专利名称：鼠抗人酯多糖受体抗体重链和轻链可变区基因及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，主要涉及鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因，尤其涉及到鼠抗人酯多糖受体(国际命名CD14，抗体克隆名ZCH-7-2F9)单克隆抗体重链和轻链可变区基因及用途。
背景技术：
血液系统肿瘤如白血病、淋巴瘤是严重危害人类健康的顽症，化学治疗(化疗)仍然是当前治疗血液系统恶性肿瘤的主要方法，但常规化疗对肿瘤细胞与正常细胞之间的选择性较差，因而毒副作用较大，且反复非根治性剂量的化疗，又容易诱生肿瘤细胞的耐药，最终，许多患者因耐药肿瘤复发或大剂量化疗致严重毒副作用如严重感染、出血、重要脏器功能衰竭等而告治疗失败。
与化疗比较，单克隆抗体靶向治疗具有良好的选择性和特异性，它们只杀伤表达靶分子的细胞，而不损伤无靶分子表达的血细胞成分和组织器官细胞，从而可大大提高靶向治疗的特异性，降低药物的全身毒副作用。有效的靶向治疗取决于良好的先导分子，系列特异性表面分化抗原单抗作为先导分子，将药物或毒素特异地带到肿瘤细胞膜上或细胞内，或通过完整抗体激活补体(CDC)或通过抗体介导细胞毒(ADCC)作用以达到杀灭白血病细胞的目的，有着无可替代的优势。目前，大多数高亲和力的单抗属于鼠源性的，用鼠源性单抗进行临床靶向治疗可以发生严重的血清病或因产生人抗鼠免疫球蛋白(Ig)抗体(HAMA)而消除药物的抗肿瘤作用等问题，限制了它们在临床上的有效应用。为了在临床上能大量重复使用鼠源性单抗治疗血液系统恶性肿瘤，就必须最大限度地降低鼠源性单抗对人体的免疫原性。现知，抗体的免疫原性主要位于抗体恒定区(Fc)段，而识别抗原的部分(抗体的可变区)则抗原性较弱。通过适当的方法去除鼠Ig的Fc段而保留可变区FV段，可以大大降低鼠单抗的免疫原性而保留其识别抗原的特异性。人鼠嵌合型鼠抗人B淋巴细胞表面抗原CD20单抗是该技术的典型代表，其研制方法是采用人B淋巴细胞来免疫Balb/C纯种小白鼠，然后通过鼠-鼠杂交瘤技术研制出抗人CD20单抗杂交瘤细胞株。通过对该杂交瘤细胞株编码抗人CD20免疫球蛋白可变区肽链的信使核糖核苷酸(mRNA)的扩增、克隆以及测序，并将编码该抗体可变区基因与人免疫球蛋白恒定区基因进行重组表达，制成嵌合型人鼠CD20抗体(可变区为鼠源性，恒定区为人源性的基因工程抗体)，使该抗体保留识别CD20抗原的特性，从而特异性地识别人B系淋巴细胞包括表达该抗原的所有淋巴瘤细胞、白血病细胞以及正常细胞，而消除了由鼠源性恒定区对人体产生免疫反应的缺点，从而起到有效的治疗作用。该抗体的临床应用已经使B细胞系肿瘤的治疗进入了一个崭新的时代。要使一个鼠源性单抗能在临床病人体内反复使用的关键是鼠源性抗体的人源化基因改造，而人源化基因抗体研制的关键是该鼠源性抗体可变区基因的序列，因为抗体靶向作用的关键是该抗体的可变区，而编码可变区基因序列是决定每一个单抗各自靶向作用的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供ZCH-7-2F9(CD14)鼠免疫球蛋白(单抗)重链和轻链可变区基因，具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列，及SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列。本发明提供的是鼠抗人酯多糖受体(国际命名CD14，抗体克隆名ZCH-7-2F9)单克隆抗体重链和轻链可变区基因。
本发明的另一个目的是提供ZCH-7-2F9(CD14)鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因在制备治疗急性单核细胞性白血病药物中的应用。
采用单抗靶向治疗某种特定血液肿瘤的基本条件是抗体必须能识别某种血液肿瘤细胞膜抗原。ZCH-7-2F9单抗具有良好的识别急性单核细胞白血病细胞膜CD14抗原而不识别其他组织、细胞成分的特性，体外实验表明，2F9免疫毒素对2F9阳性的急性单核细胞白血病细胞具有良好的选择性杀伤作用，而对2F9阴性的细胞却无作用，因此，该抗体具有潜在治疗急性单核细胞性白血病的应用前景。
本发明提供的ZCH(Zhejiang Children’s Hospital)-7-2F9(以下简称2F9)是以末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)阳性小儿急性髓系-淋巴细胞系双克隆白血病复发时的白血病细胞作为免疫原，致敏Balb/C纯种小白鼠，通过鼠-鼠杂交瘤单抗技术研制成功的鼠抗人白细胞分化抗原酯多糖受体[国际分化簇(CD)命名为CD14]的单抗[1]，该抗体已在第6届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA6)上进行了全面鉴定并获得了分化簇(CD)命名[2]。由于同一CD号的单抗，其鼠免疫球蛋白亚类、与细胞的反应谱及某些生物学特性有所不同，某个抗体有它的特殊性，如2F9抗体属鼠免疫球蛋白Gκ轻链(IgGlκ亚类)，而我国国内中国医学科学院血液学研究所仅有的另一个CD14克隆(HI222)，属IgM亚类[2]。2F9的反应特性除与国际上其他CD14克隆类似外，尚有识别未分化型急性单核细胞白血病细胞(AML-M5a)的能力[1，3]，后者大多数CD14抗体无此功能，为2F9单抗用于M5a白血病的诊断和导向治疗提供分子基础。
由于鼠抗人CD14抗体ZCH-7-2F9并非天然存在，而是需要刻意应用特定的抗原进行免疫致敏动物，然后通过细胞融合、筛选、鉴定等一系列繁琐而复杂的技术过程研制而成，且到目前为止，国际上尚无其他克隆的鼠抗人CD14单抗免疫球蛋白重链和轻链基因有测序的文献报道，而本发明完成了对该抗人CD14抗体(ZCH-7-2F9)重链和轻链可变区基因的克隆和测序。基于该基因序列所研制的人源化基因工程抗体将可能对临床急性单核细胞性白血病靶向治疗具有十分重要的应用价值。
图1为高纯度的2F9单克隆细胞株的筛选绿色实线为CD14-PE，蓝色影印为2F9+GAM Ig-FITC；图2为PCR扩增VL2F9、VH2F9基因及重组质粒pGEM-T Easy/VL、pGEM-TEasy/VH的琼脂糖电泳鉴定；图3为抗人CD14抗原单抗ZCH-7-2F9的可变区轻链基因(VL2F9)序列(两个箭头之间的序列)；图4为抗人CD14抗原单抗ZCH-7-2F9的可变区重链基因(VH2F9)序列(两个箭头之间的序列；图5为完整2F9抗体与Genistein偶合制成的免疫毒素(2F9-Gen)对2F9(CD14)阳性白血病细胞(急性单核细胞白血病，AML-M5)靶向杀伤作用观察，并以2F9阴性的急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)细胞作为阴性对照。PBS为磷酸盐缓冲液，Gen为游离三羟基异黄酮，纯化2F9为纯化的2F9鼠免疫球蛋白IgG1。
具体实施例方式
本发明结合实施例，作进一步的说明。
实施例一 本发明2个基因的核苷酸序列及氨基酸序列1、抗人CD14单抗ZCH-7-2F9鼠免疫球蛋白重链可变区基因(VH2F9)的核苷酸(SEQ ID NO 1)及氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。
2、抗人CD14抗原单抗ZCH-7-2F9鼠免疫球蛋白轻链可变区基因(VL2F9)的核苷酸(SEQ ID NO 2)及氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。
实施例二 本发明通过下列步骤获得
1、ZCH-7-2F9单抗的研制基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行，以髓/淋混合型(双克隆)急性白血病(HAL)复发时的白血病细胞[已转变为末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)阳性的急性髓细胞性白血病(AML)，其免疫表型为HLA-DR+，CD13+，CD33+，TdT+，CD19-，CD7-，CD41a-]作为免疫原，将107白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脱臼杀死小鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞按6∶1混合，以50％聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9～20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100％孔达到阳性，即建立了能持续分泌2F9单抗的杂交瘤细胞株。经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌2F9单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1∶3200)或培养上清(荧光法效价1∶16)作为2F9单抗的来源。
2、最佳克隆的筛选将冻存于液氮(-196℃)中的2F9细胞复苏后进行亚克隆培养，获得5孔单克隆细胞群，通过异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白(GAM Ig-FITC)间接标记法比较各单克隆细胞群培养上清与进口藻红蛋白标记的CD14单抗(CD14-PE，克隆名LeuM3)在正常单核细胞上的平均荧光强度，参见图1和表1。根据两者平均荧光强度的对比，从中筛选出2个最佳亚单克隆细胞株93A10和94D6，选用93A10作进一步的实验。
表1.2F9最佳亚克隆细胞株的筛选(单位平均荧光强度指数)
“-”阴性对照。
3.2F9重、轻链基因(VH2F9、VL2F9)的扩增3.1总RNA的抽提和处理收集最佳克隆(93A10)的2F9杂交瘤细胞及鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞分别约8×106，以核糖核酸(RNA)抽提试剂盒(TRIZOL液)按说明书步骤抽提总RNA。最后溶于25μl DEPC(diethyl-pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，并加入RNasin(核糖核苷酸酶抑制剂)至终浓度为1U/μl(单位/微升)。紫外分光光度计测定A260、A280及其比值，1％琼脂糖电泳观察总RNA。进行逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)前，各取2μl 2F9及NS-1总RNA，按照RQ1(无RNA酶的DNA酶试剂盒)说明的方法，消化总RNA中污染的基因组DNA。
3.2总RNA的抽提(1)计数细胞，共8×106个活细胞；(2)常温下1000转/分钟(rpm)离心15分钟，弃上清；(3)沉淀中加入无菌生理盐水后在1000rpm条件下离心15分钟，重复洗涤2次；(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL(1ml/106细胞)，立即用5ml无菌针筒反复抽打剪切数分钟；(5)将上述TRIZOL溶液按1ml/管转入1.5ml eppendorf管中，室温下静置5分钟；(6)每管加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置10分钟；(7)4℃下12000g离心15分钟，将水相转入新的1.5ml的eppendorf管中，每管加入0.5ml异丙醇，立即摇匀，室温下静置10分钟；(8)4℃下，12000g离心10分钟；(9)弃上清，每管加入1.5ml 75％乙醇，混匀，4℃下，7500g离心5分钟，弃上清；(10)真空干燥机中晾干，每管加入25μl无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80℃冰箱保存。
3.3总RNA浓度的测定取出2μl新抽提的总RNA，加入98μl DEPC水混匀，紫外分光光度计(GeneQuantII)测定260吸光值(A260)及280吸光值(A280)，RNA实际浓度用如下公式计算
3.4总RNA凝胶电泳取新抽提的总RNA 3μl加入电泳上样缓冲液5μl，1％琼脂糖凝胶内含溴乙啶(EB)浓度0.5μg/ml，经100V直流电压下电泳5分钟，凝胶成像系统观测结果并摄像保存。
3.5总RNA的处理取总RNA 1μl+无RNA酶的DNA酶(RNase-free Dnase)(1U/μl)10μl+RNasin(40U/μl)1μl+氯化镁(25mM)1μl，总量达13μl，经37℃×1小时，90℃×5分钟孵浴后立即置冰上待用。
3.6RT-PCR按照说明书，将RQ1无RNA酶的DNA酶处理过的总RNA进行逆转录(25μl体系)，并用DNA纯化试剂盒(QIAquick)纯化mRNA/cDNA杂交双链。取纯化的cDNA2.5μl进行PCR。
3.6.1RT反应体系取RQ1处理过的总RNA 13μl+寡聚脱氧胸苷
1.5μl，总量达14.5μL，经65℃预变性5分钟，立即置冰上，加入以下试剂DEPC水2.5μl+5倍缓冲液5μl+25mM dNTP(脱氧核苷混合物)0.5μl+RNA酶抑制剂1.5μl+逆转录酶(200U/μL)1μl至总体积25μl，经37℃，30分钟孵浴以合成互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，置95℃5分钟，然后移至4℃冰浴备用。
3.6.2PCR体系(1)50μl的PCR反应体系2.5μl纯化的2F9或NS-1cDNA，10pmol的轻链或重链可变区上下游引物各1μl，0.5μl 25mM的dNTP，5μl 10×高保真PCR缓冲液，2μl 50mM×MgSO4(硫酸镁)溶液，0.2μl高保真Taq聚合酶(PlatinumTaq High Fidelity)；引物序列如下重链可变区5’引物序列CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT重链可变区3’引物序列CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT轻链可变区5’引物序列GATATCCAGATGACACAGACT轻链可变区3’引物序列GGATACAGTTGGTGCAGCATC(2)反应条件94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环；
(3)最后一个循环完成后，加入1μl Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)72℃延伸7分钟；(4)取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时加标准分子量标志物DL2000，鉴定PCR产物片断大小，分别命名为VL2F9和VH2F9基因。结果可观察到350碱基对(bp)左右的VL2F9条带和400bp左右的VH2F9条带，而以NS-1细胞cDNA扩增无阳性条带出现。将前述阳性条带切胶回收纯化得到VL2F9和VH2F9基因，浓度分别为13.52μg/ml和17.84μg/ml。以作为该杂交瘤融合对象的NS-1细胞cDNA为模板的PCR产物电泳结果未见扩增条带(图2)。
4.VL2F9、VH2F9基因的扩增产物的克隆和鉴定将VL2F9和VH2F9基因片段通过连接酶分别与克隆载体pGEM-T Easy连接，获得的连接产物pGEM-TEasy/VL和pGEM-T Easy/VH，通过转化DH5α感受态细菌，得到数十个白色菌落和数个蓝色菌落，分别挑取4个白色菌落进行质粒扩增，抽提后进行核酸限制性内切酶EcoRI酶切处理，1％琼脂糖电泳结果均可见350bp和400bp左右的目的片段，参见图2，其中M低核糖核苷酸(DNA)标准分子量标志物；1VH2F9基因；2NS-1重链可变区基因(VHNS-1)；3VL2F9基因；4NS-1轻链可变区基因(VLVS-1)；5～8重组质粒pGEM-T Easy/VL的EcoRI酶切；9～12重组质粒pGEM-T Easy/VH的EcoRI酶切。
5.VH2F9、VL2F9基因序列测定和分析参见图3、图4，对阳性重组质粒纯化后进行测序，VH2F9和VL2F9基因均符合小鼠Ig可变区框架结构。VH2F9基因全长360bp(见SEQ ID NO 1)，编码120个氨基酸(见SEQ ID NO 3)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行检索，发现此重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链的同源性达98％，氨基酸序列与小鼠Ig重链的同源性达87％，归属于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析结果显示，重链可变区含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区，在第22位和第96位为特征性Cys。VH2F9基因序列结构框架1～25 FR126～33 CDR134～50 FR251～58 CDR259～96 FR397～108CDR3109～120 FR4
VL2F9基因全长321bp(见SEQ ID NO 2)，编码107个氨基酸(见SEQ ID NO4)，在NCBI上进行检索，发现此轻链可变区基因与小鼠Igκ链的同源性达97％，氨基酸序列与小鼠Igκ链的同源性达95％，归属于小鼠Ig的Vκ基因。氨基酸序列分析结果显示，轻链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，在第23位和第88位为特征性半胱氨酸(Cys)。VL2F9基因序列框架1～26 FR127～32 CDR133～50 FR251～53 CDR254～88 FR389～97 CDR398～107 FR4实施例三 为证实2F9抗体的潜在临床治疗应用前景，我们将纯化的2F9鼠源性完整抗体与三羟基异黄酮(Genistein，简称Gen)偶合制成2F9抗体的免疫毒素(2F9-Gen)，观察其对2F9阳性(急性单核细胞性白血病，AML-M5)和阴性(急性部分分化型粒细胞白血病AML-M2)细胞进行靶向杀伤研究，结果发现，2F9-Gen对AML-M5细胞具有很强的选择性杀伤作用，经37℃48小时孵浴培养后，2F9-Gen组的细胞存活率仅5％，明显高于对照组，且2F9-Gen对2F9阴性的AML-M2却无杀伤作用，说明2F9-Gen具有良好的导向杀伤AML-M5的作用(图5)，其中PBS为磷酸盐缓冲液，Gen为游离三羟基异黄酮，纯化2F9为纯化的2F9鼠免疫球蛋白IgG1。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.汤永民，郭淑芬，沈红强.ZCH-7-2F9一个抗人CD14新克隆的研制鉴定及初步应用.中华血液学杂志，2001，22(8)439-441.
2.Leucocyte Typing VI.Edited by Tadamitsu Kishimoto，et al.Garland Publishing，Inc.New York & London 1997.p1109～1220.
3.Y.M.Tang，H.Q.Shen and S.F.Guo.ZCH-7-2F9A new clone of CD14 capable ofrecognizing M5a leukemia cells.Tissue Antigens(Abstracts of the 7thWorkshop andConference on Human Leucocyte Differentiation Antigens(HLDA7)) 2000；55(1)supplement42.
权利要求
1.鼠抗人酯多糖受体抗体重链和轻链可变区基因，国际命名CD14，抗体克隆名ZCH-7-2F9，具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因，国际命名CD14，抗体克隆名ZCH-7-2F9，具有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因在制备治疗急性单核细胞性白血病药物中的应用。
全文摘要
本发明提供鼠抗人酯多糖受体抗体重链和轻链可变区基因，国际命名CD14，抗体克隆名ZCH－7－2F9，具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列及SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列。本发明提供了抗人CD14抗体(ZCH－7－2F9)重链和轻链可变区基因的克隆和测序。基于该基因序列所研制的人源化基因工程抗体将可能对临床急性单核细胞性白血病靶向治疗具有十分重要的应用价值，可在制备治疗急性单核细胞性白血病药物中的应用。
文档编号A61K39/395GK1782078SQ20051006083
公开日2006年6月7日 申请日期2005年9月21日 优先权日2005年9月21日
发明者汤永民, 宁铂涛, 曹江 申请人:浙江大学