专利名称：樟芝抗氧化酶的蛋白质与核酸及其制造方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种樟芝抗氧化酶的蛋白质、氨基酸及其核酸、核苷酸，及可供制造该蛋白质的表现载体、宿主细胞及制造方法，与含有该蛋白质的医药组成物。
背景技术：
抗氧化酶包含超氧歧化酶(superoxide dismutase，SODEC 1.15.1.1)及过氧化还原酶(peroxiredoxin，Prx，例如1-Cys Prx和2-Cys Prx等)，它们对维持身体健康起重要作用。在2003年，Gems和McElwee氏指出长寿基因是包含多种抗氧化酶和热休克蛋白，这些抗氧化酶和蛋白能恢复已不正常折迭的蛋白质〔misfolded proteins〕的构形和活性，而有利于寿命增长。同年，Neumann氏等人指出Prx在小鼠〔mice〕中如使上述抗氧化酶失去活性将造成严重的溶血性贫血和癌化致使寿命剧减，足见对生物体的寿命、健康和解毒有重要作用，值得研究分述如下超氧歧化酶SOD它的功能是排除O2·-，有报告指出SOD应用在创伤伤口能加速愈合和清除脸部黑斑、雀斑。又，SOD具有调节神经细胞产生IL-1β、NO和TNF-α的功能(Chang，et al.，2001)，故SOD在维持身体健康中有重要作用。SOD存在于好氧性或厌氧性的真核或原核生物中，能将超氧自由基催化成氧分子或过氧化氢，提供了生物体抵抗毒性氧所带来的破坏与伤害的机能，其反应式如下。SOD是含金属的酵素蛋白，根据其活性位置所结合的金属辅因子的不同一般可分为铜锌型、锰型及铁型三种类型(Bannister，et al.，1987)，这三种不同类型的SOD分布于不同的物种与不同的区位。1969年美国学者McCord与Fridovich发现此种含铜锌的蛋白质具有清除超氧自由基的功能，因此将它命名为SOD，随后陆续在各种生物体内发现有Cu/Zn-SOD的存在。在真核细胞中，以甘薯和木瓜Cu/Zn-SOD为例，其次单元体分子量为19kDa，纯化出来的蛋白质呈淡蓝色，在pH2.2～12之间安定，热安定性甚高，4％ SDS or 2M的咪唑〔imidazole〕的环境的下仍能维持其活性(Lin，etal.，1995，1999)。由X-光晶格绕射牛类动物〔bovine〕的Cu/Zn-SOD蛋白分子，发现有三个带正电荷的氨基酸形成带正电荷的活性通道，分别是Arg141、Lys120、Lys135，铜离子在活性中心的位置是由四个His(44、46、61、118)的咪唑环基〔imidazolering〕形成配位键，锌离子则是以His61做为桥梁与铜离子连结，其它与锌离子键结的氨基酸残基尚有His61、His69、His78及Asp81。上述Cu/Zn-SOD蛋白分子的内生性的双硫键位于Cys60及Cys161(Steinman，et al.，1974；Schinina，etal.，1996)。SOD与超氧自由基的反应速率极快，几乎接近于扩散极限，但活性中心的铜离子暴露于溶剂的面积却不及酵素表面积的0.1％，Cu/Zn-SOD蛋白质次单元体表面多是带负电，所以因为同性电荷的斥力，将同样带负电的超氧自由基送到带正电的活性中心，进行酵素的催化反应(Tainer，et al.，1983)，因此静电力被认为对引导负电性的超氧自由基到达活性中心有促进作用。铜离子在歧化反应中扮演了氧化与还原两种角色，而锌离子并没有参与催化作用，其功能主要是在安定整个酵素的结构。若以其它金属离子取代铜离子时，酵素将失去活性，但若以Co2+、Hg2+或Cd2+甚至空位取代锌离子，则酵素分子仍具有部分活性(Fridovich，1986)。Mn-SOD在1970年由大肠杆菌中分离出来呈淡红色，主要位于原核细胞与真核细胞的粒线体中。蛋白质的活性随着次单元体活性中心锰离子的价数改变而改变，当活性中心锰离子带正二价电荷时具有酵素的催化能力，当活性中心锰离子带正三价电荷时则呈休息状态，不具有酵素的催化能力。Mn-SOD多为由两个蛋白质次单元体组成的二元体，但也发现有四元体甚至三元体的存在。以T.thermophilus菌的Mn-SOD为例，其每单元体分子量约19～22kDa，每个蛋白质单元体中含有一个锰离子。该菌的Mn-SOD由His26、His81、Asp175、His179与锰离子键结(William，et al.，1984)。Fe-SOD分布于原核细菌细胞基质中，藻类、某些高等植物及其叶绿体中，然而在所有的动物组织中都没有发现Fe-SOD存在，但在一些高等植物组织中则发现有Fe-SOD存在，例如银杏(Ginkgo biloba)、蕃茄、十字花科的油菜、水稻的花器(Pan and Yan，1991)。Fe-SOD呈淡黄色，在核酸与氨基酸序列上与Mn-SOD相似(William，et al.，1984；Wayne，et al.，1991)，对热及pH值安定性较差，也不受氰化物〔cyanide〕抑制，但对过氧化氢则较无抵抗力，且与Cu/Zn-SOD的氨基酸序列有明显的不同。Fe-SOD通常是由两个蛋白质次单元体组成，每个蛋白质单元体的分子量约18.5～22kDa左右，但也有发现以四元体(Lim，et al.，1997)的形式存在，在每个单元体中含有0.5～1个铁离子。以大肠杆菌E.coli为例，其Fe-SOD以His27、His81、Asp163、His167与铁离子键结(Lim，et al.，1997)。酵素的活性随着单元体活性中心铁离子的价数而改变。当活性中心铁离子带正二价电时，具有酵素的催化能力，带正三价电时酵素呈现休止状态。
过氧化还原酶Prx于2003年Horling氏等在阿拉伯芥的芽中发现有七种基因产物，来适应多种氧化还原环境，分别称2-Cys PrxA、2-Cys PrxB、PrxQ、PrxIIA、PrxIIB、PrxIIC、PrxIIE，尤其PrxIIB受tB氧化剂〔tertiarybutylhydroperoxide〕所诱发，PrxQ对过氧化物〔peroxide〕和双胺化合物〔diamide〕的处理最容易被诱导。另外2002年Castro氏等人报告，寄生虫(Leishmania infantum)因2-Cys Prx的表现〔expression〕可增强对H2O2和tB氧化剂的防御力。其分子量约21kDa。
过氧化还原酶Prx主要功能在排除生物体内的过氧化物如H2O2、3-丁基过氧化物〔t-butylperoxide〕、异丙苯过氧化物〔cumene peroxide〕等，这些过氧化物如不及时清除，则会对生物体(如蛋白质，脂质，和核酸)造成许多伤害，累积这些受伤害的物质是致使老化或神经退化疾病的原因。由蛋白质序列比较，依据保守区的半胱氨酸位置〔cysteine residues〕，过氧化还原酶Prx可分成二大族群〔1〕、1-Cys Prx是缺乏Cys170而仅具有Cys47保守区。〔2〕、2-Cys Prx是具有Cys47和Cys170二保守区。Kawazu氏等人从疟疾原虫(P.falciparum)分别选殖到2-Cys Prx和1-Cys Prx。
过氧化还原酶Prx是一种新奇的抗氧化蛋白，属于过氧化酶peroxidase的家族中的一员，分子量约25KDa，其以硫氧化还原蛋白系统thioredoxin(Trx)system(Trx，Trx reductase和NADPH)作为电子提供者。过氧化还原酶Prx可保护一些易受自由基伤害的酵素系统恢复活性〔例如，经由金属催化自由基产生系统metal-catalyzed oxidation systems维他命C氧化系统ascorbateoxidation system(Fe3+，O2and ascorbate)和硫氧化系统thiol oxidation system(Fe3+，O2and RSH)〕，除此之外，过氧化还原酶Prx尚具多种功能转译调控，细胞凋零，免疫力和感染力，最显著的是它的抗氧化性质。Prx依据氨基酸序列，组织分布，和细胞位置至少可分成5大族群(Gourlay，et al.2003)。
活性氧ROS(reactive oxygen speceies)的产生主要是在于呼吸或外在的阳光，辐射和药物的氧化还原及刺激宿主的吞噬细胞(phagocytes)所造成氧的不完全还原。ROS的增加及氧化压力的增加，生物均具抗氧化压力的机制如抗氧化酶和抗氧化分子如SOD、过氧化氢酶(catalase)、过氧化酶(peroxidase)、硫氧化还原蛋白(thioredoxin)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)来保护，以免受到ROS的伤害。
过氧化还原酶Prx主要是还原H2O2和烷基过氧化氢(alkyl hydroperoxide)成为水和醇类(Jeon and Ishikawa，2003)。细胞也会产生活性硫(reactive sulfurspecies，RSS)如亚硫酰自由基(thinyl radicals，RS)，二硫自由基阴离子(disulfideradical anions，RSSR)和过氧磺胺自由基(peroxysulfenyl radicals，RSOO.)。Prx也能排除活性硫，以避免活性硫造成的伤害。
樟芝(Antrodia camphorata)又名牛樟芝、牛樟菇(臧和苏，1990)，报导指出对肝肿瘤及子宫颈肿瘤的治疗非常有效，因只能在台湾牛樟树生长，故民间视樟芝为珍宝。因樟芝是菇类唯一能代谢牛樟树中大量抑菌性黄樟素而能生长的菇类，因有不同于他种菇类的生理机能。樟芝在民间传统疗法上最主要应用于食品中毒，腹泻、下腹部疼痛、皮肤痒及肝癌等症状。在众多具有生理活性的成分中，抗氧化物特别受到重视，因此针对其抗氧化成分，其抗氧化成分的分析，在深层培养(A.camphorata in submerged culture)中被详细的研究，指出在樟芝菌丝体的萃取液中，三萜类对于脂质的过氧化作用具有抑制的功能，三萜类与多酚化合物对于清除氧自由基有非常重要的作用(Song and Yen，2002)。由于樟芝中含有大量且成分复杂的抗氧化成分，因此一系列通过提高抗氧化效果而达到保护正常细胞或毒杀癌化细胞的机制，也陆续做了研究。以樟芝菌丝体甲醇萃取物在低剂量下，对肝肿瘤细胞株Hep G2有很强的细胞毒杀作用，其次为水萃取部分，但发酵滤液则几乎不具毒杀性。以C57BL/6和BALB/c两种小鼠进行试验，结果显示鼠血中TNF-a、IFN-γ和IL-2皆明显增加，而IL-4和IL-10则与控制组无明显差异。此外，樟芝菌丝体发酵过滤液利用其抗氧化物与清除自由基的能力，有保护其肝功能正常的效果。透过樟芝菌丝体萃取液的处理，可避免人类正常的红血球细胞中的GSH与ATP的消耗，并对白血病leukimia HL-60细胞产生细胞毒性，显示樟芝菌丝体可能具有抗氧化物与抑制肿瘤的效应(Hseu，et al.，2002)。樟芝对于肝功能的疾病疗效十分良好，其多糖体对于B型肝炎病毒有明显的抑制效果。在已发表的菇类多糖体中，樟芝为第一个被证实其多糖体对于B型肝炎病毒有直接抑制效果的物种(Lee，et al.，2002)。但关于樟芝子实体的研究报告较少，其疗效应高于菌丝体，故以新鲜樟芝子实体为材料。
SOD和抗氧化相关基因常因来源不同使其蛋白质的稳定性和活性不同，但樟芝子实体SOD和抗氧化相关基因产物所知甚少，即使其它生物，尤其上述抗氧化相关基因，也是近几年的报告，因此值得将樟芝子实体SOD和抗氧化相关基因作系统的研究。
以采自台湾地区的南投县鹿谷乡的新鲜樟芝子实体为材料，抽取RNA，合成cDNA。借由EST序列信息设计引子，用樟芝子实体cDNA为模板，以PCR增生SOD和Prx DNA并进行筛选，筛得樟芝子实体SOD和Prx的片段DNA，再进行5′RACE和3′RACE，最后得到全长Mn-SOD和1-Cys Prx，2-Cys Prx的cDNAs，继之与表现型载体连接，植入E.coli和酵母菌进行大量生产并纯化。SOD和Prx基因产物均为蛋白质，分子量介于41～16kDa之间，而如何植入真核细胞是另一大考验，因此在N端分别接上几个氨基酸(Tat)，则Tat-SOD，-Prx产物将容易植入真核细胞以发挥其功能。可应用于美白淡斑化妆品，或添加在烫伤药膏中。
发明内容
本发明提供一种樟芝抗氧化酶的蛋白质与核酸，及制造该蛋白质的载体、宿主细胞及方法，与含该蛋白质的组成物。
本发明由新鲜樟芝子实体的选殖并选择表现至少一种抗氧化酶(Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx)。该酶蛋白可去除过氧化物并因此可应用于化妆品、烫伤药膏及皮肤移植等。
蛋白质本发明是关于一种抗氧化酶蛋白质，其选择包含序列辨识编号如序列表1至3所示的序列辨识编号1至6〔SEQ ID NO1～6〕的氨基酸序列。根据本发明，凡具有与本发明樟芝抗氧化酶蛋白质及其基因相同的去自由基与过氧化物功能的相似物也包含于本发明的范围内。如本文所使用，词语″去自由基与过氧化物的功能相似物″为一具有与本发明樟芝抗氧化酶蛋白质的去自由基与过氧化物功能相同的蛋白质。较佳的，本发明蛋白质包含如序列辨识编号SEQ ID NO1～6所示的氨基酸序列。
根据本发明的较佳具体实施例，选殖出具有去自由基与过氧化物活性的抗氧化酶蛋白质，其具有序列辨识编号1～6的氨基酸序列，分别实质包含229，223与188个氨基酸。将本发明樟芝抗氧化酶氨基酸序列与其它物种的Mn-SOD，Prx序列加以比较，本发明樟芝抗氧化酶应属于Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx。此外本发明也发现樟芝抗氧化酶蛋白质具有良好的比活性，pH值安定性，热安定性，蛋白酶安定性及化学药剂安定性。例如本发明樟芝抗氧化酶蛋白质具下列特性本发明樟芝抗氧化酶的Mn-SOD酶比活性约为5320U/mg；在80℃加热7分钟后，仍能维持相当高(约50％)的活性；经5.4～11.0的pH值处理，对其活性无影响；经2％SDS或0.8M浓度的咪唑(imidazole)处理，蛋白质或活性都没有明显改变；加入酶液量1/20的]胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或胰蛋白酶(trypsin)，在37℃下反应3h后，进行电泳分析，经蛋白质染色及活性染色的结果发现蛋白质或活性都没有明显改变。
本发明樟芝抗氧化酶的1-Cys Prx在60℃加热16min后，仍能维持37％的活性；经5.4～11.0的pH值处理，对其活性无影响；1.6M浓度的咪唑处理，仍能维持14％的活性；加入酶液量1/20的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶，在37℃下反应20min之后，仍能维持15％的活性。
本发明樟芝抗氧化酶的2-Cys Prx在60℃加热2min后，仍能维持相当高(约68％)的活性；经5.4～11.0的pH值处理，对其活性无影响；经2％SDS或0.4M浓度的咪唑处理，仍能维持相当高(约50％)的活性；加入酶液量1/20的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶，在37℃下反应3h后，仍能维持相当高(约50％)的活性。
再有，根据本发明，樟芝抗氧化酶蛋白质的制备是在可容许该蛋白质表现的条件下，培养包含编码本发明蛋白质的核酸分子的宿主细胞及回收该蛋白质。
核酸本发明提供一种分离核酸分子，包含编码具SEQ ID NO1～6(见序列表1～6)所示樟芝抗氧化酶蛋白质氨基酸序列的核酸序列。本文所使用的词语″核酸分子″意指包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(如mRNA)、使用核酸同类物所产生的DNA或RNA同类物及其衍生物、片段及同源物。核酸分子可为单股或双股，但以双股DNA较佳。本文所使用的词语″分离核酸″分子意为分离存在于天然物质的其它核酸。
根据本发明，核酸可仅包含编码樟芝抗氧化酶蛋白质生物活性的部分片段。本文所使用的语词″片段″意指编码仍具生物活性的樟芝抗氧化酶蛋白质片段的核苷酸序列部分。
根据本发明的一较佳具体实施例中，本发明分离核酸分子具有SEQ IDNO1～6的核苷酸序列(见序列表中第1、第3、第5个序列)或其简并序列(摆动假说，Wobble hypothesis)。在另一较佳具体实施例，本发明分离核酸分子包括如SEQ ID NO1(Mn-SOD)所示的核苷酸序列，其全长为891，转译区有687bp，可以转译出229个氨基酸。SEQ ID NO3(1-Cys Prx)所示的核苷酸序列，其全长为837，转译区有669bp，可以转译出223个氨基酸。SEQ ID NO5(2-Cys Prx)所示的核苷酸序列，其全长为939，转译区有564bp，可以转译出188个氨基酸。本发明核酸分子与其它来源的序列比较，有高的相似性。本发明核酸所编码的樟芝抗氧化酶蛋白质可将O2·-还原成H2O2和将过氧化物如H2O2，t-butylperoxide，cumenene peroxide等还原成水和醇类，提供了生物体抵抗毒性氧所带来的破坏与伤害。本领域技术人员，基于基因密码的简并性(摆动假说)，可制得许多编码本发明樟芝抗氧化酶蛋白质的核酸。因此，针对一已被鉴定的特定氨基酸序列，本领域技术人员可在不改变樟芝抗氧化酶蛋白质的氨基酸序列的情况下，借简单修饰一或多个密码而制出各种不同核酸。
根据本发明，编码樟芝抗氧化酶蛋白质的核酸可使用标准杂交及选殖技术来分离。特别的，本发明核酸可使用标准选殖及筛选技术，自新鲜樟芝子实体的cDNA库分离出来。本发明核酸的放大(amplification)可根据标准PCR放大技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板及适当的寡核苷酸引子而得。经放大的核酸可选殖至适当载体并借DNA序列分析来鉴定。
表现载体及宿主系统本发明还提供一表现载体，包含本发明的核酸。本发明表现载体包含一编码如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5所示的蛋白质核酸序列。
本文所使用的词语″表现载体″是可直接表现连接至其上的基因核酸分子。较佳的载体为可自行复制及表现连接于其上的核酸。一般而言，可用于重组DNA技术的表现载体通常为″载体″形式，一般为环状双股的DNA，在其为载体形式时并未融合至染色体。
本发明编码抗氧化酶蛋白质或其功能相似物的核酸序列可插入适当的表现载体中以表现具生物活性的抗氧化酶蛋白质。该表现载体需含有插入编码序列的转录及转译等必要组件。根据本发明，本领域技术人员可利用熟知的方法构筑含有编码抗氧化酶蛋白质及适当转录及转译控制组件的表现载体。此等方法包括体外重组DNA技术，合成技术及体内基因重组技术等。
本发明另一目的是提供包含表现载体的宿主细胞，该载体包含编码抗氧化酶蛋白质的核酸序列。本文所使用的词语″宿主细胞″为可经载体(如质体)感染的宿主细胞。根据本发明，许多宿主系统可用于包含且表现编码抗氧化酶蛋白质的序列。此等宿主系统包括但不限于微生物(如以重组质体或表现载体转形的细菌)、酵母菌(如以酵母菌表现载体转形的酵母菌)、或动物细胞系统。本发明的宿主细胞为大肠杆菌及酵母菌。本发明将抗氧化酶蛋白质的cDNA在大肠杆菌或酵母菌系统表现，确实能表现出具有活性的重组蛋白质，经亲和性管柱进行快速纯化后，获得纯的抗氧化酶蛋白质。
根据本发明的一具体实施例本发明樟芝抗氧化酶的Mn-SOD是以pYEX-S1为表现型载体的构筑；设计N端含限制Eco RI片段(5’GGAATTCGATG TCC ATG CTC AGT ACT GCT C3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTT CTG TGC AGCTTC GAC GTA G 3’)，以抗氧化酶蛋白质的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。将该DNA送入大肠杆菌中进行筛选，抽取的质体DNA是使用限制酶Eco RI处理，所得片段与相同限制酶处理过的pYEX-S1接合，送入酵母菌(yeast)，并以介质YPD medium(1％酵母提取物yeast extract，2％蛋白胨peptone，2％葡萄糖glucose)在30℃下培养5D(170rpm)，打破菌体，以10,000xg离心5min，收集上清液后，经亲和性管柱进行快速纯化后。电泳后作蛋白质染色，经12.5％SDS-PAGE，于25kDa处可看到明显色带，此即为抗氧化酶蛋白质。为方便抗氧化酶蛋白质穿过细胞膜，可在前端接上含有九个氨基酸的Tat，并将接上Tat的抗氧化酶蛋白质DNA送入酵母菌中进行表现。
本发明樟芝抗氧化酶的1-Cys Prx也以pYEX-S1为表现型载体；设计N端含限制酶Eco RI片段(5’GGAATTCG ATG CCT AGC CTC CGC CTT GGA 3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTCA GTG GTG GTGGTG GTG GTG TAC GTT GAG AGG GGT GGT TCG 3’)，以1-Cys Prx的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。其余步骤与Mn-SOD相同。
本发明樟芝抗氧化酶的2-Cys Prx也以pYEX-S1为表现型载体；设计N端含限制酶Eco RI片段(5’GGAATTCG ATG GTC GCC ATC GTC CAG AA3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTGGTG GTG CCA TGT TCG TCC TTT TAA ACG G 3’)，以2-Cys Prx的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。其余步骤与Mn-SOD相同。
医药组成物本发明还包括一种医药组成物，其包含本发明的蛋白质。除本发明蛋白质外，该医药组成物可含有适当的医药上可接受的载剂。
本发明的医药组成物可以本领域已知的方式(例如利用常用方法)制造，该常用方法包括混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包胶、包陷及/或冷冻干燥等步骤。
本发明的医药组成物可借任何途径投药，这些途径包括(但不限于)口服、静脉内、肌内、动脉内、穿皮、皮下、腹膜腔内、鼻内或肠道给药。
实用性本发明来源于樟芝的樟芝抗氧化酶蛋白质，其活性皆比其它来源的抗氧化酶蛋白质为佳。因此，本发明樟芝来源的樟芝抗氧化酶蛋白质在医学、食品、学术研究等方面更具利用价值及贡献。
本发明樟芝抗氧化酶蛋白质可将O2·-还原成H2O2和过氧化物如H2O2，t-butylperoxide，cumenene peroxide等还原成水和醇类，提供生物体抵抗过氧所带来的破坏与伤害的能力。本发明抗氧化酶蛋白质应用于化妆品，可去除黑斑、雀斑及防止皱纹；添加于烫伤药膏可加速伤口愈合；在整形外科的皮肤移植及人造皮移植应用中，可借由抗氧化酶蛋白质防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合。
序列1为樟芝子实体第一种抗氧化酶蛋白质(Mn-SOD)的核苷酸序列，全长为891bp；转录区为687bp；编码区域为229个氨基酸残基。
序列3为樟芝子实体第二种抗氧化酶蛋白质(1-Cys Prx)的核苷酸序列，全长为837bp；转录区为669bp；编码区域为223个氨基酸残基。
序列5为樟芝子实体第三种抗氧化酶蛋白质(2-Cys Prx)的核苷酸序列，全长为939bp；转录区为564bp；编码区域为188个氨基酸残基。
具体实施例方式下列实施例进一步说明本发明，但非欲限制本发明的范围，任何本领域技术人员所知的替代和改变，均包含于本发明的范围中，而不偏离本发明的精神和目的。
樟芝抗氧化酶(Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx)cDNA的选殖由新鲜樟芝子实体总RNA的抽取、cDNA的合成并建立cDNA库和EST序列信息、借由EST序列信息设计引子，用樟芝cDNA为模板，以PCR增生抗氧化相关DNA并进行筛选，再进行RACE，最后得到全长抗氧化酶cDNA。
樟芝子实体总RNA的抽取取4g樟芝子实体以液态氮急速冷冻，于研钵中磨成粉末后取出，马上与20M1的溶解缓冲液(lysis buffer)(Novalgen’s Straight’s mRNA Isolation System)于30mL离心管中混合，置于4℃下5min后以9,000xg在4℃离心15min，离心后取上面水溶液层，大约有20mL。将水溶液吸至50mL Falcon中加入3mg磁化颗粒(magnetight particles)混匀，置于4℃下以磁座吸住磁化颗粒(magnetightparticles)，以1.5mL wash buffer洗涤三次，在60℃以0.5mL水洗离即为RNA(10ug)，加入0.1 vol.3 M醋酸钠(sodium acetate)和0.8vol.异丙醇(isopropanol)置于-75℃20min，随后以12,000rpm在4℃下离心15min，以70％乙醇(ethanol)共清洗三次，干燥后储存于-70℃备用。
樟芝5’-RACE-Ready cDNA与3’-RACE-Ready cDNA的合成Based on BDBiosciences Clontech’s SMART RACE cDNA Amplification Kit.
5’-RACE-Ready cDNA将下列所有反应溶液加入于1.5mL的微量试管中并在冰上完成mRNA(ug/uL)(1ug) 1uL5’-CDS primer 1uLSmart II A Oligo 1uLH2O 2uL总计 5uL3’-RACE-Ready cDNAmRNA(ug/uL)(1ug) 1uL3’-CDS primerA1UlH2O 3uL总计 5uL小心均匀混合反应溶液，并稍微离心后置于72℃恒温水浴槽中2min。作用后将离心管置于冰上2min。加入2uL 5X first-strand buffer，1uL 20mM DTT，1uL 10mM dNTP混合，1uL powerscript reverse transcriptase于42℃恒温水浴槽中1.5h。后加入200uL tricine-EDTA buffer于72℃恒温水浴槽中7min后储存于-70℃备用。
樟芝抗氧化酶Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx基因的选殖借由樟芝EST序列信息设计引子，用樟芝5’-RACE-Ready cDNA与3’-RACE-Ready cDNA为模板，以PCR增生抗氧化相关基因DNA并进行筛选，得樟芝抗氧化基因的片段DNA，再进行5′RACE与3’-RACE，最后得到全长抗氧化酶的cDNA。
Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx cDNA的表现经由PCR、胶体的制备及电泳、次选殖(subcloning)、在酵母菌表现型载体(pYEX-S1)的构筑、及蛋白质的诱发与样品的电泳分析等程序达成。
PCR程序将下列反应试料加至0.5mL微量试管中，依序加入下列试剂模板DNA 0.2ug5′-正义引子10pmol3′-反义引子10pmol10X Taq DNA聚合酶缓冲液 5uL15mM MgCl26uLTaq DNA聚合酶 2.5units10mM dNTP 1.5uL加入无菌水至总计50uL加入50～100uL矿物油，进行25 cycles of PCR(94℃ for 30min，50℃for 30min，72℃for 1.5min)PCR反应结束后，可得DNA产物，经回收后可用来进行下一步的实验，例如进行DNA重组，分析其序列。
胶体的制备及电泳所用的胶体为1.0％琼脂糖胶，倒入1X TAE缓冲液以能完全覆盖住胶为原则。取15uL PCR产物，加上其1/10体积的追踪染剂(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯蓝FF，30％甘油于水中)，注入孔中，另外也注入6uL的1kb DNA标记用来了解DNA样品的大小，接着以100伏特的电压进行电泳，待DNA染料移动至胶的2/3处，即可中止电泳。将完成电泳的胶以溴乙啶(EtBr)染色15min后，放入水中退染，之后即可置于紫外光源箱下观察，另外也以拍立得照相。
次选殖1.PCR产物与载体接合与宿主细胞转形取1uL PCR产物，加入1uL盐溶液，1uL的无菌水与0.5uL的pCR4之后，于室温下反应5min以进行连接。取前述已接合好的重组DNA，加入18uL TOPO10活性细胞中，置于冰上30min，后置于42℃的水浴中30sec进行热休克后立即置于冰上2min，加入150uL SOC培养基，在37℃下振荡培养60min，将其均匀涂布在含有50ug/mL抗生素氨苄青霉素(ampicillin)的LB琼脂糖的培养皿，在37℃培养12-16h之后，挑选50-80个单一菌株置于新的ampicillin的LB琼脂糖上，待进一步实验。
2.菌体的转印与放射性探针的制备将转印纸覆于培养皿表面，并以针头扎洞作定位之后，轻轻取出转印纸，此时培养皿上的菌落(colony)转印到转印纸上，转印工作完成。准备一浅盘，上覆3mm滤纸，倒入变性溶液(0.5M NaoH，1.5M NaCl)，倒入量以能充分湿润3mm滤纸为原则，将转印纸以吸附菌面朝上，放在湿润的3mm滤纸之上7min，接着取另一浅盘以中和溶液(1MTris-HCl，1M NaCl，pH7.5)充分湿润3mm滤纸之上7min。重复中和液步骤之后，将转印纸置于烘箱中，以60-70℃烘干，需时40min。之后，将转印纸放于紫外交联仪机器(Amersham)中，进行网状连结15sec后，待进一步以放射性探针来筛选。
放射性探针的制备寡核苷酸(3pmole/uL)0.5uL10X T4聚核苷酸基酶缓冲液 3.0uL聚核苷酸基酶(12unit) 1.5uL[r-32p]ATP 3.5uLH2O 21.5uL总计 30.0uL混合均匀，置于37℃下反应30min后。即完成放射性探针的制备，将放射性探针加入杂交溶液中，用来筛选所要的目标基因。
3.目标基因DNA的选殖取出前述经网状连结的转印纸，加入以1.5X SSC及0.1％SDS配制成的洗剂，在44℃下震摇30min，倒掉洗剂，加入不含放射性探针的杂交溶液(5X SSC，5X Denhardt溶液，0.5％SDS，100ug/mL鲑鱼精子DNA)，目的为去除一些非特异性的结合，以降低背景值，此一过程称为预杂交。倒出杂交溶液，加入含有放射性探针的杂交溶液，置于44℃水浴震摇16h以上，倒出含有放射性探针的杂交溶液，用前述洗剂，在44℃震摇15min，重复此一步骤2-4次。压干转印纸，进行自动放射显影，冲片后，挑出正反应株。
4.细菌质体的纯化与检视挑出正反应株培养于含ampicillin(50ug/mL)的LB，于37℃下培养6-8h。以10,000xg离心3min，取得菌体沉淀物，加入200uL再悬浮溶液(50mM Tris，pH7.5，10mM EDTA)振荡，使菌体悬浮状态。加入200uL溶裂液(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻的混匀，使菌体能被完全溶掉，质体能溶离出来。加入200uL中和液(1.32M醋酸钾)，小心的混匀，而后以12,000xg离心10min，取上清液，注于0.5mL离心管(含DNA吸附膜)，以12,000xg离心1min，使DNA能吸附于膜上，之后加入700mL的洗涤溶液，以12,000xg离心2min后。再以12,000xg离心2min以去除残留的酒精，最后加入50uL的热水(60℃)静置30sec后，以12,000xg离心2min，收集离心下来的质体DNA作质体的限制酶反应与电泳分析。即取DNA以及适量的限制酶，加上10 x reactin缓冲液，最后加无菌水使体积为10uL，在适当的温度下反应2h，以1％琼脂糖胶电泳分析，以确定嵌入DNA的大小。
5.序列的判读利用ABI PRISM 377-96DNA定序仪进行自动定序。
在酵母菌表现型载体的构筑表现载体为pYEX-S1，Mn-SOD是以pYEX-S1为表现型载体的构筑；设计N端含限制酶Eco RI片段(5’GGAATTCG ATG TCC ATG CTC AGT ACT GCTC3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTA GTG GTGGTG GTG GTG GTG TTT CTG TGC AGC TTC GAC GTA G 3’)，以抗氧化酶蛋白质的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。将该DNA送入大肠杆菌中进行筛选，抽取的质体DNA是使用限制酶Eco RI处理，所得片段与相同限制酶处理过的pYEX-S1接合，送入yeast，并以YPD medium(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose)在30℃下培养5D(170rpm)，打破菌体，以10,000xg离心5min，收集上清液后，经亲和性管柱进行快速纯化后。电泳后作蛋白质染色，经12.5％SDS-PAGE，于25kDa处可看到明显色带，此即为抗氧化酶蛋白质。更好的，为方便抗氧化酶蛋白质穿过细胞膜，可在前端接上含有九个氨基酸的Tat，并将接上Tat的抗氧化酶蛋白质DNA送入酵母菌中进行表现。
1-Cys Prx也以pYEX-S1为表现型载体；设计N端含Eco RI片段(5’GGAATTCG ATG CCT AGC CTC CGC CTT GGA 3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTCA GTG GTG GTG GTGGTG GTG TAC GTT GAG AGG GGT GGT TCG 3’)，以1-CysPrx的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。其余步骤与Mn-SOD相同。
2-Cys Prx是以pYEX-S1为表现型载体；设计N端含限制酶Eco RI片段(5’GGAATTCG ATG GTC GCC ATC GTC CAG AA3’)与C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5’GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CCA TGTTCG TCC TTT TAA ACG G 3’)，以2-CysPrx的cDNA为模板与引子进行PCR得到的DNA。其余步骤与Mn-SOD相同。
将其转殖入酵母菌[trp--ada---ura---]作为表现宿主。pYEX-S1(均先以Eco RI处理连接)，取前述已接合好的重组DNA，加入酵母菌活性细胞中，筛选挑出正反应株以进行蛋白质表现。
在酵母菌转形1.制备转形细胞(1)方法1选取单一菌落并完全的在YPD培养皿上划线，在28-32℃培养8～96h，从细菌培养基表层刮取菌，加入Yeastern商品SCOS混合液至110μL使试管中细菌浓度达5×107个/试管。
(2)方法2选取单一新鲜菌落加入1～10mL YPD培养液中，于28-32℃摇晃培养20～30h。将培养液加入10～100mL YPD培养液中静置8-24h，以2000xg离心10min，去掉上清夜，以无菌水清洗两次去除残余的YPD培养液，将沉淀物混合搅拌入110-115μL SCOS混合液直至细菌浓度达5×107个/试管。
2.制备SCOS混和液在1.5mL试管中加入100μL SCOS缓冲夜，加入5μL 1M DTT(保存于-20℃)，加入5μL ss DNA(保存于-20℃)，加入质体DNA(不超过5μL)。
3.制备干式选择性培养皿完全干燥的培养皿在Yeastern’s SCOS转形系统中可提供良好的转形反应，因此建议在将培养皿迭置前先将无盖培养皿置于无菌操作台内1h左右，待其完全干燥。
4.SCOS转形(1)将SCOS混合液与酵母菌悬浮细胞混合搅拌制成SCOS转形混合液。
(2)将试管加盖，置于45.5℃10～60min。
(3)将转形混合液直接涂敷于干燥培养皿[YNBD(1.7g yeast nitrogen base，5g硫酸氨，20g葡萄糖，15g琼脂糖溶于1L水)含有20ug Trp/mL]，此程序20sec内完成，将培养皿置于28-32℃下2～4天。
蛋白质表现取单一菌落(1～2mm)于10mL YWAAND(1.7g yeast nitrogen base，5g天冬酰胺酸，20g葡萄糖in one liter)含有20ug Trp/mL培养液，此容器使用125mL烧瓶，并于30℃培养箱中以250rpm震荡培养过夜，次日再加入5mL培养液使OD600达到0.1时并继续以30℃、250rpm震荡培养72h后，再加入10mLYPD并继续以30℃、250rpm震荡培养48h。
将所有菌液以5000xg、4℃离心10min，收取菌加入0.5g玻璃球及2mLPBS(pH8.0)，打破菌体，以10,000xg离心5min，收集上清液后，再加入2mL缓冲液，重复此一萃取步骤，最后用2mL缓冲液再萃取一次，一共收集6mL上清液，此为粗蛋白质样品，待进一步的电泳，电泳的胶体大小为10cm×8cm×0.75mm。
1.电泳胶体的制备将铝板与玻板拭净后，和隔条(spacer)组合好，放入制胶模型中，再依下表所列的用量配制胶体溶液分离凝胶，混匀并注入模型中，再加入适当的水压平，约经过1h，胶体形成后，移去水层，再注入堆积凝胶，并插上槽梳，待成胶即可。
2.电泳取适量样品与样品载入缓冲液混匀后注入胶体孔洞中，以100伏特电压进行电泳，native-PAGE约需65min，SDS-PAGE约需130min后中止电泳，小心取下胶体，进行考马斯蓝〔Coomassie blue〕染色将胶体浸于染剂中，均匀摇动30min，移去染剂，用无菌水清洗一次后，加入退染剂，退染12h即可。
3.胶体的干燥将欲干燥的胶体浸于10％甘油溶液中30min，取一玻板及两张配合玻板大小的玻璃纸，用水充分湿润玻璃纸，后将其中的一张平铺于玻板上，再放上所要干燥的胶体，最后铺上另一张玻璃纸，用塑料夹固定，置于室温下阴干。
4.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx的纯化因C端带有6个His，以Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharose superflow来进行亲和性管柱纯化，方法如下3mL的树脂管柱，用5vol.的PBS平衡，之后将6mL的粗蛋白质样品注入并收集流下来的液体(pass through)约6mL。再以3vol.PBS含20mM imidazole洗管柱，继之以1.5mL PBS含100mM imidazole冲提，共收集6个部分，其中有2个部分共3mL有收集到蛋白质，因为含有imidazole，所以需经过透析除去。
透析液将样品约3mL装入透析膜中，以透析夹夹好，放入含200mL 1/3PBS含有1mM DTT and 5％glycerol透析液的烧杯中，于4℃下透析4h以上，重复此透析步骤即可分装待进一步分析。
5.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx的蛋白质含量先制作蛋白质标准曲线(BSA standard curve)即分别取蛋白质标准品(BSA，0.5mg/mL)1、2、3、4、5、6uL于其所对应的灭菌水中，使最后体积达800uL，之后分别加入呈色剂200uL室温下反应5min，测OD595nm并依吸光值求出蛋白质标准曲线。将采收的样品依相同方法测得吸光值即可由标准曲线求得蛋白质含量。
6.活性测定Mn-SOD(1)首先将完成电泳的胶体，浸泡于21.6mL 2.5mM NBT(nitroblue tetrazolium)的水溶液中，避光摇动15min，移去NBT溶液，以去离子水清洗胶体后，再浸泡于21mL含有8×10-5M核黄素(riboflavin)及30mM TEMED的水溶液中，照光摇动，呈现透明亮带的区域为具有SOD活性之处。此法为利用riboflavin及光照条件下与TEMED反应，作为产生超氧的系统，NBT作为呈色剂(chromogenic reagent)。有SOD存在的胶体区域，超氧被分解，NBT不发生还原反应，而呈现透明的亮带。无SOD存在的区域，超氧与NBT发生还原反应，而生成蓝紫色的formaza(Beauchamp and Fridovich，1971)。
(2)依据RNASOD kit(Ardmore，UK)，取不同的稀释度S1～S6；S10.05mLMn-SOD标准品(5.9U/mL)，加入1.7mL的混和基质(含0.05mM xanthine，0.025mM INT[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride]，0.94mM EDTA，50mM CAPS buffer，pH10.2)。混和均匀后，加入0.25mLxanthine oxidase(0.02U)，混匀于37℃反应，分别在30sec及3min时，测定其在波长595的吸光值A1及A2，依据下列公式计算出抑制百分率后，以标准品的活性取对数作为横轴，抑制百分率作为纵轴，经过线性回归后，得到标准曲线。
(A2-A1)/2.5＝ΔAstandard or sample/min100-(ΔAstandhard or sample/min×100)/ΔAS1/min＝％inhibition取适量纯化的酶与标准品的测定方法相同，得到反应时间30sec及3min在波长595nm吸光值的变化，并换算成抑制百分率，对照标准曲线，即可求出蛋白质样品(sample)的SOD活性(U/mg)。
1-Cys Prx，2-Cys Prx活性测试先制作H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide标准曲线即分别取H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide标准品(1mM)各1、2、4、8、16uL于其所对应1/3PBS containing(5％glycerol and 1mM DTT)中，使最后体积达50uL，之后加入20uL 26.3％TCA，接着加入20uL 10mM Fe2+，最后加入10uL 2.5MKSCN，总体积100uL，测定OD475nm吸光值并依吸光值求出H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide标准曲线。将采收的样品依相同方法测得吸光值即可由标准曲线求得蛋白质在微量离心管中清除过氧化物(peroxide)的能力即微量离心管中加入1/3PBS含有(5％甘油和1mM DTT)，适量1mM H2O2和适量酶(enzyme)总体积达到50uL，室温下反应10min，即加入20uL 26.3％TCA，接着加入20uL 10mM Fe2+，最后加入10uL 2.5M KSCN，总体积100uL，测定OD475nm吸光值。
7.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx性质热稳定性分别取适量酶液于1.5mL试管中，各5管，分别于80℃(for Mn-SOD)，60℃(for 1-Cys Prx)，60℃(for 2-Cys Prx)加热0、2、4、8、16min后，置于冰上，进行15％Native-gel电泳，分别作蛋白质染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性测试(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。结果显示此酶非常安定，Mn-SOD在80℃加热其活性减少一半所需时间为7min，其降解常数为1.02×10-1min-1。
pH的影响分别取适量酶液，于1.5mL试管中，共6管，加入不同pH值缓冲液0.2M柠檬酸钠缓冲液(pH2.3、or 5.4)，0.2M Tris-Hcl缓冲液(pH7.8、or 9.0)，0.2M甘氨酸NaOH缓冲液(pH10.4 or 11.2)，在37℃下反应1h后，置于冰上，分别进行15％Native-gel电泳后作蛋白质染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性测试(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。结果显示此酶非常安定，显示以酸碱处理很安定，尤其至pH8～pH11处理1h对酶活性并没有影响。
SDS的影响分别取适量酶液，于1.5mL试管中，共5管，分别加入不同量的20％SDS，使SDS最终浓度为0、1、2、3、4％，在37℃下反应1h后，分别进行15％Native-gel电泳后作蛋白质染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性测试(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。结果显示Mn-SOD以SDS的处理也很安定，浓度高至4％时只抑制23％。
咪唑的影响分别取适量酶液，于1.5mL试管中，共5管，分别加入不同量的咪唑，使咪唑最终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6M，在37℃下反应1h后，分别进行15％Native-gel电泳后作蛋白质染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性测试(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。结果显示Mn-SOD以咪唑的处理也很安定，必须高至1.6M时对活性才有抑制(70％)。
蛋白酶的影响分别取适量酶液，于1.5mL试管中，共4管，分别加入相当酶液量1/20的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶于Tri-HCl缓冲液(pH8.5含20mM CaCl2)分别在37℃下反应1、2、3h，分别进行15％Native-gel电泳后作蛋白质染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性测试(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。结果显示Mn-SOD以胰蛋白酶的处理很安定，3h后，活性只下降23％。胰凝乳蛋白酶处理也很安定，3h后，活性只下降33％。
虽然本发明已利用前述较佳实施例详细化开，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与修改，因此本发明的保护范围当以权利要求书限定的范围为准。
序列表<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>891<212>DNA<213>樟芝(Antrodia camphorata)<220>
<221>CDS<222>(36)..(725)<400>1ctattcacat ataaaaacca ccgttaactc tcgcc atg tcc atg ctc agt act53Met Ser Met Leu Ser Thr1 5gct cgc acc gct gct cgc aca gcg cgc gcg tcg cgc gct ctc ccc ttt101Ala Arg Thr Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala Ser Arg Ala Leu Pro Phe10 15 20gcc tcg ttc tcg ctc gcc gcg agg gcc aag tcg ctg cac acg ctc cct149Ala Ser Phe Ser Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ser Leu His Thr Leu Pro25 30 35gag ctt gac tac gcg tac gat gca ctc gag ccg cac atc tct ggc cag197Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro His Ile Ser Gly Gln40 45 50atc atg aag ctg cac cat aca aag cac cac cag acg tac gtc acc ggc245Ile Met Lys Leu His His Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Thr Gly55 60 65 70ctc aac gcg gcg gag gag agc tac gcc aag gcg ccc tcg ccc aag gag293Leu Asn Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ala Lys Ala Pro Ser Pro Lys Glu75 80 85cgg att ctc ctt cag ccc gcg ctc aaa ttc aat ggc gga ggt cac atc341Arg Ile Leu Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile90 95 100aat cac tcg ctc ttc tgg aag aac ctt gcg ccc cag tcg cag ggt ggc389
Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Gln Ser Gln Gly Gly105 110 115ggc cag ctc gct gcg ggt ccc ttc aaa gat gca gta gat gct gac ttc437Gly Gln Leu Ala Ala Gly Pro Phe Lys Asp Ala Val Asp Ala Asp Phe120 125 130ggc ggt gtc gat ggc ttg aag aag aaa ttg aac gcg gcg aca gct gcc485Gly Gly Val Asp Gly Leu Lys Lys Lys Leu Asn Ala Ala Thr Ala Ala135 140 145 150atc cag ggc tcc ggt tgg ggc tgg ctt gga tac aat ccg acc act aaa533Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Tyr Asn Pro Thr Thr Lys155 160 165aag ctt gag gtt gtc aca acc gca aac cag gat cct ctc ctc tct cac581Lys Leu Glu Val Val Thr Thr Ala Asn Gln Asp Pro Leu Leu Ser His170 175 180att ccc ata att ggc atc gac atc tgg gag cac tca tac tat ctt caa629Ile Pro Ile Ile Gly Ile Asp Ile Trp Glu His Ser Tyr Tyr Leu Gln185 190 195tac cag aat gtg aaa gcc gac tac ctc caa gcc atc tgg agc gtc atc677Tyr Gln Asn Val Lys Ala Asp Tyr Leu Gln Ala Ile Trp Ser Val Ile200 205 210aat ttc aag gag gct gag cgc cgc tac gtc gaa gct gca cag aaa taa725Asn Phe Lys Glu Ala Glu Arg Arg Tyr Val Glu Ala Ala Gln Lys215 220 225agtgacgata taacctagag agttcgaaca tgctattgag atgacgtgtc aaagtggcga 785cggaagaatg gcagaagcat gggaggaccc attcgtcgtc gcactactga actgcatttg 845taatatataa cgttccaacg acacgcaatt cgtctcaaaa aaaaaa 891<210>2<211>229<212>PRT<213>樟芝(Antrodia camphorata)<400>2
Met Ser Met Leu Ser Thr Ala Arg Thr Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala1 5 10 15Ser Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ser Phe Ser Leu Ala Ala Arg Ala Lys20 25 30Ser Leu His Thr Leu Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu35 40 45Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Met Lys Leu His His Thr Lys His His50 55 60Gln Thr Tyr Val Thr Gly Leu Asn Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ala Lys65 70 75 80Ala Pro Ser Pro Lys Glu Arg Ile Leu Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe85 90 95Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala100 105 110Pro Gln Ser Gln Gly Gly Gly Gln Leu Ala Ala Gly Pro Phe Lys Asp115 120 125Ala Val Asp Ala Asp Phe Gly Gly Val Asp Gly Leu Lys Lys Lys Leu130 135 140Asn Ala Ala Thr Ala Ala Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly145 150 155 160Tyr Asn Pro Thr Thr Lys Lys Leu Glu Val Val Thr Thr Ala Asn Gln165 170 175Asp Pro Leu Leu Ser His Ile Pro Ile Ile Gly Ile Asp Ile Trp Glu180 185 190
His Ser Tyr Tyr Leu Gln Tyr Gln Asn Val Lys Ala Asp Tyr Leu Gln195 200 205Ala Ile Trp Ser Val Ile Asn Phe Lys Glu Ala Glu Arg Arg Tyr Val210 215 220Glu Ala Ala Gln Lys225<210>3<211>837<212>DNA<213>樟芝(Antrodia camphorata)<220>
<221>CDS<222>(53)..(724)<400>3acgcggggga gattaatttt tcagccttca tcttcattgc agagacatca tc atg cct58Met Pro1agc ctc cgc ctt gga agc att gcc ccc aat ttt gaa gct gag act acc106Ser Leu Arg Leu Gly Ser Ile Ala Pro Asn Phe Glu Ala Glu Thr Thr5 10 15cag ggt cac att aag ttc cac gac tgg att ggt gat tca tgg gcc atc154Gln Gly His Ile Lys Phe His Asp Trp Ile Gly Asp Ser Trp Ala Ile20 25 30ttg ttc tct cac ccg ggt gac ttc act cct gtc tgt aca acg gag ctg202Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr Glu Leu35 40 45 50gct gag gtc gca cga aag gct cct gaa ttc gca aag cgc aat gtc aaa250Ala Glu Val Ala Arg Lys Ala Pro Glu Phe Ala Lys Arg Asn Val Lys55 60 65gtt atc ggt atc tct gcc aac gat ctc aat gac cat gag aaa tgg gtg298
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<212>PRT<213>樟芝(Antrodia camphorata)<400>4Met Pro Ser Leu Arg Leu Gly Ser Ile Ala Pro Asn Phe Glu Ala Glu1 5 10 15Thr Thr Gln Gly His Ile Lys Phe His Asp Trp Ile Gly Asp Ser Trp20 25 30Ala Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr35 40 45Glu Leu Ala Glu Val Ala Arg Lys Ala Pro Glu Phe Ala Lys Arg Asn50 55 60Val Lys Val Ile Gly Ile Ser Ala Asn Asp Leu Asn Asp His Glu Lys65 70 75 80Trp Val Gln Asp Ile Asn Glu Tyr Gly Thr Lys Ser Leu Gly Pro Thr85 90 95Asn Val Gln Phe Pro Ile Ile Ala Asp Gly Asn Arg Lys Ile Ser Thr100 105 110Leu Tyr Asp Met Leu Asp Glu Gln Asp Ala Thr Asn Arg Asp Ala Lys115 120 125Gly Leu Pro Phe Thr Ile Arg Thr Val Phe Val Ile Asp Pro Lys Lys130 135 140Val Ile Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Pro Ala Ala Thr Gly Arg Asn Phe145 150 155 160Asp Glu Ile Leu Arg Val Val Asp Ser Leu Gln Leu Gly Asp Lys Tyr
165 170 175Arg Val Thr Thr Pro Val Asn Trp Gln Lys Gly Asp Asp Val Ile Val180 185 190His Pro Ser Val Ser Asn Glu Glu Ala Lys Thr Leu Phe Pro Glu Val195 200 205Thr Phe His Lys Gln Ser Tyr Ile Arg Thr Thr Pro Leu Asn Val210 215 220<210>5<211>939<212>DNA<213>樟芝(Antrodia camphorata)<220>
<221>CDS<222>(13)..(579)<400>5ttgaatacga ct atg gtc gcc atc gtc cag aaa cct gcg ccc gga ttc aag51Met Val Ala Ile Val Gln Lys Pro Ala Pro Gly Phe Lys1 5 10gcc acg gcc gtc gtt gat ggt cag ttc cag gat att tct cta tct gac99Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Gln Phe Gln Asp Ile Ser Leu Ser Asp15 20 25tac ttc gga caa tgg gtg gtt ctc ttc ttc tat ccc ctt gac ttc act147Tyr Phe Gly Gln Trp Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr30 35 40 45ttc gta tgc cca act gaa atc ctt gcc ttc aat gac gcc ctt cct caa195Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Leu Ala Phe Asn Asp Ala Leu Pro Gln50 55 60ttc aag gag ctg aac act act gtc ctc agc gtc tca act gat tca cac243Phe Lys Glu Leu Asn Thr Thr Val Leu Ser Val Ser Thr Asp Ser His65 70 75
tac gcg cat ttg gca tgg gcc acg caa gac cgc aag cag ggt ggt ctt291Tyr Ala His Leu Ala Trp Ala Thr Gln Asp Arg Lys Gln Gly Gly Leu80 85 90ggt ccg aac ctc aag ctc ccc atg att gcg gat aag aac acg cag atc339Gly Pro Asn Leu Lys Leu Pro Met Ile Ala Asp Lys Asn Thr Gln Ile95 100 105tca cgc gac tac ggg gtt ttg atc gag gaa gag ggt gtt gct ctt cgc387Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Ile Glu Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg110 115 120 125ggt ctc ttc ttg att gac ccc aag ggt acc ctg agg caa atc aca atc435Gly Leu Phe Leu Ile Asp Pro Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile130 135 140aac gat tta cca gtc ggt cgc tct gtc gat gag acc att cgt ctg atc483Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Ile Arg Leu Ile145 150 155aag gcg ttc cag ttc act gta tgt cga tct acc gtc att tcc att gat531Lys Ala Phe Gln Phe Thr Val Cys Arg Ser Thr Val Ile Ser Ile Asp160 165 170att aac act ggc agc cat act gac cgt tta aaa gga cga aca tgg tga579Ile Asn Thr Gly Ser His Thr Asp Arg Leu Lys Gly Arg Thr Trp175 180 185ggtttgccct gccaactgga cagaaggcgg caagacgatc aaagctgatc ccaagggttc639attggagtat ttttccacag cgggtgcaaa tggtcataca gacgctaaag ggactaccaa699gaagcgtgct cgcgttgact gaggttcatc tgttcattct tggaggctat agaagcaaag759actatgagaa gacgtcgaag actcagactt tgcagctatg gtacaccaac atcttgtgta819tctcacttta tttagacttt ccctgtagat atagagttga cagacagact gctgcttgat879tgcccaatgc taaaaacgac gattcgccgt cattaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa939<210>6<211>188<212>PRT<213>樟芝(Antrodia camphorata)
<400>6Met Val Ala Ile Val Gln Lys Pro Ala Pro Gly Phe Lys Ala Thr Ala1 5 10 15Val Val Asp Gly Gln Phe Gln Asp Ile Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Gly20 25 30Gln Trp Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys35 40 45Pro Thr Glu Ile Leu Ala Phe Asn Asp Ala Leu Pro Gln Phe Lys Glu50 55 60Leu Asn Thr Thr Val Leu Ser Val Ser Thr Asp Ser His Tyr Ala His65 70 75 80Leu Ala Trp Ala Thr Gln Asp Arg Lys Gln Gly Gly Leu Gly Pro Asn85 90 95Leu Lys Leu Pro Met Ile Ala Asp Lys Asn Thr Gln Ile Ser Arg Asp100 105 110Tyr Gly Val Leu Ile Glu Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg Gly Leu Phe115 120 125Leu Ile Asp Pro Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile Asn Asp Leu130 135 140Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Ile Arg Leu Ile Lys Ala Phe145 150 155 160Gln Phe Thr Val Cys Arg Ser Thr Val Ile Ser Ile Asp Ile Asn Thr165 170 175Gly Ser His Thr Asp Arg Leu Lys Gly Arg Thr Trp180 18权利要求
1.一种樟芝抗氧化酶的蛋白质，其属于樟芝子实体抗氧化酶的蛋白质，其选自樟芝的超氧歧化酶Mn-SOD、过氧化还原酶1-Cys Prx、过氧化还原酶2-CysPrx其中，该樟芝的超氧歧化酶Mn-SOD包含(SEQ ID NO1)所示的氨基酸序列1 CTATTCACATATAAAAACCACCGTTAACTCTCGCC36 ATG TCC ATG CTC AGT ACT GCT CGC ACC GCT GCT CGC ACA GCG CGC GCG TCG CGC1 M S M L S T A R T A A R T A R A S R90 GCT CTC CCC TTT GCC TCG TTC TCG CTC GCC GCG AGG GCC AAG TCG CTG CAC ACG19 A L P F A S F S L A A R A K S L H T144 CTC CCT GAG CTT GAC TAC GCG TAC GAT GCA CTC GAG CCG CAC ATC TCT GGC CAG37 L P E L D Y A Y D A L E P H I S G Q198 ATC ATG AAG CTG CAC CAT ACA AAG CAC CAC CAG ACG TAC GTC ACC GGC CTC AAC55 I M K L H H T K H H Q T Y V T G L N252 GCG GCG GAG GAG AGC TAC GCC AAG GCG CCC TCG CCC AAG GAG CGG ATT CTC CTT73 A A E E S Y A K A P S P K E R I L L306 CAG CCC GCG CTC AAA TTC AAT GGC GGA GGT CAC ATC AAT CAC TCG CTC TTC TGG91 Q P A L K F N G G G H I N H S L F W360 AAG AAC CTT GCG CCC CAG TCG CAG GGT GGC GGC CAG CTC GCT GCG GGT CCC TTC109 K N L A P Q S Q G G G Q L A A G P F414 AAA GAT GCA GTA GAT GCT GAC TTC GGC GGT GTC GAT GGC TTG AAG AAG AAA TTG127 K D A V D A D F G G V D G L K K K L468 AAC GCG GCG ACA GCT GCC ATC CAG GGC TCC GGT TGG GGC TGG CTT GGA TAC AAT145 N A A T A A I Q G S G W G W L G Y N522 CCG ACC ACT AAA AAG CTT GAG GTT GTC ACA ACC GCA AAC CAG GAT CCT CTC CTC163 P T T K K L E V V T T A N Q D P L L576 TCT CAC ATT CCC ATA ATT GGC ATC GAC ATC TGG GAG CAC TCA TAC TAT CTT CAA181 S H I P I I G I D I W E H S Y Y L Q630 TAC CAG AAT GTG AAA GCC GAC TAC CTC CAA GCC ATC TGG AGC GTC ATC AAT TTC199 Y Q N V K A D Y L Q A I W S V I N F684 AAG GAG GCT GAG CGC CGC TAC GTC GAA GCT GCA CAG AAA TAA217 K E A E R R Y V E A A Q K *726 AGTGACGATATAACCTAGAGAGTTCGAACATGCTATTGAGATGACGTGTCAAAGTGGCGA786 CGGAAGAATGGCAGAAGCATGGGAGGACCCATTCGTCGTCGCACTACTGAACTGCATTTG846 TAATATATAACGTTCCAACGACACGCAATTCGTCTCAAAAAAAAAA 891再有，该樟芝的过氧化还原酶1-Cys Prx包含(SEQ ID NO3)所示的氨基酸序列1 ACGCGGGGGAGATTAATTTTTCAGCCTTCATCTTCATTGCAGAGACATCATC53ATGCCT AGC CTC CGC CTT GGA AGC ATT GCC CCC AAT TTT GAA GCT GAG ACT ACC CAG1 M P S L R L G S I A P N F E A E T T Q110 GGT CAC ATT AAG TTC CAC GAC TGG ATT GGT GAT TCA TGG GCC ATC TTG TTC TCT CAC20G H I K F H D W I G D S W A I L F S H167 CCG GGT GAC TTC ACT CCT GTC TGT ACA ACG GAG CTG GCT GAG GTC GCA CGA AAG GCT39P G D F T P V C T T E L A E V A R K A224 CCT GAA TTC GCA AAG CGC AAT GTC AAA GTT ATC GGT ATC TCT GCC AAC GAT CTC AAT58P E F A K R N V K V I G I S A N D L N281 GAC CAT GAG AAA TGG GTG CAG GAC ATC AAC GAG TAT GGG ACG AAG TCC CTC GGG CCT77D H E K W V Q D I N E Y G T K S L G P338 ACG AAC GTC CAG TTT CCA ATT ATA GCA GAC GGG AAC AGG AAG ATC TCA ACC TTG TAT96T N V Q F P I I A D G N R K I S T L Y395 GAC ATG TTG GAT GAA CAG GAT GCT ACC AAT CGC GAT GCT AAG GGC CTG CCC TTC ACC115 D M L D E Q D A T N R D A K G L P F T452 ATA CGC ACT GTA TTT GTG ATT GAC CCA AAG AAG GTC ATT CGC CTT ACA CTT TCC TAC134 I R T V F V I D P K K V I R L T L S Y509 CCT GCT GCA ACT GGA CGT AAC TTC GAC GAG ATT TTG AGG GTC GTC GAC TCT CTT CAA153 P A A T G R N F D E I L R V V D S L Q566 CTT GGG GAC AAG TAC CGT GTC ACA ACT CCT GTG AAC TGG CAG AAA GGT GAT GAC GTC172 L G D K Y R V T T P V N W Q K G D D V623 ATT GTA CAC CCG TCC GTA AGC AAT GAG GAG GCG AAA ACC TTG TTC CCT GAG GTT ACC191 I V H P S V S N E E A K T L F P E V T680 TTC CAC AAG CAA TCG TAT ATC CGA ACC ACC CCT CTC AAC GTA TAA GTA GAA CAG ATA210 F H K Q S Y I R T T P L N V *737 TGGATTTGTTATCGGATCTGTGTAACTGTATTTGTATAAGTGATGCAATCCTGAAACGTTTCTCATTTCCGCAAA812 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA←837再有，该樟芝的过氧化还原酶2-Cys Prx包含(SEQ ID NO5)所示的氨基酸序列1 TTGAATACGACT13 ATG GTC GCC ATC GTC CAG AAA CCT GCG CCC GGA TTC AAG GCC ACG GCC GTC GTT GAT1 M V A I V Q K P A P G F K A T A V V D70 GGT CAG TTC CAG GAT ATT TCT CTA TCT GAC TAC TTC GGA CAA TGG GTG GTT CTC TTC20G Q F Q D I S L S D Y F G Q W V V L F127 TTC TAT CCC CTT GAC TTC ACT TTC GTA TGC CCA ACT GAA ATC CTT GCC TTC AAT GAC39F Y P L D F T F V C P T E I L A F N D184 GCC CTT CCT CAA TTC AAG GAG CTG AAC ACT ACT GTC CTC AGC GTC TCA ACT GAT TCA58A L P Q F K E L N T T V L S V S T D S241 CAC TAC GCG CAT TTG GCA TGG GCC ACG CAA GAC CGC AAG CAG GGT GGT CTT GGT CCG77H Y A H L A W A T Q D R K Q G G L G P298 AAC CTC AAG CTC CCC ATG ATT GCG GAT AAG AAC ACG CAG ATC TCA CGC GAC TAC GGG96N L K L P M I A D K N T Q I S R D Y G355 GTT TTG ATC GAG GAA GAG GGT GTT GCT CTT CGC GGT CTC TTC TTG ATT GAC CCC AAG115 V L I E E E G V A L R G L F L I D P K412 GGT ACC CTG AGG CAA ATC ACA ATC AAC GAT TTA CCA GTC GGT CGC TCT GTC GAT GAG134 G T L R Q I T I N D L P V G R S V D E469 ACC ATT CGT CTG ATC AAG GCG TTC CAG TTC ACT GTA TGT CGA TCT ACC GTC ATT TCC153 T I R L I K A F Q F T V C R S T V I S526 ATT GAT ATT AAC ACT GGC AGC CAT ACT GAC CGT TTA AAA GGA CGA ACA TGG TGA GGT172 I D I N T G S H T D R L K G R T W *583 TTGCTGCCAACTGGACAGAAGGCGGCAAGACGATCAAAGCTGATCCCAAGGGTTCATTGGAGTATTTTTCCAC658 AGCGGGTGCAAATGGTCATACAGACGCTAAAGGGACTACCAAGAAGCGTGCTCGCGTTGACTGAGGTTCATCTGT733 TCATTCTTGGAGGCTATAGAAGCAAAGACTATGAGAAGACGTCGAAGACTCAGACTTTGCAGCTATGGTACACCA808 ACATCTTGTGTATCTCACTTTATTTAGACTTTCCCTGTAGATATAGAGTTGACAGACAGACTGCTGCTTGATTGC883 CCAATGCTAAAAACGACGATTCGCCGTCATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA←939
2.一种樟芝抗氧化酶的分离核酸，其包含一核苷酸序列，该核苷酸序列可用以编码如权利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白质的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的樟芝抗氧化酶的分离核酸，其中该分离核酸在酵母菌中进行表现及量化。
4.一种樟芝抗氧化酶的表现载体，其包含如权利要求2所述的樟芝抗氧化酶的分离核酸的核苷酸序列。
5.一种樟芝抗氧化酶的宿主细胞，其包含如权利要求4所述的樟芝抗氧化酶的表现载体。
6.一种樟芝抗氧化酶的蛋白质的制造方法，其用以制造如权利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白质，该制造方法包含下列步骤取得一樟芝抗氧化酶的核苷酸序列，其可用以编码该樟芝抗氧化酶的蛋白质的氨基酸序列；将该樟芝抗氧化酶的核苷酸序列载入一表现载体中；将该樟芝抗氧化酶的表现载体载入一宿主细胞中；将该樟芝抗氧化酶的宿主细胞于一培养液中进行培养，该培养液可容许该樟芝抗氧化酶的核苷酸分子编码的蛋白质表现，以合成樟芝抗氧化酶的蛋白质；及自该宿主细胞的培养液中回收该樟芝抗氧化酶的蛋白质。
7.一种樟芝抗氧化酶的医药组成物，其包含如权利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的樟芝抗氧化酶的医药组成物，其中该樟芝抗氧化酶的医药组成物选择用于化妆品、烫伤药膏及皮肤移植。
9.根据权利要求8所述的樟芝抗氧化酶的医药组成物，其中由该樟芝抗氧化酶的医药组成物制成的化妆品选择用以去除黑斑、雀斑及防止皱纹。
10.根据权利要求8所述的樟芝抗氧化酶的医药组成物，其中由该樟芝抗氧化酶的医药组成物制成的烫伤药膏用以加速伤口愈合。
11.根据权利要求10所述的医药组成物，其中该樟芝抗氧化酶的医药组成物用于皮肤移植时，借由樟芝抗氧化酶蛋白质防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合。
全文摘要
本发明涉及樟芝抗氧化酶的蛋白质与核酸，其包含序列辨识编号1、3及5所示的Mn－SOD、1－Cys Prx及2－Cys Prx的氨基酸序列，及可编码该氨基酸序列的核酸。本发明还涉及上述樟芝抗氧化酶的蛋白质与核酸的制造方法及用途。
文档编号A61P17/00GK1912113SQ200510089869
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者林棋财 申请人:林棋财