免疫的能力。本发明P-丙内脂的灭活疫苗中加入浓度1.0ing/Hi1的适量Al(OH)3作为佐剂，能够非特异性地增强猴体对SV40病毒抗原诱导的免疫应答水平。但由于佐剂表現为免疫增强作用，本发明不限制其它佐剂，包括合成的多核甘酸，淋巴因子等.本发明采用Tween-20和甘氛酸是增加抗体活性的物质，具有中和溶解病毒的作用.同样,作为一种佐剂，它不受列举所限.抗猴SV40病毒感染灭活疫苗的制备方法，其特征在于(1)将致细胞病变作用(CPE)达90%,感染滴度达到10"-"TCIDWiBl的SV40病毒凌进行纯化；(2)用P-丙内脂灭活经初步纯化的SV40病毒，用碗代碟酸钠中止灭活剂；(3)按以上配比，用佐剂吸附已灭活SV40病毒，加缓冲液、混匀后再加入Tween-20和甘氨酸.所述P-丙内脂起始浓度10mmol/L~12mniol/L.而浓度l.Omg/ml的Al(OH)3作为佐剂吸附已灭活SV40病毒.并将SV40灭活疫苗于41C保存，具休实施方式1、纯化(1)SV40病毒在Vero细胞中增值，Vero细胞形成单层后，按3m.o.i接种SV40病毒，吸附悬浮培养3^5d,待达到90"/。CPE时，收毒，放入-20"C,反复冻融4~5次，其间剧烈振荡数次；再合并同一代次SV40。(2)合并病毒后，3000rpm离心，10min收集上清，缓慢加入NaCl,PEG6000,使终浓度为0.5Mg/(W/V)，室温lh,4TC36h，10000rpm25min收集沉淀，溶于由25mMTris、137mMNaCl、5mMKCl、10.7mMNa2PO4,25raMMgCl2.构成的TD溶凌中.冰洛，缓慢加入脱氧胆酸钠和TritonX-IOO,使细胞液最终浓度分别达到0.5%和1.0%,(3)蔗糖溶于pH7.4，0.02位ol/L的Tris溶液中,上层密度为20*睛),下层密度为75%(W/W);再溶于TD溶液，在4"C23000卬m下，离心3.5h.计算感染滴度，至TCTDsoM.8后收集底层组分。(4)离心后的小管取出，呈三个界面，取底层及中层液体.(5)收集液做PCR检测及毒力检测。PCR检测阳性，惑染性表现为致细胞病变(CPE)，证明获得纯化的活病毒，于-20"C保存.2、灭活(1)初步纯化的病毒加入1/5(V/V)的l鹏恥l/LpH7.2的裤酸盐缓冲液，分别用起始浓度llmmol/L的P-丙内脂灭活3d，置2(TC下连续拔拌灭活。(2)向溶液加入相同体积的細mol/L碟代碟酸钠2(TC15迅in,离心45000i卿，2h,弃上清后用生理盐水悬浮。(3)残余活毒检溷将灭活病毒样品接种lml/瓶的Vero细胞中，每15西in摇动一次，lh后加入维持液，37"C培养7天。盲传三代后，取样品做感染滴度测定。CPE结果阴性者为病毒灭活完全.PCR检溯SV40基因为阳性的证明保留病毒抗原.以上过程中经过纯化的SV4O病毒用0-丙内脂灭活，每隔一段时间取样，SV40的感染滴度不断下降，在24~28h病毒被灭活，说明P-丙内脂灭活对SV柳病毒有很强的作用.灭活的病毒经盲传三代，来检測到活病毒存在，表明SV柳感染性已经检测不到。3、SV40灭活病毒的佐剂吸附将灭活的病毒SV40(其病毒全量为4.6"5.2TCroso/m,)按体积比为1.0mg/ml的AI(OH)3:SV4(N3:2混合，补pH7J的2mM磷酸盐缓冲液，混匀后再加入终浓度分别为0.05mg/ml和3.0mg/ml的Tween-20和甘氨酸，室温混匀分装后，4卩保存。4、疫苗的免疫原性检测把BALB/C雌性小鼠分7组每组5只，包括对照组和SV40灭活疫苗组，疫苗蛋白含量分别为1.0、3.0和5.0聘；灭活疫苗加佐剂组疫苗蛋白含董也分别为A1(OH>31.0、3.0和5.0re,实验期间，来见小鼠有异常反应.通过不同剂量的灭活疫苗免疫小鼠后，进行ELISA和中和实验检滩，均可检測到较强的抗-SV40免疫反应。用灭活疫苗免疫的BALB/C錄性小鼠，在20d时小鼠的阳转率为90%,在30d时全部阳转。免疫后抗体最大滴度为1/2560,佐剂组高于不加佐剂组.随着免疫糸i量加大，小鼠免疫应答也逐渐增强.SV40灭活病毒免疫小鼠的结果表明在实验中所选剂量范围内，免疫剂量越大，所诱导小鼠的免疫应答越强，抗体滴度越髙，第二次免疫后，抗体的几何平均滴度明显髙于第一次免疫后的抗体水乎；加入Al(OH)i佐剂组的灭活疫苗效果好于不加佐剂组；邇过纯化的病毒进行SDS-PAGE和Westernblot检湘，表明SV40灭活痏毒诱导小鼠产生的特异抗体能识别SV40200510048627.5说明书第3/3页病毒;、疫苗的安全性检測随机挑选实验小鼠应用特异PCR引物对免疫后小鼠外周血和不同器官进行基因组的检溯，在检测动物中除在血中检滩到一例阳性外，在其它组织和器官中均为阴性，证明在主要器官中尚未发现病毒基因组整合情况.结果如表h表J:不同裙织的PCR检测<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>-6、疫苗的动物免疫效果检溯用SV40灭活疫苗进行猴体免疫.疫苗分为基础免疫(第一次)和加强免疫(第二次)。实验证明基础免疫后所有实验猴均产生抗体转阳，加强免疫后抗体水平明显提髙.提示SV40灭活疫苗能有效诱导猴子产生特异性免疫。结果如表2:表2:猴抗SV40免疫血清抗体效价<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>用SV40灭活疫苗进行小鼠免疫。疫苗分为基础免疫(第一次)和加强免疫(第二次)。实验证明基础免疫后所有实验猴均产生抗体转阳，加强免疫后抗体水平明显提髙.提示SV40灭活疫苗能有效诱导小鼠产生特异性免疫.结果如表:k表3:小鼠抗SV40免疾血清中和抗体滴度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>权利要求1、抗猴SV40病毒感染灭活疫苗，其特征在于灭活疫苗由以下成分组成(1)β-丙内脂灭活的SV40病毒与佐剂，两者体积比为2∶1，(2)与上述成分混匀后终浓度0.03～0.05mg/ml的Tween-20和2.0～4.0mg/ml的甘氨酸。2、根据权利要求1所述的抗猴SV40病毒感染灭活疫苗，其特征在于佐荆是浓度l.Omg/ml的Al(OH)3,3、抗猴SV40病毒感染灭活疫苗的制备方法，其特征在于(1)将达到90%CPE感染滴度达到lO4"2TCIDso/ml的SV40病毒液进行纯化，U)用p-丙内脂灭活SV40病毒，硫代琉酸钠中止，3)按权利要求l提出的配比，用佐剂吸附已灭活SV40病毒，加缓冲液、混均后再加入Tween-20和廿氨酸。4、根据权利要求3所述的抗猴SV40病毒感染灭活疫苗的制备方法，其特征在于p-丙内脂起始浓度10mnK)l/L~12mmol/L。5、根据权利要求3所述的抗猴SV40病毒感染灭活疫苗的制备方法，其特征在于浓度l.Omg/ml的AI(OH)3作为佐剂吸附已灭活SV40病毒.6、根据权利要求3所述的抗猴SV40病毒感染灭活疫苗的制备方法，其特征在于SV40灭活疫苗于4x:保存。全文摘要抗猴SV40病毒感染灭活疫苗及制备方法，属于动物疫苗。本发明目的是对SV40病毒进行增殖、灭活、纯化，并制备抗猴SV40病毒感染灭活疫苗。本发明疫苗为β-丙内脂灭活的SV40病毒及佐剂，两者体积比为2∶1～3∶2，缓冲液，与上述成分混均后终浓度为0.03～0.05mg/ml的Tween-20和2.0～4.0mg/ml的甘氨酸，其中，病毒含量为10<sup>4.6-5.2</sup>TCID<sub>50</sub>/ml。疫苗的制备方法将达到90％CPE的SV40病毒液纯化收集病毒；用β-丙内脂灭活SV40病毒并中止；用佐剂吸附已灭活SV40病毒。本发明诱导小鼠产生的特异抗体能识别SV40病毒，并具有安全性。本发明免疫猴可产生特异性中和抗体，产生的特异性中和抗体在体外实验中可使SV40病毒失去对细胞培养物的感染性。提示灭活疫苗可能具有天然抗感染作用。文档编号A61P31/00GK101099862SQ20051004862公开日2008年1月9日申请日期2005年11月15日优先权日2005年11月15日发明者和占龙,唐永明,孙强明,孙茂盛,孙雯佳,张光明,增曹,李鸿钧,蒋鸿超,谢天宏申请人:中国医学科学院医学生物学研究所