用于治疗或预防尼古丁成瘾的半抗原－载体偶联物的制作方法

专利名称：用于治疗或预防尼古丁成瘾的半抗原－载体偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗和预防尼古丁成瘾。具体说，本发明涉及新颖的半抗原-载体偶联物，它能诱导产生抗体。这些抗体能特异性结合尼古丁。另外，本发明涉及通过给予药学上可接受的半抗原-载体偶联物制剂，预防或治疗尼古丁成瘾。本发明还考虑用对该半抗原-载体偶联物应答反应产生的抗体来预防和治疗尼古丁成瘾。
背景技术：
在美国和世界范围吸烟、吸雪茄和烟斗是普遍存在的问题。发烟的烟草和无烟的烟草都富含尼古丁，尼古丁是一种已知的成瘾物质。尼古丁是从烟草植物所衍生的生物碱，引起吸烟者的精神和成瘾作用。尼古丁是由以下两个环通过一单键连接而形成的芳族六元环(吡啶)和脂族五元环(吡咯烷)。吡咯烷是N-甲基化的，通过它的-2碳连接于吡啶的-3碳。所以，-2碳是手性碳，且假设可环绕连接两个环的单键自由旋转。已确定-2碳的绝对构型为S型。所以，尼古丁的天然构型是(S)-(-)-尼古丁。
由于不难得到香烟、雪茄、烟斗、和无烟烟草所以尼古丁得到广泛使用。按照美国卫生和个人服务部的报道，吸烟是导致美国可预防死亡的唯一首要原因。同样可见McGinnis等人，J.Am.Med.Assoc.270，2207-2211(1993)。还已报道，暴露于二次吸烟会产生严重的有害的健康影响，包括哮喘加剧。
虽然众所周知尼古丁的天然上瘾性，但吸烟依旧流行。吸一支烟10-15分钟内血液中尼古丁的最高水平将到达约25-50毫微克/ml。对人而言，吸一支烟将导致动脉尼古丁的含量比静脉尼古丁的含量高10倍，因为尼古丁迅速地由肺传递到心脏(见Henningfield(1993)，药物酒精的依赖，3323-29)。这将导致高动脉浓度的尼古丁被迅速送递到脑。一旦尼古丁穿过血-脑屏障，有证据表明尼古丁能结合胆碱能受体，而这通常是由神经传递介质乙酰胆碱完成的，乙酰胆碱参与呼吸、心率的维持、记忆、警觉和肌肉运动。当尼古丁结合这些受体后，通过引发其他神经传递介质(如多巴胺)的释放，将影响脑的正常功能。多巴胺见于脑中参与情绪、促动和快感的区域。神经传递介质的释放，尤其是多巴胺，造成吸烟者对尼古丁成瘾或其他摄取尼古丁。
由于吸烟对健康有明显的不良作用，吸烟者常常试图戒烟。但尼古丁的天然成瘾性和香烟的易得，增加继续对尼古丁的依赖和尝试戒烟人的高失败率。戒烟的症状令人不快，吸烟可减轻。
已开发了许多治疗尼古丁成瘾的方法，但大部分都无效。两种最流行的治疗方法仍然是尼古丁透皮贴片和将尼古丁掺入咀嚼口香糖中。这些治疗方法(称为“尼古丁代替疗法”)替代了使用者原先从吸烟中接受的尼古丁的量，起到让使用者戒断尼古丁的作用。但这种类型的治疗存在一些缺点。具体地说，依旧有低浓度的尼古丁渗入血流，从而增加对吸烟的渴望。诸如口腔刺激、颌部溃疡、恶心等问题一直与使用尼古丁咀嚼口香糖相关。诸如皮肤刺激、干扰睡眠和神经过敏等问题一直与使用尼古丁透皮贴片相关。
所以，需要另外的方法来治疗尼古丁成瘾。文献已认识到这种需要，且已有许多尝试来提供治疗尼古丁成瘾的方法。其中一种方法涉及给予对尼古丁应答而产生的抗体。然而已知低分子量物质(称为半抗原)不能触发宿主动物的免疫应答。尼古丁也不例外，作为小分子它没有免疫原性。为了引发对半抗原的抗体，通常将半抗原共价结合于一载体蛋白质，这种复合物会引发识别半抗原的抗体产生。
例如4’-羧酸可替宁，当共价结合于匙孔血蓝蛋白(KLH)时，可用于产生抗尼古丁代谢物可替宁的抗体。这些抗体可用于测定生理性液体中可替宁的存在。见Bjerke等人，J.Immunol.Methods，96239-246(1987)。
Castro等人(Eur.J.Biochem.，104，331-340，(1980))制备了其他尼古丁抗体。Castro等人制备了通过尼古丁6-位外的接头偶联载体蛋白质的尼古丁半抗原(偶联于牛血清白蛋白(BSA))。Castro等人制备了其他尼古丁BSA偶联物，将它们注射入哺乳动物产生了抗体。在其他出版物中，Castro等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.67，583-589(1975)公开了两种尼古丁白蛋白偶联物N-琥珀酰-6-氨基-(±)-尼古丁-BSA和6-(σ-氨基癸酰胺)-(±)-尼古丁-BSA。在该1975出版物中，Castro等人还使用尼古丁载体偶联物(6-(σ-氨基癸酰胺)-(±)-尼古丁-BSA)的抗体来测定血液和尿中尼古丁的水平，见Res.Commun Chem.Path.Pharm.51，393-404(1986)。
Swain等人(WO98/14216)公开了尼古丁载体偶联物，其中半抗原偶联于尼古丁的1、2、4、5、6、或1’位。Hieda等人显示了用连接于匙孔血蓝蛋白的6-(羧甲基脲基)-(±)-尼古丁免疫接种动物，能产生尼古丁特异性抗体。J.Pharm.andExper.Thera.283，1076-1081(1997)。Langone等人制备了半抗原衍生物，O-琥珀酰基-3’-羟甲基-尼古丁，见Biochemistry，12，5025-5030，在放射免疫试验中使用了此半抗原载体偶联物的抗体。见“酶学方法”，84，628-635(1982)。Langone产生的偶联物易水解。另外，Abad等人，Anal.Chem.，65，3227-3231(1993)描述了在ELISA试验中将半琥珀酸3’-(羟甲基)尼古丁偶联于牛血清白蛋白，产生针对尼古丁的抗体，以能够测量香烟的烟凝结物中的尼古丁含量。
所以本领域先前未说明一种稳定的保存尼古丁半抗原手性特性的尼古丁-载体偶联物，该偶联物以保留尼古丁表位特性的方式将半抗原连接于载体。另外，本领域尚未说明或提议用这种偶联物预防和治疗尼古丁成瘾的方法。Seeman，Heterocycles，22，165-193(1984)公开了尼古丁的构型分析和化学反应性研究的结果。

发明内容
为了回答对更有效地治疗尼古丁成瘾的方法的需求，本发明的目的是提供稳定的新颖尼古丁-载体偶联物，其含有天然(s)-(-)形式的尼古丁，并用尼古丁-载体连接保留尼古丁表位的特性和尼古丁分子两个环的相对取向。认为尼古丁的两个环和它们的相对取向是在溶液中被尼古丁抗体识别的基础。这种偶联物能刺激抗体(能特异性结合尼古丁)的产生。用本发明的偶联物，发明者提高了哺乳动物血清中尼古丁的水平，降低了脑中尼古丁的水平。另外，用本发明的偶联物，发明者还预防了尼古丁引起的血压变化和运动影响。
本发明的另一目的是通过给予尼古丁成瘾患者本发明的偶联物，在患者体中产生抗尼古丁的抗体，来治疗尼古丁成瘾。从而当患者吸烟(或咀嚼烟草)时，这些产品中的尼古丁将与血流中的抗尼古丁抗体结合，从而防止尼古丁穿过血-脑屏障，而消除尼古丁引起的脑化学成分的变化(尼古丁成瘾的原因)。从这点来看，尼古丁-载体偶联物引发抗体的产生是非常重要的，该抗体能识别天然尼古丁分子。如上所述，本发明的新颖尼古丁-载体偶联物保留了天然尼古丁的手性和表位。
关于尼古丁偶联物和对这种偶联物应答反应中产生的抗体如何抑制被哺乳动物吸收的尼古丁的作用，本发明并不受任何具体理论的限制。另外，除了防止尼古丁透过血脑屏障，通过简单的立体封阻，抗体还可防止尼古丁与周围神经系统的其他受体结合。
通过提供下式(I)半抗原-载体偶联物实现这些目的 式中m是1-2500，n是0-12，y为1-12，X选自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y选自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S，且-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分连接于3’、4’或5’位。在半抗原-载体偶联物的一优选实施例中，m是11-17，n是1，y为2，X是NH-CO，Y是CO-NH，载体蛋白质是外蛋白质(exoprotein)A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分结合于3’位。在半抗原-载体偶联物的另一优选实施例中，m是11-17，n是1，y是2，X为NH-CO，Y是CO-NH，载体蛋白质是外蛋白质A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分连接于4’位。在半抗原-载体偶联物的另一优选实施例中，m为11-17，n为1，y是2，X是NH-CO、Y是CO-NH，载体蛋白质是外蛋白质A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分连接于5’位。在另一优选的实例中，m选自1-20和1-200。
上述目的可通过提供式(III)的半抗原-载体偶联物实现 式中n为0-12，j为1-1000，k是1-20，E是含氨基酸的基质(matrix)。在一优选实例中，基质是聚-L-谷氨酸。
这些目的还可通过提供对式(I)半抗原-载体偶联物应答反应时产生的抗体来实现。在其他实施例中，抗体是功能片段。在一优选实例中，抗体是单克隆抗体。在本发明的另一优选实例中，抗体是多克隆的。
这些目的还可通过提供对式(III)半抗原-载体偶联物应答反应时产生的抗体来实现。在另一实施例中，抗体是功能片段。在一优选实例中，抗体是单克隆抗体。在本发明的另一优选实例中，抗体是多克隆的。
这些目的可通过提供治疗或预防尼古丁成瘾的方法而实现，包括对需要这种治疗的患者给予治疗有效剂量的式(I)或(III)的半抗原-载体偶联物。或者，这些目的可通过提供治疗或预防尼古丁成瘾的方法而实现，包括对需要这种治疗的患者给予治疗有效剂量的对式(I)或(III)半抗原-载体偶联物应答反应中产生的抗体。
另外，通过提供含有式(I)或式(III)的半抗原载体偶联物的疫苗组合物可实现这些目的。这种疫苗还可含有其他治疗尼古丁成瘾的治疗性化合物。
这些目的还可通过提供产生抗体的方法而实现，包括用式(I)或(III)的半抗原-载体偶联物免疫接种宿主哺乳动物。在一优选实施例中，产生的抗体是单克隆抗体。在另一实施例中，抗体是多克隆的。
另外，这些目的的实现还通过提供一种测定样品中是否存在尼古丁的试剂盒，所述的试剂盒包括对式(I)或式(III)半抗原-载体偶联物应答反应中产生的抗体。
这些目的和其他方面通过本发明下面的详细描述和权利要求书的描述，对本领域技术人员而言是显而易见的可实现的。


图1的图表显示了用3’AMNic-Suc-rEPA偶联疫苗主动免疫，在单剂量注射尼古丁后，对大鼠尼古丁血清水平的影响。显示了注射尼古丁后3和10分钟，尼古丁血清水平。
图2显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫对大鼠血流和脑尼古丁水平的影响。用12.5、25和50mg抗体处理大鼠。
图3显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫对大鼠血流和脑尼古丁水平的影响。在给予抗体后30分钟和1天以及注射尼古丁后3分钟测定尼古丁水平。
图4显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫对接受多个剂量尼古丁大鼠的血清尼古丁水平的影响。
图5显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫对接受多个剂量尼古丁大鼠的脑尼古丁水平的影响。
图6显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫对大鼠中尼古丁引起的运动的影响。
图7显示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗体被动免疫，对尼古丁引起的收缩期血压增加的影响。该图显示随着抗体量的增加，将提高抗体减少尼古丁增加血压的效果。
具体实施例方式
本发明提供用于治疗尼古丁成瘾的尼古丁半抗原-载体偶联物。该尼古丁半抗原-载体偶联物为式(I) 式中m是1-2,500；n是0-12；y为1-12；X选自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y选自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；载体蛋白质是适当的免疫原性蛋白质或多肽。优选的载体蛋白质可含有T-细胞表位，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分连接于尼古丁分子的3’、4’或5’位。
在式(I)中，m较佳地为1-200。在另一优选实施例中，m是1-20。在一优选实施例中，m是11-17。在另一优选实施例中，X选自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH和CO-NH-NH-CO。
如果m大于1，则方框中的部分以m次附着于载体蛋白质中的不同附着点。例如，若m＝2，则式(I)将是
因为对尼古丁本身的应答反应中不能产生抗体，本发明已开发了自尼古丁3’、4’或5’位衍生的尼古丁半抗原。将该分子结合于载体蛋白质，得到半抗原载体偶联物，当把它注射入适合的宿主哺乳动物时，能产生抗尼古丁分子的抗体。就此而言，当给予哺乳动物时，为了含有半抗原载体偶联物的药物组合物能引发抗体的产生，载体蛋白质必需是免疫原性的。较佳地，它含有T-细胞表位。所以，当载体蛋白质偶联于尼古丁半抗原，随后给予哺乳动物时，哺乳动物在对尼古丁半抗原的应答反应中产生或“引发(raise)”了抗体。
半抗原和衍生化本发明所用的术语“半抗原”指一类低分子量化合物，它们本身不能引发免疫应答，但一旦附着于载体分子就能引发免疫应答。在一优选实例中，半抗原通过接头附着于载体。本发明的半抗原是尼古丁衍生物。此尼古丁半抗原含有反应性官能基团，载体可直接或通过接头或通过基质或通过接头和基质连接于此官能团。较佳地，此尼古丁半抗原通过酰胺键或二硫键连接于载体蛋白质。酰胺键和二硫键具有理想的稳定性。因为本发明的半抗原-载体偶联物要作为疫苗使用，所以重要的是该偶联物必需是稳定的，以延长疫苗的保质期。
在本发明的一优选实施例中，以下式(II)表示尼古丁半抗原 式中n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)m-Z连接于3’、4’或5’位。Z部分能直接或通过接头连接于载体。一旦将其引入患者或动物的体内，载体-半抗原偶联物可诱导抗体的产生。
在一优选实例中，尼古丁半抗原为下式(3’-氨甲基尼古丁) 1.直接偶联物为了产生“直接偶联物”，用或不用接头直接将单个尼古丁半抗原附着于载体。例如，可将单个尼古丁半抗原连接于载体上的各个可用的胺基。用同型功能交联剂或异型双功能交联剂，直接将半抗原偶联于载体蛋白质的通用方法的描述见，如G.T.Hermanson，“生物偶联技术”，Academic Press(1996)，和Dick和Beurret，“偶联疫苗”，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karger，Basal(1989)第10卷，48-114。使用双功能交联剂的直接偶联，半抗原与蛋白质的摩尔比受到蛋白质上具有的特异性偶联化学结构的官能团数量的限制。例如，含有n个赖氨酸的载体蛋白质，理论上讲，有n+1个伯胺(包括末端氨基)可用于与接头的羧基反应。因此，采用这种直接偶联方法产生的产物限于形成n+1个酰胺键，即最多可附着n+1个半抗原。
本领域技术人员可认识到，取决于将尼古丁半抗原偶联于载体蛋白质所用的试剂的浓度和载体蛋白质的性质，半抗原与载体的比例可变化。同样，在确定的尼古丁-载体偶联物制备中，各个偶联物的半抗原/载体的比例也可变。例如，理论上外蛋白质A具有15个可偶联于半抗原的胺。但发明者测定到当将3’氨甲基-琥珀酰基-尼古丁偶联于此蛋白质时，在每次制备偶联物时，范围为11-17个尼古丁半抗原结合于每个外蛋白质A载体。这个范围是用气相过滤层析试验测定的，且测到260nmUV吸光度增加。17个尼古丁结合于一些载体，因为尼古丁半抗原能与载体上的非胺基部分结合。半抗原可结合的非胺基基团例子包括(但不限制于)-SH和-OH。但这些副反应的发生率是低的。
2.基质偶联物为了回避使用直接偶联法对可结合于载体的半抗原数量的限制，可使用氨基酸“基质”。术语“基质”指氨基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚多肽和聚多肽。基质也可以是线性或分支多肽。可用于形成基质的氨基酸例子包括(但不限制于)天冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和L-谷氨酸。可将这些氨基酸制成聚合物，如聚-L-谷氨酸。当使用氨基酸(如半胱氨酸)时，硫羟基被保护，从而使半抗原能结合于氨基酸的羧基。本领域技术人员熟悉保护基团的类型和使保护基团结合于氨基酸官能团的方法。为讨论起见，见Green，“有机化学物中的保护基团”，John Wiley &Sons，New York，1991。
适合的基质含有合适的官能团，载有两个或多个半抗原。因此，在本发明的另一优选实施例中，将尼古丁-取代的基质偶联于载体蛋白质，以增加半抗原-载体偶联物中半抗原与载体的摩尔比。基质起双重作用，首先作为大量半抗原的支持物，其次作为交联接头。偶联于载体蛋白质的尼古丁取代的基质可以式(III)表示 式中n是0-12，j是1-1000，k是1-20，E是可结合半抗原的含氨基酸的基质，载体蛋白质是任何合适的含有T-细胞表位的蛋白质或多肽。含氨基酸的基质E可以是氨基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚或多聚多肽。基质可含有一种或多种氨基酸，包括(但不限制于)天冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和聚-L-谷氨酸。在一优选实施例中，j是1-200，在另一优选实施例中，j是1-4。
基质-载体偶联物能形成多聚体“网格”。这种网格以下图表示。术语“网格”用于指共价连接的复合物，它含有多个基质、半抗原、接头和载体蛋白质，它们都是共价连接在一起的。因为尼古丁-取代的基质含有多个可与载体偶联的尼古丁部分，可形成含有多个载体和多个尼古丁取代的基质的网格。如下简单地表示了这种网格的一部分
尼古半抗原接头 基质 载体蛋白质本领域技术人员将认识到本发明的网格含有式(III)的半抗原载体偶联物。
不论蛋白质上可偶联的官能团的数量多少，用基质进行偶联的方法具有灵活性可控制半抗原与蛋白质的摩尔比。当使用特定的载体蛋白质时和当需要得到最佳比例以实现较高免疫原性的偶联物时，这特别有用。虽然当使用的一种基质不一定必需使用时，可使用这种接头。为了使用本实施例的接头，使尼古丁取代的基质与一活性接头化合物反应。例如，ADH、己二酸二酰肼可用作基质偶联物的接头。
载体蛋白质一旦制备了尼古丁半抗原，即可将其偶联于载体蛋白质，从而可用于引发抗尼古丁载体偶联物的抗体。用于本发明尼古丁载体偶联物的载体蛋白质在式(I)和(III)中以 表示，包括任何合适的免疫原性蛋白质或多肽。“免疫原性”分子是能引发免疫应答的分子。较佳地，载体蛋白质含有T-细胞表位。同样，“载体蛋白质”包括MAPs或多-抗原性肽(分支肽)。由于有多个支链氨基酸残基，使用MAP可将半抗原的密度和化合价最大化。可用于形成MAP的氨基酸例子包括(但不限制于)赖氨酸。
本发明的载体蛋白质包括含有至少一个T细胞表位(能刺激对象的T细胞)的分子，从而诱导B细胞产生抗整个半抗原-载体偶联物分子的抗体。本发明描述中所用的术语“表位”包括抗原上任何负责该抗原与抗体分子反应的决定簇。表位决定簇通常由分子(如氨基酸)的化学表面活性基团或糖侧链构成，且具有特异性三维结构特征以及特异性带电特征。为了具有免疫原性，认为蛋白质或多肽必需能刺激T-细胞。然而无T-细胞表位的载体蛋白质也可能具有免疫原性。
通过选择已知能刺激强免疫应答的载体蛋白质，可用本发明的半抗原-载体偶联物来治疗多种类型的患者。载体蛋白质必须有足够的外源性以引发对疫苗的强免疫应答。通常所用的载体蛋白质宜为大分子，能赋予共价连接的半抗原以免疫原性。特别优选的载体蛋白质是天生就有高度免疫原性的蛋白质。所以，具有高度免疫原性且能使对半抗原的抗体产量最大化的载体蛋白质是很理想的。
在用动物作试验来开发偶联疫苗时，牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)常常被用作载体。但这些蛋白质可能不适合用于人。已被用于制备治疗性偶联疫苗的蛋白质包括(但不限制于)病原菌的许多毒素及其类毒素。其他候选物是与细菌毒素的抗原性类似的蛋白质，即指交叉反应物质(CRMs)。
在制备尼古丁偶联物药物组合物时，重组铜绿假单胞菌蛋白质A(rEPA)可作为载体蛋白质，因为对这种蛋白质的结构和生物活性有很好的了解。另外，国家卫生研究院和本发明的发明者已在金黄色葡萄球菌荚膜多糖偶联疫苗中将这种重组蛋白质成功地且安全地用于人。Fattom等人，感染免疫，611023-1032(1993)。已鉴定出这种蛋白质是一种合适的蛋白质载体，因为由于553位氨基酸的缺失，已消除了这种天然外毒素的固有酶促活性。因此，rEPA具有与天然外毒素A(ETA)相同的免疫特征，但不具有天然ETA的肝毒性。在本申请中，“外蛋白质A”指修饰过的、非-肝毒性ETA。这种外蛋白质A的一个实例含有553位的氨基酸缺失。
将半抗原偶联于载体蛋白质有大量的官能团可采用以便于载体与小分子(如半抗原)连接或偶联。这些官能团包括羧酸、酸酐、混合酸酐、酰基卤、叠氮酰基、烷基卤、N-马来酰亚胺、亚氨酸脂、异氰酸脂、胺、硫醇和异硫氰酸脂，以及本领域技术人员已知的其他物质。这些基团能与蛋白质分子的反应基团形成共价键。取决于所用的官能团，反应基团可以是载体蛋白质上或修饰的载体蛋白质分子上赖氨酸残基或硫羟基的ε氨基，当与这种ε氨基反应时将形成酰胺、胺、硫醚、脒脲或硫脲键。本领域技术人员知道还可使用其他合适的活性基团和偶联方法。如见Wong，“蛋白质偶联和交联化学”，CRC Press，Inc，(1991)。也可见Hermanson，“生物偶联方法”，Academic Press1996，以及Dick和Beurret，“偶联疫苗”，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karge，Basal(1989)第10卷，48-114。
对将半抗原偶联于载体蛋白质而言，与环状或分支接头相比线性接头分子是优选的。一种优选的接头是琥珀酰基接头。但接头除线性分子外也可以是环状结构。接头的另一实例是ADH。
所以，本发明尼古丁半抗原-载体偶联物的制备，是通过将一种或多种半抗原与载体蛋白质反应，产生能刺激T细胞的半抗原载体偶联物，从而使T细胞增殖并释放介质，在对免疫原性半抗原-载体偶联物的应答反应中，这些介质活化特异性B细胞刺激抗体产生。在对半抗原载体偶联物应答反应中产生的一些抗体对半抗原-载体偶联物中的半抗原部分是特异性的。本发明期待将各种合适的半抗原与载体蛋白质组合一起用于治疗尼古丁成瘾。
单克隆和多克隆抗体产生单克隆抗体的方法是本领域熟知的。可将含有尼古丁半抗原-载体偶联物的组合物注射入小鼠，然后取出血清样品验证是否产生抗体，取出脾脏以得到B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，克隆这种杂交瘤，选出产生抗半抗原-载体偶联物抗体的阳性集落，培养这些产生抗原抗体的集落，从杂交瘤培养物中分离抗体，得到单克隆抗体。
可用各种已知的方法从杂交瘤培养物分离和纯化单克隆抗体。这些分离方法包括用蛋白质A-琼脂糖作亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。如见Coligan第2.7.1-2.7.12和第2.9.1-2.9.3。也可见Baines等人，分子生物学方法中的“免疫球蛋白G(IgG)的纯化”，第10卷，第79-104页(The HumanaPress，Inc，1992)。
制备多克隆抗体的方法也是本领域熟知的。按本领域已知的标准方法制备多克隆抗体。为制备多克隆抗体，用免疫原性物质注射动物，收集富含抗体的血清，血清中含有抗体混合物，这些抗体针对注射的免疫原的多个表位。用于产生抗体的适合的宿主哺乳动物包括(但不限制于)人、大鼠、小鼠、兔和山羊。
对本发明而言，也可用功能性抗体片段。产生这种片段的方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化学还原法切断二硫键。另外，本发明的抗体片段还可用自动肽合成仪(如可从Applied Biosystems，Multiple PeptideSystems和其他公司购得的合成仪)，或可用本领域熟知的方法手工合成。见Geysen等人，免疫学方法杂志102259(1978)。可用常规方法对本发明的单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列进行直接测定。
本发明的片段可以是Fv片段。抗体的Fv片段是由抗体重链的可变区(Vh)和抗体轻链的可变区(V1)构成的。蛋白酶切割抗体能产生双链Fv片段，其中Vh和Vl结构域依旧非共价结合且保留了结合抗原的能力。Fv片段还包括重组单链抗体分子，其中轻链和重链的可变区通过一肽接头相连。见Skerra等人，科学，240，1038-41(1988)。本发明的抗体片段还包括Fab、Fab’、F(ab)2、和F(ab’)2，它们都不含有完整抗体的Fc片段。
治疗方法由于当尼古丁通过血-脑屏障后，尼古丁就有许多明显作用，所以本发明的治疗方法在于防止尼古丁穿过血-脑屏障。具体地说，给予患者尼古丁半抗原-载体偶联物，能在患者的血流中产生抗尼古丁抗体。另外，可将在待治疗的患者体外(如在合适的宿主哺乳动物中)产生的抗尼古丁抗体给予患者。如果患者吸烟，在他血流中的尼古丁将被循环性抗尼古丁抗体结合，从而防止尼古丁到达脑。所以，该抗体能防止尼古丁在脑部引起的精神和心理作用。由于吸烟者将经历这些作用的减轻或消除，他/她将失去吸烟的愿望。如果患者使用无烟烟草，用本发明的尼古丁半抗原-载体偶联物免疫接种后，预计会得到同样的治疗效果。另外，通过影响尼古丁刺激周围神经系统的能力，本发明的偶联物和抗体可发挥其作用。
如上所述，本发明的新颖尼古丁-载体偶联物保留了尼古丁分子的天然手性和结构。具体说，这些偶联物的尼古丁部分具有(S)-(-)构型。所以，在对这种偶联物应答反应中产生的抗体对天然形式的尼古丁是特异性的，且在特异性结合吸烟吸入的或从无烟烟草吸收的尼古丁和抑制这种摄取的尼古丁的作用上是最有效的。另外，本发明的偶联物是化学稳定的，这种稳定性对生产长保质期的疫苗是关键性的。
本发明的组合物可与用于治疗成瘾的化合物或其他治疗剂联合使用。这包括给予化合物(但不限制于)抗抑郁药，如Zyban和Prozac等化合物。
1.给予尼古丁半抗原-载体偶联物本发明的偶联物适用于治疗和预防尼古丁成瘾。对于治疗尼古丁成瘾而言，将本发明的尼古丁-载体偶联物给予患尼古丁成瘾的患者。对于预防尼古丁成瘾而言，用本发明的偶联物来治疗有发展成尼古丁成瘾危险的患者(如青少年)。直接将该偶联物给予患者称为“主动免疫”。
本发明的疫苗组合物含有至少一种尼古丁半抗原-载体偶联物，其量足以引发对它的免疫应答。这种尼古丁半抗原-载体偶联物能在体内保存一定的浓度，足以主动抵抗随后摄取的尼古丁。
用本发明尼古丁半抗原载体偶联物的初次疫苗接种产生高滴度的尼古丁特异性抗体。技术人员不难确定给予需要治疗尼古丁成瘾患者的偶联物的治疗有效剂量。合适的剂量范围为1-1000μg/剂。通常患者需要一周到几周来产生抗上述抗原的抗体。可用本领域技术人员熟知的方法，如ELISA、放射免疫试验和Western印迹分析，来监测患者血流中抗体的产生情况。也可通过评估尼古丁的各种生理作用，如血压，来监视治疗效果。
如下详述，可将本发明的尼古丁半抗原-载体偶联物加工成易于给予患者的组合物。给药的优选方式包括(但不限制于)鼻内、气管内、口腔、皮肤、透粘膜皮下注射和静脉注射。技术人员将懂得首次注射后还可给予一次或多次“加强剂量的”偶联物。这种加强剂量将增加抗本发明尼古丁半抗原-载体偶联物的抗体的产量。
本发明的疫苗组合物可含有至少一种佐剂。选择的用于本发明的佐剂应不会抑制载体蛋白质的作用。用于本发明的佐剂是那些人生理上可接受的佐剂，包括(但不限制于)明矾、QS-21、皂苷和MPLA(单磷脂A)。
本发明的疫苗组合物任选地含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。适用于本发明的赋形剂包括无菌水，盐溶液，如盐水，磷酸钠、氯化钠，醇，阿拉伯树胶，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明胶，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸镁、粘性石蜡、脂肪酸脂、羟甲基纤维素和缓冲液。当然本领域技术人员已知的其他赋形剂也可用于本发明。
为了给予需要治疗或防止尼古丁成瘾的患者，可将本发明的半抗原-载体偶联物掺入药物组合物中。当含有半抗原-载体偶联物的该组合物用于注射时，较佳地将半抗原-载体偶联物溶解在盐水溶液(具有药物学上可接受的pH)中。但也可使用可注射的半抗原-载体偶联物悬浮液。除常用的药物学可接受的赋形剂外，该组合物可含有任选成分以确保纯度、提高生物可利用性和/或增加渗透性。
另外，此疫苗组合物可任选地含有至少一种辅助剂，如分散剂、包裹剂、微球、脂质体、微胶囊、酯类、表面活性剂、润滑剂、防腐剂和稳定剂。当然，任何本领域技术人员已知的其他辅助剂也可用于本发明。同样任何能与本发明疫苗组合物起协同作用的试剂也是有用的。
本发明的药物组合物是无菌的，且足够稳定能耐受保存、分配和使用。另外，此组合物还可含有其他成分以保护组合物不受微生物的感染、抑制微生物的生长。较佳地，将此组合物制成冻干粉末形式，在给药前用药学上可接受的稀释剂重建。制备无菌注射用溶液的方法是本领域技术人员熟知的，包括(但不限制于)真空干燥、冷冻干燥和旋转干燥。这些方法产生了一种带有掺入预混合物中的赋形剂的活性成分粉末。
2.给予对尼古丁-载体偶联物应答反应中产生的抗体被动免疫包括给予或使抗体接触对本发明的尼古丁半抗原载体偶联物应答反应中产生的多克隆抗体或单克隆抗体。可在动物或人中产生这些抗体。给予对本发明尼古丁偶联物应答反应中产生的抗体来预防尼古丁成瘾。例如，可将这种抗体给予有发展成尼古丁成瘾危险的患者，如青少年。这种抗体也适用于治疗尼古丁成瘾的患者。如上所述，该抗体将结合血流中的尼古丁，并防止尼古丁穿过血脑屏障。给予本发明半抗原-载体偶联物所产生的抗体的分子量范围约为150kDa-1,000kDa。
本领域技术人员不难确定给予患者(需要治疗尼古丁成瘾的)本发明治疗性抗体的治疗有效剂量。合适的剂量范围为1-1000μg/剂。
本发明治疗用组合物含有至少一种对本发明尼古丁-载体偶联物应答反应中产生的抗体。本发明的这种组合物可任选地含有一种或多种药学上接受的赋形剂。适用于本发明的赋形剂包括无菌水，盐溶液，如盐水，磷酸钠、氯化钠，醇，阿拉伯树胶，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明胶，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸镁、粘性石蜡、脂肪酸脂、羟甲基纤维素和缓冲液。当然本领域技术人员已知的其他赋形剂也可用于本发明。
为了给予需要治疗或防止尼古丁成瘾的患者，可将本发明的抗体掺入药物组合物中。当含有抗体的该组合物含有用于注射时，较佳地将抗体溶解在盐水溶液(具有药物学可接受的pH)中。但也可使用可注射的抗体悬浮液。除常用的药物学可接受的赋形剂外，此组合物可含有任选成分以确保纯度、提高生物可利用性和/或增加渗透性。
含有本发明抗体的药物组合物是无菌的，且足够稳定能耐受保存、分配和使用。另外，此组合物还可含有其他成分以保护组合物不受微生物的感染、抑制微生物的生长。制备无菌注射用溶液的方法是本领域技术人员已知的，包括(但不限制于)真空干燥、冷冻干燥和旋转干燥。用这些方法产生了一种带有掺入预混合物中的赋形剂的活性成分粉末。
含有本发明抗体的试剂盒也可将本发明的抗体用于制备试剂盒，此试剂盒可用来探测或定量测定样品中的尼古丁水平。本发明的试剂盒在一合适的容器中含有本发明的尼古丁特异性抗体。对放射免疫试验而言，这种试剂盒还可含有标记的尼古丁。通过使标记的尼古丁与抗体结合，然后与测试样品中的抗体竞争标记的尼古丁，来测定样品中的尼古丁。ELISA试剂盒也含有本发明的抗体。ELISA包括抑制抗体与已知量的尼古丁结合，与怀疑含有尼古丁的样品的抑制相比较。比较样品与已知浓度尼古丁的标准抑制曲线，可确定样品中的未知尼古丁。另一种类型的ELISA，将怀疑含有尼古丁的样品在微量滴定板上培养，该微量滴定板上包被有能结合尼古丁的物质。加入本发明的抗体，并在板上加入酶连接的抗-抗体抗体。加入底物将定量测定与板结合的尼古丁的量。
以下实施例仅进一步说明本发明的制备和使用方法。本发明的范围不受以下实施例的限制。
实施例1-合成衍生的尼古丁半抗原(在3’位被取代)合成半抗原的起始物是可商品购得的反式-4’-羧基-(-)-可替宁。按Cushman和Castagnoli，Jr.(1972)有机化学杂志，37(8)1268-1271描述的修饰方法，酸的甲基酯化后再还原脂，提供醇(反式-3’-羟甲基-(-)-尼古丁)。然后磺酸化该醇，用叠氮基替代磺酸盐，最终将其还原成胺。
将4g反式-4’-羧基-(-)-可替宁溶解在用无水甲醇配制的50ml 2N硫酸中，室温搅拌过夜。将得到的悬液用Whatman No.1滤纸过滤，然后慢慢加到100ml碳酸氢钠饱和溶液中。蒸发掉溶剂后，用二氯甲烷提取酯，得到4.2g淡红色油。在干氩气下，将用干四氢呋喃(100ml)配制的3.9g该酯的溶液逐滴加到干四氢呋喃(70ml)配制的4当量氢化铝锂悬液中。室温搅拌此悬液2小时。在冰浴中冷却时，仔细、可控地添加水来破坏过量的氢化物。过滤得到白色沉淀，将此滤物在硫酸钠上干燥，减压下浓缩，得到2.7g黄色油状醇。
将此醇(1.9g)溶解在20ml二氯甲烷中。然后逐步向此溶液中加入三乙胺(0.75ml)和对-甲苯磺酰氯(1g)。室温搅拌此桔红色溶液。在硅藻土柱床上过滤此沉淀的三乙胺盐酸盐，减压下浓缩过滤物得到棕色油。在硅石快速层析柱上纯化此磺酸盐，用二氯甲烷配制的5％甲醇洗脱，得到2.1g黄色油。
80℃用50ml二甲基甲酰胺配制的叠氮化钠(0.8g)置换此磺酸盐(1.8g)1小时。高真空蒸发掉二甲基甲酰胺后，将残留物溶解在二氯甲烷中，用水和盐水洗涤，硫酸钠干燥。溶剂蒸发后，得到呈棕色油状的叠氮盐(1.1g)。
将用干四氢呋喃(20ml)配制的该叠氮盐加到用干四氢呋喃(50ml)配制的氢化铝锂悬液中，易产生所需的胺，用薄层层析监测。纯化胺的质子和碳核磁共振广谱对应于预期的结构。
实施例2-合成衍生的尼古丁半抗原(在4’位被取代)烯醇盐烷化可替宁，然后还原此烷基化的产物，能实现在尼古丁的4’位引入官能化的臂。可用各种烷化剂，如合适地被保护的3-溴-丙胺。例如，可用3-溴-N-苄脂基(carbobenzyloxy)-丙胺或N-(3-溴丙基)-邻苯二酰胺。烷化和还原后偶联于载体蛋白质之前，除去胺的保护基团。环状内酰胺(含有吡咯烷酮(pyrrolidinone)环)的烯醇盐烷化已有文献报道(一般综述可见G.Helmchen等人(1995)Houben-Weyl-方法中有机化学物质的立体选择性合成，E21a卷，762-881，Thieme，Stuttgart，Germany，反应的立体考虑则可见A.J.Meyers等人(1997)J.Am.Chem.Soc.，119，4564-4566)。还有一些可替宁自身烯醇盐烷化的例子(N.-H.Lin等人(1994)J.Med.Chem.，37，3542-3553)。以酮(或醛)和2-烷氧基-3-链烯胺(alkenamine)为起始物，用串联阳离子氮杂-Cope重排-Mannich环化反应，制备了感兴趣的4’-乙酰基-尼古丁(1∶1混合的两种差向异构体)(L.E.Overman(1983)J.Am.Chem.Soc.，105，6622-6629)。可延伸此反应产生4’-醛-尼古丁，适用于偶联。
将3-溴-丙胺氢溴化物(4.2g)悬浮在50ml二氯甲烷中，加入三乙胺(约7ml)直至得到清澈的溶液。将溶液冷却至0℃，逐滴加入氯甲酸苄基酯(2.5ml)。让反应在室温中搅拌下进行16小时。过滤掉沉淀的盐，用冷水、冷的1N HCl和冷水洗涤清澈的有机层，硫酸钠干燥，减压下蒸发得到黄色油(2.93g粗产物)。
分别与无水甲苯共蒸发可替宁(62mg)和3-溴-N-苄脂基-丙胺(100mg)。将可替宁溶解在5ml新鲜蒸馏的无水四氢呋喃中，加入60μl N，N，N’，N’-四亚甲基二胺(TMEDA)，将溶液浸入乙醇-干冰浴中冷却至-78℃。将可替宁溶液逐滴加到预冷至-78℃的四氢呋喃配制的二异丙胺锂中(LDA，200μl用庚烷-四氢呋喃配制的2M溶液)。-78℃搅拌此桔红色溶液15分钟，然后在冰浴(2-6℃)中升温。再次将反应物冷却至-78℃，并逐滴加入溶解在无水四氢呋喃的3-溴-N-苄脂基-丙胺，为时15分钟。将反应混合物升温至-10℃，然后用甲醇萃取。在硅胶柱上快速层析纯化反应产物。用硼烷随后用氟化铯(用热乙醇配制的)完成这种可替宁衍生物酰胺的还原。在酸性条件中除去苄脂基后得到最终的胺。
实施例3-合成衍生的尼古丁半抗原(在5’位被取代)通过使适当保护的烷基锂化合物与尼古丁反应，随后与氰基硼氢化钠反应，可实现将功能臂引入尼古丁的5’位，反应过程与Shibagaki等人(1986)Heterocycles，24，423-428和N.-H.Lin等人(1994)见上所述的类似。
实施例4-将衍生的尼古丁半抗原偶联于载体蛋白质通过琥珀酸臂将重组外蛋白质A(rEPA)连接于衍生的尼古丁半抗原上。用琥珀酐不难将rEPA的15赖氨酸琥珀酰化。然后，在常规的偶联反应中制备了5-10mg/ml溶解在0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(含有0.15M NaCl，pH6.0)的琥珀酰化重组外蛋白质A(Suc-rEPA)。将溶解在最少量蒸馏水中的等量3’-氨基甲基-(-)尼古丁(3’AMNic)半抗原加到该蛋白质溶液中。在加入前用0.1N HCl将半抗原溶液的pH调至6.0。最后，将等量的盐酸1-乙基-3-(3-二乙基氨基)丙基碳化二亚胺(EDC)加到该半抗原蛋白质混合物中，室温搅拌下反应30分钟。将得到的尼古丁偶联物在Sephadex G-25柱上纯化，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水洗脱。偶联物的回收率为80-90％范围。
实施例5-尼古丁负载基质的偶联本实施例描述了半抗原-载体偶联物的合成，此偶联物含有3’-氨甲基-(-)-尼古丁作为衍生的半抗原，重组外蛋白质A(rEPA)作为载体蛋白质，己二酸二酰肼(ADH)作为接头，聚-L-谷氨酸作为半抗原的“基质”或多聚支持物。
在本实施例中所用的聚-L-谷氨酸的平均分子量为39,900，多分散性为1.15，聚合度为264。计算半抗原和聚合物的反应量，使靶向取代的程度约为80％。即当达到80％取代时，此谷氨酸聚合物平均每分子总共264个重复单元中约208个半抗原单元被偶联。
此负载尼古丁的聚-L-谷氨酸的化学式如下 如图所示，聚谷氨酸聚合物含有约52个谷氨酰胺残基。但此数是可变的，取决于所选聚氨基酸残基的批次和来源。同样上图显示每个重复单元有4个尼古丁半抗原。这个数目是可变的，取决于基质与尼古丁半抗原偶联时所用反应物的比例。
与衍生的尼古丁偶联后，未反应的羧基(约20％)与ADH衍生。当此基质偶联于载体时(如实施例6所述)，负载尼古丁基质与蛋白质的摩尔比为1∶1。因此在偶联中，理论上偶联反应完成时，尼古丁半抗原与蛋白质的摩尔比应为200∶1。
用产物的NMR分析估计了聚谷氨酸上尼古丁取代基的实际比例。相对于尼古丁吡啶环的四个氢，谷氨酸α-氢峰的强度提供了掺入的尼古丁的比例。估计出的平均比例为143∶1(尼古丁/载体蛋白质)。
实施例6-用负载尼古丁的基质制备尼古丁偶联疫苗A.将尼古丁半抗原加载到基质上将10mg聚-L-谷氨酸盐(Sigma，Ca#P-4761)溶解在2ml 0.05M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(含有0.15M NaCl，pH 6.0)中。将10mg 3’-氨基甲基-(-)-尼古丁溶解在最少量蒸馏水中，用0.1N HCl将溶液的pH调节到pH 6.0。边搅拌，边将尼古丁半抗原溶液逐滴加入此多肽溶液中，随后调节到pH 6.0。分三批，将20mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)固体加到半抗原-多肽混合物中，为时20分钟。反应在室温进行1小时。三次换水来透析此反应产物(尼古丁-取代的基质)并冷冻。得到12mg呈白色蓬松物质的尼古丁取代的聚谷氨酸。
B.将接头结合于尼古丁取代的基质将10mg尼古丁取代的聚谷氨酸溶解在2ml MES缓冲液(pH 6.0)中。边搅拌边将8mg己二酸二酰肼(ADH)加到溶液中，然后再加入10mg EDC。让反应在室温进行1小时。最后将得到的溶液用pH 6.0 MES缓冲液透析换液3次。
C.偶联于载体蛋白质将10mg重组外蛋白质A(rEPA)溶解在2ml 0.05M MES缓冲液(pH 5.6，含有0.15M NaCl)中。将估计含有7.5mg此衍生物质的ADH-结合的尼古丁-取代的聚谷氨酸溶液加到此蛋白质溶液中。室温边搅拌边将固体EDC分三批加到此混合物中，为时20分钟。让反应在室温下进行过夜。在Sephadex G-25柱上最后纯化得到的偶联物，用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗脱。此产品是偶联物的纯化制品，其中偶联物仅含有(S)-(-)形式的尼古丁。
实施例7-实施例4尼古丁载体偶联物的特性分析在Superose 12大小排阻层析柱上分析了实施例4的纯化的偶联疫苗，并用pH 7.4的PBS洗脱。掺入尼古丁后，测定260nm UV吸收增加(相对于280nm的吸收)，计算出半抗原与蛋白质的摩尔比为11∶17。这个范围是通过计算六批分开制备的半抗原-载体偶联物(1批17.2，2批16.2，3批13.2，4批12.0，5批11.0，6批17.2)中半抗原/载体蛋白质的比例确定的。用MALDI-TOF质谱进一步分析确定此比例得到了与UV吸光度差异基本相同的数据。此偶联疫苗的蛋白浓度用BCA试剂测定。对实施例4的尼古丁-载体偶联物进行了稳定性研究。研究所用的疫苗装在1ml玻璃瓶中，浓度为0.5mg/ml，测定了在以下三种不同温度时玻璃瓶中疫苗的稳定性-70℃，2-8℃和室温。
实施例8-实施例4的尼古丁载体偶联物的稳定性如在-70℃、2-8℃和室温下六个月偶联物稳定性所观察的那样，基于半抗原-接头-载体之间形成酰胺键的偶联方法比形成酯键看来更有利。稳定性研究包括用如下程序对偶联疫苗进行监测和分析1.目测观察是否形成任何颗粒(混浊度、沉淀)2.核查pH是否有明显的变化3.大小排阻层析结合260和280nm的UV吸光度测定，以确定尼古丁掺入比例是否改变4.反相层析，核查载体蛋白质是否降解5.用银染色作SDS PAGE，检查偶联的蛋白质是否被蛋白酶切割。
如在-70℃和2-8℃6个月偶联物的稳定性测试中所观察到的那样基于在半抗原和接头之间以及接头和载体蛋白质之间形成酰胺键的偶联方法看来是有利的。
实施例9-实施例4和6的载体偶联物的免疫原性证据用两种尼古丁半抗原-载体偶联物来免疫接种小鼠、大鼠和家兔。
A.动物测试多克隆抗体用标准方法免疫接种动物。对小鼠，皮下注射疫苗3次，间隔为2周，在第一次和第二次注射后1周进行采血测试，第三次注射后1周放血。在实施例10中描述了用ELISA试验对这些血清样品进行评价。用3’AMNic-pGlu结合的微量滴定板进行ELISA试验。
用此疫苗腹腔内免疫接种大鼠3次。间隔两周进行注射，且在第一次和第二次注射后一周测试血液。第三次注射后一周给大鼠放血。在第一次注射时用Freund完全佐剂，随后的注射用Freund不完全佐剂。用ELISA试验评价血清样品。
用100μg疫苗肌内免疫接种家兔3次，间隔3周。第一次注射剂中含有Freund佐剂，以后的注射剂中含有Freund不完全佐剂。第二次和第三次注射后一周测试家兔血液，以确保产生的血液有足够的滴度。如果获得合适的滴度(用ELISA测定)，将家兔置于每周产血方案(20-40ml血清/兔)。全程监测抗体的滴度，如果需要恢复抗体水平可加强接种动物。
表1-5显示了这些免疫原性研究的结果。表1和2显示了小鼠中免疫原性研究的结果。表1中，所用的偶联物是3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀酰基-rEPA(实施例4)。表2中，所用的偶联物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(实施例6)。这些表显示产生了高滴度的特异性结合尼古丁的抗体。另外，还显示这些偶联物诱导增强应答的能力。
表3和4显示了大鼠中免疫原性研究的结果。表3中，所用的偶联物是3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀酰基-rEPA(实施例4)。表4中，所用的偶联物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(实施例6)。
这些表显示产生了高滴度的特异性结合尼古丁的抗体。另外，还显示这些偶联物诱导增强应答的能力。
表5显示了家兔中免疫原性研究的结果。使用3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀酰基-rEPA(实施例4)或3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(实施例6)，产生了对这两种偶联物的高滴度抗体。这些滴度保持升高6个月以上。
表1-用3’AMNid-Suc-rEPA处理小鼠

剂量根据蛋白质试验。
滴度是相应的注射后一周的算术平均值。
表2-用3’AMNid-pGlu-ADH-rEPA处理小鼠

剂量根据冻干偶联物的干重。
滴度是相应的注射后一周的算术平均值。
表3-用3’AMNid-Suc-rEPA处理大鼠

剂量根据蛋白质试验。
滴度是相应的注射后一周的算术平均值。
表4-用3’AMNid-pGlu-ADH-rEPA处理大鼠

剂量根据冻干偶联物的干重计算。
滴度是相应的注射后一周的算术平均值。
表5-用3’AMNic-Suc-rEPA和3’AMNic-pGlu-ADH-rEPA处理家兔

对3’AMNic-Suc-rEPA根据蛋白质试验计算剂量，对3’-AMNic-pGlu-rEPA根据干重计算剂量滴度是第三次注射后6-7周的算术平均值。
实施例10-ELISA试验和抗体特异性尼古丁分子本身不适合包被ELISA板，需要将它连接于有较好粘附特性的较大分子。聚-L-赖氨酸或聚-L-谷氨酸通常用于这一目的。将衍生的尼古丁半抗原3’-氨基甲基-(-)-尼古丁(3’AMNic)偶联于聚-L-谷氨酸，并将获得的3’-氨基甲基(-)-尼古丁-聚-L-谷氨酸偶联物(3’AMNic-pGlu)用于包被ELISA板。
如下用3’AMNic-pGlu ELISA评估产生的抗3’AMNic疫苗的抗体100ul/孔，用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)配制的10ng/ml 3’AMNic-pGlu包被Dynatech Immulon4微量滴定板(Chantilly，VA)，室温(RT)培养过夜(ON)。然后抽吸这些平板，用PBS配制的1％BSA室温封闭1小时。用PBB(1％BSA、0.3％BRIJ用PBS配制，pH 7.2)稀释样品和参考血清，直到稀释液450nm的光密度(OD)接近2.0。用9％NaCl，0.1％BRIJ洗板5次，加入稀释的样品和参考血清。将参考品和样品稀释2倍，板上的终体积为100μl/孔，37℃培养此板1小时。然后再洗板，加入用PBB稀释的过氧化物酶-偶联的抗种系IgG，Fc特异性抗体(Jackson，West Grove，PA)，100μl/孔，37℃培育1小时。洗板，室温与100μl/孔，用H2O2(由TMB试剂盒提供)1∶1稀释的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(KPL，Gaithersburg，MD)培育10分钟。加入100μl/孔1M磷酸终止反应，在MR4000微量滴定板读数仪(Dynatech)上以450nm读数。相对于参考品以平行线分析定量测定样品。指定的参考品为其数值(U/ml)，相应于450nmOD值约2.0的稀释液。
用ELISA抑制试验评估了抗体的特异性。将各[3’AMNic-Suc-rEPA]血清稀释到一浓度，其450nm光密度约为2.0浓度的两倍。采用上述3’AMNic-pGluELISA，37℃用递增量的测试抗原(抑制剂)，以1∶1(v/v)吸收被测试的稀释血清3小时，用未吸收的血清为参考在ELISA中测试吸收的样品。确定各样品相对未吸收样品的吸收百分比。
以酒石酸尼古丁作为抑制剂，用ELISA抑制试验计算含抗体(对3’AMNic-Suc-rEPA应答反应中产生的)的大鼠血清的特异性。该抗体的IC50为3.5×10-6M。以酒石酸尼古丁作为抑制剂，用ELISA抑制试验计算含抗体(对3’AMNic-Sur-rEPA应答反应中产生的)的兔血清的特异性。该抗体的IC50为2.3×10-6M。
实施例11-抗体亲和力和结合能力用0.7ml血浆、Teflon半微量杯、分子量筛截断值为12-14kD的Spectrapor2膜和Sorenson缓冲液(0.13M磷酸，pH 7.4)，37℃用平衡透析4小时测定了抗体的结合能力，见Pentel等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.246，1061-1066(1987)。在到达平衡透析终点时测定血清的pH，只有最终pH为7.30-7.45的样品才可用。
用可溶性放射免疫试验计算抗体对尼古丁的亲和力，见Mueller，Meth.Enzymol.，92，589-601(1983)。测得IgG的分子量为150kD。
用放射免疫试验得到的结合常数和亲和力如下。抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]大鼠血清的IC50(摩尔)为1.36×10-7。Ka(摩尔-1)为2.57×107。结合部位浓度为2.61×10-6结合位点/L，尼古丁-特异性IgG浓度为0.2mg/ml。
实施例12-评估动物模型的血浆和脑中尼古丁的分布在各种动物模型中评价了本发明的疫苗。用大鼠模型来评估主动或被动免疫对血浆和脑中尼古丁分布的作用。一项研究检验了被动免疫对尼古丁减弱运动的作用，即尼古丁对中枢神经系统(CNS)的作用。另一研究评估了被动免疫对尼古丁对心血管系统作用的影响评估收缩期血压。
为了评估本发明的免疫疗法，开发了一动物模型，模拟人迅速吸收两支烟的尼古丁。Hieda(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.283(3)1076-1081描述了这种动物模型。在这种模型中，用0.03mg/kg尼古丁静脉注射大鼠为时10秒，模拟吸烟者由肺迅速吸收尼古丁。注射尼古丁后3和10分钟采集血样，测定血浆尼古丁。当测定尼古丁脑浓度时，在注射尼古丁后3分钟处死动物，迅速取出它们的脑。在大鼠中评估了实施例4中的疫苗，确定它们对尼古丁在血浆和脑中分布的作用。
A.主动免疫尼古丁疫苗免疫接种大鼠，每次25μg疫苗(3’AMNic-Suc-rEPA)腹腔内注射，间隔2周共3次。注射0.03mg/kg尼古丁(为时10秒)后3和10分钟，这些动物的血浆尼古丁水平升高(与未免疫接种的对照动物相比)。见图1。所以主动免疫对增加血浆中尼古丁的结合是有效的。已知适当地减少到达脑部的尼古丁的量能显著改变尼古丁的行为作用。
B.被动免疫用被动免疫，可确定免疫IgG在增加尼古丁血浆水平和减少尼古丁脑水平中的剂量应答反应作用。每次注射大鼠不同量的抗-(3’AMNic-Suc-rEPA)IgG(12.5-50mg)。如图2所示，存在明显的剂量应答反应作用，增加IgG的剂量，将增加血清尼古丁水平而降低脑尼古丁水平。
如图3所示，每次注射给予总量为50mg的抗体后30分钟和1天，大鼠的血清中存在抗尼古丁抗体(抗3’AMNic-Suc-rEPA)而且是活性的。如图3所示，用尼古丁攻击后(0.03mg/kg注射10秒)，这些抗体有效地降低了脑中尼古丁浓度，增加了血浆中尼古丁水平(给予抗体后30分钟和1天)。
用本发明尼古丁疫苗被动免疫有效的另一证明是，它能抵抗连续注入的尼古丁。在大鼠分开的被动免疫试验中，多次剂量的尼古丁并没有耗竭存在的抗体或明显降低它们结合新鲜注入的尼古丁的能力。图4中，在0时注入50mg抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]，24小时后，从右颈静脉注射5次0.03mg/kg尼古丁(10秒)，每20分钟一次共80分钟。进行总量为5次的尼古丁注射。第5次尼古丁注射用3H-尼古丁示踪。第五次注射后1分钟收集血液和脑。以下显示了结果，并在图4和5中图解。


这些结果显示即使在注射了五次尼古丁后，抗体依然能有效地增加血清尼古丁的水平并降低脑尼古丁水平。用3H-尼古丁的结果证明抗体能有效地抵抗第五剂注射的尼古丁。
实施例13-评估尼古丁的运动作用设计本试验以确定被动免疫能否预防尼古丁的即刻CNS介导作用。由Dr.David Malin开发了用于本试验的大鼠模型，描述见Malin等人，“尼古丁-特异性IgG减少了大鼠脑中尼古丁的分布并减弱其行为和心血管作用”(递交给尼古丁和烟草研究协会的第五次年会，San Diego，CA，1999年3月5-7日)。为了确定基线，测定了皮下注射0.8mg/kg酒石酸尼古丁对大鼠运动能力水平的作用。0.8mg/kg酒石酸尼古丁是不引发运动异常的最高可用剂量。
注射尼古丁后，未用抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]预处理的和用50mg正常家兔血清IgG预处理的大鼠活性水平增加。见图6A的右直方和图6B的左直方。用50mg抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]免疫IgG预处理动物抑制了这种作用(图6B右直方)。这显示抗尼古丁血抗血清消除了尼古丁的体内刺激作用。
实施例14-评估尼古丁对收缩期血压的作用在本试验中，测定了尼古丁行为作用的另一标志收缩期血压的变化。用抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]IgG或对照IgG预处理大鼠。用0.1mg/kg酒石酸尼古丁皮下注射处理大鼠。对照大鼠显示当用尼古丁处理时，收缩期血压增加42.6±3.2mmHg。当大鼠用抗尼古丁抗血清IgG预处理时，尼古丁的攻击效果差。当抗尼古丁血清给予的量增加时，可消除尼古丁升高血压的能力。如图7所示，作为IgG剂量的函数血压呈负线性趋势。
权利要求
1.一种半抗原载体偶联物，它具有下式II结构 式中，n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)n-Z连接于3’、4’或5’位；其中，该Z部分能直接或通过接头连接于载体。
2.如权利要求1所述的半抗原载体偶联物，其特征在于，所述接头是琥珀酰基部分。
3.如权利要求1所述的半抗原载体偶联物，其特征在于，所述载体蛋白包括T细胞表位。
4.如权利要求1所述的半抗原载体偶联物，其特征在于，所述T细胞表位能刺激对象的T细胞，从而诱导B细胞产生针对该半抗原载体偶联物的抗体。
5.权利要求1所述的半抗原载体偶联物在制备用于治疗或预防尼古丁成瘾用的药剂中的用途。
6.针对权利要求1所述的半抗原载体偶联物产生的抗体。
7.权利要求6所述的抗体的功能性片段。
8.一种产生抗体的方法，其特征在于，该方法包括用权利要求1所述的半抗原载体偶联物免疫宿主哺乳动物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。
11.一种疫苗组合物，它含有权利要求1所述的至少一种偶联物。
12.一种用于检测样品中尼古丁的存在的试剂盒，它包括权利要求6所述的抗体。
全文摘要
一种新颖半抗原－载体偶联物，能在体内诱导产生特异性结合尼古丁的抗体。这些偶联物含有偶联于免疫原性载体蛋白质的尼古丁半抗原。这种新颖的偶联物保留了尼古丁的手性，呈天然(S)－(－)状，具有良好的稳定性。可将这种偶联物用于配制主动免疫的疫苗，用于预防或治疗尼古丁成瘾。对该尼古丁半抗原－载体偶联物应答反应中产生的抗体可用于被动免疫。给予这些抗体来预防和治疗尼古丁成瘾。
文档编号A61K39/395GK1768861SQ200510092438
公开日2006年5月10日 申请日期1999年12月1日 优先权日1998年12月1日
发明者S·恩尼法, A·I·法托姆, R·B·纳索 申请人:Nabi生物制药公司