专利名称：基因工程方法生产的高活性胸腺素β4衍生物的制作方法
技术领域：
本发明属于重组蛋白质药物生产与衍生物的产生领域。通过对前体融合蛋白的基因工程构建，实现了目的蛋白的高效表达，该方法具有表达量高，操作简便，终产品Ala-Tβ4纯度高(大于98％)的特点。
二.
背景技术：
免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中胸腺素β4(Tβ4)是现在结构和功能较为明确的一种主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一种涉及正在发育的胚胎中细胞迁移和存活的蛋白)的活性所做的一项研究所表明的那样，“胸腺素-贝塔4”增强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活Akt“存活激酶”。这些结果说明，“胸腺素-贝塔4”对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治疗目标。德克萨斯州大学的研究人员发现一种在心脏发育过程中制造的蛋白质(胸腺素β-4)在心脏病发作后能够帮助心脏器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。
胸腺素β-4是一种胚胎在心脏发育过程中表达的蛋白，它能促进心脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡。新研究表明这种蛋白能够在实验诱导的心脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。胸腺素β-4已经被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将来这种蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。
Tβ4是Goldstein等最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽，含43个氨基酸，分子量4.963KD，无二硫键与糖基化。
目前，Tβ4的生产主要是来源于化学合成。化学合成方法中原料药采用固相合成法制成，用高效液相色谱法提纯精制。这种制备方法对原料纯度要求高，合成仪器和设备投资大，生产工艺(合成和化学修饰等)复杂，产品活性较低，生产成本高。而常规的基因工程方法构建胸腺素β4基因表达载体，在大肠杆菌中表达，经分离纯化而制成，得到的产品纯度与活性高，但由于小肽分子表达后易被降解且不易被检测，其产率和收率均达不到产业化要求。
三.
发明内容
本发明的特点是利用一段能在细菌体内大量稳定表达、存在的蛋白作先导，将Tβ4在表达过程中带出来，产生“Tβ4人工前体蛋白”，再经过体外酶切回收，得到高纯度的Ala-Tβ4，且Ala-Tβ4与Tβ4相比较生物活性较高，但在生产成本上远低于化学合成方法和常规的基因工程表达方法。首先，我们选用的先导蛋白是谷胱甘肽转硫酶(GST)的一段，而这段蛋白在大肠杆菌BL21的胞质中，能大量的以可溶形式稳定存在，比GST完整序列可溶形式表达、存在率高1-2倍，最大量约为菌体蛋白总量的45％-60％。刚好Tβ4不能在大肠杆菌内大量可溶表达的原因，很有可能是它本身的结构以及种属关系，不能在大肠杆菌内高产量表达，这就大大降低了产量及增加了生产工艺难度。当我们把Tβ4接到先导蛋白后面以后，发现“Tβ4人工前体蛋白”也可以在大肠杆菌内超量表达且以可溶性形式存在。又因为我们选用的这段先导蛋白，在一定条件下仍能与谷胱甘肽亲和柱结合，这就进一步提高了生产量、减少工艺难度，从而降低生产成本，使用这套工艺使得1g湿菌体可最终得到约1mg成品蛋白Ala-Tβ4，纯度大于98％。虽然终产品的N未端多了一个Ala，但是它是小分子氨基酸不但不会对Tβ4结构产生影响，而且还对Tβ4的结构起稳定作用，这点从生物活性上的提高可以看出。其次，我们在选择筛选抗性时，将常规的氨苄青霉素换成了卡那霉素，使得本工艺难度与成本大大下降。本发明生产的Ala-Tβ4活性高于化学合成的Tβ4。本发明通过表达Tβ4人工前体蛋白的方法，在大肠杆菌内高效生产人Tβ4使生产成本大大降低，更利于取代化学合成的Tβ4，有望为广大患者提供优质价廉的药品。
本发明中Tβ4人工前体的产生及Ala-Tβ4的制备方法为先以Tβ4氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tβ4 DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，以GST氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，再将先导肽、Tβ4以及筛选质粒βBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选出一成功重组子命为PSK-Tβ4。用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本公司质粒PGM(该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建)连接，经筛选得到正确重组子命名为PGMTβ4。将PGMTβ4转化到表达宿主菌BL21中，经表达筛选出高表达工程菌PGM Tβ4/BL21，然后在30升发酵罐中对PGMTβ4/BL21进行高密度发酵，经12小时发酵，最终得到目的蛋白表达量占菌体总蛋白量60％(见图1)的工程菌体，湿重约100g/L，再经离心收集菌体，高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用凝血酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98％。
在动物实验研究中，发现胸腺素Ala-Tβ4与其它两种蛋白一起，通过激活Akt/蛋白激酶B来促进心肌细胞的迁移和存活。在研究了培养的细胞活性后，研究人员将60只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从而创造出大鼠模型。接着给20只大鼠局部注射胸腺素Ala-Tβ4 2ug/只，给20只大鼠局部注射胸腺素Tβ4 2ug/只，而另20只大鼠只注射盐水200uL作为空白对照。连续注射胸腺素Ala-Tβ4与Tβ4一月的大鼠的受损心脏中的细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能，而且Ala-Tβ4治疗效果比Tβ4明显。研究人员相信胸腺素Ala-Tβ4能够改变细胞的代谢并创造出更强大的心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。接下来，研究人员将会确定这种蛋白的最有效剂量、用药的最佳时间。这项研究将会为心脏病的治疗开辟出新的途径。如果这种蛋白对人类同样有效，那么这种蛋白将会成为一种强有力的心脏病治疗药物。
经测试，本发明生产的Ala-Tβ4活性大于化学合成Tβ4。
四.
图1是Ala-Tβ4的发酵表达SDS-PAGE电泳图谱。
图2是Ala-Tβ4的纯化后的SDS-PAGE电泳图谱。
图3是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁厚度的影响结果。
图4是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维化程度的影响结果。
五.
具体实施例方式
1.胸腺素β4前体蛋白表达质粒的构建与工程菌的获得首先通过全基因合成扩增出胸腺素β4前体蛋白的全基因序列GGA TCC CCT CGA GCT TCT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTCGAT AAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCTTCC AAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA GTC GAC以GST基因为模板，PCR扩增获得500bp左右的产物，经测序质粒克隆、基因测序，得到设计序列备用。
目的片段经BamH I、EcoR I、XhoI双酶切后分别回收小片段，质粒PGM经XhoI和EcoRI双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PGMTβ4。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经胸腺素β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达胸腺素Ala-Tβ4前体蛋白的工程菌命名为PGMTβ4/BL21。
2.发酵1).摇瓶表达含胸腺素β4前体蛋白基因的PGMTβ4/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素β4前体蛋白(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％左右。
2)发酵工艺a.培养基a)种子液培养基(LK)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升、卡那霉素50微克/毫升。
b)种养基(15升)磷酸氢二钠315克、磷酸二氢钾100克、氯化钠10.05克、氯化铵50克、胰蛋白胨90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁15克、葡萄糖450克、补料(500克/升)葡萄糖b.发酵过程a)种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LC中，36度、200转/分，过夜。
b)发酵过程将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
3.层析1)亲和层析采用GSH-Agrose层析介质(Sigma公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
2)酶解上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
3)阴离子交换层析采用Source30Q层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上一步得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4.检测得到的胸腺素β4通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于98％(见图2)。
5.Ala-Tβ4与Tβ4对大鼠心脏缺血模型的治疗效果评价1)、病态动物模型的制作与试验方法为了评价Ala-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了急性心肌梗塞的病态动物模型--大鼠冠状动脉左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠前胸壁皮肤，切断第3到第6肋骨，露出胸腔，将肺推向一侧，打开心囊，露出心脏。从冠状动脉左前降支起点到3mm处，用6-0聚丙烯(polypropylene)结扎丝与NELATON结扎血管，1小时后再灌注。确认无出血后，将切断的肋骨与胸骨缝合，再缝合皮肤。手术后肌肉注射庆大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2)、利用超声心动图比较左心室前壁厚度建立大鼠心脏缺血模型后，注射阴性对照物(生理盐水)，阳性对照物(Tβ4)，试验物质(Ala-Tβ4)。注药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500)与探针(probe15-16L)，测定各组左心室前壁厚度。
基础值(第0天，给药前)，生理盐水组0.2594±0.0225，Tβ4组0.2378±0.018，Ala-Tβ4组0.2432±0.01，各组之间无显著性差异。
给药第14天生理盐水组0.1306±0.0128，Tβ4组0.1215±0.013，Ala-Tβ4组0.1299±0.011，各组之间无显著性差异。
给药第28天，生理盐水组0.1207±0.0151，Tβ4组0.1233±0.0071，Ala-Tβ4组0.1288±0.012，各组之间无显著性差异。
给药56天，生理盐水组0.1265±0.0125，Tβ4组0.1232±0.0057，Ala-Tβ4组0.1508±0.0078，Ala-Tβ4组心脏左心室前壁厚度增加(p＜0.05)。
这些结果显示，Ala-Tβ4能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁厚度的减少(见图3)。
3)、利用组织学图片比较在心室纤维化程度试验第56天，取心脏，以乳头状肌肉为准，横切心脏，做成切片。用1％福尔马林浸泡24小时，制造石腊组织切片及玻片，进行Masson’trichrom染色。各组之间比较采用了Image-proPLUS ver.4.1(Media Cybemetics)方法。
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，生理盐水组28.13±2.1％，Tβ4组22.91±2.3％(P≤0.05)，Ala-Tβ4组16.86±1.8％(P≤0.0005)；生理盐水组与Tβ4组、Ala-Tβ4组之间有显著性差异，尤其Ala-Tβ4组有非常显著性差异。这些结果表明Ala-Tβ4能有效减少心肌梗塞引起的心肌损伤和心肌纤维化(见图4)。
序列表<110>北京诺思兰德生物技术有限公司<120>基因工程方法生产的高活性胸腺素β4衍生物<140>
<141>
<160>1<210>1<211>44<212>PRT<213>Ala-Tβ4<400>1Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys1 5 10 15Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro20 25 30Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser35 40 4权利要求
1.一种用融合表达的方式生产胸腺素β4的方法以及用它生产出的44肽胸腺素β4衍生物，其特征为一段能在大肠杆菌胞质中超量稳定表达、存在的蛋白与43个氨基酸的胸腺素β4融合后形成的前体蛋白在大肠杆菌胞质中能够超量稳定表达；该前体融合蛋白经发酵、酶切、纯化后得到高活性的成熟蛋白44肽胸腺素β4衍生物氨基酸序列为Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
2.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为主要成份，用于治疗皮肤组织损伤的修复。
3.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为主要成份，用于治疗心脏组织损伤的修复。
4.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为主要成份，用于冠心病的治疗。
5.使用权利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作为主要成份，用于角膜损伤的修复。
6.权利要求1中所述的工艺中采用的表达质粒筛选标记为卡那霉素抗性基因。
7.权利要求1中所述的工艺中采用的一段能在大肠杆菌胞质中超量稳定表达、存在的蛋白为天然谷胱甘肽转硫酶(GST)的一段或全序列。
8.权利要求1中的前体蛋白以大肠杆菌或酵母为宿主菌用基因工程的方法进行可溶性表达。
全文摘要
本发明涉及一段能在细菌体内大量稳定表达、存在的蛋白与天然胸腺素β4(Tβ4)形成的、能在大肠杆菌中进行高产量可溶表达的融合蛋白，以及由上述融合蛋白酶切加工后产生的具有高生物活性的胸腺素β4衍生物。本发明可以使该融合蛋白在大肠杆菌中得到稳定高效的表达。经过表达后的前体蛋白经过切割加工后，得到了高纯度的有效成分蛋白，可用于皮肤、心脏损伤的修复。
文档编号A61P9/10GK1896096SQ20051008389
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者聂李亚, 马素永, 许松山, 文美玉 申请人:北京诺思兰德生物技术有限责任公司