专利名称：：大肠杆菌定居因子抗原蛋白转基因植物的生产方法及产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白及其衍生物转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有大肠杆菌定居因子抗原蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。腹泻病广泛流行于世界各地，是当今全球性的公共卫生问题之一。它们不仅是发展中国家婴幼儿发病和死亡的主要原因，也是发达国家常见的食物性细菌感染和中毒的主要传染性疾病。引起传染性腹泻的病原很多，但其中最常见的病原之一是毒素源性大肠杆菌(E.coli，ETEC)，据最新的统计资料表明，全球每年因ETEC感染引起的腹泻病例高达6.5亿人次，导致80余万5岁以下婴幼儿死亡。ETEC的致病因子包括两类毒性因子，即肠毒素和定居因子(colonizationfactor，CS)表面抗原。其中肠毒素包括耐热肠毒素(heat-stabletoxin，ST)和热敏肠毒素(heat-labiletoxin，LT)两种。ST是含19个氨基酸残基的蛋白小肽，因其分子量小而几乎没有免疫原性，当它与靶细胞膜上的特异性受体结合后，活化鸟苷酸环化酶-环鸟苷酸系统(guanylate-cyclasecGMPsystem)，通过cGMP途径，影响细胞生理功能，导致水和电解质流失而致病。LT由一个A亚基和5个B亚基蛋白构成，它们分别行使不同的生物学功能。B亚基可与靶细胞膜上的受体-神经节苷酯(GM-1)结合，形成蛋白通道，然后A亚基进入细胞内激活腺苷酸环化酶-环腺苷酸系统(adenylatecyclasecAMPsystem)，引起细胞脱水和电解质平衡失调，从而产生水样类腹泻。LTB亚基无毒且具有很强的免疫原性，因此是生产口服类疫苗的理想抗原蛋白[1]。菌毛抗原(定居因子)在毒素源性大肠杆菌与哺乳动物肠道表皮细胞相互识别过程中起重要作用。只有在相互识别之后，大肠杆菌才能够将毒素导入到靶细胞中。已知能够侵染人的ETEC可产生20种不同血清型的定居因子，其中CS6是其中最常见的7种定居因子之一。CS6或单独存在或与其它定居因子(CS4，CS5，CFA/III)同时产生，但只有含有CS6的ETEC才能够引起人的腹泻[2]。有实验表明，用CS6阳性菌株免疫动物，能引起肠道抗定居免疫反应，而攻毒实验也证明CS6是CFA/IV三种抗原中最重要的保护性抗原[3]。故专家建议，新研制的ETEC疫苗一定应该把CS6包括在内。已知CS6全基因可以编码cssA、cssB、cssC和cssD4种蛋白。cssC是伴侣蛋白，它主要保护cssA和cssB不受蛋白酶所降解和护送它们通过细胞周质到外膜，cssD是引导蛋白，它在接收cssA和cssB亚基后，把它们呈现到细菌细胞的外膜表面。尽管CS6菌毛抗原蛋白的详细结构目前还不是很清楚，但可以确定的是，cssA和cssB亚基才是构成定居因子的主要成份。另外，值得提出的是，其它定居因子只含有一种蛋白亚基成份，而CS6则含有多种成份，这也许可能就是CS6对ETEC非常重要的原因之一。大量的实验研究表明，人或其它哺乳动物在受到病原感染后会产生多种免疫应答反应以抵御这种病原的入侵。该过程至少涉及以下三种免疫机制之一粘膜、体液或细胞。粘膜免疫应答产生分泌型抗体IgA，可保护呼吸道、消化道、生殖系统和腺体表面不受侵染。粘膜抗体可阻止病原在粘膜表面定居从而构成第一道防御屏障。粘膜抗体的产生可通过分泌性腺体和组织的局部免疫而获得，也可通过刺激肠道和呼吸道淋巴组织产生。另一方面，体液免疫主要涉及IgG和IgM，它们在血液中参与侵入病原的吞噬，病毒中和或有补体介导的细胞毒性。研究人员已经注意到口服接种也可诱导血液和粘膜抗体的产生，通常的情况是口服接种需要比较多的抗原，这是因为这些抗原被实际吸附和利用的数量比较少。因此，在一般情况下，口服接种所需要的抗原数量远远超过注射接种[4]。然而，也有例外，业已发现，一些蛋白只需要口服少量就能够产生体液和粘膜免疫应答，原因是这些蛋白能够与粘膜表面的糖脂或糖蛋白特异性结合，因此，这些蛋白也被称为粘膜性抗原，例如病毒性血凝素。口服和肌肉注射剂量比较实验表明，粘膜类抗原也能够非常有效地引起体液免疫，与肌肉注射相比，二者之间只有轻微的差别。大肠杆菌定居因子抗原蛋白、特别是CS6B亚基抗原蛋白可能也属于粘膜性抗原。基因工程研究领域的最新进展使植物表达外源基因成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生出完整植株，并将外源基因稳定地遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已经进行了成功的转化。例如烟草、马铃薯、番茄、大豆、苜蓿和玉米等。农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行外源基因的导入、遗传转化细胞的筛选和转基因植株的再生。单子叶植物经农杆菌介导转化比较困难，但也可以利用其它的转化方法如PEG和电融合法。有人成功地将外源基因导入玉米、水稻和小麦的原生质体中。然后从转化的原生质体再生出完整的植株。一些新的转化方法如微管注射法和基因枪法在单子叶植物转化和再生中可能更加有效。植物是一种多样化、低成本和可再生的材料资源，而生物技术的迅速发展则使我们进一步拓宽了植物的使用范围，国外在植物中采用这种“分子农业”的方法，已经成功地生产了越来越多的有用物质，其中包括一些高价值药用蛋白多肽，如人的细胞生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等[5-24]，一些研究机构和公司已经开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大的经济效益。已有人尝试在植物中表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)，发现在植物中产生的HBsAg抗原与源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg具有相似的抗原特性和物理特性，并进而提出了“食物疫苗”的概念，为此，还申请了相关专利[25]。然而，在本发明之前，还没有人利用植物表达毒素源性大肠杆菌定居因子、特别是CS6B亚基抗原蛋白，而这类蛋白有可能通过食用或肠道给药的方式使人体或其他哺乳动物产生专门针对毒素源性大肠杆菌的保护性抗体。在本发明之前，尽管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具体操作中存在很大困难，因为植物中的表达的抗原蛋白含量不确定，且植物不同个体或同一植物个体的不同器官之间存在很大差异，人或动物直接食用这种转基因植物就会产生很大风险，长时间食用含少量抗原蛋白的植物材料会引起免疫耐受性，而短时间食用过多抗原蛋白又会引起超敏反应。本发明首次提出将含有毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白的转基因植物食用部分加工成胶囊、冲剂或其它制剂的方法，由于可对其中所含的抗原蛋白进行严格的定量，从而对人或哺乳动物的食用间隔和食用量有了明确的规定，由此克服了直接食用转基因植物存在的上述缺点。本发明提供表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白转基因植物的构建方法以及如何应用含该重组抗原蛋白转基因植物的方法。本项发明特别适用于中国或其它发展中国家。本发明利用可以食用的转基因植物生产毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白，该重组蛋白在免疫原性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了表达毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基抗原蛋白转基因植物的生产方法以及如何具体应用这种含重组抗原蛋白转基因植物的方法。本发明利用转基因植物生产细菌抗原蛋白，如果将其加工成口服胶囊、冲剂或其它制剂，则具有廉价、安全和使用方便的特点，会使更多的人或动物得到保护。按照一个优先的实施方案，人或哺乳动物只需食用这些转基因植物的果实、汁液、根、茎、叶或植物的其它部分，或以肠道给药的方式利用这些转基因植物或转基因植物粗提取物(可定量)制备的胶囊、冲剂或其它制剂便可获得对疾病的免疫能力。这里的植物是指人们日常所食用的，同时由于避免了提纯过程，降低了生产成本和存在的其它一些不利因素。按照一个实施方案，本发明涉及利用转基因植物生产含大肠杆菌抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的方法。生产这种胶囊、冲剂或其它制剂的转基因植物材料可以有多种方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果实、叶子、茎和块茎，或植物某一部分的粗提物、或经完全纯化以及部分纯化源自转基因植物的毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白。总之，采用何种方式主要取决于该抗原蛋白本身的免疫原性，产生粘膜免疫应答反应所需这种源自转基因植物的抗原的剂量以及在这种成份中所含的干扰免疫应答反应的物质的多少，如糖类、热原和毒素等，并尽量降低免疫耐受性的产生。本发明所指的抗原蛋白是指在转基因植物中生产的，首先是编码细菌抗原蛋白的基因被分离出来，然后插入到一个含有选择标记的质粒上，启动子位于该基因的上游，它操纵该基因在植物中的表达。外源基因在植物各器官或可食用部分中表达后，人或动物可食用这部分植物组织。本发明提供了在植物细胞中生产细菌定居因子抗原蛋白的方法，按照一个优先的实施方案，本发明提供了在植物细胞中生产定居因子CS6B亚基重组抗原蛋白的方法，而该蛋白已知在天然状态下可引起哺乳动物产生免疫应答反应。或者说，本发明所指的细菌重组蛋白可作为抗原，具有与源自毒素源性大肠杆菌CS6B亚基蛋白一样的免疫原性。或者更确切说，本发明的抗原蛋白与源自毒素源性大肠杆菌或其它常规表达系统产生的该抗原蛋白一样，均能够通过口服和肠道给药的方式引起免疫应答反应。按照一个优先的实施方案，这种细菌重组蛋白是一种抗原蛋白，它可以在植物细胞中表达产生，且具有与源自毒素源性大肠杆菌或其它常规表达系统所产生的该抗原蛋白相似的免疫原性。本发明的抗原可在植物中表达产生，而表达产生该抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或经过粗加工后可以食用，例如番茄和苜蓿等。这种植物或植物的食用部分不应具有毒性，因此，许多常见的食用植物都包括在本发明所定义的植物范围之内。此外，在某些情况下，如马铃薯，在这里也被认为是可食用植物，尽管它的某些部分被认为是有毒的(马铃薯块茎部分是无毒的，因此属于本发明的权利要求范围之内，但它的果实是有毒的)，在这种情况下，这种植物也应包括在本发明的权利要求范围之内。本发明的重组抗原蛋白可以是该细菌天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，抗原也可能只是该天然蛋白分子的一部分。有时，抗原可与另外一个多肽或蛋白分子如细菌热敏毒素B亚基(LTB)蛋白多肽结合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前就连接在一起，这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。在本发明的其它实施方案中，一种表达毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基重组抗原蛋白的转基因植物被构建。就本发明而言，一种转基因植物至少应该在该植物的部分细胞中表达了毒素源性大肠杆菌定居因子重组抗原蛋白。按照本发明的某些优先实施方案，本发明的转基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表达的抗原是毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基重组抗原蛋白，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。本发明涉及到了一种食物的组成问题，该食物中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白。就本发明而言，植物或植物的某一部分被认为应该具有某些营养价值，它能够为人或其它哺乳动物提供代谢所需的能量，维生素和其他辅助因子。尽管莴苣并不大量提供能量、蛋白质、碳水化合物和脂肪，但就因为它含有重组抗原蛋白而被人们特意食用的话，莴苣也应包括在本发明的权利要求范围内。莴苣的粗纤维对哺乳动物的健康是有利的，即使哺乳动物并不能够消化莴苣的粗纤维。本发明涉及到了一种胶囊、冲剂或其它制剂的组成成份问题，胶囊、冲剂或其它制剂中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达毒素源性大肠杆菌定居因子重组抗原蛋白。就本发明而言，胶囊、冲剂或其它制剂中含有的抗原蛋白应该能够精确定量，以避免人或哺乳动物食用后产生免疫耐受性。按照本发明的一个优先实施方案，本发明的胶囊、冲剂或其它制剂所含有的抗原是毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基抗原蛋白，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。因此，按照一个更加具体的实施方案，本发明所指的食物将至少包括转基因植物的一部分，它具有某些营养价值，并含有毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基本身或与其他蛋白形成的融合蛋白或衍生物，而该抗原蛋白能够与人或哺乳动物粘膜细胞膜表面的糖基化分子受体结合。在任何情况下，本发明的食物都包括植物的根、茎、叶、果实或所说的植物种子。对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的转基因植物以及转基因植物的加工应用中起重要作用。用于转化植物的质粒载体由编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的DNA序列和操纵该DNA序列在所说的植物中表达的一个植物启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因植物或细胞的检测。在某些具体实施方案中，本发明的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化可食用植物，它编码的抗原是一种粘膜抗原，更进一步说，质粒载体所编码的抗原能够诱导免疫应答反应，特别是粘膜性免疫应答反应，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该抗原蛋白一样。本发明提供的DNA片段可用于基因枪法转化植物。本发明也提供了获得转基因植物细胞的方法，它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且该基因被置于一个植物启动子的操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的植物细胞再生出完整的转基因植株的方法。本发明提供了各种植物细胞或植物的转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合、电融合。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化植物细胞或植物。本发明在详细介绍转化方法时仅提到了马铃薯和番茄，然而，正如本领域专家所早已熟知的植物转化方法那样，许多种植物都可以利用本发明提供的方法进行转化。因此，所有这些植物都应包括在本发明的权利要求范围之内，这些植物可以是了单子叶植物或双子叶植物。就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明植物转化方法中所用的质粒载体是一个Ti质粒系统。按照一个实施方案，本发明使用的质粒是一个双元整合性载体。按照一个更加优先的实施方案，本发明所使用的质粒是pBI121。本发明提供了一种转基因食物的生产方法。它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.收获转基因植物的食用部分；5.食用一定量的这种转基因植物，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防疾病的效果。本发明也提供了含确定数量抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.自转基因植物细胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成胶囊、冲剂或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或者其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥和粉碎，然后加工成胶囊、冲剂或其它制剂，并确定其中含有的该抗原蛋白数量。为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考图1CS6B亚基抗原蛋白基因的克隆及细菌表达载体pETCS6B的构建。图2植物表达载体pBICS6B的构建过程，它含有毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基抗原基因。其中GUS代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；CS6B代表毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基蛋白基因。图3质粒pBICS6B所含的2个结构基因及其调控表达序列。其中Nos-Pro代表胭脂碱合成酶启动子；npt-II代表新霉素磷酸转移酶基因；Nos-Ter代表胭脂碱合成酶终止子；35SPro代表花椰菜花叶病毒35S启动子；RB代表DNA右边界序列；LB代表DNA左边界序列。图4不同株系转基因马铃薯叶片中CS6B亚基抗原蛋白mRNA的Northern杂交结果。1和2为非转基因马铃薯植株，3-6为转基因马铃薯植株。图5不同株系转基因马铃薯块茎中定居因子CS6B亚基抗原蛋白的含量。图6PCR检测CS6B亚基抗原蛋白基因在不同转基因番茄株系中的整合情况。其中1为1kbDNALadder，2为阴性对照扩增产物，3为阳性对照植物扩增结果，4-8为不同转基因番茄扩增产物。为倍比稀释后的样品。图7定居因子CS6B亚基重组抗原蛋白在植物汁液中的稳定性测定。其中含抗原蛋白的马铃薯块茎(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，室温下(15-20℃)放置1-7天后，取100ul上清液酶联反应后测定OD405nm光吸收值。图8定居因子CS6B亚基重组抗原蛋白在高温下的稳定性测定。其中含抗原蛋白的马铃薯块茎(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，不同温度下放置3小时后，取100ul上清液酶联反应后测定OD405nm光吸收值。图9经亲和层析纯化出的植物重组CS6B亚基抗原蛋白的PAGE分析。其中1为标准分子量蛋白(Pharmacia)；2为BL21(DE3)菌株表达产物阴性对照(IPTG诱导)；3为含质粒pET-28b(+)的BL21(DE3)菌株表达产物阴性对照(IPTG诱导)；4为含质粒pETCS6B的BL21(DE3)菌株表达产物阴性对照(未经IPTG诱导)；5为含质粒pETCS6B的BL21(DE3)菌株表达产物(IPTG诱导)；6为从BL21细胞中纯化出重组CS6B亚基蛋白；7为从转基因马铃薯块茎中纯化出的重组CS6B亚基蛋白；8为转基因马铃薯块茎中的总蛋白提取物9为非转基因马铃薯块茎中的总蛋白提取物；。图10饲喂不同剂量抗原蛋白后小鼠抗体产生情况的曲线表示本发明包括以下几个组成部分1.利用DNA重组技木构建质粒表达载体，它含有毒素毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物，人或其它哺乳动物在食用该抗原蛋白后有可能产生针对毒素源性大肠杆菌的特异性中和抗体；2.选择适宜的受体植物进行转化，使编码抗原蛋白的基因稳定地整合入受体植物的染色体中并可遗传给后代；3.从转化的受体植物细胞中再生出完整的转基因植物，而且该植物能够稳定、高效地产生毒素源性大肠杆菌定居因子蛋白抗原；4.人或哺乳动物直接食用这种转基因植物或以肠道给药的方式口服以该转基因植物食用部分或其提取物为主要活性成份加工而成的胶囊、冲剂或其它制剂后，有可能预防毒素源性大肠杆菌造成的腹泻。本发明提供了表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物转基因植物的构建方法，这种转基因植物作为食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂后被食用有可能引起人或哺乳动物的免疫应答。这种免疫应答的结果使人或哺乳动物对毒素源性大肠杆菌造成的腹泻具有抵抗能力。这种免疫应答是由于在转基因植物中表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物后而产生的结果，而毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白的产生则是由于该蛋白基因整合入植物的基因组中并在植物启动子调控下能够稳定地表达的结果。1.利用植物生产重组外源蛋白在植物中生产重组药用蛋白多肽最早的例子之一是利用植物贮藏蛋白天然的高水平表达特性，生产人的神经肽-亮氨酸脑啡肽。它是一个含有5个氨基酸残基的小分子多肽，在油菜中先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的形式被生产出来，后经胰蛋白酶水解被从贮藏蛋白质上切割下来，再通过HPLC予以回收，在临床上可作为止痛剂或镇静剂使用。继早期的研究之后，在植物中表达人和动物的抗体又成为人们关注的焦点。免疫球蛋白如IgG、IgM、IgG/IgA嵌合抗体、Fab片段、单链抗体和单域抗体等均已实现了表达，表达产物含量最高达植物可溶性蛋白的2％以上。这类抗体具有生物学活性，在纯化后可用作药物、诊断试剂和亲合剂等。此外，在植物中表达抗体还有可能增强作物的抗病毒能力、提高产量以及改良其它农艺性状等。在植物中生产重组药用蛋白的另外一条途径是使用基因工程植物病毒作为表达载体，这类裁体可瞬时高效表达大量外源蛋白，是农杆菌转化系统等所不能做到的，已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CpMV)等，其中超过150多种的蛋白多肽在TMV载体中成功表达[26]。利用融合蛋白表达策略已生产出含有疟疾、动物口蹄疫病毒、鼻病毒及人免疫缺陷病毒(HIV)抗原决定簇的嵌合外壳蛋白，这类融合蛋白的生产方式将来可能是生产疫苗的一条重要和经济有效的途径。本发明不仅允许在一种植物中生产一种大肠杆菌定居因子抗原蛋白，而且可以在一种植物中同时生产多种细菌抗原蛋白。将多种抗原蛋白的基因构建在同一个表达载体上，然后用其转化植物，从而在一个转基因植物中可同时表达多种细菌抗原蛋白。例如，毒素源性大肠杆菌含有定居因子CS6B亚基表面抗原蛋白和热敏毒素B亚基抗原蛋白，这两种抗原蛋白基因就可以构建在同一个植物表达载体上，分别受不同的植物启动子控制，然后同时导入植物，从而在一个转基因植物中就可以同时产生这两种抗原蛋白；也可以将这编码这两种抗原蛋白的基因在转化前就相互融合，但并不改变各自的移码框架，在导入植物后，在植物体内便可表达由这两种蛋白形成的一个融合蛋白，由此，便可进一步提高这两种蛋白彼此的免疫原性。此外，转基因植物也可以通过多次转化或者同时用多个含有不同抗原基因的表达载体同时转化的方法获得。2.受体植物的选择利用不同的外源DNA转移技术，现已转化了多种植物，包括许多双子叶植物和一些单子叶植物。考虑到遗传转化操作的难易程度，本发明更倾向于使用双子叶植物作为受体植物，尽管某些单子叶植物如小麦、玉米和水稻可能更适于作为人们的食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂。选择受体植物进行遗传转化要考虑到抗原蛋白是否能够在它的食用部分中表达。因为，抗原蛋白在植物的某一部分如果实、叶子、茎、种子、或根中表达后，人或哺乳动物可直接食用该部分的植物组织或者在加工以后做成胶囊、冲剂或其它制剂供人们口服。按照一个并不优先的实施方案，抗原蛋白也可在不能食用的植物中表达，然后从中完全纯化出所需的抗原蛋白加工成胶囊、冲剂和其它制剂。在选择受体植物时，还要考虑其它一些因素。受体植物的食用部分最好不需加热就可以食用，因为加热会引起抗原蛋白变性，从而降低它的免疫原性。此外，因为毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白在人或动物刚出生时最易诱导免疫应答反应的产生，因此，含有该抗原蛋白的植物部分最好能加工成液体的方式被饮用。适于本发明转化的受体植物包括所有可作为人或动物食物的双子叶植物和单子叶植物，植物的一部分或全部可食用，这些植物包括马铃薯、番茄、胡萝卜、莴苣、黄瓜、小麦、大豆、水稻、玉米和香蕉等，但不仅限于此。3.植物转化方法有许多种方法可以将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物。将外源基因稳定整合入植物染色体基因组DNA的主要方法包括1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入植物染色体基因组DNA。植物组织的转化方法因植物和农杆菌系统而异。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的植物外植体。农杆菌转化方法特别适用于双子叶植物的转化。正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入植物细胞或组织中。按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入植物细胞中并整合入植物的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基蛋白或其衍生物的基因；该目的基因的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在植物基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在植物细胞中表达后可提供一个选择标记证实植物或植物细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过三亲交配的方式或DNA直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到植物细胞中起重要作用。熟悉植物遗传转化的人应该知道转化用的农杆菌菌株可以有多种选择，质粒构建也有多种方式，其目的都是为了更有利于植物的遗传转化。同样，人们也应该知道除了根癌农杆菌外，在有些情况下，还有其它农杆菌如发根型农杆菌更适于一些植物的转化。植物组织的转化方法因植物和农杆菌介导系统而异。最常用的是植物叶盘转化法，它适于多种易于再生的植物外植体。在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出植物细胞及完整植株。本发明不仅仅限于使用农杆菌Ti质粒转化系统，还应包括其它物理性的手段将外源基因直接导入植物细胞或原生质体的方法以及其它将外源基因导入植物细胞的方法。4.基因表达启动子在受体植物和转化方法确定之后，一个组成型的、发育调节型的或组织特异型的表达启动子被选择以便外源基因能够在植物中表达。所有已知能操纵外源基因在植物细胞中转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如花椰菜花叶病毒35S启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的35S启动子)；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)；逆境诱导基因如乙醇脱氢酶(Adh1)或玉米肌动蛋白基因启动子等，但不仅限于此。本发明也可利用已知在植物可食部分高效表达的启动子如马铃薯质体基因启动子。用于植物转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。下面以转基因马铃薯和番茄生产毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基蛋白抗原为例，描述一个优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。选择毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白在转基因植物中表达是因为毒素源性大肠杆菌造成的腹泻是一种常见的人或哺乳动物疾病，目前还没有口服性疫苗可供使用。选择马铃薯和番茄作为受体植物是为了举例说明在植物的不同部分可表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白。实施例11.定居因子CS6B亚基抗原蛋白细菌表达载体pETCS6B的构建根据已公布的、编码人源毒素源性大肠杆菌定居因子CS6完整菌毛抗原蛋白的DNA核苷酸序列(见GenBank，U04846)，合成了一对特异性引物(由上海生工生物工程公司合成)，其中上游引物(5’端引物)为5’-AACCATGGGAAACTGGCAATATAAATCTCTGG-3’，下游引物(3’端引物)为5’-AACTCGAGATTGCTGTAAAATGATACAGTC-3’，并以含有CS6菌毛抗原全部编码序列的质粒DNA为模板(由中国军事医学科学院生物工程研究所张兆山研究员提供)，通过多聚酶链式反应(PCR)扩增，获得了人源毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基抗原蛋白基因，该基因片段被直接插入到pMD18-T质粒中(Takara，大连宝生物工程有限公司)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有该基因的细菌克隆pMD18-CS6B，然后，通过核苷酸序列分析，确定定居因子CS6B亚基抗原蛋白基因是正确和完整的(上海生工生物工程公司完成)。因为在扩增CS6B亚基基因的5’端和3’端引物中分别引入了NcoI和XhoI限制性酶切位点，所以pMD18-CS6B质粒DNA经NcoI和XhoI双酶切后，可将定居因子CS6B亚基抗原蛋白基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pET-28b(+)中(NcoI和XhoI双酶切)，便构建成细菌性表达载体DETCS6B。质粒pET-28b(+)购自美国Novagen公司，其为高效细菌性表达载体，并受IPTG诱导表达。该质粒多酶切位点的两端分别都含有一个6个组氨酸的蛋白标签，外源基因插入到合适的多酶切位点后，在不改变移码框架的情况下，可与位于N端或C端的6组氨酸标签形成融合蛋白，便于外源重组蛋白的提纯。2.CS6B亚基抗原蛋白在细菌中的高效表达利用质粒pETCS6B转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购自Novagen公司)，从LB固体平板培养基上(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1升，pH7.0并含卡那霉素50mg和15g琼脂)。挑取转化后形成的细菌单菌落，接种于LB液体培养基上(含卡那霉素50mg/L)，振荡培养过夜；次日，取部分培养液按1∶100比例加到新鲜的LB液体培养基(含Kan50mg/L)中，继续培养至OD600达到0.6时，加入IPTG(购自Sigma公司)，使其终浓度为1mmol/L，诱导培养3小时后，离心，收集菌体，悬浮于1×SDS上样缓冲液(50mmol/LTris-HCL，pH6.8，100mmol/LDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，在100℃水浴中煮3min破碎菌体，离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳，分析是否有重组蛋白产生，实验中分别以pET28b(+)转化的BL21菌株(IPTG诱导)、pETCS6B转化的BL21菌株(未加IPTG诱导)以及BL21空白菌株作为阴性对照。3.CS6B重组蛋白的纯化大量培养含pETCS6B质粒的BL21细菌细胞，在经IPTG诱导后，收集BL21菌体，随后将菌体悬浮于细菌裂解缓冲液(0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0)，超声波破碎菌体，12000rpm离心15min，保留沉淀(包涵体)。加入包涵体溶解液(0.05mol/LTris-HCl缓冲液，1mmol/LPMSF，8mol/L尿素，10mmol/LDTT，pH8.0)，室温处理4小时；12000rpm，离心15min，取上清。由于CS6B亚基重组蛋白的C端含有6个组氨酸的标签，因此其纯化可以利用组氨酸亲和层析柱的方法来进行。His6融合蛋白纯化试剂盒ProBondTMPurificationSystem购自美国Invitrongen公司，纯化过程完全按照试剂盒所提供的方法进行。汇集洗脱后的蛋白液，经冷冻干燥，然后溶解在0.05mol/LTris-HCl缓冲液中(含10mmol/LEDTA，pH7.0)，至终浓度为1mg/ml。4.抗血清的制备供试小白鼠(BALB/c)购自北京大学医学部，全部为雄性，体重为20g左右。取上述经His6柱亲和层析后CS6B亚基蛋白，每个小鼠腹腔注射入0.1ml，每隔10天注射1次，在第6次注射后第7天，从小鼠眼部取血，汇集在10ml离心管中，37℃放置1小时，然后置于4℃过夜，次日，5000rpm离心15min，收集上部血清，分装后，置于-20℃冰箱中长期保存。实施例21.CS6B亚基抗原蛋白植物表达载体pBICS6B的构建为了构建高效植物表达载体，根据已知的CS6B亚基核苷酸序列，合成了一对引物(由上海生工生物工程公司合成)，其中上游引物(5’端引物)为5’-AAATCTAGAAACAATGGGAAACTGGCAATATAAATCTCTGG-3’，下游引物(3’端引物)为5’-AAAGAGCTCATTGCTGTAAAATGATACAGTC-3’，并以质粒pMD18-CS6BDNA为模板，经过PCR，扩增获得CS6B亚基抗原蛋白基因，因在5’端和3’引物中分别引入了XbaI和SacI位点，所以扩增产物用上述两个酶直接酶切后，直接定向插入到质粒pBI121的原GUS基因位点内(经XbaI和SacI双酶切)，便构建成双元表达载体pBICS6B。质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的XbaI限制性酶切位点位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间，而SacI则位于GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBI121是因为用XbaI和SacI双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个新的外源蛋白基因，新基因将能够在植物细胞内高效表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织与未转化的植物细胞或组织区分开来。nptII基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们均源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。质粒pBICS6B含有1)新霉素合成酶基因II(nptII)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)人源毒素源性大肠杆菌定居因子CS6B亚基抗原蛋白基因及操纵该基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将nptII基因和CS6B亚基抗原蛋白基因转移到植物体内并整合到植物染色体中。pBICS6B的结构如图3所示。2.将表达载体pBICS6B导入农杆菌(A.tumefaciens)含有定居因子CS6B亚基抗原蛋白基因的质粒pBICS6B被通过三亲交配的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株LBA4404现已被广泛应用，它是改造后的农杆菌菌株，含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pBICS6B向植物细胞内的转移。农杆菌在含有25mg/L链霉素的50mlYEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl5克，加蒸馏水至1升，pH7.0)培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pBICS6B的DH5α(购自美国GIBCO公司)和含有辅助质粒pRK2013(购自美国Clonetech公司)的HB101(购自美国Clonetech公司)分别接种在含有50mg/L卡那霉素50mlLB培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞分别悬浮在1ml不合任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200ul，置于同一1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10ul，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有pBICS6B质粒的农杆菌菌落开始产生。用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pBICS6B质粒DNA是否存在。3.农杆菌介导的植物遗传转化植物的遗传转化首先是植物组织器官或细胞与农杆菌共培养，在培养约2天后，将植物外植体移置相应的选择培养基中。植物外植体可以是原生质体、愈伤组织或其它器官组织，因植物而异。选用带叶子的器官是最常用的方法。叶片转化主要依据Horsch等人的方法(27)。马铃薯无菌苗(中薯3号，购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)保存在22℃光照培养箱中，给予16小时中等强度光照，每隔3星期剪取顶端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固体培养基中，生长2星期的叶片最适于转化。番茄(中蔬5号，种子购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)则以7-10日龄的子叶或下胚轴无菌外植体进行转化。无论马铃薯还是番茄均以叶片进行转化为最好。含有表达载体pBICS6B的农杆菌LBA4404接种在50mlYEP培养基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml链霉素)中28℃培养2天，4000g离心5分钟收集菌体，用25ml液体MS培养液(不含抗生素)洗涤一次，再用MS重新悬浮至OD600nm＝0.2-0.4。将有伤口的叶片浸入稀释后的农杆菌培养液中数分钟，用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液，然后将叶片移置不含任何抗生素的再生培养基上23-25℃共培养2天。将叶片移置新鲜的选择培养基上培养，该培养基中含有100ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧苄青霉素，以后每两周更换一次选择培养基。当叶片伤口处愈伤有幼芽形成并长至足够大时，将幼芽切下(通常在转化后6-10星期)转移到生根培养基上生长。当根出现后，将再生植株移置无菌条件下生长或转移到土壤中，给予适宜的温度、光照和营养条件下生长。4.表达CS6B亚基抗原蛋白转基因工程植株的筛选在转化大约四个月后(番茄产生果实需10个月)。可检测转基因植株是否含有CS6B亚基抗原蛋白。1)生物化学和免疫学检测从转基因植物的叶片、茎、块茎或果实采集样品。并将样品在水或缓冲液(如PBS磷酸缓冲液，1L中含0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，0.2gKCl，pH7.4)中磨碎后，匀浆液在10000g离心10分钟，取上清液，除留一小部分用于Lowry法定量可溶性蛋白外，其余用于CS6B亚基抗原蛋白蛋白含量的测定。通过酶联免疫法测定植物中CS6B亚基抗原蛋白的含量。2)CS6B亚基抗原蛋白基因的检测转基因植物中CS6B亚基抗原蛋白基因的整合情况可通过PCR扩增目的片段基因或Southern杂交印迹反应进行检测，自转基因植物和对照植物中分别提取其基因组DNA，以此作为模版，用特异性的CS6B亚基基因引物(见上文)进行扩增，或用XbaI和SacI单酶切后，琼脂糖电泳分离DNA片段，然后再转移到尼龙膜上后，以地高辛(Digoxigenin)标记的CS6B亚基蛋白核酸编码序列作为探针(BM公司)。此外，可收集转基因植株自交种子，通过卡那霉素抗性萌发实验或PCR分析其后代的外源基因纯合情况。5.表达CS6B亚基抗原蛋白转基因植物的繁殖和培育在筛选出高效和稳定表达CS6B亚基抗原蛋白的转基因马铃薯或番茄植株后，为生产该抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。马铃薯是通过营养繁殖的，因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量幼苗和微型薯，且不必担心由于有性生殖而引起后代的遗传重组问题。番茄或其它依靠种子繁殖的转基因植物要获得稳定表达的后代，则需要较长时间，因为种子繁殖有缺点，其后代缺乏均一性，外源基因按照孟德尔遗传规律传给后代。基本上，每个种子遗传上是不同的，具有它自己的遗传特性。因此，转基因植物最好要经过几代筛选，在得到纯系后，外源基因才能稳定地传给后代。6.含CS6B亚基抗原蛋白转基因食品的制备CS6B亚基抗原蛋白可通过大量繁殖转基因植物进行生产，植物食用部分在收获后可直接食用、或者直接加工、或经部分提纯、或完全提纯后再加工成胶囊、冲剂以及其它制剂。马铃薯块茎虽然不能够生吃，但在冷冻干燥后，磨成细粉并加工成胶囊、冲剂或其它制剂。而番茄果实则可以加工成瓶装番茄汁方便饮用。在一定时间内，人们通过口服一定量的胶囊、冲剂或番茄汁或直接食用番茄(在一段时间内一次或多次)，其中含有的CS6B亚基抗原蛋白有可能激发人体产生免疫应答反应，人们也就具备了对人源毒素源性大肠杆菌的免疫能力。实施例31.马铃薯的转化在农杆菌介导下，利用叶盘法转化马铃薯，然后通过在选择培养基上[MS中基础成分中添加植物激素(Sigma公司)6-BA1.5mg/L和NAA0.1mg/L，并含有200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素]连续培养和筛选，完整的卡那霉素抗性马铃薯植株被再生出来。按照Horsch等人的方法，利用叶盘法转化马铃薯。马铃薯无菌苗在重新扦插于MS固体培养基中生长2周后，用剪刀自叶柄与茎相连部位处将叶片剪下。含有表达载体pBICS6B的农杆菌菌株LBA4404接种在50mlYEP中，28℃培养2天，4000g离心5分钟，收集菌体，然后重新悬浮在液体的MS培养基中至OD600nm＝0.4，将剪下叶片浸入稀释后的农杆菌中5分钟，然后取出，用滤纸吸干，叶面朝上置于MS固体培养基上，28℃共培养2天。然后将叶片移置新鲜的选择培养基上，以后每隔2个星期更换一次选择性培养基直到叶柄伤口处长出愈伤并分化出幼苗。当幼苗出现并长到足够大时，将幼苗切下来(通常在共培养后4-8个星期)，移到生根培养基上(MS含有100ug/ml卡那霉素)，当根长出后，幼苗被移到无菌的营养土中生长并辅之以适当的温度和光照条件。2.转基因马铃薯的RNA分析利用地高辛标记的CS6B亚基蛋白基因DNA片段做探针(标记方法见BM公司试剂盒)，对pBICS6B表达载体转化后的部分卡那霉素抗性马铃薯植株RNA进行了杂交分析。转基因马铃薯植株的叶片总RNA被提取，方法见参考文献(28)。大约1.0g叶片在液氮中用研钵磨成粉末，加入10mlRNA提取缓冲液(0.2MTris-HCl，pH6.8；0.2MNaCl；20mMEDTA；2％SDS)，随即加入10ml饱和酚缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA饱和)进行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g离心，收集上层水相，加入0.3M醋酸钾(pH5.2)缓冲液和2.5倍体积的无水乙醇，10000g离心收集沉淀，风干后，沉淀重新悬浮在2ml的水中，随后加入2ml6M的醋酸铵缓冲液和10ml无水乙醇，10000g离心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新悬浮在0.4ml水中，RAN浓度可通过测定260nm的吸光值进行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25单位。取10ugRNA样品，约5ul，与2倍体积RNA样品缓冲液(10ml去离子甲酰胺，3.5ml37％甲醛，2ml5XMOPS)混合后，65℃加热5分钟，冷却后，加入3ulRNA加样缓冲液(50％甘油，1mMEDTA，0.4％溴酚蓝)，然后经过1％的RNA琼脂糖凝胶电泳。核酸通过毛吸管法转移到尼龙膜(HybondN+)上，所用的缓冲液为20XSSC，pH7.2(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为16小时。核酸通过紫外线照射后被交连在尼龙膜上，将膜置于预杂交液中[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，100ug/ml鲑鱼精DNA]，68℃预杂交3小时，然后更换新的杂交液[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％的封闭剂(BM试剂盒中提供)]，5ml杂交液中加入变性的地高辛标记的DNA探针60ng进行杂交，探针长452bp，它是来自质粒pMT18-CS6B的NcoI和XhoI的酶切片段，包括了CS6B亚基基因的全部编码序列。在杂交液中68℃杂交24小时后，取出杂交膜，于200ml2XSSC，0.1％SDS缓冲液中室温下洗膜2次，然后于100ml0.1XSSC，0.1％SDS缓冲液中68℃洗膜2次。显色反应基本依据试剂盒中提供的方法(BM)，尼龙膜先于洗脱缓冲液中平衡5分钟，然后用50ml1X封闭缓冲液封闭30分钟，加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体至浓度为75mU/ml，室温下反应30分钟，用洗脱缓冲液2次，每次15分钟。将膜移置20ml显色缓冲液(0.1MTris-HCl，pH9.5；0.1MNaCl；50mMMgCl2)中平衡5分钟，更换新的底物缓冲液(200ulNBT/BCIP底物加入10ml显色缓冲液)，遮光条件下显色16小时，待所期望的条带出现后，用水终止反应。经质粒pBICS6B转化后获得的转基因植株和阴性对照植株的RNA杂交结果如图示4。不同转基因植株的RNA杂交信号有差异，这可能是由于基因的插入位点和基因的拷贝数不同引起的。和标准RNA分子量相比，转录的RNA约有450bp长，与预先估计的相一致。阴性对照植物的RNA没有观察到杂交信号。mRNA的稳定、大量表达并能够与编码CS6B亚基蛋白的DNA核酸探针特异性杂交的结果表明，mRNA的稳定性不会成为CS6B亚基基因在马铃薯中表达的一个问题。3.不同转基因马铃薯植株CS6B亚基抗原蛋白含量的测定取不同转基因马铃薯植株叶片0.1g，各加入1ml去离子水，在4℃下用玻璃匀浆器磨碎。匀浆液10000g4℃离心5分钟，利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定马铃薯叶片中CS6B亚基抗原蛋白的含量，取叶片0.2g，以1∶3(W/V)的比例在包被缓冲液中磨碎(1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加蒸馏水至1升)，匀浆液10000g4℃离心5分钟，取上清液200ul加入酶联反应板的小孔中，每个样品设两个重复，然后将酶联板置于4℃下包被过夜，次日，用PBST缓冲液(8gNaCl，0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKCl，0.5mlTween20，加蒸馏水至1升)洗3次，每次3分钟，甩干后，每个小孔中加入200ul小鼠抗CS6B亚基蛋白抗血清(见实施例1)，抗血清在使用前经PBST按1/1000倍稀释。37℃反应2小时，用PBST洗3次，每次3分钟，甩干后，每个小孔中各加入200ul碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(购自Sigma公司)，酶标抗体在使用前经PBST按1/5000倍稀释，37℃反应1小时，用PBST洗4次，每次3分钟，甩干后，小孔中各加入显色底物缓冲液(9.7ml二乙醇胺，加蒸馏水80ml，用HCl调pH至9.8，然后加入底物p-硝基苯至终浓度0.6mg/ml)，室温下显色1小时，然后每个小孔各加入50ul3MNaOH中止反应，405nm下读取光吸收值。以His6亲和层析柱纯化出的标准含量的CS6B亚基抗原蛋白(见实施例1)为阳性对照，阳性对照被稀释成不同蛋白水平(0.2-32ng)，在颜色反应后，读取405nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。如图5中所示，通过比较发现，阴性对照植物中(柱1)没有发现含有CS6B亚基抗原蛋白，而在转基因马铃薯植株中则可以检测到不同含量的CS6B亚基抗原蛋白，含量约为植物可溶性蛋白10-30ng/mg(柱2至柱5)。不同转基因马铃薯之间差异比较大这可能是由于基因插入的拷贝数和插入位点不同引起的。4.转基因马铃薯不同组织器官CS6B亚基抗原蛋白含量的测定取转基因马铃薯叶片、茎和块茎组织各0.2g，处理和测定方法同上。表1中列出了转基因马铃薯不同组织器官中CS6B亚基抗原蛋白的含量。表1.马铃薯叶子、茎和块茎中CS6B亚基抗原蛋白的含量马铃薯叶子中的CS6B亚基抗原蛋白表达量最高约为可溶性蛋白的0.003％，为160ng/g鲜重。茎中的CS6B亚基抗原蛋白尽管表达量占植物可溶性蛋白的0.006％，但因茎中含有的可溶性蛋白量比较低，故每g鲜重只含有75ngCS6B亚基抗原蛋白，约为叶片的一半。马铃薯块茎中的CS6B亚基抗原蛋白含量最高，约为810ng/g鲜重，这就为加工和利用马铃薯块茎生产抗大肠杆菌腹泻口服疫苗提供了极大的方便。5.CS6B亚基抗原蛋白转基因马铃薯的繁殖转基因马铃薯的繁殖已在实施例2中描述。实施例41.番茄的转化番茄(Lycopersicomesculentum)的转化方法如同实施例3的1中所描述的那样，也是在农杆菌LBA4404介导下利用叶盘法进行遗传转化。农杆菌侵染生长7-10天后子叶或下胚轴无菌外植体，该外植体不需预培养，而是在切下后立即浸入农杆菌菌液中5-10分钟，取出后用滤纸吸干多余的菌液，后移置Z1培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光条件下共培养2天。然后将外植体转移到SM培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导愈伤组织形成和幼苗分化(29)。切下的幼苗在RM培养基(1/2MS基本培养基中加入0.2mg/LNAA，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导生根，待长至一定高度，然后转移到灭菌土壤中，给予适宜的条件培养生长。2.PCR检测CS6B亚基抗原蛋白基因在番茄中的整合情况番茄基因组DNA的提取方法基本依据Chee的方法(30)。取3g番茄新鲜叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml离心管中，然后加入9mlCTAB提取液(100mMTris-HCl，pH7.5含5MNaCl，10mMEDTA，10ml/Lβ-巯基乙醇，10g/LCTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入4.5ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一20ml离心管中，加入4.5ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入10ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用3ml76％乙醇含0.2MNaOAc和2ml76％乙醇含10mMNH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。取上述番茄基因组DNA1ug约1ul作为模版，加入CS6B亚基抗原蛋白基因核酸编码序列特异性引物各1ul(见实施例2)，10XPCR缓冲液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环。反应结束后，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图6所示，阴性对照植物中(泳道2)没有发现特异性的条带，而在转基因番茄植株中则可扩增出1个约450bp的特异性条带(泳道4-8)，该结果表明CS6B亚基抗原基因已整合进入番茄基因组DNA中。2.叶子和果实中CS6B亚基抗原蛋白含量的测定用研钵将植物组织磨碎，在磨碎过程中加入液氮，植物组织粉末中加入10倍体积灭菌无离子水进行稀释。植物匀浆液10000g4℃离心5分钟，依据试剂盒(Sigma公司，p5656)提供的方法，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。转基因植株中CS6B亚基抗原蛋白含量的检测方法同实施例3中的3。表2中列出了转基因番茄叶子和果实中CS6B亚基抗原蛋白的含量。取在温室中生长的转基因番茄的绿叶和红色果实进行可溶性蛋白和CS6B亚基抗原蛋白含量的测定，就象上文中所描述的那样。非转基因植物叶子和果实中检测不到CS6B亚基抗原中蛋白。表2番茄叶子和果实中的CS6B亚基蛋白的含量番茄叶子中的CS6B亚基抗原蛋白含量略高于马铃薯叶片，表达量为可溶性蛋白的0.0039％。在成熟果实中CS6B亚基抗原蛋白的含量约占可溶性蛋白的0.005％，或为105ng/g鲜重。因为果实的密度比较高，番茄果实中的CS6B亚基抗原蛋白的表达量集中了番茄植株CS6B亚基蛋白的大部分，一个重100克的番茄果实含有大约10ugCS6B亚基重组抗原蛋白。实施例51.重组CS6B亚基抗原蛋白在植物组织中的稳定性测定重组CS6B亚基抗原蛋白在完整的植物细胞中可长时间保存。如以马铃薯块茎方式4℃下低温保存，保存期长达一年，抗原也不会有任何损失。但当植物细胞结构破坏后，细胞器中的各种蛋白酶就会被释放出来，它们能降解植物汁液中所含的重组抗原蛋白。因此，检测重组抗原蛋白在植物汁液中的稳定性，对于今后在加工过程中尽可能保证抗原蛋白不受损失至关重要。从图7中可以看出，重组的CS6B亚基抗原蛋白在植物汁液中放置的时间越长，蛋白的损失就会越大。在室温下放置1天后与新研磨的汁液中抗原蛋白含量差别不大，但从第2天起，抗原蛋白的量会急剧减少，到第七天后，基本上检测不到抗原蛋白了。该结果表明，在转基因马铃薯块茎加工过程中，应尽快使其脱水干燥，才可以有效防止重组抗原蛋白不会被细胞中释放出的蛋白酶降解破坏。尽管高温可加速转基因马铃薯块茎脱水干燥，但重组CS6B亚基抗原蛋白对高温的忍受能力是有限的。从图8可以看出，当温度超过50℃时，处理时间达3小时，植物汁液中能够检测到的抗原蛋白的数量急剧下降，这表明该抗原蛋白可忍受的极限高温是50℃。超过此温度，蛋白会变性，从而失去与特异性抗体的反应能力。综合上述，可以得出如下结论，干燥马铃薯块茎以低温、快速最为适宜，在此条件下可有效保护重组抗原蛋白不受损失。2.含CS6B亚基抗原蛋白胶囊的制备马铃薯块茎不便于食用，可考虑加工成胶囊。1000g鲜重马铃薯块茎在冷冻干燥后可获得干物质约140g，该干物质进而在低温下被磨成150-200目的干粉，经测定，每100mg这种转基因马铃薯块茎制成的干粉中约含有580ngCS6B亚基抗原。该干粉可直接灌入肠溶性或胃溶性的胶囊外壳内。根据具体情况，每个胶囊可灌入100-500mg转基因马铃薯块茎制成的干粉，例如，一个300mg的胶囊约含有1.7ug的CS6B亚基抗原蛋白。成人一次需服用至少5粒，才有可能获得足够的免疫剂量。为了提高每个胶囊内CS6B亚基抗原蛋白的含量，新鲜马铃薯块茎也可在加入等重量水后，在4℃低温情况下进行彻底粉碎，低速离心收集上清液，经迅速冷冻干燥后，每100mg这种提取物中约含有10-20ugCS6B亚基抗原蛋白，成年人每次只需服用1粒100mg的胶囊，就有可能达到足够的免疫剂量。3.含CS6B亚基抗原蛋白冲剂的制备胶囊的容积比较小，如果直接灌入转基因马铃薯块茎制成的干粉，则每粒胶囊所含有的重组抗原蛋白较少，成人每次需服用多粒胶囊才能够达到足够的免疫剂量，因此，增加一次性食用量在某些情况下可能是必需的。此时，可采用冲剂包装形式，每袋内装入5-10g由转基因马铃薯块茎制成的干粉。以5g包装为例，含有CS6B亚基抗原蛋白29ug。成人每次只需服用1袋，便可获得足够的免疫剂量。在服用时，为避免高温导致蛋白变性，可伴以温开水稀释后服下。4.含CS6B亚基抗原蛋白的其它制剂含CS6B亚基抗原蛋白的转基因番茄果实在直接食用时存在一些问题，因为不可能对每个番茄中的抗原蛋白含量进行测定，因而也就无法确定人每次食用几个番茄果实较为适宜。在这种情况下，可考虑将番茄果实加工成果茶或其它饮料方式，只需对每批产品进行抽样检测，便可作为人服用剂量的指导依据。当然，马铃薯块茎或其它转基因植物也可以加工成饮料的方式便于服用，其前提是必须保证在液体情况下重组CS6B亚基抗原蛋白不会被蛋白酶所降解，在室温条件下能够长期储存。植物来源的CS6B亚基抗原蛋白还可以有其它应用方式，例如，抗原蛋白在经过完全纯化或部分纯化后，可作为食品添加剂，掺入奶粉、豆粉、果汁和酸奶等食物以及饮料中制备成各种特殊功能性食品。实施例61.利用亲和层析法从转基因马铃薯或番茄中提纯CS6B亚基抗原蛋白CS6B亚基抗原蛋白小鼠抗血清的制备见实施例1，取2ml该小鼠抗血清与8mlPBS缓冲液混合后，置于50ml小烧杯中，连续搅拌下缓慢加入等量饱和硫酸铵溶液，室温下搅拌1小时，10000rpm离心15分钟，取沉淀，重新悬浮于10mlPBS缓冲液中，连续搅拌下缓慢加入5ml饱和硫酸铵溶液，室温下搅拌1小时，10000rpm离心15分钟，取沉淀，重新悬浮于2mlPBS缓冲液中，然后置于透析袋中对2L的PBS缓冲液进行透析过夜，期间更换2次PBS缓冲液，透析完成后，将抗体IgG自透析袋中吸出，测定280nm吸光值，然后将IgG浓度调至1mg/ml。按照产品说明书中提供的方法，该小鼠抗体被固定在经CNBr活化的Sepharose4B上(PharmaciaBiotech公司产品)。取1000克转基因马铃薯块茎或番茄叶片，加入等量PBS缓冲液(含有0.1％TritonX-100；0.5mMPMSF)，在4℃下匀浆。匀浆液经40,000g离心后收集上清液。上清液经冷冻干燥后，重新溶解在20mlTSA缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.0，140mMNaCl，0.025％NaN3)中，然后与上述活化的抗体-凝胶复合物在4℃下充分混合16小时。反应物上柱后，用5倍柱体积pH8.0和pH9.0的Tris缓冲液(50mMTris-HCl，0.1％TritonX-100，500mMNaCl)分别洗柱，接着用10ml三乙醇胺缓冲液(50mM三乙醇胺，pH11.5，0.1％TritonX-100，150mMNaCl)进行洗脱，洗脱液分别收集在10个1.5ml离心管中。通过酶联吸附反应检测每个离心管中抗原蛋白的有无。将有免疫反应的洗脱液汇集在一起，装入透析袋中进行4℃透析过夜，透析缓冲液为2升PBS。透析完成后从透析袋中吸出透析物，经冷冻干燥后，重新溶解在1mlPBS缓冲液中，然后从中取出20ul进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳检测发现植物中获得的重组CS6B亚基抗原蛋白分子量约为16KD，与大肠杆菌所产生的天然CS6B亚基蛋白相一致(1)。2.小鼠的注射免疫接种试验供试小白鼠(BALB/c)购自北京大学医学部，两种性别，但每批实验各处理组的小鼠均为雄性或雌性，体重在15-20克左右。取上述经过纯化后的CS6B亚基抗原蛋白100ng，加入PBS缓冲液至终体积200ul，不加入任何佐剂，以腹腔注射方式免疫每只小鼠，每组接种5只小鼠。每隔10天注射接种1次，在第5次接种后10天通过眼部取血方式收集小鼠抗血清。表3注射免疫接种后小鼠抗血清效价的测定(1)表中数字为3次实验的平均值(OD405nm吸光值)抗血清的效价通过酶联吸附反应进行测定，纯化的CS6B亚基抗原蛋白经包被缓冲液(见上文)稀释后，每个小孔内加入200ul(含抗原蛋白20ng)，4℃下包被过夜。次日，用PBST缓冲液洗3次，每次2分钟，甩干后，加入经PBST(含0.2％BSA)稀释成不同浓度的上述小鼠抗血清200ul，37℃反应2小时。用PBST洗3次，甩干后，加入经PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鼠酶标抗体(Sigma公司产品)200ul，37℃反应1小时，用PBST洗4次，甩干后，加入200ul底物缓冲液，室温下反应30分钟，然后加入50ul3MNaOH终止反应，读取各小孔405nm光吸收值。如表3所示，植物来源的CS6B亚基抗原蛋白具有相当强的免疫原性，所制备的小鼠抗血清在稀释倍数达1/10,000时，检测20ngCS6B亚基抗原蛋白时，OD405nm的吸光值比阴性对照的高2倍之多。而以其他蛋白如BSA或卵清蛋白替代CS6B亚基蛋白包被酶联反应板后，则不能发生任何特异性血清学反应(结果未列出)。同时，用PBS缓冲液免疫的小鼠血清(阴性对照)在相同稀释度的情况下，其吸光值也表现为非特异性反应。3.小鼠的口服免疫接种实验供试小鼠与上面注射接种实验相同。因自然取食无法确定每个小鼠的免疫剂量(各小鼠吃的量不一致)，故口服免疫接种采取一次性口腔注入的方法。取0.5g或1g转基因马铃薯新鲜块茎与等量PBS缓冲液混合后，利用玻璃匀浆器研磨成糊状，然后利用针尖为圆球形的注射器(购自北京化学试剂商店)将匀浆液通过小鼠口腔小心注入小鼠食道内(在操作过程中避免对小鼠消化道造成任何伤害)。小鼠在口服接种前先饥饿24小时，接种后2小时之内不予进水。对照转基因马铃薯块茎(不含有CS6B亚基抗原蛋白基因)进行同样处理，以相同方式分别注入小鼠食道内。所有处理组均每隔10天口服接种1次，共接种8次。在每次口服接种后的第7天，从小鼠尾静脉取血3滴，将每组(5只小鼠)小鼠的血汇集在一起，然后与100ulPBS缓冲液混合后，37℃下放置1小时，离心收集上部血清，抗血清的效价通过酶联吸附反应进行测定，方法同上。检测结果如表4和图10所示，用含有CS6B亚基抗原蛋白的转基因马铃薯块茎口服饲喂小鼠是可以诱导特异性抗体产生的，而且口服接种1g转基因马铃薯的效果要好于口服接种0,5g的。表4不同抗原以口服方式接种后小鼠体内抗体产生情况的比较(1)表中数字为3次实验的平均值(OD405nm吸光值)4.小鼠食用转基因马铃薯后的安全性评价小鼠(BALB/c)每次饲喂1ml的转基因马铃薯块茎(0.5g)汁液，每隔10天饲喂1次，连续饲喂3个月，并在此后观察3个月年，没有发现供试小鼠有畸变、死亡或其它异常情况发生。同样地，小鼠每3天饲喂1ml转基因马铃薯块茎(0.5g)汁液1次，连续饲喂2周，此后的长时间观察也未发现小鼠有畸变、死亡和其它异常情况发生，见表5。表5小鼠食用转基因马铃薯后的安全性评价(1)每组供试的小鼠有5只。(2)“-”代表没有参考文献1.张兆山等，大肠杆菌热敏肠毒素和耐热肠毒素基因融合及其免疫原性研究，高技术通讯，2000，10(1)15-182.杨晓等，表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆，微生物学报，1995，35(5)390-3933.SvennerholmA，etal.，Inf.Imm.，1988，56(2)523-5284.deAizpuruaandRussell-Jones，J.Exp.Med.，1988，167440-4515.Grill，L.K.，PBIBulletin，1998，113-146.Haq，K.I.，etal.，Science，1995，268714-7167.Mason，H.S.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，935335-53408.Ma，J.K.，etal.，Science，1995，268716-7199.Ma，S.W.andJevnnikar，A.M.，PBIBulletin，1998，16-810.Gans，P.R.，etal.，InTransgenicPlantAProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins，editedbyM.R.L.OwenandJ.Pan.，JohnWileyandSonsLtd.，NewYork，NY.1996，pp281-29711.Krebbers，E.andvandeKerckhove，L.，TrendsinBioechnology，1990，81-312.Parmenter，D.L.，etal.，PlantMolecularBiology，1995，291167-118013.Higo，K.I.，Saito，Y.andHigo，H.，Biosci.Biotechnol.Biochem，1993，81-314.Matsumomo，S.，etal.，Biosci.Biotechnol.Biochem，1993，571249-125215.Bosch，D.，Smal.J.andKrebbers，E.，TransgenicResearch，1994，3304-31016.Sijmons，P.C.，etal.，Bio/Technology，1990，8217-22117.Dezoeen，G.A.，etal.，Virology，1989，172213-22218.Kumagai，M.H.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90427-43019.Hamamoto，H.，etal.，Bio/Technology，1993，11930-93220.Sugiyama，Y.，etal.，FEBSLetters，1995，359247-25021.Turpen，T.H.，etal.，Bio/Technology，1995，1353-5722.Porta，C.，etal.，Virology，1994，202949-95523.Dasgaard，K.，etal.，NatureBiotechnology，1997，15248-25224.Fernandez-Fernandez，M.R.，etal.，FEBSLetters，1998，427229-23525.Man-kit，L.D.，Arntzen，C.J.andMason，H.S.，WO94/20135，199426.Mason，H.S.，Man-kit，L.D.andArntzen，C.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，8911745-1174927.Horsch，R.B.，etal.，Science，1985，2271229-123128.Mason，H.，etal.，PlantMolecularBiology，1988，11845-85629.王跃驹，硕士研究生论文，1998，中国农业科学院30.Chee，P.P.，Drong，R.F.andSlightom，J.L.，PlantMolecularBiologyManual，1991，C31-28本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求以及为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>转大肠杆菌定居因子CS6B亚基植物的生产方法及产品<160>2<210>1<211>441<212>DNA<213>人源毒素源性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)<220><221>CDS<222>(1)...(438)<400>1ggaaactggcaatataaatctctggatgtaaatgtaaatattgagcaaaattttatt57GlyAsnTrpGlnTyrLysSerLeuAspValAsnValAsnIleGluGlnAsnPheIle151015ccagatattgattccgctgttcgtataatacctgttaattacgattcggatccgaaa114ProAspIleAspSerAlaValArgIleIleProValAsnTyrAspSerAspProLys20253035ctgaattcacagttatatacggttgagatgacgatccctgcaggtgtaagcgcagtt171LeuAsnSerGluLeuTyrThrValGluMetThrIleProAlaGlyValSerAlaVal40455055aaaatcgtaccaacagatagtctgacatcttctggacagcagatcggaaagctggtt228LysIleValProThrAspSerLeuThrSerSerGlyGlnGlnIleGlyLysLeuVal60657075aatgtaaacaatccagatcaaaatatgaattattatatcagaaaggattctggcgct285AsnValAsnAsnProAspGlnAsnMetAsnTyrTyrIleArgLysAspSerGlyAla80859095ggtaagtttatggcagggcaaaaaggatccttttctgtcaaagagaatacgtcatac342GlyLysPheMetAlaGlyGlnLysGlySerPheSerValLysGluAsnThrSerTyr100105110acattctcagcaatttatactggtggcgaataccctaatagcggatattcgtctggt399ThrPheSerAlaIleTyrThrGlyGlyGluTyrProAsnSerGlyTyrSerSerGly115120125130acttatgcaggacatttgactgtatcattttacagcaattaa441ThrTyrAlaGlyHisLeuThrValSerPheTyrSerAsn*135140145<210>2<211>146<212>PRT<213>人源毒素源性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)<400>2GlyAsnTrpGlnTyrLysSerLeuAspValAsnValAsnIleGluGln151015AsnPheIleProAspIleAspSerAlaValArgIleIleProValAsn202530TyrAspSerAspProlysLeuAsnSerGluLeuTyrThrValGluMet354045ThrIleProAlaGlyValSerAlaValLysIleValProThrAspSer505560LeuThrSerSerGlyGlnGlnIleGlyLysLeuValAsnValAsnAsn65707580ProAspGlnAsnMetAsnTyrTyrIleArgLysAspSerGlyAlaGly859095LysPheMetAlaGlyGlnLysGlySerPheSerValLysGluAsnThr100105110SerTyrThrPheSerAlaIleTyrThrGlyGlyGluTyrProAsnSer115120125GlyTyrSerSerGlyThrTyrAlaGlyHisLeuThrValSerPheTyr130135140SerAsn14权利要求1.一种通过转基因植物生产毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的方法。2.如权利要求1中的方法，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。3.一种引起人或哺乳动物对毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物产生免疫应答的方法，该方法包括使用有效和确定免疫剂量的、来源于能产生该抗原蛋白或其衍生物的转基因植物的植物材料或其加工提取物对人或哺乳动物进行口服或肠道给药。4.如权利要求3中的方法，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。5.一种食物至少是由转基因植物的某一部分所组成，它被食用是因为它具有一定的营养价值，其中所说的植物是一种能够表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的植物，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。6.如权利要求5中的任何食物，其中所说的植物食用部分包括果实、叶子、茎、根或所说的植物种子。7.一个用于转化植物的质粒载体包括一段编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的DNA序列，该序列编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性，一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。8.如权利要求7中的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。9.如权利要求7中的质粒载体，其中所说的植物至少有一部分是可食用性的。10.一段用于基因枪法转化植物的DNA序列包括一段编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的DNA序列，该序列编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性；一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。11.如权利要求10中的DNA序列，它含有一个选择或标记基因。12.如权利要求10中的DNA序列，其中所说的植物至少有一部分是可食性的。13.一种构建转基因植物细胞的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有一段编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的基因，该基因编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性；一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达；用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞。14.如权利要求13中的方法，它包括从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。15.生产一种胶囊、冲剂或其它制剂的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有一段编码毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的基因和可操纵该基因在所说的植物中表达的植物启动子，该基因编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性。用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞；将转基因植物食用部分冷冻、干燥和磨碎后制作成胶囊、冲剂或其它制剂。16.如权利要求15的方法，其中还包括在利用转基因植物作为食物以及加工成胶囊、冲剂或其它制剂之前，应从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。17.如权利要求15中的方法，其中还包括从所说的植物细胞中部分纯化或完全纯化出所说的抗原蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的活性组成部分。18.如权利要求15中的方法，其中所说的植物细胞是通过农杆菌系统转化的。19.如权利要求18中的方法，其中所说的农杆菌系统是农杆菌Ti质粒系统。20.如权利要求15中的方法，其中所说的植物是番茄、马铃薯、莴苣、胡萝卜、苜蓿、黄瓜、小麦和水稻或其它可食用的植物。21.如权利要求15中的方法，其中所说的植物细胞是通过除农杆菌转化系统以外的其它转化方法如基因枪法、微管注射法、PEG吸收法以及电融合法等方法转化的。22.如权利要求15中的方法，其中所说的植物细胞是一个双子叶植物的细胞，或是一个单子叶植物的细胞。全文摘要本发明涉及表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原蛋白及其衍生物转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有大肠杆菌定居因子抗原蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。文档编号A61K9/48GK1928095SQ200510098259公开日2007年3月14日申请日期2005年9月5日优先权日2005年9月5日发明者刘德虎,李刚强,徐妙云,魏昭荣,王跃驹申请人:中国农业科学院生物技术研究所