专利名称：一种新的杆状细菌及分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型微生物及其应用，尤其涉及一种从人的肿瘤细胞系K562细胞中分离培养得到的新菌种。
背景技术：
K562细胞系来源于一个53岁的慢粒白血病患者的白血病细胞，由Lozzio CB和Lozzio BB在1975年(Blood.45(3)321-34，1975)建系。该细胞为费城染色体阳性，是一个在世界范围内被广泛使用的白血病细胞系。
目前，未见报道有关在人的K562细胞中提取和分离到细菌；我们从该细胞系中分离到一种细菌，该细菌与人类细胞有非常良好的共生关系，这也是过去没有任何报道的。这表明该菌是人类从自然中分离的新菌种。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的细菌，命名为Leukemibacteriumzucineum，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 205004，保藏日期为2005年1月7日。
菌种来源所述的杆状细菌Leukemibacterium zucineum，生活在人的肿瘤细胞系K562细胞中，分离出Leukemibacterium zucineum的方法是将人的肿瘤细胞系K562细胞(由浙江大学肿瘤研究所提供)培养在RPMI-1640完全培养液中，培养温度为37℃，加入烟叶的甲醇提取物，培养2-7天后，K562细胞内的细菌(Leukemibacterium zucineum)生长，获得生长的细菌Leukemibacterium zucineum。可再将获得细菌Leukemibacterium zucineum用普通的细菌培养液扩增，培养液可为普通的Lb，营养肉汤，固体培养基可为哥伦比亚血琼脂平板，MacConkey琼脂平板，巧克力平板，中国蓝平板，MH琼脂平板。再将所述细菌Leukemibacterium zucineum接种于羊血平板上使其长成集落。
Leukemibacterium zucineum的生长特性Leukemibacterium zucineum为非发酵菌，生长缓慢，初代培养35℃48小时以后长出细小、点状、圆形、凸起、灰白色的菌落，不溶血，72-96小时以后菌落长到直径2-3mm，表面干燥并联成一片，呈皱折状，整个菌落能推动，在液体培养基内，该细菌在液体表面生长，形成一层扩散的、灰白色的菌膜。能在麦康凯平板(MacConkey Agar)生长，但在SS平板上不能生长。以37℃生长最好，在人的细胞内可以生存。
Leukemibacterium zucineum的形态为革兰氏阴性、短小的杆菌。长时间放置后再行涂片，细菌形态变得不规则，短小的和细长的杆菌均存在。在脑心浸液液体培养基中，细菌革兰染色呈链状。直径为0.5-1.0um，长为1.5-3um。鞭毛染色为单鞭毛，鞭毛位于菌体的一端。在电子显微镜下细菌的形态如短杆状。
Leukemibacterium zucineum的详细生化特性参见表2。
SEQ ID NO 1为Leukemibacterium zucineum的16S rRNA核苷酸序列5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAGAGCGAACGCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTCGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGATACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCGTGCTAGTTGTCGGCATGCATGCATGTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCACCTTTTGACATGCCCTGATCGCTGGAGAGATCCAGTTTTCCCTTCGGGGACAGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGGGACCGCCGGTGGTAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGACTACAG
AGGGTTGCGATGCTGCGAAGCGGAGCTAATCCCTAAAAGTCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAGTCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACTCACCGCCCGTCGCACCATGGGAGTTGGCTTTACCCGAAGGCGGTGCGCTAACCAGCAATGGAGGCAGCCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’本发明的另一个目的是由于提供的这种杆状细菌Leukemibacteriumzucineum在制备治疗肿瘤相关药物中应用，该杆状细菌经实验证明可杀死多种肿瘤细胞，可诱导肿瘤细胞凋亡。
本发明提供的这种杆状细菌也可在制备含有所述杆状细菌Leukemibacterium zucineum的生物制品中应用，生物制品包括试剂、或试剂盒。
还可用所述杆状细菌Leukemibacterium zucineum及其来源的材料，包括其遗传物质，蛋白质，或该菌的其他成分，或用通过培养该菌而获得的成分，用于制备生物制品。
由于Leukemibacterium zucineum可进入真核细胞(如人的细胞)内，并可在细胞内长期生存，因此该菌可作为载体携带任何类型的化合物(如遗传物质、蛋白质、药物、和其他任何类型的化合物)进入细胞。该项用途在生物医学界具有广泛的应用前景。
本发明对提供的新型细菌做了微生物学鉴定，包括形态、生化、生长、16SrRNA序列等都做了详细的实验鉴定，揭示了该菌为一种新的菌，不属于任何一个已知属的细菌，因此将此菌命名为Leukemibacterium(属名)zucineum(种名)。该专利还揭示了Leukemibacterium zucineum具有治疗肿瘤等的用途。
图1Leukemibacterium zucineum革兰氏染色结果，为革兰氏阴性杆菌；图2Leukemibacterium zucineum透射电镜照片，显示为杆菌；图3Leukemibacterium zucineum透射电镜照片，显示为杆菌，而且有成对现象；图4Leukemibacterium zucineum透射电镜照片，显示细胞壁的细微结构；图5Leukemibacterium zucineum扫描电镜照片，为杆菌；图6Leukemibacterium zucineum负染电镜，有一根端鞭毛；图7血平板上Leukemibacterium zucineum菌落，血平板上菌落呈灰色干燥皱褶状；图8K562细胞+0.5％(V/V)烟草叶甲醇提取液8小时后透射电镜照片，细胞内有很多空泡，主要存在于胞质中，空泡中发现L-型细菌，细菌大小，形态各异，一个细胞中可以发现几个到几十个L-型细菌，大部分细胞细胞膜完整；图9K562细胞+0.5％(V/V)烟草叶甲醇提取液24小时后透射电镜照片，细胞全部破碎，大体形态消失，看到几乎全都是L-型细菌，细菌大小，形态各异；图10激光共聚焦显微照片，发现K562细胞内有完整的Leukemibacteriumzucineum(细胞红色，细菌绿色)；图11激光共聚焦显微照片，发现Ku8 12细胞内有完整的Leukemibacteriumzucineum(细胞红色，细菌绿色)；图12-a透射电镜示K562细胞内L-型细菌；图12-b为图12-a方框处放大；图13-a透射电镜示Ku812细胞内L-型细菌；图13-b为图13-a方框处放大；图14Leukemibacterium zucineum的系统发育树；图15Balb/c小白鼠生长曲线图，各个时期对照组和处理组体重没有明显的差别；图16-a对照组心HE染色；图16-b实验组心HE染色；图17-a对照组肝HE染色；图17-b实验组肝HE染色；图18-a对照组脾HE染色；图18-b实验组脾HE染色；图19-a对照组肺HE染色；图19-b实验组肺HE染色；图20-a对照组肾HE染色；图20-b实验组肾HE染色；图21-a对照组脑HE染色；图21-b实验组脑HE染色；图22-a对照组子宫HE染色；图22-b实验组子宫HE染色；
图23-a对照组卵巢HE染色；图23-b实验组卵巢HE染色；图24-a对照组胃HE染色；图24-b实验组胃HE染色；图25-a对照组小肠HE染色；图25-b实验组小肠HE染色；图26-a对照组大肠HE染色；图26-b实验组大肠HE染色；图27-a对照组外周血HE染色；图27-b实验组外周血HE染色；图28-a对照组骨髓HE染色；图28-b实验组骨髓HE染色；图29-a为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对Ho8910细胞系的生长抑制曲线图；图29-b为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对A549细胞系的生长抑制曲线图；图29-c为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对D6细胞系的生长抑制曲线图；图29-d为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对KBV200细胞系的生长抑制曲线图；图29-e为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对Bcap37细胞系的生长抑制曲线图；图29-f为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对H9细胞系的生长抑制曲线图；图29-g为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对Jurkat细胞系的生长抑制曲线图；图29-h为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对HL60细胞系的生长抑制曲线图；图29-i为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对HL60/ADR细胞系的生长抑制曲线图；图29-j为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对LS174T细胞系的生长抑制曲线图；
图29-k为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对SW480细胞系的生长抑制曲线图；图29-l为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对Pancl细胞系的生长抑制曲线图；图29-m为不同浓度的Leukemibacterium zucineum对RKO细胞系的生长抑制曲线图；图29-n为热灭活后的Leukemibacterium zucineum对Jurkat细胞系的抑制曲线图；图29-o为热灭活后的Leukemibacterium zucineum对RKO细胞系的抑制曲线图；图29-p为热灭活后的Leukemibacterium zucineum对Ho8910细胞系的抑制曲线图；图30为Leukemibacterium zucineum的洗脱液对Jurkat细胞系的生长抑制曲线图；图31为Jurkat细胞系以及其经过Leukemibacterium zucineum处理24、48、72小时后，G2/M期细胞含量的变化图；图32为Jurkat细胞系以及其经过Leukemibacterium zucineum处理24、48、72小时后，亚2倍体细胞含量的变化图；图33为Jurkat细胞系经过Leukemibacterium zucineum处理后出现的凋亡小体(原始放大倍数为×400)；图34为不同浓度的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系后产生的DNA ladder电泳图；图35-a为TUNEL试剂盒检测到的Jurkat细胞系培养72小时后，Jurkat细胞凋亡的FCM图；图35-b为TUNEL试剂盒检测到的Jurkat细胞系经过105/mlLeukemibacterium zucineum处理72小时后，Jurkat细胞凋亡的FCM图；图35-c为TUNEL试剂盒检测到的Jurkat细胞系经过106/mlLeukemibacterium zucineum处理72小时后，Jurkat细胞凋亡的FCM图；图35-d为TUNEL试剂盒检测到的Jurkat细胞系经过107/mlLeukemibacterium zucineum处理72小时后，Jurkat细胞凋亡的FCM图；图36为经过Leukemibacterium zucineum处理后ICR小鼠中的EAC腹水体积的变化图；
图37为经过Leukemibacterium zucineum处理后ICR小鼠中的EAC腹水细胞总数的变化图；图38为经过Leukemibacterium zucineum处理后ICR小鼠中的HepA腹水体积的变化图；图39是经过Leukemibacterium zucineum处理后ICR小鼠中的HepA腹水细胞总数的变化图；具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。
实施例1 细菌的分离1.实验材料K562细胞系，烟草叶粉末，甲醇，1640细胞培养基，哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)。
2.实验方法制备烟草叶甲醇提取液20克烟草叶粉末浸泡在100ml 100％的甲醇中，暗室放置7天，12000rpm/min离心20分钟，上清为实验所用烟草叶甲醇提取液。
K562细胞接种于96孔板，当底面细胞覆盖超过60％时，加烟草叶甲醇提取液，使其终浓度为0.5％-1％(V/V)，37℃5％CO2继续培养24-96小时，直至96孔板中有细菌生长。取上述96孔板内细菌悬液接种于哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)，37℃，5％CO2培养48-72小时，挑菌落鉴定。
各种对照确定细菌的来源分五组1.K562细胞+培养基+0.5％-1％(V/V)烟草叶甲醇提取物2.K562细胞+培养基+0.5％-1％(V/V)甲醇3.培养基+0.5％-1％(V/V)甲醇4.培养基+0.5％-1％(V/V)烟草叶甲醇提取物5.K562细胞+培养基.
各组37℃5％CO2培养24-96小时。
3.实验结果接种于96孔板的K562细胞，加入0.5-1％的烟草叶甲醇提取物后，2-14天后有细菌生长，菌悬液接种于哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)，37℃，5％CO2培养48-72小时，有菌落生长。在对照确定细菌来源的实验中，只有第一组才有细菌生长，其他组没有细菌生长(表1)，说明这个细菌是来自于K562细胞内部的，我们把它命名为Leukemibacterium zucineum。
表1确定Leukemibacterium zucineum来源表
该实验证明了烟草提取物是刺激细胞内Leukemibacterium zucineum生长的必需的因子，若没有烟草提取物，就不能使K562细胞中的Leukemibacteriumzucineum生长，也不能分离到Leukemibacterium zucineum，因此，该实验提供了分离Leukemibacterium zucineum的方法。
实施例2 Leukemibacterium zucineum的形态学鉴定1.实验材料哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)，LB液体培养基，革兰氏染色试剂，芽孢染色试剂，OLYMPUS LH50A倒置相差显微镜，JEM-1200透射电子显微镜(JEOL，Tokyo，Japan)，Sterescan 260扫描显微镜(Cambridge，England)，TECNAI10透射电子显微镜(PHILIPS，Holland)。
2.实验方法分离到的细菌作常规革兰氏染色以及芽孢染色；分离到的细菌热敏感实验细菌经过70℃，80℃，90℃，100℃，各10min以及20min加热灭活后，接种到LB中培养。
Leukemibacterium zucineum接种于哥伦比亚琼脂基础血平板，37℃5％CO2培养48-72小时，观察菌落特点。
倒置相差显微镜观察LB中Leukemibacterium zucineum的运动状况。
1％乙酸双氧铀溶液负染后，细菌悬液直接滴到铜网上，透射电镜观察细菌鞭毛。
扫描电镜Leukemibacterium zucineum用2.5％戊二醛液固定过夜，然后再冲洗3次，1.5％锇酸液后固定3h，常规冲洗、脱水、置换，CO2临界点干燥、离子溅射镀金膜，Sterescan 260型扫描电子显微镜观察。
透射电镜Leukemibacterium zucineum先2.5％的戊二醛前固定，再用1％的锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon 812包埋，制超薄切片，硝酸铀及柠檬酸铅染色，TECNAI 10透射电镜观察。
3.实验结果Leukemibacterium zucineum为革兰氏阴性杆菌，长0.5-2um，宽0.3-0.5um，细胞壁具有三层结构，该细菌具有单鞭毛，可以在肉汤液体培养基中活动。见图1-6。
Leukemibacterium zucineum为无芽孢的阴性杆菌，对热敏感，70℃加热10min即可杀死细菌。
Leukemibacterium zucineum在血平板上菌落呈灰色干燥皱褶状。见图7。
实施例3 Leukemibacterium zucineum的生长生化特性1.实验材料营养肉汤，普通LB液体培养基，MacConkey琼脂板，SS选择性平板，巧克力平板，中国蓝平板，MH琼脂平板，等等。
API 20 NE试剂盒，ATB Expression system(ID32 GN)(法国BioMe′rieux，ATB)。
2.实验方法分离到的细菌用API 20NE和ATB ID32 GN以及常规手工方法鉴定其生长生化特性。API 20NE以及ATB ID32 GN严格按照试剂盒产品说明使用，常规手工方法参考(Murray，P.R.，E.J.Baro，M.A.Pfaller，F.C.Tenover，and.R.H.Yolken(ed.).1999.Manual of clinical microbiology，7th ed.American Society forMicrobiology，Washington，D.C.).除氧化酶和触酶试验外，所有生长生化试验在培养72小时后看结果。
3.实验结果生化及培养特性为表2本实验分离到阴性杆菌的生长及生化特性
+阳性；-阴性；(+)弱阳性；O氧化；Leukemibacterium zucineum触酶、氧化酶阳性，硝还试验阳性。它能够同化利用葡萄糖、辛二酸盐、3-羟基丁酸及L-蒲氨酸；尿素酶、水解β-葡萄甙酶和水解蛋白酶弱阳性；它能够迟发氧化葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖和果糖。
Leukemibacterium zucineum吲哚试验，KIA硫化氢产气试验，甲基红试验，V-P试验均为阴性；它不具有精氨酸双水解酶，苯乙酸脱氨酶，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，β-半乳糖苷酶DNA酶，乙酰氨酶；该菌不能同化利用以下物质阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、癸酸、己二酸、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸、鼠李糖、核糖、肌醇、衣康酸、丙二酸盐、蔗糖、乙酸盐、D-乳酸盐、L-丙酸盐、水杨酸、蜜二糖、L-岩藻糖、山李醇、丙酸盐、戊酸盐、组氨酸、5-酮基葡萄糖酸盐、糖原、4-羟基苯甲酸盐、2-酮基葡萄糖酸盐、羟基苯甲酸盐、L-丝氨酸；Leukemibacterium zucineum既不能氧化也不能发酵D-木糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、纤维二糖、鼠李糖、甘露醇、山李醇、水杨酸。
Leukemibacterium zucineum可以在营养肉汤，MacConkey琼脂平板，巧克力平板，中国蓝平板，MH琼脂平板等等上生长。不能在SS平板以及克氏双糖铁琼脂上生长；它可以在含有0％-4％NaCl的LB液体培养基里生长，其中1％NaCl的LB液体培养基里生长最好，不能在含有6％NaCl的LB液体培养基里生长；在4℃温度下，Leukemibacterium zucineum不生长，25至47℃下，它能够生长，以37℃生长最好。
该实验提供了培养Leukemibacterium zucineum的方法。
实施例416S rDNA提取测序1.实验材料细菌基因组DNA提取试剂盒(维特洁，杭州)，16S通用引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(上游)5’-ACGGNTACCTTGTTACGACTT-3’(下游)N表示A，T，C，G中任何一种。
PCR反应常用试剂盒，ABI Prism 377 DNA测序仪，pGEM-T-Easy载体，测序引物5’-CCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(上游)5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’(下游)5’-GCCTTCGATACTGGACATCTTGA-3’(上游)5’-AATTAAACCACATGCTCC ACCG-3’(下游)2.实验方法用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，16S通用引物进行PCR扩增，PCR产物克隆至pGEM-T-Easy载体，转化感受态细胞，经过平板筛选后，LB扩增转化成功的细菌，提取质粒后测序，由于被测片断＞1500bp，在内部设计一对引物以完成整个片断的测序。测序结果在Genebank/EMBL/DDBJ数据库中比对。
3.实验结果16S rDNA测序结果在NCBI/EMBL/DDBJ中，和已知细菌的16S rDNA比对后发现Leukemibacterium zucineum细菌为一新的菌种。Leukemibacteriumzucineum 16S rDNA全序列为
AGAGTTTGATCCTGGCTAGAGCGAACGCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTCGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGATACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCGTGCTAGTTGTCGGCATGCATGCATGTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCACCTTTTGACATGCCCTGATCGCTGGAGAGATCCAGTTTTCCCTTCGGGGACAGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGGGACCGCCGGTGGTAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGACTACAGAGGGTTGCGATGCTGCGAAGCGGAGCTAATCCCTAAAAGTCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAGTCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACTCACCGCCCGTCGCACCATGGGAGTTGGCTTTACCCGAAGGCGGTGCGCTAACCAGCAATGGAGGCAGCCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGT4.结论在Genebank/EMBL/DDBJ数据库中未检索到Leukemibacterium zucineum16S rDNA的序列，因此可认为Leukemibacterium zucineum的16S rDNA为一个新菌种的16S rDNA。
实施例5Leukemibacterium zucineum基因组DNA G+C含量的测定1.实验材料细菌基因组提取试剂盒(维特洁，杭州)，70％高氯酸，C18反相柱(AtlantisTMdC18)大肠杆菌，A，C，G碱基标准品。HEWLETT Series 1100 HPLC system。
2.实验方法严格按照细菌基因组提取试剂盒的说明，提取Leukemibacteriumzucineum以及大肠杆菌的基因组DNA，并且对所提取的DNA进行纯度鉴定。高纯度的基因组DNA冰冻干燥后，用高氯酸在沸水浴中水解一小时，水解产物用水溶解后13000rpm离心20分钟，上清即为HPLC上柱样品。用A，C，G配置标准品溶液。
标准品上样重复8次，得到A，C，G的保留时间和单位峰面积所相当的碱基摩尔数(用系数k表示)k＝标准品的摩尔浓度/标准品的峰积分面积重复制备样品3次，每次样品重复上样5次，求得平均峰面积。峰面积乘以对应的系数k出A，C，G的mol量。用公式G+C＝(G+C)/(G+C+2A)求得Leukemibacterium zucineum的细菌基因组GC含量。
3.实验结果大肠杆菌的G+C含量是51.4％。
Leukemiabacterium zucineum的G+C含量是71.1％。
4.结论大肠杆菌的G+C含量是51.4％，和国外文献报道很接近(国外文献报道是(51％左右)，所以这个方法测定的Leukemibacterium zucineum的G+C含量是正确的，为71.1％，说明Leukemibacterium zucineum是一个高GC含量的新型细菌。
实施例6 细胞内寄生特性1.实验材料K562、Ku812、HL60细胞系，大白兔，ImmunoPure(Protein A)IgGPurification Kit(PIERCE Biotechnology，Rockford，USA)。TritonX-100，FITC标记的羊抗兔二抗(Santa Cruz，USA)，罗丹明标记的phallotoxins(MolecularProbes，USA)，ZEISS LSM510激光共聚焦显微镜，JEM-1200透射电子显微镜(JEOL，Tokyo，Japan)。
2.实验方法Leukemibacterium zucineum沸水灭活30分钟，经兔子耳缘静脉注射1×1010。两周后，同样方法同样用量加强一次，取兔子血清，用凝聚反应测定多克隆抗体效价，当效价高的时候，从兔子心脏取血，收集血清后，严格按照ImmunoPure(Protein A)IgG Purification Kit试剂盒说明纯化兔抗Leukemibacterium zucineum多克隆抗体。
K562细胞+0.5％-1％(V/V)烟草叶甲醇提取物8小时，及24小时后，收集细胞，做常规透射电镜。
K562细胞、Ku812细胞、HL60细胞和Leukemibacterium zucineum 1∶10混合，37℃，5％CO2培养4h收细胞，作细胞荧光免疫组化。步骤如下感染Leukemibacterium zucineum后的细胞甩到涂有多聚赖胺酸的载玻片上。
室温下，3.7％多聚甲醛固定10分钟。
固定后细胞用0.2％TritonX-100(溶解在pH7.2，0.1M PBS中)处理3-5分钟。50mM TBS，pH 7.2洗细胞。
加兔抗Leukemibacterium zucineum多克隆抗体，室温湿盒孵育2小时。TBS洗掉未结合的一抗。
加FITC标记的羊抗兔二抗，室温下，暗湿盒内结合半小时，TBS洗去未结合二抗。
罗丹明标记的phallotoxins染细胞，洗片。
甘油缓冲液封片，ZEISS LSM510激光共聚焦显微镜下观察拍照。
K562细胞、Ku812细胞、HL60细胞和Leukemibacterium zucineum 1∶10混合，37℃，5％CO2培养传代30天后收集细胞，作细胞荧光免疫组化以及常规细胞透射电镜。
3.实验结果收集到的效价比较高的兔子血清经过ImmunoPure(Protein A)IgGPurification Kit纯化，得到兔抗Leukemibacterium zucineum多克隆抗体。
K562细胞+0.5％-1％(V/V)烟草叶甲醇提取物8小时，收集细胞做常规透射电镜发现，细胞内有很多空泡，主要存在于胞质中，空泡中发现L-型细菌，细菌大小，形态各异，一个细胞中可以发现几个到几十个L-型细菌(图8)。大部分细胞细胞膜完整。
K562细胞+0.5％-1％(V/V)烟草叶甲醇提取物24小时，收集细胞做常规透射电镜发现，细胞全部破碎，大体形态消失，看到几乎全都是L-型细菌，细菌大小，形态各异(图9)。
Ku812细胞、HL60细胞和Leukemibacterium zucineum 1∶10混合，37℃5％CO2培养4h收细胞，作细胞荧光免疫组化，在ZEISS LSM510激光共聚焦显微镜下可观察到细胞内有Leukemibacterium zucineum。(图10-11)Ku812细胞、HL60细胞和Leukemibacterium zucineum 1∶10混合，37℃5％CO2培养传代30天后收集细胞，透射电镜发现细胞胞内有L-型细菌，但是找不到胞壁完整的细菌。(图12-a，图12-b，图13-a，图13-b)。
这个实验说明Leukemibacterium zucineum在细胞内为L-型的细菌。
L-型Leukemibacterium zucineum可以和K562、Ku812、HL60等细胞共生，胞内寄生时为L-型，在细胞内一般不大量扩增，细胞内保持一个低感染率。
烟草叶甲醇提取物可以刺激胞内L-型Leukemibacterium zucineum的扩增，直至细菌扩增过量导致细胞破裂死亡，最初24小时从细胞内扩增的细菌极大部分都是L-型。在细菌培养基上扩增后恢复至胞壁完整型细菌。
该实验证明Leukemibacterium zucineum可进入真核细胞，并在细胞内长期生存，因此该菌可作为载体携带任何类型的化合物(如遗传物质、蛋白质、药物、和其他任何类型的化合物)进入细胞。该项用途在生物医学界具有广泛的应用前景。该实验还提供了Leukemibacterium zucineum与真核细胞寄生关系的研究模型。该实验还提供了检测Leukemibacterium zucineum的方法。
实施例7 细菌分类1.实验材料MEGA2.1软件包。
2.实验方法根据Neighbor-Joining方法和Kimura双参数矫正模型建立系统发育树，通过1000次取样计算其Bootstrap值，选用Rhizobium mongolense作为外种群。
3.实验结果Bootstrap值都标明在图14上，图示标尺表示每一百个核苷酸中有一个核苷酸置换。综合本研究菌的形态特征，生长生化特性，在细胞内寄生的特性，16S同源性分析，我们把这个细菌分类到Alphaproteobacteria目，Caulobacteraceae科，一个新的属，新的，并且命名为Leukemibacteriumzucineum，表示这是个能在细胞内寄生的杆菌，在浙江大学肿瘤研究所被发现和鉴定。
实施例8 动物毒性实验1.实验材料
雌性6周龄Balb/c小白鼠，Balb/c裸鼠，HE染色试剂。
2.实验方法实验动物分为四组，两个实验组10只balb/c小白鼠，10只balb/c裸鼠，两个对照10只balb/c小白鼠，10只balb/c裸鼠。
LB新鲜培养的Leukemibacterium zucineum，用生理盐水洗三遍后，再用生理盐水重悬调节细菌浓度至1×1010cfu/ml。
实验组每隔一周经尾静脉注射100ul细菌悬液，重复5次。对照组注射同剂量的生理盐水，观察10个月。
3.实验结果10个月内，对照组和实验组没有死亡，没有任何疾病症状，体重和对照组没有统计学意义的差别(图15)。主要组织器官心(图16-a，图16-b)、肝(图17-a，图17-b)、脾(图18-a，图18-b)、肺(图19-a，图19-b)、肾(图20-a，图20-b)、脑(图21-a，图21-b)、子宫(图22-a，图22-b)、卵巢(图23-a，图23-b)、胃(图24-a，图24-b)、小肠(图25-a，图25-b)、大肠(图26-a，图26-b)、外周血(图27-a，图27-b)、骨髓(图28-a，图28-b)经HE染色后，发现对照组和处理组没有差异，都显示正常细胞组织结构。说明Leukemibacterium zucineum对老鼠没有毒性。
实施例9 细菌的耐药性实验1.实验材料哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)，Escherichia coli(ATCC 25922)以及Staphylococcus aureus(ATCC 29213)药物质控菌株。药物头孢吡肟；头孢唑林；头孢拉啶；头孢哌酮；头孢他啶；头孢噻肟；头孢美唑；头孢呋辛；安曲南；哌拉西林；苯唑西林；阿米卡星；左氧氟沙星；环丙沙星；萘替米星；替卡西林/克拉维酸；哌拉西林/三唑巴坦；舒普深；亚胺培南；美罗培南；万古霉素。
2.实验方法参照NCCLS微量肉汤稀释法(National Committee for Clinical LaboratoryStandards.(2003).Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria That Grow Aerobically.Approved Standard M7-A6，6th ed.NCCLS，Wayne，Pa.)，每个板接种细菌浓度1×105cfu/ml，35℃培养72-96小时。
3.实验结果
表3Leukemibacterium zucineum药敏结果 药敏实验说明Leukemibacterium zucineum对很多药物的MIC值比较高，包括头孢唑林，头孢拉啶，头孢噻肟，头孢美唑，头孢呋辛，安曲南，苯唑西林，阿米卡星，萘替米星。该项结果也说明该细菌可用于药物筛选。
实施例10 Leukemibacterium zucineum抑制肿瘤细胞生长1.实验方法细菌培养条件将Leukemibacterium zucineum菌培养在含有1％(重量/体积)酵母提取物的LB培养液中，放置于37℃，5％CO2的环境中静置培养两天，用PBS洗涤一次去除LB溶液，磷酸缓冲液(PBS)重悬。Leukemibacterium zucineum浓度的测定，按照0.5麦氏单位的细菌浓度为108/ml。PBS调整Leukemibacteriumzucineum浓度为109/ml备用。
细胞的培养人卵巢癌细胞株Ho8910、人肺癌细胞株A549和D6、人乳腺癌细胞株Bcap37、人T淋巴瘤细胞株H9和Jurkat、人早幼粒细胞白血病细胞株HL60和HL60/ADR、人结肠癌细胞株LS174T、SW480和RKO，人胰腺癌细胞株Pancl均来源于美国ATCC(AmericanTyping Culture Collection)公司。人口腔上皮癌细胞株KBV200购自中国医学科学院血液病研究所。各种悬浮细胞系培养在96孔板中，每孔含2×104个细胞。将上述调整好浓度的Leukemibacterium zucineum悬液加入96孔板中，使Leukemibacterium zucineum的处理浓度为分别为0，105，106，5×106，107/ml，每种浓度设置三个复孔。而各种贴壁细胞系，培养在96孔板中，每孔含0.8×104个细胞，细胞贴壁过夜后，分别加入0，105，106，5×106，107/ml浓度的Leukemibacterium zucineum，每种浓度设置三个复孔。
选取人T淋巴瘤细胞株Jurkat、人结肠癌细胞株RKO、人卵巢癌细胞株Ho8910三个细胞系用热灭活的Leukemibacterium zucineum进行细胞抑制实验。细胞系的培养方法同上。取上述调整好浓度的Leukemibacterium zucineum悬液置沸水中煮沸20分钟杀死细菌，将该灭活后的Leukemibacterium zucineum溶液加入96孔板中，使灭活Leukemibacterium zucineum的处理浓度相当于活菌浓度的0，105，106，107/ml，每种浓度设置三个复孔。
以上细胞均培养在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO，美国)中。将上述细胞置于37℃，5％CO2细胞孵箱中分别继续培养72小时。取出处理好的细胞，用流式细胞仪计数每孔中的细胞数目。实验重复三次。
2.实验结果如图29(a-m)所示，Ho8910、A549、D6、KBV200、Bcap37、H9、Jurkat、HL60、HL60/ADR、LS174T、SW480、Pancl、RKO细胞系对各种浓度的Leukemibacterium zucineum表现不同程度的生长抑制现象，而且其抑制率与Leukemibacterium zucineum浓度呈正相关性。当Leukemibacterium zucineum的浓度为107/ml时，Leukemibacterium zucineum对大部分细胞系的抑制率达到80％以上。
图29(n-p)中所示为热灭活后的Leukemibacterium zucineum对Jurkat、RKO、Ho8910细胞系的抑制率。实验结果显示，热灭活后的Leukemibacteriumzucineum与活体Leukemibacterium zucineum对Jurkat、RKO、Ho8910三个细胞系的生长抑制能力相当。
3.结论活的和热灭活的Leukemibacterium zucineum均可有效抑制各种人肿瘤细胞生长。
实施例11 Leukemibacterium zucineum的分泌物对Jurkat细胞系的生长抑制1.实验方法取Leukemibacterium zucineum细菌悬液涂板，370C、5％CO2环境中培养两天，用适量的PBS溶液收集平板上的Leukemibacterium zucineum，使Leukemibacterium zucineum悬液的浓度为1011/ml。6000rpm，5min离心后收集上清液，并用0.22μm孔径的无菌滤器过滤，取部分此上清液沸水中煮沸20分钟，-20℃保存备用。
Jurkat细胞培养在96孔板中，每孔含1×104个细胞。分别用上述两种处理的Leukemibacterium zucineum洗脱液处理Jurkat细胞系。其处理浓度分别相当于2、4、8、16、32×108/ml的Leukemibacterium zucineum中洗脱所得到的溶液。37℃、5％CO2细胞孵箱中共培养72小时。MTT法检测570nm的OD值，MTT为SIGMA(Saint Louis，Missouri，美国)公司产品。
2.实验结果图30显示，Leukemibacterium zucineum的洗脱液对Jurkat细胞系的生长具有一定的生长抑制作用，而且呈浓度依赖相关性，其抑制率可以达到64.98±4.95％。同时从30中看出，经过沸水加热煮沸20分钟后的Leukemibacteriumzucineum洗脱液对Jurkat细胞系的生长抑制能力与未灭活的相同。
3.结论热灭活和未灭活的Leukemibacterium zucineum洗脱液对Jurkat细胞系的生长有强的抑制效应。
实施例12 Leukemibacterium zucineum对Jurkat细胞系细胞周期的影响1.实验方法Jurkat细胞培养在6孔板中，每孔含4×105个细胞。将上述调整好浓度的Leukemibacterium zucineum悬液加入6孔板中，使Leukemibacterium zucineum的处理浓度为分别为0，105，106，107/ml。将细胞置于37℃，5％CO2细胞孵箱中分别继续培养24、48、72小时。离心收集细胞，按碘化丙啶(propidium，PI)试剂盒(Becton-Dickinson，San Jose，CA，美国)说明书对细胞做PI染色，用流式细胞仪FACScan(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)分析Jurkat细胞的周期，用CELLQuest软件对数据进行分析处理。
2.实验结果在该实验中，从图31的柱状图中可以看出，Jurkat细胞系在培养不同时间段后，细胞周期变化非常少，细胞的各个周期比例相当稳定。而用107/ml的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞不同时间后，其G2/M期发生明显的变化，尤其是处理24小时后Jurkat细胞的G2/M期细胞含量从22.01±2.34％增加到43.48±5.84％。延长处理时间，G2/M期细胞的百分比下降，同时亚二倍体细胞增加(如图32)。在Leukemibacterium zucineum处理72小时，亚2倍体细胞增加到35.82±4.31％。说明Leukemibacterium zucineum可导致肿瘤细胞在细胞周期的G2/M期阻滞，阻滞的细胞再变为亚2倍体细胞而死亡(见表4，图31和图32)。
表4107/ml Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系不同时间后，细胞周期的变化。
3.结论Leukemibacterium zucineum可引起肿瘤细胞的细胞周期发生阻滞而杀死肿瘤细胞。
实施例13 Leukemibacterium zucineum诱导肿瘤细胞凋亡1.实验方法瑞—吉姆萨染色检测Jurkat细胞凋亡形态瑞—吉姆萨染液为珠海贝索生物技术有限公司的产品。Jurkat细胞系经过107/ml Leukemibacteriumzucineum处理72小时后，收集细胞，1200rpm×5min离心甩片，甲醇固定细胞。根据贝索公司的瑞—吉姆萨染液的说明书对Jurkat细胞染色，显微镜下观察。
DNA梯带的检测2×106个Jurkat T细胞与不同浓度的Leukemibacterium zucineum混合培养24、48、72小时后，收集细胞，用200μl细胞裂解液(10mM Tris-HCl[pH 7.6]，10mM EDTA，50mM NaCl，1.25％SDS)充分悬浮细胞，加入蛋白酶K(10μg/ml)(Sigma公司，Saint Louis，Missouri，美国)混匀，56℃水浴1小时，加入NaCl溶液使其浓度达到5M，充分混匀后15,000g离心，上清液中加入两倍体积的无水酒精，混匀后离心，用50μl双蒸水溶解DNA沉淀。DNA溶液进行1％的琼脂糖胶分析。
TUNEL(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，原位末端凋亡法)分析Jurkat细胞的凋亡细胞凋亡试剂盒(APO-BRDU a Flow cytomety Kit forApoptosis)为Sigma(Saint Louis，Missour，美国)公司产品。2×106的Jurkat细胞经过不同浓度的Leukemibacterium zucineum(105、106、107/ml)处理72小时后，收集细胞，根据TUNUL试剂盒的操作说明分析细胞的调亡率。
2.实验结果如图33所示，Jurkat细胞系经过107/ml Leukemibacterium zucineum处理72小时后，Jurkat细胞出现凋亡小体。
DNA梯带的出现是细胞凋亡的标志。图34中显示，随着Leukemibacteriumzucineum浓度的增加，Jurkat细胞系的DNA ladder出现递增趋势，当Leukemibacterium zucineum浓度为106/ml时就能检测到明显的DNA ladder，Leukemibacterium zucineum浓度为107/ml时小片断DNA的量明显增加。图34代表的是，不同浓度的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞72小时后出现的DNA ladder。在该图中，M代表DNA Marker，1代表阴性对照，2代表105/ml Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系72小时、3代表106/mlLeukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系72小时，4代表107/mlLeukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系72小时。
不同浓度的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞72小时后，通过TUNEL试剂盒检测到的细胞凋亡率见表1，从表5中可以看出，Jurkat细胞的凋亡率随着Leukemibacterium zucineum浓度的增高而明显增加，从105/mlLeukemibacterium zucineum处理的9.52±1.29％增加到了107/mlLeukemibacterium zucineum处理的88.38±5.04％。
表5TUNEL试剂盒检测到的不同浓度Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞系后的凋亡率。
图35显示出Jurkat细胞系经过不同浓度的Leukemibacterium zucineum处理72小时后，TUNEL试剂盒处理，FCM分析得出的细胞凋亡率。图35-a为阴性对照组的Jurkat细胞，图35-b代表105/ml的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞72小时的凋亡图，图35-c代表106/ml的Leukemibacteriumzucineum处理Jurkat细胞72小时的凋亡图，图35-d代表107/ml的Leukemibacterium zucineum处理Jurkat细胞72小时的凋亡图。
2.结论Leukemibacterium zucineum可以引起Jurkat细胞的凋亡。因此Leukemibacterium zucineum抑制肿瘤细胞是通过诱导肿瘤细胞的凋亡。
实施例14 Leukemibacterium zucineum在体内抑制肿瘤的生长1.实验方法取18-22g的ICR雌性小鼠(浙江省医学科学院)。每组处理的小鼠数量为7只。Leukemibacterium zucineum对EAC腹水抑制实验共分为4组对照组，每次注射108(记为T1组)、109组(记为T2组)、1010组(记为T3组)个Leukemibacterium zucineum细菌组。每只ICR小鼠接种4×106细胞数目的EAC(艾氏腹水瘤)细胞，接种24小时后，处理组每只小鼠注射Leukemibacterium zucineum悬液，对照组注射生理盐水。此后，每隔一天注射Leukemibacterium zucineum一次。腹水接种后12天，脱颈处死全部小鼠，取出小鼠中的全部腹水，计数其腹水体积以及EAC腹水细胞数。
取18-22g的ICR雌性小鼠。每组处理的小鼠数量为7只。每只ICR小鼠接种4×106细胞数目的小鼠肝癌细胞HepA腹水型细胞，接种24小时后，处理组每只小鼠注射1ml 1010/ml的Leukemibacterium zucineum悬液，对照组注射相应量的生理盐水。此后，每个一天注射Leukemibacterium zucineum一次。从腹水接种后12天，全部处死小鼠，取出小鼠中的全部腹水，计数其腹水体积以及HepA腹水细胞数。
2.实验结果图36的结果显示，EAC腹水ICR小鼠经过不同浓度的Leukemibacteriumzucineum处理后，小鼠的腹水体积与对照组有明显的减少。腹水体积从对照组的16.44±2.17ml减少到T1组的10.33±1.44ml、T2组的4.80±1.71和T3组的4.12±1.11ml。
图37的结果显示，经过Leukemibacterium zucineum处理后，EAC腹水细胞数也有明显的减少。细胞数从从对照组的(1505.68±52.38)×106、T1组的(214.89±15.36)×106、T2组的(84.93±36.49)×106、减少到T3组的(75.08±31.92)×106。
在图38中，可以看出经过1010量的Leukemibacterium zucineum处理ICR小鼠11天后，ICR小鼠的HepA腹水体积和腹水细胞数与对照组比都明显的减少。腹水体积从对照组的(16.43±1.92)ml减少到Leukemibacterium zucineum处理组的(11.6±1.15)ml，而HepA腹水细胞数则从对照组的(2056.07±384.47)×106减少到Leukemibacterium zucineum处理组的(1192.63±211.98)×106，两组比较，腹水体积和腹水细胞数均有显著差异，如图39。
3.结论Leukemibacterium zucineum在体内可有效抑制肿瘤的生长，具有显著的抗肿瘤活性。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
<110>浙江大学<120>一种新的杆状细菌及其应用<160>7<210>1<211>20<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>1agagtttgat cctggctcag 20<210>2<211>21<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>2acggntacct tgttacgact t 21<210>3<211>23<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>3cccagggttt tcccagtcac gac 23<210>4<211>22<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>4tcacacagga aacagctatg ac 22<210>5<211>23<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>5gccttcgata ctggacatct tga 23<210>6<211>22<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>6aattaaacca catgctccac cg 22<210>7<211>1443<212>DNA<213>菌种(bacteria)<400>7
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权利要求
1.一种新的杆状细菌，命名为Leukemibacterium zucineum，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 205004。
2.根据权利要求1所述的名为Leukemibacterium zucineum的杆状细菌，其特征是16S rRNA具有与SEQ ID NO 1 99％以上的同源核苷酸序列5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAGAGCGAACGCTGGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGCCCTTCGGGGCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATGTGCCCTTTGGTACGGAACAACACAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCATTGGAGCAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGAAGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGTCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATGTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGACATCTTGATACGGGAGAGGTGAGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCACTGGCCCGTTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCGTGCTAGTTGTCGGCATGCATGCATGTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCACCTTTTGACATGCCCTGATCGCTGGAGAGATCCAGTTTTCCCTTCGGGGACAGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGGGACCGCCGGTGGTAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGACTACAGAGGGTTGCGATGCTGCGAAGCGGAGCTAATCCCTAAAAGTCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAGTCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACTCACCGCCCGTCGCACCATGGGAGTTGGCTTTACCCGAAGGCGGTGCGCTAACCAGCAATGGAGGCAGCCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’。
3.根据权利要求1或2所述的杆状细菌，其特征是所述的杆状细菌革兰氏染色阴性，长0.5-3um，宽0.3-1.0um，细胞壁具有三层结构，具有单端鞭毛，在肉汤液体培养基中染色后呈链状，在血平板上菌落呈灰色干燥皱褶状，不溶血，触酶、氧化酶阳性，硝还试验阳性，能够同化利用葡萄糖、辛二酸盐、3-羟基丁酸及L-蒲氨酸；尿素酶、水解β-葡萄甙酶和水解蛋白酶弱阳性，能够迟发氧化葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖和果糖，在MacConkey琼脂平板上生长，不能在SS平板以及克氏双糖铁琼脂上生长，可以在不含有NaCl的LB液体培养基里生长，可在含有1-4％的LB液体培养基里生长，但不能在含有6％NaCl的LB液体培养基里生长，在4℃温度下不生长，在25℃至47℃下能够生长，在人的细胞内可以生存。
4.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，在制备治疗肿瘤制品中的应用。
5.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，在制备生物制品中的应用。
7.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，在制备检测该细菌的诊断试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，该细菌在建立研究模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的该杆状细菌在建立研究模型中的应用，研究模型包括但不限于该细菌用于药物筛选和细胞内寄生。
10.根据权利要求1-3任一所述的杆状细菌，其特征是通过其来源的材料或成分，或用通过培养该杆状细菌而获得的成分在制备生物制品中的应用。
11.根据权利要求10所述的杆状细菌，其特征是；来源的材料包括遗传物质、蛋白质、任何类型的化合物、以及这些化合物形成的各种形式的复合物。
12.根据权利要求10所述的杆状细菌，其特征是；来源的遗传物质包括基因组脱氧核糖核酸、非基因组DNA、核糖核酸、以及任何形式的核酸类物质、及其核酸序列、及其基因产物。
13.根据权利要求1-11任一所述的杆状细菌，其特征是在作为载体携带遗传物质、蛋白质、化合物进入真核细胞中的应用。
14.一种从细胞中分离如权利要求1-3任一所述的杆状细菌的方法，其特征是在细胞培养中加入烟草提取物，培养温度为37℃，培养2-14天后有细菌生长，菌悬液接种于哥伦比亚琼脂血平板，培养2-7天，获得菌落。
15.一种培养如1-3所述的杆状细菌的方法，其特征是液体培养基可为普通的Lb，营养肉汤，固体培养基可为哥伦比亚血琼脂平板，MacConkey琼脂平板，巧克力平板，中国蓝平板，MH琼脂平板。
全文摘要
本发明涉及一种新的杆状细菌及分离方法和应用，该菌种被命名为Leukemibacterium zucineum，保藏号为CCTCC M 205004。该菌种可诱导多种肿瘤细胞凋亡，具有治疗肿瘤的前景。由于该杆状细菌可进入真核细胞(如人的细胞)内，并可在细胞内长期生存，因此该菌可作为载体携带任何类型的化合物(如遗传物质、蛋白质、药物、和其他任何类型的化合物)进入细胞。本发明提供的杆状细菌可制备治疗肿瘤制品中的应用。该杆状细菌在生物医学界具有广泛的应用前景。
文档编号A61P35/00GK1673352SQ200510049239
公开日2005年9月28日 申请日期2005年1月26日 优先权日2005年1月26日
发明者胡讯, 张昆, 韩卫东, 潘锵荣 申请人:浙江大学