专利名称：一种具有促增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有促进机体增长作用的融合蛋白及其编码基因与其在制备儿童及成人生长激素缺乏症治疗性药物中的应用。
背景技术：
人生长激素(human growth hormone，hGH)是一种包含191个氨基酸残基的多肽，由脑垂体前叶细胞分泌。它具有促进机体生长、维持肌肉基质和长度的作用，并具有对抗胰岛素和促进其合成代谢的作用。垂体分泌生长激素(hGH)主要被两种下丘脑分泌的肽类激素调控一种为生长激素释放激素(growth hormone releasinghormnone，GHRH或GRH)，它诱导hGH释放，另一种为生长激素抑制激素(somatostatin，SS)，它抑制hGH释放，即前者为hGH的兴奋性激素，后者为抑制性激素。早期研究发现，损毁大鼠内侧基底下丘脑可引起GH分泌不足，从而导致生长停滞，相反刺激腹内侧核和弓状核可引起明显GH释放，推测该部位可能含有促GH分泌的生长激素释放因子(growth hormone releasing factor，GHRF或GRF)。1980年，Frohman从肢端肥大症病人胰腺肿瘤分离到对GH分泌具有刺激作用的GHRF，并部分纯化其提取物(Frohman LA，Szabo M，Berelowitz M，Stachura ME.Partial purification andcharacterization of a peptide with growth hormone-releasing activity fromextrapituitary tumors in patients with acromegaly.J Clin Invest，1980，65(1)43-54；Frohman LA，Downs TR，Chomceynski P，et al.Growthhormone-releasing hormonestructure，gene expression and molecularheterogeneity.Acta Pediatr Scand，1990，367(suppl)81-86)。至1982年，Guillemin和Vale两个实验室对肿瘤组织做进一步研究分析，获得了具有GH释放作用的，分别由44个氨基酸残基和40个氨基酸残基构成的两种多肽，并测定了它们的氨基酸序列，将这两种多肽分别命名为GHRH-44和GHRH-40(Guillemin R，Brazeau P，Bohlen P，Esch F，Ling N，Wehrenberg WB.Growth hormone-releasing factor froma human pancreatic tumor that caused acromegaly.Science，1982 Nov 5，218(4572)585-587；Brazeau P，Ling N，Bohlen P，Esch F，Ying SY，GuilleminR.Growth hormone releasing factor，somatocrinin，releases pituitary growthhormone in vitro.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(24)7909-7913)。在发现胰腺的GHRH后不久，研究人员又从人的下丘脑中分离到GHRH，其中三分之二是GHRH-44，三分之一是GHRH-40，两者是由前GHRH原分子(即prepro-GHRH)经过不同的翻译后加工途径生成的，它们在下丘脑的含量很高，具有相似的刺激GH释放的能力。目前多数学者相信特发性GH缺乏症的病因大多系下丘脑GHRH合成或分泌缺陷所致，而非垂体病变引起。许多研究报道指出特发性GH缺乏性侏儒症的患者中，40％-80％的病例对GHRH刺激有反应；1985年GRF欧洲联合中心报道70％的原发性GH缺乏症病例对GHRH激发实验有反应。上述事实表明，大多数GH缺乏症病例可采用GHRH治疗。自1985年GHRH应用于临床以来，应用生物工程技术合成的GHRH治疗GH缺乏症并取得较为满意结果的报道已有很多。与GH相比，GHRH应用于临床具有以下优势(1)符合生理情况，长期用GHRH治疗，可增加垂体反应性；(2)由于垂体存在保护性反馈机制，可避免过量给药的危险性；(3)持续给药可加强内源性GH释放，并呈脉冲式发放。另外由于GH可能导致一些副作用，如免疫反应等，因此人们希望找到具有专一促GH分泌活性的物质，以提高内源性GH水平，从而避免外源性生长激素的使用。
然而GHRH的半衰期较短，只有频繁的给药才能获得令人满意的疗效，如在临床研究中往往采用每天注射一次的用药方式。但如此频繁的用药方式再加上较长的治疗周期使得病人较难承受。因此迫切需要研制出作用时间长的GHRH。
人血清白蛋白(HSA)是机体中一种稳定且半衰期较长的蛋白。研究表明许多蛋白药物与该白蛋白交联或融合后可以显著地使药物蛋白的半衰期延长，从而使用药次数减少。目前HGS(Human Genome Sciences)公司已发明了白蛋白融合生长激素(Albutropin)，白蛋白融合粒细胞集落刺激因子(Albugranin)及白蛋白融合干扰素(Albuferon)等产品，并先后进入了I/II期临床研究，研究结果表明上述产品具有较长的体内半衰期，较高的安全性及较好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有促进机体增长作用的融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的具有促增长作用的融合蛋白，命名为HSA-GHRH，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促增长作用的蛋白质；序列表中的SEQ ID №1由640个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-585位为HSA的氨基酸残基序列，自氨基端第597-640位为GHRH的氨基酸残基序列，自氨基端第586-596位为连接肽序列。
编码上述具有促增长作用的融合蛋白的基因(HSA-GHRH)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)序列表中SEQ ID №2自5’端第1756到第1788位碱基发生缺失、缩短、延长、或突变的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1920个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1920位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1到第1755位碱基为HSA的编码序列，自5’端第1789到第1920位碱基为GHRH的编码序列，自5’端第1756到第1788位碱基为连接肽的编码序列。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述具有促增长作用的融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述具有促增长作用的融合蛋白方法，是将含有上述具有促增长作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有促增长作用的融合蛋白。
所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。
所述大肠杆菌可为E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10等。
用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体为任意一种可在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9(其物理图谱如图1所示)、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等。
以pPIC9为出发载体构建的重组酵母表达载体为HSA-GHRH/pPIC9。
当所述宿主为巴氏毕赤酵母时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度可为0.3-0.7％，优选为0.5％。
上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
培养含有本发明的具有促增长作用的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
本发明还提供了一种儿童及成人生长激素缺乏症的治疗性药物。
本发明所提供的治疗儿童及成人生长激素缺乏症的药物，它的活性成分为上述具有促增长减肥作用的融合蛋白。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为1-50μg具有促增长作用的融合蛋白/kg体重，每隔7-14天给药一次，疗程为3至12个月。
本发明所提供的融合蛋白HSA-GHRH具有显著的促增长作用，且具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，成本低的优点，有望制备成儿童及成人生长激素缺乏症的治疗性药物。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
图1为载体pPIC9的物理图谱图2为PCR扩增的GHRH的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为PCR扩增的HSA-GHRH的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为重组酵母表达载体HSA-GHRH/pPIC9的酶切鉴定结果图5为HSA-GHRH表达工程菌的高表达克隆筛选结果图6为不同诱导时间HSA-GHRH蛋白表达量的10％SDS-PAGE电泳鉴定结果图7为HSA-GHRH表达产物的10％SDS-PAGE电泳检测结果图8为外标法确定HSA-GHRH蛋白表达量的10％SDS-PAGE电泳图谱图9为经纯化的HSA-GHRH蛋白的10％SDS-PAGE电泳检测结果图10为HSA-GHRH蛋白的小鼠体内活性测定效果图11为HSA-GHRH蛋白的小鼠体内长效性测定效果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有物质含量的百分比均为质量百分比。
主要试剂1、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶等酶试剂，购自GIBCO-BRL、Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司。
2、PCR扩增试剂盒，购自瑞典Pharmacia公司。
3、DNA序列分析试剂盒，购自美国USB公司。
4、酪蛋白水解物，购自德国MERK公司。
5、Bacto-酵母抽提物，购自美国Difco公司。
6、酵母菌原生质体转化法所用的一些溶液的配制(1)SED1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0。
(2)SCE9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168g EDTA，pH5.8。
(3)CaS1M山梨醇，10mM CaCl2。
(4)SOS1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl2。
(5)CaT20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl2。
(6)PEG20％ PEG-3350，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)。
(7)1M PBS缓冲液132mL 1M K2HPO4，868mL 1M KH2PO4，pH6.0。
7、BMGY液体培养基1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)。
8、BMMY液体培养基1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)。
实施例1、融合蛋白基因HSA-GHRH的获得根据人血清白蛋白基因(HSA)和GHRH蛋白基因(GHRH)的核苷酸序列设计引物，用PCR的方法分别扩增人血清白蛋白基因和GHRH蛋白基因，引物序列如下引物15’-GGGAATTCCTATTACAATCTAGCTCTAGCACCTCT-3’；引物25’-GTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTGGTTCTTACGCTGACGCTATCTTCACTAAC-3’；引物35’-ACGCTGACGCTATCTTCACTAACTCCTACCGTAAGGTTTTGGGTCAATTGTCCGCTAGAAAGTTGTTGCAAGACATCATG-3’；引物45’-CAATCTAGCTCTAGCACCTCTCTCTTGGTTGGACTCACCTTGTTGTCTGGACATGATGTCTTGCAACAACTTTCTAGGGGA-3’。
一、GHRH基因的扩增以引物3和引物4为模板兼引物，用PCR的方法拼接出GHRH基因的全长序列，50μl PCR反应体系为10×PCR缓冲液5μl，dNTP 1.5μl，Pfu酶0.5μl，引物3和引物4各2μl，ddH2O 39μl。PCR反应条件为先94℃5分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒，共进行30个循环；然后72℃10分钟，4℃10分钟。
再以上述扩增产物为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增GHRH基因，50μl PCR反应体系为10×PCR缓冲液5μl，dNTP 1.5μl，Pfu酶0.5μl，模板1μl，引物1和引物2各2μl，ddH2O 38μl。PCR反应条件为先94℃5分钟，再94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒，共进行30个循环；然后72℃10分钟，4℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图2所示(泳道1和泳道2为PCR扩增的GHRH基因，泳道M为DL2000分子量标准)，扩增出了132bp的条带，与预期的GHRH基因的大小一致。
二、HSA基因的获得HSA基因的获得方法参照2003年3月19日授权的专利号为99102794.9的发明专利“人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主”。
三、人血清白蛋白和人生长激素释放激素融合蛋白基因HSA-GHRH的获得以步骤一得到的GHRH基因和步骤二得到的HSA基因为模板，在引物1和HSA上游引物(参照发明专利“人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主”，专利号为99102794.)的引导下，利用PCR扩增试剂盒扩增出HSA-GHRH融合蛋白基因，PCR反应体系为10×PCR缓冲液5μl，dNTP 1.5μl，Pfu酶0.5μl，GHRH模板1μl，HSA模板1μl，HAS上游引物和引物1各2μl，ddH2O 37μl。PCR反应条件为先94℃5分钟，94℃4分钟，60℃30秒，72℃40秒，共进行30个循环；然后72℃10分钟，4℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图3所示(泳道1为PCR扩增的HSA-GHRH基因，泳道M为DL2000分子量标准)，扩增出了1920bp的条带，与预期的HSA-GHRH基因的大小一致。将PCR扩增的HSA-GHRH基因用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后与经相同酶双酶切的酵母表达载体pPIC9(载体物理图谱如图1所示)用T4DNA连接酶连接，将HSA-GHRH基因克隆入pPIC9中，得到HSA-GHRH基因的重组表达载体，对其用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道1-5为酶切产物，泳道M为DL2000分子量标准)，获得了1920bp的酶切片段，与预期结果相符，得到了插入位点正确的HSA-GHRH基因的重组酵母表达载体，命名为HSA-GHRH/pPIC9。用DNA序列分析试剂盒对该重组载体进行测序，测序结果表明HSA-GHRH基因具有序列表中序列SEQ ID NO2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID№2由1920个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1920位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1到第1755位碱基为HSA的编码序列，自5’端第1789到第1920位碱基为GHRH的编码序列，自5’端第1756到第1788位碱基为连接肽的编码序列。
实施例2、人血清白蛋白和人生长激素释放激素融合蛋白基因HSA-GHRH在巴斯德毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化一、人血清白蛋白和人生长激素释放激素融合蛋白基因HSA-GHRH在巴斯德毕赤酵母中的表达1、高表达转化子的筛选将实施例1构建的HSA-GHRH的重组酵母表达载体HSA-GHRH/pPIC9用酵母原生质体转化法转化巴斯德毕赤酵母GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851，具体方法为将线性化的HSA-GHRH/pPIC9质粒DNA约10μg加入到100μl毕赤酵母GS115原生质体中，室温放置十分钟。再加入1.0mL新鲜的40％PEG/CaT溶液，温和混合后室温孵育10分钟。750g离心10分钟后小心吸净PEG/CaT溶液，用150μl SOS培养液重悬细胞。室温放置20分钟后加入850μl 1M的山梨醇溶液，涂布在MD平板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂粉)上，经组氨酸营养缺陷筛选，得到转化子。随机挑取24个转化子，接种于4mL BMGY液体培养基中，每隔12小时加入终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达，在30℃、100rpm下摇培36-48小时。培养结束后5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，将不同样品分别进行15％SDS-PAGE电泳进行检测，检测结果如图5所示(泳道1-10为不同单克隆的表达产物，泳道M为蛋白Marker)，泳道3、4、6、7为高表达克隆产物，表达产物的分子量大小约为70KD，与与预期结果相符，然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面培养，用于HSA-GHRH表达的工程菌，命名为HSA-GHRH/pPIC9(GS115)。
2、HSA-GHRH在巴斯德毕赤酵母中的表达挑取实施例1筛选的表达量高的工程菌的单菌落(以转化有pPIC9空载体的酵母菌GS115为阴性对照，该菌命名为pPIC9(GS115))分别接种于4mL BMGY液体培养基中，在30℃、100rpm摇培12-24小时。取1mL酵母工程菌培养液转接于50mL BMGY培养基中，在相同条件下继续摇培18-24小时，再按4％接菌量将40mL种子接入1000mL BMGY液体培养基中，在30℃、100rpm下继续摇培24-30小时，将培养液5000rpm离心5min，弃上清，然后将收集的工程菌HSA-GHRH/pPIC9(GS115)用200mL BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，在30℃、100rpm下摇培3-4天，每隔24小时补加甲醇(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。培养初期每隔12小时取一次样，48小时后，每隔6小时取一次样。经测定，培养结束后巴斯德毕赤酵母工程菌菌液OD600的光密度值已达到18-20，每升菌体干重为100-300克，表明HSA-GHRH表达的外源蛋白大多数已分泌到液体培养基中。将发酵培养基在4℃、10000rpm下离心20min，弃菌体，获得含大量融合蛋白基因HSA-GHRH表达产物的上清液，对不同时期取的样品进行10％SDS-PAGE电泳鉴定，电泳鉴定结果如图6所示(泳道M为蛋白Marker，其余泳道别分表示诱导表达后0、12、24、36、48、54、60、66、72小时后的产物)，诱导表达72小时，HSA-GHRH的表达量较高，表明HSA-GHRH在巴斯德毕赤酵母中获得了表达。对诱导表达的产物用10％SDS-PAGE进行进一步的鉴定，以转化有空载体的转化子为阴性对照，结果如图7所示(泳道3、4、5和6为用HSA-GHRH/pPIC9(GS115)分别为诱导表达36、48、60、72小时的上清，泳道1和2为阴性对照pPIC9(GS115))，泳道M为蛋白分子量标准，箭头示目的条带)。用外标法测定蛋白表达量，结果如图8所示(泳道100、50、40、30、20、10、5、2.5分别表示浓度为100、50、40、30、20、10、5、2.5mg/L的蛋白液)，表明样品中融合蛋白的表达量约为50mg/L。
3、HSA-GHRH融合蛋白的分离纯化将步骤2中的培养上清用截留分子量为30KD的超滤管浓缩，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡Sephadex G-75分子筛，获得最终产物，凝胶过滤所用缓冲液为PBS和0.1％Tween80，将纯化的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图9所示(泳道1为经发酵培养的上清，泳道2为蛋白Marker，泳道3为超滤浓缩样品，泳道4为凝胶过滤纯化样品)，检测结果表明经纯化后HSA-GHRH融合蛋白的纯度达90％以上，对其进行测序，测序结果表明获得了氨基酸残基序列正确的高纯度融合蛋白HSA-GHRH。
实施例3、动物实验1、融合蛋白HSA-GHRH的小鼠体内活性检测取3周龄断乳的雄性昆明小鼠20只，随机分成4组，每组5只，一组为对照组，另外3组为给药组。给药组每日每只皮下注射0.2mL步骤2获得的HSA-GHRH融合蛋白，每组注射量分别为20、2、0.2μg；对照组每日每只皮下注射0.2mL PBS。每日记录体重，连续给药两周。实验结果如图10所示，每天给药量为0.2μg的组别增重效果最明显，与对照组相比平均日增重百分比高出46％。
2、融合蛋白HSA-GHRH的小鼠体内长效性检测取3周龄断乳雄性昆明小鼠20只，随机分成4组，每组5只，一组为对照组，另外3组为给药组。给药组每周每只皮下注射0.2mL，每组注射量分别为20、2、0.2μg，对照组每周每只皮下注射0.2mL PBS。每日记录体重，连续给药两周。实验结果如图11所示，每周给药量为20μg的组别增重最显著，与对照组相比平均日增重百分比要高出34％。
序列表<160>2<210>1<211>640<212>PRT<213>人工序列<220>
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<400>1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu1 5 10 15Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys20 25 30Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys35 40 45 50Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr55 60 65Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly70 75 80 85Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe90 95 100Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu101 105 110Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys115 120 125 130Lys Tyr Leu Tyr Glu lle Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro135 140 145
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys150 155 160Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu165 170 175Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys180 185 190 195Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val200 205 210Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser215 220 225Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly230 235 240Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile245 250 255Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu260 265 270 275Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp280 285 290Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser295 300 305Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly310 315 320Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val325 330 335Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys340 345 350 355Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu360 365 370Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys375 380 385Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu395 400 405
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val410 415 420Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His425 430 435 440Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val445 450 455Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg460 465 470Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe475 480 485Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala490 495 500Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu505 510 515 520Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys525 530 535Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala540 545 550Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe555 560 565Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly570 575 580Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Asp Ala585 590 595 600Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg605 610 615Lys Leu leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln620 625 630Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu635 640
<210>2<211>1920<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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权利要求
1.具有促增长作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促增长作用的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1所述的具有促增长作用的融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)序列表中SEQ ID №2自5’端第1756到第1788位碱基发生缺失、缩短、延长、或突变的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6.一种表达权利要求1所述的具有促增长作用的融合蛋白的方法，是将含有权利要求3所述的具有促增长作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有促增长作用的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述酵母菌为巴氏毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168；所述大肠杆菌为E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体为pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K；以pPIC9为出发载体构建的重组酵母表达载体为HSA-GHRH/pPIC9。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于当所述宿主为巴氏毕赤酵母时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度为0.3-0.7％。
10.权利要求1所述的具有促增长作用的融合蛋白在制备儿童及成人生长激素缺乏症的治疗性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有促进机体增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种具有促进机体增长作用的融合蛋白及其编码基因与其在制备儿童及成人生长激素缺乏症治疗性药物中的应用。该融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促增长作用的蛋白质。本发明所提供的融合蛋白HSA－GHRH具有显著的促增长作用，且具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，成本低的优点。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61P5/00GK1733807SQ200510093428
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月29日 优先权日2005年8月29日
发明者刘志敏, 王楠, 赵洪亮, 薛冲, 张伟, 熊向华, 杨秉芬, 姚学勤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所