专利名称：：鳐血管生成抑制因子i的分离、纯化及其n－末端氨基酸序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种源于鳐类鱼的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子I的分离、纯化及其N-末端氨基酸序列，以及鳐血管生成抑制因子I在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用。
背景技术：
：美国科学家研制的Avastin是一种人工合成的抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抗体。Avastin的原理是通过抗VEGF来抑制肿瘤的生长。Avastin已经上市，被评为2003年人类十大科学贡献之一。鳐血管生成抑制因子I则是从海洋生物中分离出来的一种天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于其他多个涉及血管生成和肿瘤生长、转移的靶点。
发明内容本发明的目的在于提供一种鳐血管生成抑制因子I的N-末端氨基酸序列，具有这种N-末端氨基酸序列的鳐血管生成抑制因子I显示强抑制血管生成、强抗肿瘤生长和转移的生物活性。本发明的目的尚在于提供分离、纯化鳐血管生成抑制因子I的方法。本发明的目的还在于提供鳐血管生成抑制因子I的理化及药理性质，以利用于制备药物。一种抑制血管生成，抗肿瘤生长和转移的鳐血管生成抑制因子I的N-末端26个氨基酸残基的排列顺序为N-PFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLSKHN，分子量为42kDa，最适pH为7.0-9.0，稳定pH为4.0-9.0。鳐血管生成抑制因子I的分离、纯化方法为依次进行如下柱层析1)AnionQSepharoseFastFlow柱层析；2)HICButylSepharoseFastFlow柱层析；3)SOURCERPC柱层析。上述抑制血管生成，抗肿瘤生长和转移的鳐血管生成抑制因子I分离、纯化方法的特点在于鳐类鱼组织加0.15mol/LNaCl，0.01～0.02mol/LTris·HCl，pH7.0～9.0缓冲液匀浆，匀浆液离心(4℃，16000g)1小时，收集上清液并加饱和度20～80％的(NH4)2SO4分级分离。分级收集沉淀，脱盐后用0.01～0.02mol/L，pH8.0～8.8的Tris·HCl缓冲液溶解，经AnionQ层析纯化，层析条件为流动相A为0.01～0.02mol/L，pH7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为A液加1mol/LNaCl，流速为15ml/min，二元梯度洗脱，B％经AnionQ柱层析纯化所得组分再经HICButylSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.01～0.02mol/L，pH7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为含3mol/LNaCl的A液，流速为10ml/min，二元梯度洗脱，经HICButylSepharoseFastFlow柱层析所得组分再经SOURCERPC柱纯化，层析条件为流动相A液为含0.1％TFA的水溶液，B为含0.1％TFA的乙腈溶液，流速为0.5ml/min，二元梯度洗脱，纯化所得鳐血管生成抑制因子I的高压液相层析结果呈单一峰(图1)，SDS-PAGE电泳结果呈单一条带(图2)，其分子量为42kDa，其N末端26个氨基酸残基的排列顺序为N-PFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLSKHN。鳐血管生成抑制因子I的生物活性检测结果显示它对肿瘤细胞无直接杀伤作用，显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜和肿瘤细胞诱导的血管生成，显著抑制肿瘤生长和肿瘤转移。1、鳐血管生成抑制因子I对培养的人癌细胞生长的影响取对数生长期细胞接种于96孔板(1.0×104细胞/孔)，培养过夜后，分别加入不同浓度的鳐血管生成抑制因子I，对照组则加入相同体积的培养液，每一浓度设3个平行孔。充分混匀后，继续培养24、48、72小时，每孔加入以磷酸盐缓冲液(PBS)配制的MTT(5mg/ml)20μl，继续培养5小时，每孔加入三联液(10％SDS、5％异丁醇、0.012mol/LHCl，W/V/V)100μl，放置过夜，用酶标仪在570nm波长处测量各孔A570值，计算细胞生长抑制率。实验结果表明，鳐血管生成抑制因子I对人早幼粒白血病细胞(HL-60)、人子宫颈癌细胞(HeLa)和人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)的生长无明显抑制作用。2、鳐血管生成抑制因子I对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用采用改良的鸡胚绒毛尿囊膜法，选取已在38℃、湿度为50％的孵育箱中孵育6天的种鸡蛋。以气室为中心，用75％酒精消毒鸡蛋气室外表面，再以手术刀片钻开一直径约1cm小孔。种蛋置孵育箱继续孵育3天后，把直径1cm的园形无菌滤纸小心置于膜上，实验组加入100μl药液于滤纸上，对照组加入等量溶剂，每天一次。给药4天后，局部采用丙酮和无水乙醇(1∶1，v/v)固定。固定完成后，剪下盖有滤纸的鸡胚尿囊膜(CAM)。将贴附CAM的滤纸于清水中铺开，弃去滤纸。将CAM小心转移至干净载玻片上，在解剖显微镜下(4×10)随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相，按下式计算血管生成抑制率。结果表明，鳐血管生成抑制因子I显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成并呈剂量依赖关系(表1，图3)。表1鳐血管生成抑制因子I对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用3、鳐血管生成抑制因子I对鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响采用改良的鸡胚绒毛尿囊膜法，选取已在38℃、湿度为50％的孵育箱中孵育6天的种鸡蛋。以气室为中心，用75％酒精消毒鸡蛋气室外表面，再以手术刀片钻开一直径约1cm小孔。把外径1cm、内径0.5cm的无菌滤纸环小心置于尿囊膜上，在环中央接种人低分化鼻咽癌细胞(1.9×106细胞/只)，用透明胶带封口，置培养箱中培养4天后，加药液100μl于滤纸上，对照组则加等量溶剂，每天1次，共给药4次。然后去掉透明胶带，用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的尿囊膜置载玻片上，弃去滤纸，显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。按下式计算血管生成诱导率或抑制率。结果表明，鳐血管生成抑制因子I显著抑制癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，并呈剂量依赖关系(表2，图4)。表2鳐血管生成抑制因子I对CNE-2Z细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用<tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>4、鳐血管生成抑制因子I对促血管生成因子表达的影响给荷Lewis肺癌小鼠腹腔注射鳐血管生成抑制因子I(20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查。免疫组化法检测结果显示，鳐血管生成抑制因子I对血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表3)。鳐血管生成抑制因子I还显著抑制与DNA合成有关的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，对照组PCNA表达阳性细胞百分率为73.8％，鳐血管生成抑制因子I组为6.3％。(图5-8)。表3鳐血管生成抑制因子I对促血管生成因子表达的抑制作用5、鳐血管生成抑制因子I对小鼠Lewis肺癌微血管密度(MVD)的影响给荷Lewis肺癌的BALB/c裸鼠腹腔注射鳐血管生成抑制因子I(20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查。经CD31免疫组化染色的血管内皮细胞呈棕色。免役组化法检测结果显示，对照组Lewis肺癌组织内毛细血管大量增生，富集在肿瘤边缘处，微血管分布不均，形态不规则，数量相差悬殊，呈异质性，微血管数为18.2±3.2。鳐血管生成抑制因子I组仅在癌巢间质有极少量新生毛细血管，微血管数为6.5±1.5。鳐血管生成抑制因子I组的微血管数明显低于对照组(图9)。6、鳐血管生成抑制因子I的抗肿瘤生长和抗肿瘤转移效果取对数生长期Lewis肺癌细胞，调整细胞浓度2×107个/ml，按每只0.2ml种于BALB/c裸鼠右侧背部皮下。随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，每只8只，雌雄各半。接种后第七天开始给药。空白对照组每日每只裸鼠腹腔注射无菌生理盐水0.2ml，实验组每日腹腔注射或灌胃不同剂量鳐血管生成抑制因子I，阳性对照组每周腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide，CY)310μmol/kg·w，共注射2次。接种后第21天，称重并摘除眼球放血、颈椎脱位法牺牲动物，剥离肿瘤衡重，用10％中性福尔马林固定用于免疫组化实验。分别取出肝与肺，称重并计转移结节数。分别按下列公式计算鳐血管生成抑制因子I对肿瘤生长的抑制率和肿瘤转移抑制率。实验结果显示，鳐血管生成抑制因子I腹腔注射(20mg/kg·d×17)对小鼠Lewis肺癌的生长抑制率为61.4％(表4)，肝转移抑制率为76.5％，优于环磷酰胺的59.1％和64.6％；鳐血管生成抑制因子I灌胃(30mg/kg·d×17)对小鼠Lewis肺癌的生长抑制率为56.4％(表5)，肝转移抑制率为79.4％，优于环磷酰胺的64.6％和39.0％(表6，7，图10)。给BALB/c裸鼠尾静脉接种B16细胞，接种当天开始腹腔注射或灌胃鳐血管生成抑制因子I，每天1次，结果显示，鳐血管生成抑制因子I腹腔注射(20mg/kg·d×17)对肺转移的抑制率为63.7％(图11)，对肝转移的抑制率为48.0％，优于环磷酰胺(50mg/kg·d×2)的43.9％和33.3％；鳐血管生成抑制因子I灌胃(30mg/kg·d×17)对小鼠B16细胞肝转移的抑制率为87.55％，优于环磷酰胺的32.94％(表8，9)。表4鳐血管生成抑制因子I腹腔注射对裸小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表5鳐血管生成抑制因子I灌胃对裸小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表6鳐血管生成抑制因子I腹腔注射对小鼠Lewis肺癌肝转移的抑制作用*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表7鳐血管生成抑制因子I灌胃对裸小鼠Lewis肺癌肝转移的影响*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表8鳐血管生成抑制因子I腹腔注射对裸小鼠黑色素瘤B16细胞转移的影响*环磷酰胺分别于肿瘤接种当天、接种后第7天腹腔注射。表9鳐血管生成抑制因子I灌胃对裸小鼠黑色素瘤B16细胞肝转移的影响*环磷酰胺分别于肿瘤接种当天、接种后第7天腹腔注射。7、鳐血管生成抑制因子I对小鼠Lewis肺癌转移因子表达的影响给荷Lewis肺癌小鼠腹腔注射鳐血管生成抑制因子I(20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查。促转移因子CD44v6和ErBb2表达于细胞膜与细胞浆，以胞膜着色为主，出现少量胞浆着色；抑转移因子nm23主要表达于细胞浆。细胞浆及胞膜中出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞。免疫组化检查结果显示，鳐血管生成抑制因子I可使小鼠Lewis肺癌细胞中促转移因子CD44v6和ErBb2的表达降低，抑转移因子nm23-H1的表达增强(表10，图12-14)。表10鳐血管生成抑制因子I对小鼠Lewis肺癌转移因子表达的影响图1鳐血管生成抑制因子I的高压液相层析2鳐血管生成抑制因子I的SDS-PAGE电泳3鳐血管生成抑制因子I对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用图4鳐血管生成抑制因子I对人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用图5鳐血管生成抑制因子I对血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的抑制作用图6鳐血管生成抑制因子I对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的抑制作用图7鳐血管生成抑制因子I对血小板衍生生长因子(PDGF)表达的抑制作用图8鳐血管生成抑制因子I对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的抑制作用图9鳐血管生成抑制因子I对小鼠Lewis肺癌微血管密度(MVD)的影响图10鳐血管生成抑制因子I对裸小鼠Lewis肺癌肝转移的抑制作用图11鳐血管生成抑制因子I对裸小鼠黑色素瘤B16细胞肺转移的抑制作用图12鳐血管生成抑制因子I对裸小鼠Lewis肺癌促转移因子CD44v6表达的抑制作用图13鳐血管生成抑制因子I对裸小鼠Lewis肺癌促转移因子ErBb2表达的抑制作用图14鳐血管生成抑制因子I对裸小鼠Lewis肺癌抑转移因子nm23-H1表达的增强作用。权利要求1.一种源于鳐类鱼的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子I，其N-末端26个氨基酸残基的排列顺序为N-PFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLSKHN，分子量为42kDa，最适pH为7.0-9.0，稳定pH为4.0-9.0。2.鳐血管生成抑制因子I的制备方法为依次进行如下柱层析。1)AnionQSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.01～0.02mol/L，pH7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为A液加1mol/LNaCl，流速为15ml/min，二元梯度洗脱，2)ButylSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.01～0.02mol/L，pH7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为含3mol/LNaCl的A液，流速为10ml/min，二元梯度洗脱，B％3)SOURCERPC柱纯化，层析条件为流动相A液为含0.1％TFA的水溶液，B为含0.1％TFA的乙腈溶液，流速为0.5ml/min，采用二元梯度洗脱，3.鳐血管生成抑制因子I在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用。全文摘要本发明公开一种源于鳐类鱼的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子I的N－末端氨基酸序列及其分离、纯化方法。鳐血管生成抑制因子I的分子量为42kDa，最适pH为7.0－9.0，稳定pH为4.0－9.0，其N－末端26个氨基酸残基序列为N－PFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLSKHN。鳐血管生成抑制因子I能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜和肿瘤细胞诱导的血管生成，抑制小鼠Lewis肺癌、肝癌(H文档编号A61K38/18GK1978464SQ20051010187公开日2007年6月13日申请日期2005年12月6日优先权日2005年12月6日发明者马润娣,于立坚,苏伟明,廖铭能,黄来珍申请人:广东海洋大学