专利名称：炭疽毒素受体ATR－Fc融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白，属于医学生物工程领域。
背景技术：
炭疽热是严重威胁人类健康的传染性疾病，美国疾病控制与预防中心(CDC)将炭疽、鼠疫、天花等列为等级最高的传染性疾病，这类传染性疾病具有传播速度快、死亡率高、易引发公众恐慌和社会混乱等特点，需要特别对待和严密监测。炭疽杆菌有以下特点(1)繁殖速度快，炭疽孢子存活时间长，在自然条件下可以存活36年；(2)传染性强，室外施放含炭疽菌的气溶胶，即便在室内也有感染炭疽热的可能；(3)吸入性炭疽热死亡率极高，至今仍没有有效的方法治疗。(4)作为生物武器具有很强的杀伤能力。1993年美国国会技术评估部门(OTA)估计，在美国首都华盛顿的上风口施放100kg的气溶胶化的炭疽孢子，将会造成13万～300万人死亡，其致死性杀伤效果相当于甚至超过1颗氢弹的威力。由于炭疽杆菌的这些特点，80年前有的国家就开始了以炭疽作为生物武器的研究，“911”事件后美国又出现炭疽菌袭击，研究抵御生物恐怖袭击的新方法已成为美国政府优先资助的项目，并且引起各国政府的高度重视。
人体感染炭疽杆菌后，炭疽杆菌能在人体内增殖并产生致命的毒素。大多数的炭疽热致死病例是由炭疽毒素不可逆的毒性作用导致的。炭疽毒素包括(1)保护抗原(PA)，它可与哺乳动物细胞膜上的炭疽毒素受体(ATR)结合，并介导致死毒素(LeTx)和水肿因子(EF)进入宿主细胞内；(2)水肿因子(EF)，它是一种腺苷酸环化酶，通过提高感染部位细胞内的环腺苷酸(cAMP)浓度而引起水肿，并可抑制噬菌作用；(3)致死因子(LF)，它是一种高度特异性的锌依赖性蛋白酶，可改变巨噬细胞产生的细胞因子并诱导巨噬细胞裂解。保护抗原是炭疽毒素的核心成分，它能在细胞水平上促进炭疽感染进展。在没有保护抗原的情况下，炭疽杆菌产生的水肿因子和致死因子对人体是无害的，只有保护抗原与细胞表面的炭疽毒素受体结合形成保护抗原-受体(PA-ATR)复合物，炭疽致死毒素和水肿因子在PA-ATR复合物的介导下才能进入细胞质内并产生毒性。因此，保护抗原在炭疽感染中起着举足轻重的作用，保护抗原自然而然成为研制预防和治疗炭疽热新药的有效靶标。
抗体类药物的研究、开发和生产已成为生物制药行业中最重要和最为活跃的领域。
抗炭疽毒素抗体是预防和治疗炭疽感染最直接和最有效的手段之一，有许多抗保护抗原抗体(anti-PA antibodies)在细胞保护实验和动物实验中表现出明显的保护作用，并且在治疗中有明显疗效，由于具有Fc段，抗体不仅能结合炭疽毒素PA，并且可以由抗体Fc介导的生物学效应如抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(ADCC)、补体依赖性细胞毒效应(CDC)或免疫调理作用而杀死炭疽孢子，起到治疗的作用。但是，不是所有的anti-PA抗体都有细胞保护作用，相反，如果anti-PA抗体不是封闭PA与其受体ATR结合部位，不仅不能保护细胞，反而能强化致死毒素对巨噬细胞的杀伤作用。PA的可溶性受体ATR能够结合PA并阻止致死毒素对细胞产生杀伤作用，但是，由于可溶性受体半衰期短，而且没有抗体分子的Fc段介导的对病原体产生杀伤作用的功能。
目前国内外还没有研制ATR-Fc融合蛋白的报道。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种安全、有效的炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受体(ATR)与人Fc的二聚体融合蛋白，单链ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459个氨基酸残基；其中前27个氨基酸为ATR的信号肽。所以成熟的单链ATR-Fc有432aa，二聚体为864aa。
编码炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白单链的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列。
我们采用人工合成的方法，成功地得到了与设计相符的编码炭疽毒素受体ATR胞外区1-227aa的基因。cDNA人工合成具有许多优点，如基因的来源不受材料限制；可以从基因水平上进行优化以提高表达水平；可以对几个基因进行剪裁或组合等。但是，在利用重叠延伸PCR法组装基因过程中，由于寡核苷酸片段的反复退火与连接，可能引入错误。因此，尽量减少PCR的次数，或者合成的基因长度较短如400bp以下，会有利于寡核苷酸片段的正确组装。本文合成的加上酶切位点和剪切供体序列的ATR基因长度大于700bp，如果从第一个寡核苷酸片段顺序组装到第18个片段，PCR次数过多，容易出现错误。我们采取的策略是先组装成两个长度在300-400bp的大片段，再通过两个大片段的互补碱基的重叠延伸，得到全长基因，PCR次数减少了1倍，减少了碱基错配或缺失的几率。
合成的寡核苷酸片段的长度对全基因的正确组装也有很大影响。一方面，长度太短，
会增加寡核苷酸片段的数目和PCR的次数，导致发生错误的几率增加；另一方面，长度太长又会使合成中出现错误的几率增加，合成成本和难度极大增加。因此，合成的寡核苷酸片段的长度要综合考虑合成和组装过程中的各种因素，国外报道50-70个核苷酸长度比较适宜，合成时我们选择了50-60个寡核苷酸的长度，即可保证组装基因的质量，又大大降低了寡核苷酸合成的成本。此外，采用高保真的Taq酶，可以极大限度地减少PCR重叠延伸过程中的错误，是获得正确的全基因的关键。我们在PCR过程中，采用了TaKaRa公司的最新产品PyrobestTMDNA Polymerase，该酶与TaKaRa TaqTM相比，保真性能提高了10倍。
将全长为681bp的编码炭疽毒素受体(ATR)N端1-227氨基酸的基因分成长约50-60碱基的18个寡核苷酸片段，相邻片段重叠部分为20-22个碱基，利用重叠延伸PCR和引物PCR法，将合成的片段组装与扩增，得到了含有ATR1-227的全部编码区和Hind III、BamH I位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamH I/Hind III双酶切连接到pUC19质粒中，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定，获得了全序列正确的克隆。BamHI/Hind III双酶切质粒pUC19/ATR和pcDNA3.1/CD40-Fc，用ATR基因替换CD40基因得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATR-Fc。
将编码炭疽毒素受体(ATR)N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接，插入到pcDNA3.1的Hind III和Not I位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATR-Fc，并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中，用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10-15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白，并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性，表明ATR-Fc可与PA特异性结合。
本发明还获得了表达水平较高的表达ATR-Fc的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为CGMCCNo.1399，保存的细胞株名称为ATR-Fc融合蛋白CHO工程细胞株，地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080；电话010-62542758；传真010-62537796；电子邮件cgmcc@sun.im.ac.cn)，该细胞系的表达水平约10-15μg/(106cells.d)，并且连续传代培养1年，表达水平没有变化。
本发明的炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白用于制备治疗炭疽感染的药物的应用。
ELISA证实ATR-Fc可既能够与PA高亲和力结合，又能特异性封闭PA与其细胞受体结合区域，并且在细胞保护实验中显示，ATR-Fc可明显抑制炭疽毒素对细胞的杀伤作用，该融合蛋白值得进一步研究并开发成防治炭疽感染的抗体类药物。
本发明的优点是这种融合蛋白可与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fab片段，而Fc段又提供了抗体的生物学活性，它有以下特点(1)无抗原性，两段蛋白均来自人体；(2)亲和力高，一般配体和受体的亲和力都较高(Kd～10-10M)；(3)不用担心病毒或菌株等抗原的突变，抗体只是针对抗原的一个表位，一旦该抗原的表位突变，抗体可能失去与抗原的亲和力，而如果抗原突变导致抗原与受体不结合，则这种抗原(即病原体)便失去了致病能力，如果抗原的突变不会影响其与受体的结合，则受体-Fc融合蛋白同样可以将抗原捕获并清除；(4)也具有抗体的ADDC效应和CDC效应；(5)半衰期长，与人源抗体相近(10～20天左右)。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，不以任何方式限制本发明的实施。凡是依照本发明公开的内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为18段寡核苷酸连接组装成完整ATR基因的过程示意图。
图2为ATR基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析图。
图3为ATR-Fc融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/ATR-Fc。
图4为重组质粒pcDNA3.1/ATR-Fc酶切鉴定图谱。条带1为Hind III/Not I双酶切结果，条带2为DNAMarker，条带3为Hind III/BamH I双酶切结果。
图5为将编码ATR-Fc融合蛋白的基因用Hind III和Not I双酶切插入pcDNA3.1真核表达载体中全基因测序结果。
图6单链ATR-Fc融合蛋白的基因序列和蛋白质序列。
图7为表达ATR-Fc融合蛋白的基因重组CHO细胞克隆ATR-Fe-1D5。
图8为直接ELISA筛选表达ATR-Fc融合蛋白的阳性重组CHO细胞克隆。
图9为表达产物ATR-Fc的SDS-PAGE分析。条带1非还原SDS-PAGE；条带2蛋白质marker；条带3，4还原SDS-PAGE。
图10为ELISA定性检测ATR-Fc与炭疽毒素保护抗原的亲和性。(1)PA+mouseanti-PA MAb+HRP-labeled goat anti-mouse IgG Fc；(2)PA+ATR-Fc+HRP-labeled goatanti-human IgG Fc；(3)PA+Enbrel+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(4)CHO-K1supernatant+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(5)mouse anti-PA MAb+HRP-labeledgoat anti-mouse IgG Fc。
图11为ATR-Fc保护小鼠巨噬细胞J774A.1细胞不受炭疽致死毒素的攻击具体实施方式
以下实施例按照参照分子克隆实验手册进行；涉及的材料及其来源如下大肠杆菌DH5α(道普公司)、pUC19质粒(本室保存)、pcDNA3.1真核表达载体(Invitrogen公司)、源自基因组(含有内含子)的编码人免疫球蛋白IgG1 Fc段(铰链区、CH2区和CH3区)的基因(美国R&D Systems公司，载体名为pIG1，产品编号为pIg vectors，MBV-002-10)。
限制性内切酶Nhe I、BamH I、Not I、Hind III等购自NEB公司，T4 DNA连接酶及高保真Taq酶Pyrobest购自宝生物工程有限公司。质粒提取、PCR产物回收及酶切产物回收试剂盒均购自Promega公司。DNA Marker购白天为时代公司。
实施例1.ATR基因合成的设计Bradley等2001年发现的炭疽毒素受体ATR，实质就是人肿瘤内皮标志物蛋白(tumor endothelial marker 8，TEM8)的胞外区(1-315氨基酸)，其中1-27位氨基酸为信号肽，而实验表明可溶性受体ATR41-227具有明显的中和炭疽毒素PA的作用，因而本文合成的基因为编码ATR1-227的序列，将全长681bp ATR1-227基因分成18个片段，每个片段长约50-60碱基，相邻片段重叠部分为20-22个碱基，具体的设计见表1。寡核苷酸片段的合成和基因序列的测定由上海博亚生物技术公司完成。
表1
实施例2.寡核苷酸片段的连接和组装采用重叠延伸PCR技术，按如下方法将寡核苷酸片段连接成一完整ATR基因(见图1)①将ATR基因片段1→2、3→4、5→6、7→8、9→10、11→12、13→14、15→16、17→18重叠延伸形成核苷酸片段(1-2)、(3-4)、(5-6)、(7-8)、(9-10)、(11-12)、(13-14)、(15-16)和(17-18)，PCR反应体系为2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.125μL Pyrobest聚合酶、2.5μL 10×Buffer、寡核苷酸片段2×5μL(5μmol/L)、纯净水10.375μL，总反应体系为25μL。PCR反应条件94℃，预变性2min→[94℃，30s→57℃，30s→72℃，50s]×20循环→72℃，5min→4℃，5min；②将步骤①得到的PCR产物按(1-2)→(3-4)、(5-6)→(7-8)、(11-12)→(13-14)、(15-16)→(17-18)连接，反应体系为12.5μL(1-2)PCR产物+12.5μL(3-4)PCR产物，补加0.125μL Pyrobest聚合酶，余此类推，PCR反应条件同步骤①；③将步骤②得到的PCR产物按(1-4)→(5-8)、(11-14)→(15-18)连接，反应体系为12.5μL(1-4)PCR产物+12.5μL(5-8)PCR产物，补加0.125μL Pyrobest聚合酶，余此类推，PCR反应条件同步骤①；④将步骤③得到的PCR产物(1-8)与(9-10)连接，反应体系为12.5/μL(1-8)PCR产物+12.5μL(9-10)PCR产物，补加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反应条件同步骤①；⑤将步骤④得到的PCR产物(1-10)与(11-18)连接，反应体系为12.5μL(1-10)PCR产物+12.5μL(11-18)PCR产物，补加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反应条件同步骤①。
得到ATR的全基因。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析最终的PCR产物，证实获得的基因大小约700bp(图2)，与预计的ATR基因大小一致。
实施例3.ATR cDNA的克隆用ATR上游引物(5’端)和下游引物(3’端)PCR扩增1.4中得到的ATR全基因，PCR反应体系为8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、10μL ATR(1-18)模板、10μL 10×Buffer、2μL ATR上游引物(10μmol/L)、2μL ATR下游引物(10μmol/L)、67.5μL水，总反应体系为100μL，PCR反应条件94℃，2min(预变性)→[94℃，30s→58℃，30s→72℃，1min]×25循环→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔点琼脂糖胶回收PCR产物(Promega，Agarose LMP)。
ATR上游引物5’-CTAAAGCTT ATGGCCACGGCGGAGCGGAG-3’，下划线为Hind III酶切位点，方框中为Kozak序列；
ATR下游引物5’-CGCGGATCC TCAGCTGCTAGAATTTCGATGCAG-3’，下划线为BamH I酶切位点，阴影斜体字为Fc段铰链区前的剪切供体序列。
将回收的PCR扩增的ATR基因经Hind III和BamH I酶切后，用T4连接酶与用同样限制性内切酶酶切过的pUC19质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有X-gal和氨苄青霉素的平板上，培养过夜，挑取白色菌落接种培养，提取质粒，酶切鉴定，由上海博亚生物技术公司进行序列测定，得到的序列与设计的基因序列完全一致。
实施例4.ATR-Fc融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/ATR-Fc的构建将pIG1(R&D Systems公司，产品编号为MBV-002-10)载体和pcDNA3.1载体(美国Invitrogen公司)分别用BamH I和Not I双酶切，经低熔点胶电泳回收pIG1中大小约1500bp的Fc基因片段，在T4连接酶作用下将Fc和pcDNA3.1两段DNA连接成pcDNA3.1/Fc载体，转化大肠杆菌DH5α，挑出的克隆经摇瓶培养，提取质粒行BamH I+Xho I双酶切鉴定。将插入了Fc片段的含pcDNA3.1/Fc质粒的菌株摇瓶培养提质粒。
将测序正确的pUC19/ATR质粒(含ATR1-227基因)用Hind III和BamH I双酶切，经低熔点胶电泳回收，同时将pcDNA3.1/Fc质粒用Hind III和Bam H双酶切经试剂盒回收，在T4连接酶作用下将上述两段DNA连接成pcDNA3.1/ATR-Fc表达载体(图3)，转化大肠杆菌DH5α，挑出的克隆经摇瓶培养，提取质粒行Hind III+BamH I和Hind III+Not I双酶切鉴定。并进行ATR-Fc基因全序列测定。测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1/ATR-Fc。
结果表明(图4)，用Hind III和BamH I双酶切时，可见大小为700bp和包含Fc段1500bp的pcDNA3.1载体(约6.9kb)的片段，分别与ATR基因和载体+Fc基因大小一致，而用Hind III+Not I双酶切，可见大小为2.2kb和5.4kb的条带，分别与ATR-Fc基因和pcDNA3.1载体的大小一致，表明目的基因ATR-Fc正确插入了pcDNA3.1真核表达载体中。
实施例5.ATR-Fc基因的全序列测定。
由于ATR-Fc基因长2.2kb，测定结果表明，插入pcDNA3.1载体Hind III和Not I位点之间的ATR-Fc基因与预期的完全一致(图5)。在图5中，第11-692碱基为编码ATR1-227的基因片段，而第693-2193为编码人免疫球蛋白IgG1的Fc段(Hinge区+CH2区+CH3区)的基因。由于单链Fc为232个氨基酸残基，编码该段蛋白的基因大小应为696bp，而在pcDNA3.1/ATR-Fc载体中，Fc基因来自基因组，含有四个内含子(阴影部分)，因此基因长度约为1500bp。连接ATR和Fc的酶切位点BamH I位于第一个内含子内部，会通过RNA的拼接作用而去除，不影响蛋白质的翻译。在BamH I前面有一段剪切供体序列“ ”，有利于在转录时ATR基因和Fc段基因在mRNA水平的正确拼接。
编码完整的ATR-Fc融合蛋白单链分子的基因序列及单链ATR-Fc氨基酸序列如图6所示。图6中1-227aa(阴影部分)为ATR段，其中1-27aa为ATR的信号肽，228-459aa为Fc段，成熟的单链ATR-Fc(不含信号肽)分子应由432个氨基酸残基组成。根据N-糖基化位点氨基酸序列特征Asn-X-Ser/Thr，推测该蛋白ATR部分存在两个可能的糖基化位点(见图6)，而Fc部分在CH2区有一个糖基化位点，因此推测用CHO细胞表达的ATR-Fc融合蛋白，其单链的分子量应在60-65kDa，而完整的ATR-Fc分子的分子量约120-130kDa。我们将构建的pcDNA3.1/ATR-Fc表达载体转染CHO细胞后，得到的目的蛋白与预测的一致。
实施例6.重组质粒转染CHO-K1细胞及筛选阳性克隆转染采用Invitrogen公司生产的LipofectamineTM2000阳离子脂质体转染试剂盒，按照试剂盒说明书操作。转染的CHO-K1细胞培养于5％CO2、37℃温箱。转染12h后，换含10％加强型小牛血清(Hyclone)的DMEM/F12培养基(Hyclone)。48h后，采用750μg/mL G418(Sigma)筛选培养基加压筛选，每2-3d换液一次，加压约12d后，将抗性细胞克隆用0.25％的胰酶消化，用有限稀释法在96孔微孔细胞培养板(NUNC公司)中进行单克隆化培养，即用含10％小牛血清和300μg/mL G418的DMEM/F12培养基将细胞稀释至10个/mL，在每个微孔中接种200μL培养基(平均每个孔中含有约2个细胞)，2周后出现细胞克隆。换无血清培养基继续培养3d，收集培养上清以直接竞争ELISA挑选阳性克隆，即将无血清培养上清直接包被NUNCTM酶联板4℃过夜，3％BSA封闭后加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB试剂显色，450nm测OD值。以无血清培养基为阴性对照。
真核表达载体pcDNA3.1/ATR-Fc用LipofectamineTM2000阳离子脂质体转染CHO-K1细胞后，经过12d G418的加压筛选，出现分散的细胞抗性克隆。将抗性克隆消化下，培养基稀释细胞接种到96孔微孔细胞培养板中，接种密度为2个细胞/孔，进行单克隆培养。培养2周后出现由一个细胞扩增形成的细胞集落(图7)，一般一个微孔中形成单个细胞克隆的几率为30％-50％。将单个细胞克隆的微孔换成无血清培养基培养3d后，收集培养上清用直接ELISA筛选阳性克隆，表达水平较高的细胞克隆出现的几率约为20％-30％(图8)。
实施例7.rCHO工程细胞的扩大培养选择表达水平最高的基因重组CHO工程细胞系ATR-Fc-1D5于1000mL转瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培养基培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基，隔天收液，可连续收液3-4次。
选择表达水平较高的单克隆细胞系ATR-Fc-1D5用1000mL转瓶扩大培养，每2d收集无血清培养上清。收集的上清用蛋白A亲和层析柱(Pharmacia)分离纯化，用pH2.5的甘氨酸-HCl缓冲液洗脱，有一明显的洗脱峰，收集做SDS-PAGE和ELISA分析。1000mL的上清经纯化后可以得到蛋白浓度约0.9mg/mL的收集液30mL，即该细胞在转瓶中的表达水平约27mg/L，细胞的表达水平约10-15μg/(106cells·d)。
实施例8.表达蛋白的纯化及SDS-PAGE分析利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分离介质(Amersham Biosciences)进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方法参见产品说明。结合的蛋白用pH2.5、0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液洗脱，并用2mol/L的Tris-HCl缓冲液将洗脱液pH调至7。纯化后，以紫外分光光度计测定A260和A280吸光度推算蛋白浓度，蛋白定量公式为蛋白含量(mg/mL)＝1.45×A260-0.74×A280。以SDS-PAGE测定蛋白的纯度、分子量。
如果ATR-Fc融合蛋白能够在CHO细胞中正确表达，表达的蛋白预计应是同源二聚体抗体样分子，即ATR-Fc单链在Hinge区通过链间二硫键连接成二聚体。单链ATR-Fc分子共有227aa+232aa＝459个氨基酸残基，其中前27个氨基酸为ATR的信号肽，胞外分泌到细胞培养上清中时被切除，所以实际的单链ATR-Fc有432aa，二聚体为864aa。由于ATR和Fc段都有糖基化位点，因此单链ATR-Fc的分子量预期在60-65kD。亲和层析纯化得到的ATR-Fc融合蛋白，分别在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。在非还原条件下，在120-130kD处有一条蛋白带，而在还原条件下，在60-65kD处有一条明显的蛋白带，并且没有其他的蛋白带(图9)。由于还原条件下所有二硫键包括链间二硫键都被打断，测得的分子量为单链ATR-Fc分子，而非还原条件下不同肽链仍通过二硫键连接，在非还原条件下的分子量正好是还原条件下分子量的两倍，表明我们获得的ATR-Fc融合蛋白为同源二聚体抗体样分子，与预期的结果相符。
实施例9.ELISA定性检测产物与炭疽毒素保护抗原(PA)的特异性结合以基因重组PA(自制)包被NUNCTM酶联板，3％BSA封闭后加入ATR-Fc融合蛋白，孵育后充分洗涤，再加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)酶标多抗，孵育后加入TMB试剂显色，450nm测OD值。以anti-PA鼠源单克隆抗体(自制)为阳性对照，HRP酶标二抗为山羊抗小鼠IgG Fc多抗，以基因重组肿瘤坏死因子受体(TNFαR)-Fc和人IgG1的Fc段连接而成的TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel，自制，文章待发表)作为对照。在未包被PA的微孔中直接包被未转染的CHO-K1细胞培养上清为阴性对照，同时，还直接包被anti-PA鼠源单克隆抗体为阳性对照。
用ELISA方法初步确定了表达的ATR-Fc与炭疽毒素保护抗原PA具有特异性结合的能力(图10)。该蛋白与PA的结合能力，与anti-PA单克隆抗体相似，表明与人IgG Fc融合后，不仅不影响ATR与其配体PA的结合，甚至ATR-Fc与PA结合的亲和力比可溶性受体sATR与PA的亲和力还高1个数量级，这个结果与其他受体-Fc融合蛋白相似，例如TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel)与TNFc的亲和力比sTNFαR高50-1000倍，更高的亲和力更有利于结合和中和炭疽毒素。非常有趣和令人意外的是，本来作为阴性对照的重组TNFαR-Fc融合蛋白，ELISA结果却表明该融合蛋白与PA有中等强度的结合能力(图10)。我们正在测定Enbrel与PA的亲和力，以及验正Enbrel在炭疽毒素PA+LF细胞致死实验中能否起到中和毒素和保护细胞的作用。如果证明TNFαR-Fc融合蛋白可与PA结合，那么可以断定TNFαR是炭疽毒素PA的第三种细胞受体，并且Enbrel可能在防治炭疽感染中有一定的作用。
实施例10.ATR-Fc融合蛋白在炭疽致死毒素杀伤小鼠巨噬细胞J774A.1实验中保护细胞的作用在96孔细胞培养板(NUNC公司)中预先用100μl含10％胎牛血清(Hyclone公司)的MEM培养基(Hyelone公司)培养J774A.11小鼠巨噬细胞(ATCC No.TIB-67)，细胞密度为1×105cells/孔，基因重组炭疽毒素保护抗原(PA)100ng/ml(来源军事医学科学院微生物流行病研究所，参见文献Xu J(许俊杰)，Dong D(董单)，Chen W(陈薇)，et al.Expression，purification and characterization of the recombinant anthrax protectiveantigen.Chin.J.Biotechnol.2004，20(5)，652-655)和基因重组炭疽毒素致死因子(LF)100ng/ml(来源军事医学科学院微生物流行病研究所，参见文献Guo Q，Xu J，Dong D，Fu L，Chen W.Expression and characterization of the recombinant anthrax lethal factor.Acta.Microbiol.Sinica.2004，44(6)，749-751)与溶解于含10％胎牛血清(Hyclone公司)MEM培养基(Hyclone公司)中不同浓度的基因重组ATR-Fc融合蛋白在37℃条件下孵育30分钟，取100μl上述溶液加到有J774A.11小鼠巨噬细胞生长的96孔细胞培养板中，在37℃条件下孵育3小时，弃去培养上清，每孔加入100μl含0.5mg/ml MTT(Sigma公司)的pH7.0的磷酸缓冲液，在37℃条件下孵育30分钟，之后弃去上清，每孔加入100μl酸化异丙醇溶液(0.5％SDS(w/v)，25mM HCl溶于90％的异丙醇中)。在振荡器上振荡摇匀，用酶联仪(BioRad公司)在570nm波长下测定OD值。观察每个孔中活细胞比率。实验表明(图11)ATR-Fc浓度在37.5μg/ml的浓度下便可以充分保护J774A.1细胞免受炭疽致死毒素的致命攻击，说明ATR-Fc可以用于预防和治疗炭疽感染。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>459<212>PRT<213>人工合成<400>1Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg20 25 30Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile
35 40 45Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr50 55 60Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met65 70 75 80Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr85 90 95Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val100 105 110Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser115 120 125Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val130 135 140Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr145 150 155 160Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr165 170 175Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala180 185 190Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu195 200 205
Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu210 215 220Ala Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro225 230 235 240Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro245 250 255Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr260 265 270Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn275 280 285Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg290 295 300Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val305 310 315 320Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser325 330 335Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys340 345 350Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe370 375 380Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu385 390 395 400Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe405 410 415Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly420 425 430Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr435 440 445Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455<210>2<211>1380<212>DNA<213>人工合成<400>2atggccacgg cggagcggag agccctcggc atcggcttcc agtggctctc tttggccact 60ctggtgctca tctgcgccgg gcaaggggga cgcagggagg atgggggtcc agcctgctac120ggcggatttg acctgtactt cattttggac aaatcaggaa gtgtgctgca ccactggaat180
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权利要求
1.一种炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受体(ATR)与人Fc的二聚体融合蛋白，单链ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459个氨基酸残基；其中前27个氨基酸为ATR的信号肽；成熟的单链ATR-Fc有432个氨基酸残基，二聚体为864个氨基酸残基。
2.编码炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白单链的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的碱基序列。
3.权利要求1所述的炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白用于制备治疗炭疽病毒感染的药物的应用。
4.含有权利要求2所述的编码炭疽毒素受体ATR-Fc融合蛋白的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于该载体为真核表达载体。
6.含有权利要求4或5所述的表达载体的细胞系。
7.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。
8.权利要求7所述的细胞系用于制备治疗炭疽病毒感染的药物的应用。
9.表达ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO细胞株ATR-Fc-1D5，编号为CGMCCNo.1399。
10.权利要求9所述的表达ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO细胞株用于制备治疗炭疽病毒感染的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种炭疽毒素受体ATR－Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受体(ATR)与人Fc的二聚体融合蛋白，单链ATR－Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共459个氨基酸残基；其中前27个氨基酸为ATR的信号肽。ATR－Fc融合蛋白可用于制备治疗炭疽病毒感染的药物。本发明的优点在于这种融合蛋白可与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fab片段，而Fc段又提供了抗体的生物学活性，它有以下特点(1)无抗原性，两段蛋白均来自人体；(2)亲和力高；(3)不用担心病毒或菌株等抗原的突变；(4)也具有抗体的ADDC效应和CDC效应；(5)半衰期长，与人源抗体相近(10～20天左右)。
文档编号A61K39/395GK1724570SQ20051008423
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月18日 优先权日2005年7月18日
发明者胡显文, 高丽华, 陈惠鹏, 师明磊, 陈薇, 许俊杰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所