专利名称：香豆素衍生物及其制法和其药物组合物与用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了新结构类型的香豆素及二氢喹啉酮衍生物及其药用盐、这类化合物的制备方法、含有这类化合物的药物组合物，特别是用于制备治疗慢性肾衰、糖尿病、高血压和心脑血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大药物中的应用。
背景技术：
在以前的研究中合成了一系列香豆素衍生物(中国专利——徐世平等，申请号02155525.7，申请日2002年12月5日；国际专利(PCT)——国际申请号PCT/CN03/01046，国际申请日2003年12月5日，优先权日2002年12月5日)，具有较好的抗肾衰和降压作用，对某些器官的纤维化有治疗作用。基于上述结果我们在继续研究中证明，本发明合成的一系列新香豆素，和一系列二氢喹啉酮衍生物。本发明化合物具有显著的抑制转化生长因子β1(TGFβ1)和降低血管紧张素II(AngII)及肾素的作用，因此本发明的化合物具有潜在的治疗慢性肾衰、高血压、糖尿病、肝硬化和前列腺肥大及肺纤维化的作用。
药理试验表明，在我们研究的新一代的化合物中，部分化合物对顺铂(Cisplatin)引起体外培养的大鼠肾系膜细胞、人肾小管上皮细胞损伤具有保护作用；在体内可显著地降低Cisplatin所致急性大鼠肾损伤血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平及尿蛋白(UP)水平，减小Cisplatin引起的肾水肿；同时亦可降低5/6肾切除模型大鼠血清BUN水平、Scr水平及尿蛋白(UP)水平；降低链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病尿蛋白水平。其肾保护、降压以及降低糖尿病肾病尿蛋白水平可能不同于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素IIAT1型受体拮抗剂(AT1RA)。而与抑制TGF-β1和降低肾组织TGF-β1mRNA表达以及抑制细胞分泌的基质金属蛋白酶活性有关。从而抑制肾小球硬化和肾间质纤维化。这些化合物将可能用于缓解Cisplatin肿瘤化疗的肾脏毒性；用于治疗由高血压和糖尿病所导致的慢性肾功能不全；预防和治疗各种原因引起的肾小球硬化和肾脏纤维化；用于II型糖尿病的治疗以预防进一步糖尿病肾病的发生。
为了活性测定方面的便利，在这里采用了，以药物对顺铂所致的肾毒性的保护作用，来初步评价化合物的活性和疗效。
为了进一步评价化合物的疗效，也采用了5/6肾切除模型大鼠，作进一步研究，以确定本发明化合物的疗效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一类新的香豆素及二氢喹啉酮衍生物其异构体和其药用盐；本发明要解决的另一个技术问题是提供这类化合物的制备方法；本发明要解决的又一个技术问题是提供一类新的药物组合物，其含有本发明的化合物及制药领域常用的载体。
本发明要解决的再一个技术问题是提供这类新的化合物在制备治疗慢性肾衰、糖尿病、高血压和心脑血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大药物中的应用。
为解决的上述技术问题，本发明采用如下的技术方案本发明涉及如通式I所示的化合物 其中X选自O，NH，R选自C1-C6直链或分支烷基W选自CO，CH2，R3选自未取代或取代的N-吡咯基，(吡咯环上的取代基为R10，其中R10为羧基，C1-C4酮基，酯基，羰烷基，未取代或取代的羰基苯基，苯环上的取代基为H，卤素，C1-C4甲氧基，NO2)；未取代单取代或多取代的咪唑基或吡唑基，(咪唑基或吡唑基上的取代基选自H，C1-C6烷基，CF3，CHO，CO2H，CO2C2H5)；取代的羰基-N-吲哚基，(吲哚环上的取代基为H，C1-C4烷羰基)；NHR13，其中R13选自-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4”，未取代、单或多取代的苯基，(苯环上的取代基为卤素，OH，C1-C4烷氧基，羧基，C1-C4酯基，C1-C4羧基烷氧基，1”，2”，3”，4”-唑基，等)；R6选自H，C1-C4烷基，NO2，R7选自H，OH，C1-C4烷氧基；R8选自H，C1-C8烷基，烷氧基，NO2；为完成本发明的目的，优选的化合物包括但不限定于如通式(Ia)所示的化合物
其中XR，R6，R7，R8所代表的基团与通式(I)的各种情况下相同；R11选自C6H5-，p-HO-C6H4-，p-HO2C-C6H4-，p-EtO2C-C6H4-，m-HO2CCH2CH2-C6H4-，3’-HO-4’-HO2C-C6H3-，3’-HO2C-4’-HO-C6H3-，3’-Cl-4’-HO2C-C6H3-，-CH2CH2C6H4-OH-4’，-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4’， 为完成本发明的目的，优选的化合物还包括但不限定于如通式(Ib)所示的化合物 其中XR，R6，R7，R8所代表的与通式(I)的各种情况下相同；R12选自N-(取代的吡咯基)即( 其中R10选自COCH3，CO2CH3，2’-COC6H5，3’-CO-C6H5，2’-CO-C6H4-Cl-4”，3’-CO-C6H4-Cl-4”，2’-CO-C6H4-OCH3-4”，3’-CO-C6H4-OCH3-4”，2’-CO-C6H4-NO2-4”，3’-CO-C6H4-NO2-4”)；N-(取代的咪唑基)即( 其中R10a或R10b选自CH3，CO2H，CO2C2H5，)；或吡唑基即( 其中R10c或R10d选自CH3，C3H7，CF3，CO2H，CO2C2H5)；N-(3’-取代的吲哚基)即
为完成本发明的目的，优选的化合物包括但不限定于如通式(I)代表的下列表中的化合物，其中XR代表的基团如标出的，W-R1，R2-R4代表的基团，除标出者外，其它均为H；R2’-R6’代表的基团，除标出者外，其它均为H；除标出 的R10者外，其它均为 的取代基。
表1
在本发明中，术语“卤素″是指氟、氯、溴、碘。术语“低级烷基”“低级烷”是1-6碳原子的直链或支链的烷基。
根据本发明，本发明化合物可以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。
本发明化合物可存在双键的顺反异构体，不对称中心具有S构型或R构型，本发明包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。如果存在顺/反异构体，本发明涉及顺式形式和反式形式以及这些形式的混合物，如果需要单一异物体可根据常规方法分离或通过立体选择合成制备。
根据本发明的实施方案，所述的本发明化合物还包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物。
根据本发明还涉及制备本发明化合物的方法，3-羧基的各种取代香豆素、与相应的各种取代氨类化合物反应制备。酰氨化反应是在合适的反应剂、催化剂及合适的溶剂条件下进行的。另外一类化合物的制备是，用各种取代的苯胺类化合物与氯代乙酰氯进行反应，得部分本发明化合物的中间体。以这些中间体与三氯氧磷及二甲基甲酰胺反应，生成取代的喹啉，然后与相应的各种取代吡咯化合物反应，所得产物水解后得各种目的化合物。这些化反应是在合适的反应剂、催化剂以及合适的溶剂条件下进行的。这些反应剂包括三氯化磷、三氯氧磷、五氯化磷、二氯亚砜、草酰氯、乙酸酐以及硫酸二甲酯、碘甲烷、1，3-二环己基亚胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1，3-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺(EDCI)等。其中优选的反应剂为五氯化磷、三氯氧磷、N，N-二甲基甲酰胺、三氯化磷和二氯亚砜、草酰氯，更优选五氯化磷、三氯氧磷、二氯亚砜。制备本发明化合物所使用的催化剂包括三级胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷基吡啶等。其中优选为三级胺和吡啶。更优选为吡啶。反应在适宜的溶剂中或上述缩合剂中进行，如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙二醇二甲醚、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。其中优选为甲苯、DMSO和DMF，更优选甲苯和DMF。反应温度为10-110℃，优选为20-90℃，更优选为30-80℃，特别优选为50-70℃。
下列反应方程式具体说明
本发明因此还涉及含有作为活性成份的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的本发明化合物。
本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的化合物的用量为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为5-45mg/Kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
用已知体内外试验方法测定本发明化合物和/或组合物的活性和效果，继续合成的香豆素和二氢喹啉类化合物，具有明显地肾保护作用，本发明化合物对顺铂(Cisplatin)引起体外培养的大鼠肾系膜细胞、人肾小管上皮细胞损伤具有保护作用；在体内可显著地降低Cisplatin所致急性大鼠肾损伤血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平及尿蛋白(UP)水平，减小Cisplatin引起的肾水肿；同时亦可降低5/6肾切除模型大鼠血清BUN水平、Scr水平及尿蛋白(UP)水平；降低链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病尿蛋白水平。
初步作用机制研究表明，其肾保护、降压以及降低糖尿病肾病尿蛋白水平不同于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素II AT1型受体拮抗剂(AT1RA)。而与抑制TGF-β1和降低肾组织TGF-β1 mRNA表达以及抑制细胞分泌的基质金属蛋白酶活性有关。其主要途径可能归结为对TGF-β1的抑制，从而抑制肾小球硬化和肾间质纤维化。
本发明化合物31将可能用于缓解Cisplatin肿瘤化疗的肾脏毒性；用于治疗由高血压和糖尿病所导致的慢性肾功能不全；预防和治疗各种原因引起的肾小球硬化和肾脏纤维化；用于II型糖尿病的治疗以预防进一步糖尿病肾病的发生。
图1本发明化合物31对cisplatin引起大鼠肾系膜细胞(rMC)损伤的保护作用。
图2本发明化合物31对cisplatin引起人肾小管上皮细胞(HKC)损伤的保护作用图3本发明化合物31对人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡影响的形态学观察A controlB cisplatin 2μmol/LC cisplatin 2μmol/L+31 2μmol/LD cisplatin 2μmol/L+31 10μmol/LE cisplatin 2μmol/L+31 50μmol/L图4本发明化合物31对cisplatin诱导的HKC细胞染色体DNA断裂的影响1 control2 cisplatin 10μmol/L+31 50μmol/L3 cisplatin 10μmol/L+31 10μmol/L4 cisplatin 10μmol/L+31 2μmol/L5 cisplatin 10μmol/L6 marker图5.本发明化合物31对Fe2+-L-cys诱发肝微粒体脂质过氧化的影响图6.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织TGF-β1mRNA表达的影响Lane 1.ControlLane 2.Cisplatin+31 10mg/kgLane 3.Cisplatin+31 30mg/kgLane 4.Cisplatin+Benazapril 10mg/kgLane 5.Cisplatin modelLane 6.Marker图7.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织TGF-β1mRNA表达的影响统计分析图8.本发明化合物31对HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响1 cisplatin 5μmol/L2 cisplatin 5μmol/L+31 3.12μmol/L3 cisplatin 5μmol/L+31 12.5μmol/L4 cisplatin 5μmol/L+31 50μmol/L5 control
图9.本发明化合物31对大鼠肾系膜细胞(rMC)分泌基质金属蛋白酶能力的影响1 control2 cisplatin 5μmol/L3 31 3.12μmol/L4 31 12.5μmol/L5 31 50μmol/L具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但是这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例实施例13-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羟基-8-甲基香豆素(31)的制备将3-羧基-6-硝基-7-羟基-8-甲基香豆素10.6g(0.04Mol)与30ml二氯亚砜反应完成后，除去多余的二氯亚砜，加入20ml二甲基甲酰胺(DMF)，40ml吡啶和7g(0.043Mol)4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)搅拌均匀，在50℃加热4小时。过滤，用乙醇、水洗涤、干燥1HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.78(s，1H，NH)，8.8(s，1H，NH)，8.6(b，2H，4，5-H)，8.0(d，2H，J＝8.7Hz，Ar’H)，7.9(d，2H，J＝8.7Hz，Ar’H)，2.23(s，3H，CH3)实施例23-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羟基-8-甲基香豆素(32)的制备根据实施例化合物31的制备方法，化合物32的制备，不同点在于以3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物321HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.70(s，1H，NH)，8.92(s，1H，5-H)，8.67(s，1H，4-H)，8.4(s，1H，Ar2’-H)，7.89(d，1H，J＝7.8Hz，Ar6’-H)，7.70(d，1H，J＝7.8Hz，Ar4’-H)，7.59(t，1H，J＝7.8Hz，Ar5’-H)，2.27(s，3H，CH3)实施例33-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羟基-8-丁基香豆素(33)根据实施例化合物31的制备方法，化合物33的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基-7-羟基-8-丁基香豆素与3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物331HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.914(s，1H，4-H)，8.708(s，1H，5-H)，8.483n(s，1H，Ar-H-2’)，7.833(m，2H，J＝7.5Hz，4’，6’-H)，7.615(t，1H，J＝7.8Hz，Ar-5’-H)，2.828(t，2H，J＝7.2，1”-CH2)，1.552(t，2H，J＝7.5Hz，2”-CH2)1.372(q，2HJ＝7.5Hz，3”-CH2)，0.929(t3H，J＝7.2Hz，4”-CH3)实施例43-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-7-羟基-8-丁基香豆素(34)根据实施例化合物31的制备方法，化合物34的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基-7-羟基-8-丁基香豆素与4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物341HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.747(s，1H，-NH)，8.910(s，1H，4-H)，8.693(s1H，5-H)，8.051(d，2HJ＝8.7Hz，2’，6’-Ar-H)7.940(d，2H，J＝8.7Hz3’，5’-Ar-H)2.823(t，2H，7.2Hz，1”-CH2)，1.549(t，2H，J＝7.5Hz，2”-CH2)，1.373(q，2H，J＝7.2Hz，3”-CH2)，0.930(t，3H，J＝7.2Hz，4”-CH3)实施例53-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-丁基香豆素(35)根据实施例化合物31的制备方法，化合物35的制备，不同点在于以3-羧基-7-甲氧基-8-丁基香豆素与4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物351HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.881(s，1H，NH)，8.890(s，1H，4-H)，8.051(d，2H，J＝8.7Hz，2”，6”-Ar-H)，7.946(d，2H，J＝8.7Hz，3”，5”-Ar-H)，7.908(d，1H，J＝8.7Hz，5-H)，7.218(d，1H，J＝8.7Hz，6-H)，3.957(s，3H，-OCH3)，2.760(q，2H，J＝7.5Hz，1”-CH2)，1.515(t，2H，J＝7.2Hz，2”-CH2)，1.334(q，2H，J＝7.5Hz，3”-CH2)，0.917(t3H，J＝7.5Hz，4”-CH3)实施例63-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-丁基香豆素(36)根据实施例化合物31的制备方法，化合物36的制备，不同点在于以3-羧基-7-甲氧基-8-丁基香豆素与3-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物361HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)10.842(s，1H，NH)，8.888(s，1H，4-H)，8.470(s，1H，2’-Ar-H)，7.922-7.871(m，2H，4’，6’-Ar-H)，7.789(d，1H，J＝7.8Hz，5-H)，7.610(t，1H，J＝7.8Hz，5-Ar-H)，7.216(d，1H，J＝9Hz，6-Ar-H)，3.995(s，3H，OCH3)，2.761(t，2H，J＝7.5Hz，1”-CH2)，1.502(t，2H，J＝7.2Hz，2”-CH2)，1.332(q，2H，J＝7.5，3”-CH2)，0.915(t，3H，J＝7.2，4”-CH3)实施例73-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7，8-甲氧基香豆素(37)根据实施例化合物31的制备方法，化合物37的制备，不同点在于以3-羧基-7，8-二甲氧基香豆素与4-氨基苯基(1’，2’，3’，4’-四唑-5’)进行反应得化合物37NMR(300MHz，DMSO)，(ppm)10.83(s，1HNH)，8.80(s，1H，4-H)，8.00(d，2H，J＝8.4Hz，3’，5’-H)，7.90(d，2H，J＝8.4Hz，2’，6’-H)，7.70(d，1H，J＝9，5-H)，7.20(d，2H，J＝9Hz，6-H)，3.96(s，3H，OCH3)，3.87(s，3H，OCH3)
实施例83-苯氨羰基]-6-乙基-7-甲氧基香豆素(30)根据实施例化合物31的制备方法，化合物30的制备，不同点在于以3-羧基-6-乙基-7-甲氧基香豆素与苯氨进行反应得化合物301HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)10.67(br，1H，NH)，8.87(s，1H，4-H)，7.77(s，1H，5-H)，7.69(d，2H，J＝7.69Hz，3’，5’-H)，7.36(t，2H，J＝7.5Hz，2’，6’-H)，7.18(s，1H，8-H)，7.12(1H，J＝7.2Hz，5’-H)，3.93(t，3H，OCH3)，2.58(q，2H，J＝7.5Hz，CH2)，1.15(t，3H，J＝7.5，CH3)实施例93-(1’-甲氧羰基-2’-羟苯乙氨羰基)-6-硝基-7-羟基-8-甲基香豆素(38)根据实施例化合物31的制备方法，化合物38的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基-7-羟基-8-甲基香豆素与1’-甲氧羰基-2’-羟苯乙氨进行反应得化合物38HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.26(br，1H，NH)，8.80(br，1H，OH)，8.63(s，1H，4-H)，7.93(s，1H，5-H)，6.90(d，2H，J＝8.1Hz，Ar’H)，6.60(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)，4.70(m，1H，CH)，3.66(s，3H，OCH3)，3.01(d，2H，J＝6.9Hz，CH2)，2.23(s，3H，CH3)实施例103-苯胺羰基-6-硝基-二氢喹啉酮-2(1)根据实施例化合物31的制备方法，化合物1的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与苯氨进行反应得化合物11HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.107(s，1HNH)，11.764(s，1HNH)，9.177(s，1H，4-H)，9.060(d，1H，J＝2.1Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9Hz，7-H)，7.73(d，2H，J＝8.1Hz2’，6’Ar-H)，7.601(d，1H，J＝9Hz，8-H)，7.39(t，2H，J＝7.5Hz，3’，5’Ar-H)，7.14(t，1H，J＝7.5Hz，4’-ArH)，实施例113-(3’-羟基-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(3)根据实施例化合物31的制备方法，化合物3的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-氨基水杨酸进行反应得化合物31HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.127(s，1H，NH)，11.976(s，1H，NH)，9.155(s，1H，4-H)，9.04(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.77(d，1H，J＝8.7Hz6’-H)，7.59(d1H，J＝9.3Hz，8-H)，7.56(d，1H，J＝2.1，2’-H)，7.06(dd，1H，J1＝2.1，J2＝8.7，5’-H)实施例123-(3’-羧基-4’-羟基苯胺羰基)-6-硝基二氢喹啉酮-2(2)根据实施例化合物31的制备方法，化合物2的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与5-氨基水杨酸进行反应得化合物2
1HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.063(s，1H，NH)，11.647(s，1H，NH)，9.005(s，1H，4-H)，9.092(s，1H，5-H)，8.431(d，1H，J＝9Hz，7-H)，8.193(s，1H，2’-H)，7.771(d，1H，J＝9Hz，8-H)，7.570(d，1H，J＝9.3Hz，6’-H)，6.957(d，1H，J＝9.3Hz，5’-H)实施例133-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氢喹啉酮-2(4)根据实施例化合物31的制备方法，化合物4的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物41HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.161(s，1H，NH)＜12.033(s，1H，NH)，9.205(s，1H，4-H)，9.086(d，1H，J＝2.4Hz，5-H)，8.49(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9Hz，7-H)，8.07-7.94(m，4H，苯四唑-Ar-H)，7.61(d，1HJ＝9.3Hz，8-H)实施例143-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氢喹啉酮-2(5)根据实施例化合物31的制备方法，化合物5的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物51HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.142(s，1H，NH)，11.99(s，1H，NH)，9.19(s，1H，4-H))，9.07(d，1H，J＝2.7，5-H)，8.47(dd，1H，J1＝2.7，J2＝9.3，7-H)，8.44(s，1H，2’-H)，7.97-7.59(m，4H，4’，5’，6’-ArH，8-H)实施例153-(3’-氯-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(6)根据实施例化合物31的制备方法，化合物6的制备，不同点在于以3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与3-氯-4’-羧基苯胺进行反应得化合物61HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)13.13(s，1H，NH)，12.22(s，1H，NH)，9.15(s，1H，4-H)，9.06(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.46(dd，1H，J1＝2.1Hz，J2＝9Hz，7-H)，8.07(d，1H，J＝1.8Hz，2’-ArH)，7.87(d，1H，J＝8.7Hz，6’-H)，7.63(dd，1H，J1＝2.1Hz，J2＝8.7Hz，5’-ArH)，7.581(d，1H，J＝9，8-H)实施例163-苯胺羰基-二氢喹啉酮-2(11)根据实施例化合物31的制备方法，化合物11的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与苯胺进行反应得化合物111HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.628(s，1H，NH)，12.11(s，1H，NH)，8.97(s，1H，4-H)，7.99(d，1H，J＝8.1Hz，ArH)，7.71(d，2H，J＝8.1Hz，ArH)＜7.67(d，1H，J＝7.8Hz，ArH)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz，ArH)，7.33(m，4H，ArH)，7.11(t1HJ＝7.5，ArH)实施例173-(4’-羧基苯胺羰基)-二氢喹啉酮-2(13)根据实施例化合物31的制备方法，化合物13的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与对氨基苯甲酸进行反应得化合物131HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.718(s，1H，NH)，12.423(d，1H，J＝3.6Hz，NH)，8.994(s，1H，4-H)，8.016(d，1H，J＝7.8Hz，5-H)，7.96(d，2H，J＝8.7Hz，3’，5’Ar-H)，7.838(d，2H，J＝8.7Hz，2’，6’Ar-H)，7.708(t，1H，J＝8.4Hz，7-H)，7.475(d，1H，J＝8.7Hz，8-H)，7.337(t，1H，J＝7.8Hz，6-H)实施例183-乙氧羰基苯胺羰基-二氢喹啉酮-2(12)根据实施例化合物31的制备方法，化合物12的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与对氨基苯甲酸乙酯进行反应得化合物121HNMR(300MHz，1DMSO)，(ppm)12.42(s，1H，NH)，8.975(s，1H，4-H)，8.012(d，1H，9.9Hz，5-H)，7.979(d，2H，J＝9.9Hz，Ar’H)，7.861(d，2H，J＝9Hz，Ar’H)，7.697(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.2Hz，7-H)，7.468(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.325(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.2Hz，6-H)，4.284(q，2H，OCH2)，1.305(t，3H，OC-CH3)实施例193-(3’-羧基-4’-羟基苯胺羰基)-二氢喹啉酮-2(15)根据实施例化合物31的制备方法，化合物15的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与5-氨基水杨酸进行反应得化合物151HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.658(d，1H，J＝2.4，Hz，OH)，12.042(d，1H，J＝3.3Hz，NH)，8.974(s，1H，4-H)，8.236(d，1H，J＝2.7Hz，2’-ArH)，7.989(d，1H，J＝8.1Hz，5-H)，7.786(dd，1H，J邻＝8.7Hz，J间＝2.7Hz，Ar6’-H)，7.689(d，1H J＝7.5Hz，7-H)，7.465(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.323(t，1H，J＝7.5Hz，6-H)，6.984(d，1H，J＝8.7Hz，Ar5’-H)实施例203-(4’-羟基苯胺羰基)-二氢喹啉酮-2(16)根据实施例化合物31的制备方法，化合物16的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与4-氨基苯酚进行反应得化合物161HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.6(s，1H，NH)，11.88(s，1H，NH)，8.94(s，1H，4-H)，8.94(s，1H，4-H)，7.981(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.70(t，1H，J＝7.5Hz，ArH)，7.53(d，2H，J＝8.7Hz，ArH)，7.45(d，1H，J＝7.8Hz，ArH)，7.32(t，1HJ＝7.8Hz，ArH)实施例213-(3’-羟基-4’-羧基苯胺羰基)-二氢喹啉酮-2(14)根据实施例化合物31的制备方法，化合物14的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与4-氨基水杨酸进行反应得化合物141HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.894(s，1H，NH)，9.127(s，1H，4-H)，9.059(t，2H，J＝3.6Hz，ArH)，8.51(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9.9Hz，ArH)，7.88(d，1H，ArH)，7.74(d，1H，J＝8.7Hz，ArH)，7.52(d，1H，J＝21.8，ArH)，7.07(dd，1H，J1＝1.8Hz，J2＝8.7，ArH)实施例223-(4’-羟基苯乙胺羰基)-二氢喹啉酮-2(39)根据实施例化合物31的制备方法，化合物39的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与4-羟基苯乙氨进行反应得化合物391HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.426(s，1H，NH)，9.798(t，1H，J1＝5.4Hz，J＝5.4Hz，-NH-C-)，8.816(s，1H，4-H)，7.924(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.637(t，1H，J1＝8.4Hz，J2＝6.9Hz，7-H)，7.396(d，1H，J＝9Hz，5-H)，7.275(t，1H，J1＝7.2Hz，J2＝7.5Hz，6-H)，7.004(d，2H，J＝8.4Hz，2’，6’-H)，6.672(d，2H，J＝8.7Hz，3’，5’-H)，3.503(q，2H，J1＝13.2Hz，J2＝13.2Hz，N-CH2)，2.(t，2H，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，-CH2-)实施例233-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-7-甲氧基-8-硝基二氢喹啉酮-2(40)根据实施例化合物31的制备方法，化合物40的制备，不同点在于以3-羧基-7-甲氧基-8-硝基二氢喹啉酮-2与4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物401HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.801(s，1H，NH)，8.989(s，1H，4-H)，8.273(d，1H，J＝9.Hz，5-H)，8.055(d，2H，J＝9Hz，3’，5’-H)，7.953(d，2H，J＝9Hz，2’，6’-H)，7.378(d，1H，J＝9Hz，6-H)，4.015(s，3H，OCH3)实施例243-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-二氢喹啉酮-2(18)根据实施例化合物31的制备方法，化合物18的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物181HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.689(s，1H，NH)，12.372(s，1H，NH)，9.005(s，1H，4-H)，8.429(s，1H，2’-H)，8.03-7.32(m7H，ArH)实施例253-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-二氢喹啉酮-2(17)根据实施例化合物31的制备方法，化合物17的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物171HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.704(s，1H，NH)，12.414(s，1H，NH)，8.993(s，1H，4-H)，8.066-7.972(q，4H，J＝11.1Hz，Ar’H)，8.00(d，1H，J＝8.1Hz，8-H)，7.703(t，1H，J1＝7.8Hz，J2＝7.5Hz，7-H)，7.478(d，1H，J＝8.1Hz，5-H)，7.322(t，1H，J1＝7.5Hz，J2＝7.2Hz，6-H)实施例263-(3’-羧基亚甲氧基苯胺羰基)-二氢喹啉酮-2(10)根据实施例化合物31的制备方法，化合物10的制备，不同点在于以3-羧基二氢喹啉酮-2与3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物101HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)12.654(s1H，NH)，12.16(s，1H，NH)，9.27(s，1H，4-H)，8.0-6.61(m，8H，ArH)，4.691(s，2H，OCH2)实施例27 1-甲基-3-(乙氧羰基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(19)根据实施例化合物31的制备方法，化合物19的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-乙氧羰基苯胺进行反应得化合物191HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.907(s，1H，NH)，9.155(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝1.5Hz，5-H)，8.54(dd，1H，J1＝1.5Hz，J2＝5.4Hz，7-H)，8-7.88(m，5H，5-H，8-H，2’-H，6’-H，3’-H，5’-H)，4.33(q，2H，J＝4.2Hz，-CH2)，3.85(s，3H，N-CH3)，1.34(t，3H，J＝4.2Hz，C-CH3)实施例281-甲基-3-(3’-羧基-4’-羟基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(21)根据实施例化合物31的制备方法，化合物21的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与5-氨基水杨酸进行反应得化合物211HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.601(s，1H，NH)，9.114(s，1H，4-H)，9.08(d，1H，J＝2.7，5-H)，8.51(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，8.26(d，1H，J＝2.7Hz，6’-H)，7.87(d，1H，J＝4.3Hz，8-H)，7.77(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9Hz，3’-H)，6.98(d，1H，J＝9Hz，2’-H)，3.81(s，3H，N-CH3)实施例291-甲基-3-苯胺羰基-6-硝基-二氢喹啉酮-2(22)根据实施例化合物31的制备方法，化合物22的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与苯氨进行反应得化合物221HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.71(s，1H，NH)，9.15(s，1H，4-H)，9.08(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.52(dd，1H，J1＝2.7Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.87(d，J＝9.3Hz，8-H)，7.73(d，2H，J＝8.4Hz，2’-H，6’-H)，7.38(t，J＝8.4Hz，3’-H，5’-H)，7.13(t，J＝7.5Hz，4’-H)，3.81(s，3H，N-CH3)实施例301-甲基-3-(4’-羟基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(24)根据实施例化合物31的制备方法，化合物24的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与对氨基苯酚进行反应得化合物241HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.51(s，1H，NH)，9.12(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.5(dd，1H，J1＝2.4Hz，J2＝9.3Hz，7-H)，7.87(d，1H，J＝9.6Hz，8-H)，7.53(d，2H，J＝8.7Hz，2’-H，6’-H)，6.76(s2H，J+8.7Hz，3’-H，5’-H)，3.806(s，3H，N-CH3)
实施例311-甲基-3-(3’-羟基-4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(20)根据实施例化合物31的制备方法，化合物20的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-氨基水杨酸进行反应得化合物201HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.158(s，1H，CO2H)，9.092(d，1H，OH)，8.532(dd，1H，J邻＝2.4Hz，J间＝9.3Hz，7-H)，7.933-7.876(m，3H，ArH)，7.776(d，1H，J＝8.4Hz，8-H)，7.555(s1H，4-H)，7.107(dd，1H，J邻＝8.7Hz，J间＝1.8Hz，Ar-5’H)，2.853(s，3H，N-CH3)实施例321-甲基-3-(4’-羧基苯胺羰基)-6-硝基-二氢喹啉酮-2(23)根据实施例化合物31的制备方法，化合物23的制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与对氨基苯甲酸进行反应得化合物231HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.94(s，1H，NH)，9.14(s，1H，4-H)，9.07(d，1H，J＝2.7Hz，5-H)，8.50(dd，1H，J1＝2.4，J2＝9.3，7-H)，7.95-7.81(m，5H，8-H，2’-H，3’-H，5’-H，6’-H)，3.81(s3H，NCH3)实施例331-甲基-3-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基-6-硝基-二氢喹啉酮-2(25)根据实施例化合物31的制备方法，化合物25制备，不同点在于以1-甲基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物251HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)11.985(s，1H，NH)，9.20(s，1H，4-H)，9.129(s，1H，5-H)，8.56(d，1H，J＝9.3，7-H)，7.94(m，5H，ArH))，3.84(s，3H，NCH3)实施例341-异丙基-3-[4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氢喹啉酮-2(28)根据实施例化合物31的制备方法，化合物28的制备，不同点在于以1-异丙基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与4-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物281HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.00(s，1H，5-H)，8.89(d，1H，J＝9.3Hz，7-H)，8.47(s，1H，4-H)，8.07(d，2H，J＝7.2Hz，Ar’H)，7.9(d，2H，J＝7.2Hz，Ar’H)，7.59(d，1H，J＝9.3，8-H)，5.55(m，1H，异丙基-CH)，1.41(d，6H，异丙基-(CH3)2)实施例351-异丙基-3-[3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)苯氨羰基]-6-硝基-二氢喹啉酮-2(29)根据实施例化合物31的制备方法，化合物29的制备，不同点在于以1-异丙基-3-羧基-6-硝基二氢喹啉酮-2与3-(1’，2’3’，4’-四唑-5’)苯氨进行反应得化合物291HNMR(300MHz，DMSO)，(ppm)9.00(d，1H，J＝2.4Hz，5-H)，8.80(m，1H，7-H)，8.50(s，1H，4-H)，8.47(d，J＝2.4，2’-H)，7.96(m，1H，4’-H)，7.79(m，2H，5’，6’-H)，7.60(m，1H，8-H)，5.59(m，1H，异丙基-CH)，1.40(d，6H，异丙基-(CH3)2)化合物7、8、9、26、和27等按以上方法制备实施例363-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉酮-2(41)将0.464克(2.20mmol)2-氯-3-氯甲基二氢喹啉置于10ml圆底瓶中，加入0.475克(2.37mmol)2-对硝苯羰基吡咯及0.910克(6.60mmol)无水碳酸钾和4毫升N，N-二甲基甲酰胺(分子筛干燥)于外浴55℃反应，TLC监测(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)5.5小时后反应完全。后处理过滤，滤饼用乙酸乙酯充分洗涤，后用水溶解，乙酸乙酯提取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，浓缩后用石油醚\乙酸乙酯重结晶的0.397克产物，2-氯-3-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉，产率52.24％，mp.159.0～159.9℃1HNMR(300MHz，CDCL3)，δ(ppm)8.292(d，2H，J＝8.4Hz3，5ArH)8.032(d，1H，J＝8.4Hz，5H)7.896(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.7447.478(m，4H)，7.210(s，1H，QU4-H)6.862(d，1H，PY5-H)6.388(t，1H，PY3-H)5.879(s，2H，-CH2N)ESI-MS m/z(Intensity)392.5(100，M+)将0.350克(0.895mmol)2-氯-3-[2’-(4”-硝基苯羰基)-吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉置于10ml圆底瓶中，加入2ml醋酸和一滴水于外浴120℃回流反应，原料在加热后全部溶解，TLC监测(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，2滴醋酸)，二天后反应完全，反应液冷却后，有灰色结晶析出。
后处理过滤，用二氯甲烷充分洗涤灰色针晶，干燥得0.275克浅绿色针晶，，产率82.58％，mp.275.0～276.9℃1HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.301(d，2H，J＝9Hz，3，5ArH)，7.921(d，2H，J＝9Hz，2，6rH)，7.5637.090(m，6H)6.807(m，1H，Pyr3-H)，6.347(m，1H，Pry4-H)，5.497(s，2H，CH2-N)ESI-MS m/z(Intensity)374.5(8.3，M+)实施例373-(2’-乙氧羰基吡咯-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(71)根据实施例化合物41的制备方法，化合物71的制备，不同点在于以2-乙氧羰基吡咯与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物711H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.956(S，1H，N-H)，7.493(d，1H，J＝8.1，H-5)，7.44(d，1H，J＝7.8，H-8)，7.312(S，1H，H-4)，7.28(t，1H，J＝8.1，H-6)，7.107(t，1H，J1＝7.8，J2＝7.2，H-7)，6.961(dd，1H，J1＝2.4，J2＝1.5，H-4’)，6.866(S，1H，H-5’)，6.227(t，1H，J1＝3.9，J2＝2.7，H-3’)，5.389(S，2H，-CH2-)，4.115(m，2H，-OCH2CH3)，1.171(t，3H，J＝7.2-OCH2CH3)。
EI-MS(％)296(M+，47)，158(100)，250(78)实施例383-(2’-苯羰基吡咯N-亚甲基)香豆素(60)根据实施例化合物41的制备方法，化合物60的制备，不同点在于以2-苯羰基吡咯与3-氯甲基香豆素进行反应得化合物601HNMR(300MHz，CDCl3)，(ppm)7.62(s，1H，4-H)，7.20-7.60(m，10H，ArH，Py5-H，Ar”H)，6.80(d，1H，J＝3.3Hz，Py-3’-H)，6.20(d，1H，J＝3.3Hz，Py-4’-H)，5.55(s，2H，N-CH2)实施例393-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亚甲基)香豆素(62)根据实施例化合物41的制备方法，化合物62的制备，不同点在于以2-(4’-氯苯羰基吡咯与3-氯甲基香豆素进行反应得化合物621HNMR(300MHz，CDCl3)，(ppm)7.70(d，2H，J＝8.4Hz，2”，6”-H)，7.60(s，1H，4-H)，7.4(d，2H，J＝8.4Hz，3”，5”-H)，7.2-7.5(m，5H，ArH，Py3-H)，6.70(d，1H，J+3.6Hz，Py5’-H)，6.20(t，1HJ＝3.6Hz，Py 4’-H)，5.53(s，2H，N-CH2)实施例403-[2’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亚甲基]香豆素(61)根据实施例化合物41的制备方法，化合物61的制备，不同点在于以2-(4’-甲氧苯羰基吡咯与3-氯甲基香豆素进行反应得化合物611H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)7.70(d，2H，J＝8.1Hz，2”，6”-H)，7.10-7.40(m，6H，4，5，6，7，8-H，Py3’-H)，6.90(d，2H，J＝8.1Hz，3”，5”-H)，6.80(t，1H，J＝3.1Hz，Py-4’-H)，6.20(d，1H，J＝3.1Hz，Py-5’-H)，5.52(s，2H，N-CH2)，3.87(s，3H，OCH3)实施例413-(2’-苯羰基吡咯-N-亚甲基)-7甲氧基-二氢喹啉酮-2(54)根据实施例化合物41的制备方法，化合物54的制备，不同点在于以2-苯羰基吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物541H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)10.843(br，1H，NH)，7.798(d，2H，J＝9Hz，5，6-H)，7.759(s，1H，4-H)，7.523-7.354(m，5H，Ar’H)，6.86-6.79(m，2H，Py-3，5-H)，6.73(s，1H，8-H)，6.228(t，1H，J＝3Hz，Py4-H)，5.648(s，2H，NCH2)，3.888(s，3H，OCH3)实施例423-(3’--苯羰基吡咯-N-亚甲基)-7甲氧基-二氢喹啉酮-2(55)根据实施例化合物41的制备方法，化合物55的制备，不同点在于以3-苯羰基吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物551H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.835(d，2H，J＝7.2Hz，5，6-H)，7.502-7.403(m，5H.Ar’H)，7.358(s，1H，4-H)，6.849-6.755(m，4H，8-H，Py2-H，Py4-H，Py5-H)，5.12(s，2H，NCH2)，3.872(s，3H，OCH3))实施例433-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亚甲基]-7甲氧基-二氢喹啉酮-2(56)根据实施例化合物41的制备方法，化合物56的制备，不同点在于以2-(4’-氯苯羰基)吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物561H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.724(d，2H，J＝8.4Hz，Ar’-2，6-H)，7.541(d，2H，J＝8.4Hz，Ar’-3，5-H)，7.473-7.443(m，2H，4-H，Py3-H)，7.058(s，1H，8-H)，6.791-6.756(m，2H，5-H，Py5-H)，6.727(dd，1H，J邻＝8.7Hz，J间＝2.4Hz，Py4-H)，6.300-6280(m，1H，6-H)，5.422(s，2H，NCH2)，3.766(s，3H，OCH3)实施例443-[2’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亚甲基]-7-甲氧基-二氢喹啉酮-2(52)根据实施例化合物41的制备方法，化合物52的制备，不同点在于以2-(4’-甲氧基苯羰基)吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物521H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.717(d，2H，J＝9Hz，Ar’-2，6-H)，7.424(d，1H，J＝9Hz，5-H)，7.377(s，1H，4-H)，7.007(d，1H，J＝2.7Hz，8-H)，7.011-6.984(m，2H，Py3，5-H)，6.770-6.697(m，3H，6-H，Ar’3，5-H)，6.257(s，1H，Py4-H)，5.390(s，2H，NCH2)，3.798(s，3H，7-OCH3)，3.751(s，3H，Ar’-OCH3)实施例453-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯-N-亚甲基]-7-甲氧基-二氢喹啉酮-2(50)根据实施例化合物41的制备方法，化合物50的制备，不同点在于以3-(4’-硝基苯羰基)吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物501H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)8.929(D，2h，j＝9Hz，Ar’3，5-H)，7.951(d，2H，J＝9Hz，Ar’-2，6-H)，7.482(d，2H，J＝9Hz，5，6-H)，7.400(s，1H，4-H)，6.919-6.861(m，2H，Py2-H，8-H)，6.72(d，2H，J＝1.8Hz，Py4，5-H)，5.114(s，2H，NCH2)，3.897(s，3H，OCH3)实施例463-(2’-乙氧羰基咪唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(67)根据实施例化合物41的制备方法，化合物67的制备，不同点在于以2-乙氧羰基吡咯与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物671H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.11(S，1H，N-H)，7.847(S，1H，H-4)，7.508-7.687(m，4H，H-5，H-6，H-7，H-8)，7.334(d，1H，J＝8.4，H-5’)，7.217(d，1H，J＝6.9，H-4’)，5.676(S，2H，-CH2-)，4.476(m，2H，-OCH2CH3)，1.465(t，3H，J1＝7.2，J2＝6.9，-OCH2CH3)。
EI-MS(％)297(M+，100)，158(77)实施例473-(3’-三氟甲基-4′-乙氧羰基吡唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(69)根据实施例化合物41的制备方法，化合物69的制备，不同点在于以3-三氟甲基-4-乙氧羰基吡唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物691H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.278(S，1H，N-H)，8.329(S，1H，H-5’)，7.889(S，1H，H-4)，7.635-7.552(m，2H，H-5，H-8)，7.26-7.376(m，2H，H-6，H-7)，5.36(S，2H，-CH2-)，4.298(m，2H，-OCH2CH3)，1.325(t，3H，J1＝7.2，J2＝6.9，-OCH2CH3)。
EI-MS(％)365(M+，100)，158(77)实施例483-(2’-甲酰基吡咯-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(64)根据实施例化合物41的制备方法，化合物64的制备，不同点在于以2-甲酰基-吡唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物641H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.412(S，1H，N-H)，9.55(S，1H，-CHO)，7.741(S，1H，H-4)，7.563-7.493(m，2H，H-5，H-8)，7.343-7.237(m，2H，H-6，H-7)，7.224(d，1H，J＝7.8，H-5’)，6.989(d，1H，J＝3.9，H-4’)，6.287(S，1H，H-3’)。
ESI-MS(％)253[M+1]+实施例493-(3’-正丙基-5′-乙氧羰基吡唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(70)根据实施例化合物41的制备方法，化合物70的制备，不同点在于以3-正丙基-4-乙氧羰基吡唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物701H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，10.904(S，1H，N-H)，7.563-7.480(m，2H，H-5，H-8)，7.340-7.219(m，3H，H-6，H-7，H-4)，6.706(S，1H，H-4’)，5.407(S，2H，-CH2-)，4.421(m，2H，-OCH2CH3)，2.612(t，2H，J1＝6.9，J2＝7.8，-CH2CH2CH3)，1.684(m，2H，-CH2CH2CH3)，1.406(t，3H，J1＝7.8，J2＝6.9，-OCH2CH3)，0.971(t，3H，J1＝6.9，J2＝7.8，-CH2CH2CH3)。
EI-MS(％)339(M+，92)，158(100)，135(89)实施例503-(4’-乙氧羰基-5′-甲基咪唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(66)根据实施例化合物41的制备方法，化合物66的制备，不同点在于以4-乙氧羰基5’-甲基咪唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物661H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，8.022(S，1H，H-2’)，7.605-7.496(m，3H，H-4，H-5，H-8)，7.260-7.147(m，2H，H-6，H-7)，5.643(S，2H，-CH2-)，4.407(m，2H，-OCH2CH3)，2.689(S，3H，-CH3)，1.397(t，3H，J＝7.2-OCH2CH3)。
EI-MS(％)311(M+，48)，158(100)，265(80)实施例513-(2’-羧基吡咯-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(72)根据实施例化合物41的制备方法，化合物72的制备，不同点在于以2-羧基吡咯与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物721H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.947(S，1H，-COOH)，7.498-7.427(m，2H，H-5，H-6)，7.300(d，1H，J＝8.4，H-8)，7.226(t，1H，J1＝2.1，J2＝5.1，H-5’)，7.109(t，1H，J1＝7.5，J2＝7.8，H-7)，6.920(dd，1H，J1＝1.8，J2＝2.1，H-4’)，6.851(S，1H，H-4)，6.198(t，1H，J1＝3.9，J2＝2.7，H-3’)，5.397(S，2H，-CH2-)。
EI-MS(％)268(M+，23)，158(100)，224(70)实施例523-(2’-羧基咪唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(68)根据实施例化合物41的制备方法，化合物68的制备，不同点在于以2-羧基咪唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物681H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，11.973(S，1H，-COOH)，7.755(S，1H，H-4)，7.604(d，1H，J＝5.7，H-5)，7.487(t，1H，J1＝7.8，J2＝6.9，H-6)，7.305(d，1H，J＝8.1，H-8)，7.226(S，1H，H-5’)，7.164(t，1H，J1＝7.5，J2＝7.8，H-7)，6.922(S，1H，H-4’)，5.073(S，2H，-CH2-)。
ESI-MS(％)270[M+1]+实施例533-(4’-羧基5′-甲基咪唑-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(65)根据实施例化合物41的制备方法，化合物65的制备，不同点在于以4-羧基5’-甲基咪唑与2-氯-3-氯甲基二氢喹啉进行反应得化合物651H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，12.035(S，1H，-COOH)，9.068(S，1H，N-H)，7.696(S，1H，H-2’)，7.643(d，1H，J＝7.8，H-5)，7.519(m，1H，H-6)，7.336(d，1H，J＝8.1，H-8)，7.189(t，1H，J1＝7.8，J2＝7.5，H-7)，5.483(S，2H，-CH2-)，2.501(S，3H，-CH3)。
EI-MS(％)283(M+，10)，158(100)，239(65)实施例543-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯-N-亚甲基]香豆素(63)根据实施例化合物41的制备方法，化合物63的制备，不同点在于以2-(4’-硝基苯羰基吡咯与3-氯甲基香豆素进行反应得化合物631H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm，JHz)，8.30(d，2H，J＝7.8，Ar-H-3，5)，7.89(d，2H，J＝7.8，Ar-H-2，6)，7.703(S，1H，H-4)，7.196-7.606(m，4H，H-5，6，7，8)，6.908(S，1H，H-3’)，6.779(S，1H，H-4’)，6.296(S，1H，H-5’)，5.551(S，2H，-CH2-).
ESI-MS(％)375[M+1]+.
实施例553-[3’-(4”-甲氧苯甲酰)吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉酮-2(44)根据实施例化合物41的制备方法，化合物44的制备，不同点在于以3-(4’-甲氧苯甲酰)吡咯与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物441HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.773(d，2H，J＝8.4Hz，2，6-ArH)，7.651(s，1H，QU4-H)，7.616(d，1H，J＝7.8HzQU5-H)，7.563(s，1H，Pyr2-H)，7.484(t，1H，J＝7.5Hz，QU7-H)，7.304(d，1H，J＝8.1Hz，QU8-H)7.160(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.024(d，2H，J＝8.4Hz，3，5-ArH)8.001(m，1H，J＝2.4Hz，Pyr5-H)，6.524(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)5.078(s，2H，-CH2N)，3.817(s，3H，-OCH3)ESI-MSm/z(Intensity)359.6(5.0E5，M+)，74.4(5.5E6，M+-285)实施例563-[2’-(4”-氯苯甲酰)吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉酮-2(45)根据实施例化合物41的制备方法，化合物45的制备，不同点在于以2-(4’-氯苯甲酰)吡咯与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物451HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.728(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.556～7.421(m，5H)，7.293(d，1H，J＝8.1Hz，QU8-H)8.106(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.048(s，1H，Pyr2-H)6.792(d，1H，J＝3Hz)6.318(t，1H，J＝3Hz，Pyr4-H)5.466(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)363.5(1.23E6，M+)实施例573-[3’-(4”-氯苯甲酰)吡咯-N-亚甲基]-二氢喹啉酮-2(46)根据实施例化合物41的制备方法，化合物46的制备，不同点在于以3-(4’-氯苯甲酰)吡咯与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物461HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.762(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.650～7.542(m，5H)，7.484(t，1H，J＝8.1Hz，QU7-H)7.302(d，1H，J＝8.4Hz，QU8-H)7.159(t，1H，J＝7.5Hz，QU6-H)7.029(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr5-H)，6.548(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)，5.080(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)363.5(3.2E5，M+)，219.4(2.5E5，M+-144)实施例583-(2’-苯甲酰吡咯-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(47)根据实施例化合物41的制备方法，化合物47的制备，不同点在于以2-苯甲酰吡咯与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物471HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.715(d，2H，J＝6.9Hz，QU5，8-H)，7.598～7.281(m，7H)7.106(t，1H，J＝8.1Hz)7.038(s，1H，QU4-H)6.765(d，1H，J＝4.2Hz，Pyr3-H)6.310(t，1H，J＝3Hz，Pyr4-H)5.480(s，2H，-CH2N)ESI-MSm/z(Intensity)329.5(1.9E6，M+)，212.4(1.0E6，M+-117)实施例593-(2’-乙酰吡咯-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(48)根据实施例化合物41的制备方法，化合物48的制备，不同点在于以2-乙酰苯甲酰吡咯与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物481HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.453(q，2H，J＝8.1Hz，QU5，8-H)7.303～7.279(m，2H)7.198(dd，1H，J间＝1.8Hz，J邻＝3.9Hz，Pyr3-H)7.104(t，1H，J＝6.9Hz，QU6-H)6.858(s，1H，QU4-H)6.247(t，1H，J＝3.9Hz，Pyr4-H)5.371(s，2H，-CH2N)，3.367(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)267.5(4.6E6，M+)
实施例603-(3’-乙酰吲哚-N-亚甲基)二氢喹啉酮-2(59)根据实施例化合物41的制备方法，化合物59的制备，不同点在于以3-乙酰吲哚与2-氯-3-氯甲基-二氢喹啉进行反应得化合物591HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.457(s，1H，QU4-H)8.190(t，1H，QU7-H)7.603(s，1H，Ind2-H)7.556(d，2H，J＝8.1Hz，QU5，8-H)7.468(t，1H，J＝8.1Hz，QU6-H)7.320～7.097(m，4H，Ind4，5，6，7-H)5.363(s，2H，-CH2N)2.361(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)317.5(3.6E5，M+)275.5(1.6E54-42，M++1-42)实施例613-(3’-乙酰吲哚-N-亚甲基)-7甲氧基二氢喹啉酮-2(58)根据实施例化合物41的制备方法，化合物58的制备，不同点在于以3-乙酰吲哚与2-氯-3-氯甲基-7甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物581HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.438(s，1H，QU4-H)8.184(q，1H，Ind6-H)7.588(m，2H)7.493(d，1H，QU5-H)7.244～7.167(m，2H)6.801(sd，1H，J＝3.3Hz，QU8-H)6.760(dd，1H，J邻＝9Hz，J间＝3Hz，QU6-H)5.311(s，2H，-CH2N)3.358(s，3H，-OCH3)2.491(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)297.5(6.0E6，M+-49)实施例623-[2’-(4”-硝苯甲酰)吡咯-N-亚甲基]-7甲氧基二氢喹啉酮-2(49)根据实施例化合物41的制备方法，化合物49的制备，不同点在于以2-(4’-硝苯羰基吡咯与3-氯甲基-7甲氧基二氢喹啉酮-2进行反应得化合物491HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.303(d，2H，J＝9Hz，3，5-ArH)，7.919(d，2H，J＝9Hz，2，6-ArH)，7.520(s，1H，Pyr5-H)7.483(d，1H，J＝8.7Hz，QU5-H)7.119(s，1H，QU4-H)，6.795(d，1H，J＝2.7Hz，QU8-H)，6.773(s，1H，Pyr3-H)，6.739(dd，1H，J邻＝8.7Hz，J间＝2.7Hz，QU6-H)6.320(dd，1H，J邻＝4.2Hz，J间＝2.7Hz，Pyr4-H)5.452(s，2H，-CH2N)3.771(s，3H，-OCH3)ESI-MSm/z(Intensity)404.6(5.6E5，M+)219.4(1.3E5，)实施例633-(2’-乙酰吡咯-N-亚甲基)-7甲氧基二氢喹啉酮-2(51)根据实施例化合物41的制备方法，化合物51的制备，不同点在于以2-乙酰吡咯与3-氯甲基-7甲氧基二氢喹啉酮-2进行反应得化合物511HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.409(d，1H，J＝8.7Hz，QU5-H)7.273(t，1H，J＝1.8Hz，Pyr4-H)7.174(dd，1H，J邻＝3.6Hz，J间＝1.5Hz，Pyr5-H)6.885(s，1H，QU4-H)6.792(d，1H，J＝2.7Hz，QU8-H)6.726(dd，J邻＝8.7Hz，J间＝2.1Hz，QU6-H)6.219(dd，1H，J邻＝2.1Hz，J间＝3.3HzPyr3-H)5.330(s，2H，-CH2N)3.771(s，3H，-OCH3)2.341(s，3H，-COCH3)ESI-MSm/z(Intensity)297.5(1.8E6，M+)实施例643-[3’-(4”-甲氧苯羰基)吡咯-N-亚甲基]-7-甲氧基-二氢喹啉酮-2(53)根据实施例化合物41的制备方法，化合物53的制备，不同点在于以3-(4’-甲氧基苯羰基)吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物531HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.763(d，2H，J＝8.7Hz，2，6-ArH)，7.646(s，1H，QU4-H)7.555～7.523(m，2H)，7.024(d，2H，J＝9Hz，3.，5-ArH)，6.980(t，1H，Pyr5-H)6.7996.765(m，2H，QU6，8-H)，6.502(t，1H，Pyr4-H)5.021(s，2H，-CH2N)3.819(s，3H，QU-OCH3)3.782(s，3H，Ar-OCH3)EI-MSm/z(100％)388.5(M+)实施例653-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯-N-亚甲基-7甲氧基-二氢喹啉酮-2(57)根据实施例化合物41的制备方法，化合物57的制备，不同点在于以3-(4’-氯苯羰基)吡咯与2-氯-3-氯甲基-7-甲氧基二氢喹啉进行反应得化合物571HNMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)8.752(d，2H，J＝8.1Hz2，6-ArH)，7.640(s，1H，QU4-H)，7.569～7.522(m，4H)，7.003(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr5-H)6.797～6.773(m，2H)，6.527(t，1H，J＝2.1Hz，Pyr4-H)5.023(s，2H，-CH2N)3.782(s，3H，-OCH3)EI-MS(％)392(27，M+)，188.2(100，M+-204)化合物42和43按以上方法制备药理实验实验例1本发明化合物对cisplatin所致小鼠急性肾损伤的保护作用方法取雄性昆明(KM)小鼠，16g～22g，按体重随机分为溶剂对照组和顺铂模型组、给药组，每组8只。对照组腹腔注射生理盐水，顺铂以生理盐水溶解，腹腔注射，按7mg/kg。以上各给药体积均为0.4ml/20g，于注射顺铂前2天开始给药，注射顺铂后第3天、5天、7天分别眼球取血，用试剂盒检测血清BUN、Scr，并称体重。
结果见表1、2、3、4、5、6和7。
表1化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后3天)
表2化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后5天)
表3化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后3天)
表4化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后5天)
表5化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后7天)
表6化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后5天)
表7化合物对顺铂造成小鼠肾损伤的保护作用(造模后7天)
#P＜0.05，与对照相比；##P＜0.01，与对照相比*P＜0.05，与模型相比；**P＜0.01，与模型相比实验例2本发明化合物31在体外对cisplatin所引起肾脏细胞损伤的保护作用(一)MTT法观察本发明化合物31与cisplatin合用对大鼠肾系膜细胞rMCs生长的影响取指数生长期的大鼠肾系膜细胞(rat mesangial cell，rMC)，加入适量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用RPMI1640培养基(含20％小牛血清)制备成浓度为104/ml的细胞悬液，于96孔板中每孔接种0.1ml。将平板置于37℃、5％CO2培养箱，24小时后加不同浓度药物。设对照组(n＝6)，cisplatin 0.12、0.37、1.0、3.0、10.0、30μmol/L不同浓度组，本发明化合物31在0、33、100μmol/L分别与顺铂上述不同浓度合用组，每组设3个平行孔。
继续培养72或96小时，弃去培养基，每孔加入0.1ml无血清RPMI1640培养液配制的MTT(0.5mg/ml)，37℃温育4小时，活细胞可将MTT还原为甲簪。弃上清液，加入150μl DMSO溶解甲簪，于平板振荡器上充分振摇。用酶标仪以450nm作参比波长，于570nm检测波长测定吸光度(OD)。
细胞生长抑制率％＝1-(加药组细胞OD值/对照组细胞OD值)×100％结果如下MTT实验的原理是根据活细胞能将溴化四氮唑蓝(MTT)还原为一蓝紫色的可溶于DMSO的甲簪化合物，而死细胞则无此能力。溶于DMSO的甲簪在570nm处有较强的吸收峰，且此吸收值与活细胞数成较好的线性关系。用MTT法观察了本发明化合物31对cisplatin作用下大鼠肾系膜细胞的保护作用。
在cisplatin浓度较低时，本发明化合物31对于cisplatin造成的rMC毒性具有保护作用。0.12μmol/L cisplatin对对照组、33μmol/L本发明化合物31组、100μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为10.7％、8.3％、3.8％；0.37μmol/L cisplatin对对照组、33μmol/L本发明化合物31组、100μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为19.0％、12.8％、7.6％；1μmol/Lcisplatin对对照组、33μmol/L本发明化合物31组、100μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为25.4％、18.2％、12.0％。本发明化合物31对于3μmol/L cisplatin、10μmol/L cisplatin以及30μmol/L cisplatin造成的rMC毒性未见明显的保护作用。(见表8，附图1)表8.本发明化合物31对cisplatin引起大鼠肾系膜细胞(rMC)损伤的保护作用
(二)MTT法观察本发明化合物31与cisplatin合用对人肾小管上皮细胞(HKC)生长的影响取指数生长期的人肾小管上皮细胞(HKC)，加入适量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用DMEM/F12培养基(含20％小牛血清)制备成浓度为104/ml的细胞悬液，于96孔板中每孔接种0.1ml。将平板置于37℃、5％CO2培养箱，24小时后加不同浓度药物。设对照组(n＝6)，cisplatin 0.12、0.5、2.5μmol/L不同浓度组，本发明化合物31在0、2、10、50μmol/L分别与顺铂上述不同浓度合用组每组设3个平行孔。
继续培养72或96小时，弃去培养基，每孔加入0.1mll无血清RPMI1640培养液配制的MTT(0.5mg/m)，37℃温育4小时，活细胞可将MTT还原为甲簪。弃上清液，加入150μl DMSO溶解甲簪，于平板振荡器上充分振摇。用酶标仪以450nm作参比波长，于570nm检测波长测定吸光度(OD)。
细胞生长抑制率％＝1-(加药组细胞OD值/对照组细胞OD值)×100％结果如下用MTT法观察了本发明化合物31对cisplatin作用下大鼠HKC细胞的保护作用本发明化合物31对于cisplatin造成的HKC毒性具有保护作用。0.12μmol/Lcisplatin对对照组、2μmol/L本发明化合物31组、10μmol/L本发明化合物31、50μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为5.9％、3.8％、0.1％、0.1％；0.50μmol/L cisplatin对对照组、2μmol/L本发明化合物31组、10μmol/L本发明化合物31、50μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为11.1％、5.5％、3.5％、6.7％；2.5μmol/L cisplatin对对照组、2μmol/L本发明化合物31组、10μmol/L本发明化合物31组、50μmol/L本发明化合物31组细胞生长的抑制率分别为78.0％、69.6％、47.7％、43.1％。(见表9，图2)表9.本发明化合物31对cisplatin引起人肾小管上皮细胞(HKC)损伤的保护作用
实验例3本发明化合物31对Cisplatin所致大鼠急性肾损伤的保护作用(一)检测方法1.血清生化指标血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)采用北京化工厂生产的临床诊断用试剂盒检测。
2.考马氏亮蓝G-250法测定尿蛋白含量2.1原理考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中呈棕红色(游离态)，当它与蛋白通过疏水作用结合后，变为蓝色，最大吸收峰在595nm。以小牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，建立标准曲线。根据标准曲线推测尿蛋白浓度。
2.2试剂配制100mg G-250溶解于50ml 95％乙醇中，加入85％(w/v)的磷酸100ml，加水定容至1L。
2.3方法与操作步骤标准曲线取标准蛋白(1mg/ml)0、5、10、20、40、60、80μl，用双蒸水补至100μl，使得终浓度为0、50、100、200、400、600、800μg/ml。加5mlG-250染液，混匀，室温放置15min，在595nm处测量OD值。
测定取尿液样本100μl，同上操作。
(二)实验方法50只雄性Wistar大鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别为溶剂对照组、cisplatin模型组、cisplatin合用Benazapril 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组。溶剂对照组腹腔注射10ml/kg生理盐水；cisplatin模型组腹腔注射cisplatin 6mg/kg一次；cisplatin合用benazepril 10mg/kg组于腹腔注射cisplatin 6mg/kg前3天灌胃给予benazepril 10mg/kg共计3天，以后每日灌胃给予benazapril 10mg/kg一次，共计4日，总计给药7天；cisplatin合用本发明化合物3110mg/kg组及cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组分别于腹腔注射cisplatin 6mg/kg前3天灌胃给予本发明化合物31 10mg/kg、30mg/kg共计3天。以后每日分别灌胃给药本发明化合物31 10mg/kg、30mg/kg一次，共计4日，总计给药7天。以上各给药体积均为10ml/kg。
每日称体重，末次给药后收集大鼠24小时尿量，用G-250法检测24小时尿蛋白量。末次给药后24小时，以戊巴比妥钠30mg/kg麻醉大鼠，于眼眶取血。分别用试剂盒检测血清BUN、Scr、TGF-β1和血浆ANGII浓度。
处死动物，取肾组织，称重，计算肾脏器系数。将1/2左侧肾脏用磷酸缓冲液(pH7.4)制备10％组织匀浆，测其脂质过氧化及谷胱甘肽水平；其余部分用Trizol制备10％组织匀浆，提取总RNA，进行RT-PCR，分析肾组织TGF-β1mRNA水平。右侧肾用中性福尔马林固定做病理检查。
(三)检测指标与对照组相比较，观察模型组、cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物31 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠各组间血清生化及体重、尿蛋白、脏器指数的变化，并于给药后4天处死大鼠，取肾脏作病理检查。
(四)实验结果1.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠血清生化(BUN及Scr)水平的影响给药后7天，cisplatin模型组大鼠BUN及Scr水平较溶剂对照组明显升高，分别增加747.3％及285.4％(P＜0.01)；cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物3110mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠与cisplatin模型组相比，BUN水平显著降低，分别降低23.2％(P＜0.01)、40.0％(P＜0.01)及46.9％(P＜0.01)。Scr水平显著降低，分别降低24.3％(P＜0.05)、32.3％(P＜0.05)及35.8％(P＜0.05)(见表10)表10.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠血清生化(BUN及Scr)水平的影响(n＝10)
##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model，**P＜0.01 vs cisplatin model2.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠尿蛋白(UP)水平的影响给药后7天，cisplatin模型组大鼠24小时尿蛋白量较对照组明显升高354.6％(P＜0.01)，cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物3110mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠与cisplatin模型组相比，24小时尿蛋白量明显下降，分别下降59.8％(P＜0.05)、48.8％(P＜0.05)、63.6％(P＜0.05)。(见表11)表11.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠尿蛋白(UP)水平的影响(n＝10)
##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model3.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠体重及肾脏指数的影响给药后7天，大鼠体重明显降低，肾组织肥大，色暗红或灰白。cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物31 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠，体重亦明显降低，肾组织肥大较轻，色鲜红或暗红。三组体重减轻较小，肾脏指数增加较少。其中cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠肾脏指数与cisplatin模型组大鼠相比有统计学意义(p＜0.05)(见表12)表12.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠体重及肾脏指数的影响(n＝10)
##P＜0.01 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model实验例4本发明化合物31对大鼠5/6肾切除所致慢性肾功能不全的影响(一)检测方法血清生化检测BUN、Src试剂盒为北京北化精细化学品有限责任公司生产；血浆ANGII放免试剂盒为北京北方生物技术研究所产品；TGF-β1 ELISA kit为Biotech产品上海森雄科技实业有限公司分装。
尿蛋白测定 将大鼠置于代谢笼中收集24小时尿，采用考马氏亮蓝G-250法测定尿蛋白含量。以小牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，建立标准曲线。根据标准曲线推算尿蛋白浓度，计算24小时尿蛋白量(UP·day-1)。
(二)实验方法参照《新药临床前研究指导原则》建立大鼠部分肾脏切除引起的慢性肾功能不全模型1.模型建立取体重200g-240g雄性Wistar大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠35mg/kg，待麻醉后，手术摘除右肾，切除左肾上下极肾实质，止血，关闭腹腔，缝合。
2.分组给药实验共设6组，每组10只鼠，设假手术组、模型组、benazepril(4mg/kg)阳性对照组，losartan(10mg/kg)阳性对照组，本发明化合物31 10mg/kg、30mg/kg两个剂量给药组。
手术4周后，检测大鼠血清尿素氮、肌酐指标，依据血清尿素氮、肌酐水平随机分组，并开始给药。本发明化合物31为灌胃给药，每周6次，持续给药到16周(给药12周)；benazepril和losartan，均为灌胃给药每周6次，持续给药至16周(给药12周)。假手术组、模型组灌胃0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)混悬液，给予体积为10ml·kg-1，持续给予溶剂对照至16周(给药12周)。
3.检测指标于术后8、12、16周，乙醚麻醉动物，眼球后静脉丛取血，检测血清BUN、Scr水平，放免法测定血浆ANGII水平，ELISA法测定血浆TGF-β1水平，将大鼠置于代谢笼中收集24小时尿，测尿蛋白量(UP·day-1)；每周称体重观察大鼠生长状况；术后16周(给药12周)，除测定上述指标，各组分别处死动物，称量心脏重量，计算心脏指数，取肾脏做病理。
(三)实验结果1.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠BUN水平的影响结果见表13。与假手术组相比，模型组大鼠BUN水平在术后一直维持较高水平，在术后4周升高46.5％(P＜0.01)，术后8周升高71.7％(P＜0.01)，术后12周升高127.7％(P＜0.01)，术后16周升高84.2％(P＜0.01)。各给药组术后8周与模型组相比无明显差别。术后12周，losartan组与模型组相比下降26.8％，benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg、30mg/kg两个剂量与模型组相比无明显差别；术后16周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降22.1％(P＜0.01)、14.7％、13.2％、19.9％(P＜0.05)。
表13.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠BUN水平的影响
##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group2.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠Scr水平的影响结果见表14。与假手术组相比，模型组大鼠Scr水平在术后4周、术后8周无明显变化，术后12周升高104.0％(P＜0.01)，术后16周升高68.2％(P＜0.01)。与模型组相比，术后12周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg组、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降13.2％、15.5％、7.3％、39.0％(P＜0.01)。术后16周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降21.4％(P＜0.05)、14.9％、20.3％、34.9％(P＜0.01)。
表14.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠Scr水平的影响
##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group3.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠尿蛋白(UP)水平的影响结果见表15。与假手术组相比，模型组大鼠UP·day-1水平明显升高，术后8周时升高314.1％(P＜0.01)，术后12周升高280.3％(P＜0.01)，术后16周升高816.9％(P＜0.01)。术后8周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降49.1％(P＜0.05)、48.2％(P＜0.05)、46.7％(P＜0.05)，本发明化合物31 10mg/kg组与模型组相比未见下降；术后12周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg组、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降27.3％(P＜0.05)、26.6％、30.3％(P＜0.05)、36.6％(P＜0.05)；术后16周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg组、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降61.0％(P＜0.01)、51.4％(P＜0.05)、40.1％(P＜0.05)、72.3％(P＜0.01)。
表15.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠尿蛋白(UP)水平的影响
##P＜0.01 vs SM，*P＜0.05 vs model group，**P＜0.01 vs model group4.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠体重的影响结果见表16。术后4周假手术组、模型组、losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg组、本发明化合物31 30mg/kg组体重未见明显差异。与假手术组相比，术后16周模型组大鼠、losartan组、benazepril组体重下降约35g(10％)；本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组下降约10g(2％)。本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组体重下降幅度较小。
表16.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠体重的影响
#P＜0.05 vs SM，*P＜0.05 vs model group5.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠心脏指数的影响结果见表17。与假手术组相比，术后16周模型组大鼠心脏指数升高17.8％(P＜0.01)。losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降18.0％(P＜0.01)、6.4％、2.4％、13.7％(P＜0.01)。其中losartan组、本发明化合物31 30mg/kg组心脏指数下降较为明显，与假手术组相近。
表17.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠心脏指数的影响
##P＜0.01 vs SM，**P＜0.01 vs model group实验例5本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的影响(一)检测方法血清生化检测 采用荷兰威同selecrta-E全自动生化分析仪测定尿蛋白测定 将大鼠置于代谢笼中收集24小时尿液，采用考马氏亮蓝G-250法测定尿蛋白含量。以小牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，建立标准曲线。根据标准曲线推算尿蛋白浓度，计算24小时尿蛋白量(UP·day-1)。
(二)实验方法1.模型建立取体重200g-240g雄性Wistar大鼠，腹腔注射链脲霉素(streptozotocin STZSigma公司产品)60mg/kg(以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH＝7.4)配成所需要的浓度)2.分组给药实验共设4组，设对照组、模型组、losartan(10mg/kg)组，本发明化合物3110mg/kg给药组。造模同时给药。本发明化合物31为灌胃给药，每周6次，持续给药到24周；losartan为灌胃给药，每周6次，持续给药至24周。对照组、模型组灌胃0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)混悬液，给予体积为10ml·kg-1，持续给予至24周。
3.检测指标于造模后4、8、12、16、24周，乙醚麻醉动物，眼球后静脉丛取血，检测血清BUN、Scr、Glu水平，放免法测定血浆ANGII水平，将大鼠置于代谢笼中收集24小时尿，测定尿蛋白量(UP·day-1)；每周称体重观察大鼠生长状况；术后16周、24周，除测定上述指标，各组分别处死动物，取肾脏做病理。
(三)实验结果1.造模后4周(见表18)与对照组大鼠相比，模型组大鼠Glu水平升高473.7％；BUN水平升高61.8％(P＜0.05)，Scr.水平升高18.1％(P＜0.05)，说明糖尿病大鼠模型造模成功，且大鼠肾功能已出现损伤。各给药组大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高，肾功能未见明显改善。本发明化合物31组大鼠ANGII水平均较模型组低。
表18.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的各项指标的影响(造模后4周n＝6)
#P＜0.05，vs control group2.造模后8周(见表19)与对照组大鼠相比，模型组大鼠Glu水平升高409.9％(P＜0.05)；BUN水平升高65.9％(P＜0.05)，Scr.水平升高25.9％(P＜0.05)，各给药组大鼠Glu、Scr.亦升高，losartan组、本发明化合物31组大鼠BUN水平有所下降，分别较模型组降低25.8％及17.0％。
表19.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的各项指标的影响(造模后8周n＝6)
#P＜0.05，vs control group3.造模后12周(见表20，21)与对照组大鼠相比，模型组大鼠Glu水平升高484.2％(P＜0.05)；BUN水平升高88.2％(P＜0.05)，Scr.水平升高21.1％。各给药组大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高。与对照组大鼠相比，模型组大鼠尿蛋白水平升高63.9％，losartan组、本发明化合物31组大鼠分别较模型组降低23.4％及47.5％。
表20.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的各项指标的影响(造模后12周)
#P＜0.05，vs control group表21.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型尿蛋白的影响(造模后12周)
#P＜0.05，vs control group*P＜0.05，vs model group4.造模后16周(见表22)与对照组大鼠相比，模型组大鼠Glu水平升高512.5％(P＜0.05)；BUN水平升高127.7％(P＜0.05)，Scr.水平升高42.6％。各给药组大鼠Glu.亦升高，本发明化合物31组大鼠BUN水平有所下降，较模型组降低19.1％；losartan组Scr.水平有所下降，较模型组降低27.1％；血浆ANGII水平，各组无差异。与对照组大鼠相比，模型组大鼠肾脏脏器指数升高105.5％(P＜0.05)，各给药组大鼠亦升高，无显著差异。
表22.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的各项指标的影响(造模后16周)
#P＜0.05，vs control group5.造模后24周(见表23，24)与对照组大鼠相比，模型组大鼠Glu水平升高28.0％；BUN水平升高251.0％(P＜0.05)，Scr.水平升高12.6％。各给药组大鼠Glu、BUN、Scr.亦升高；血浆ANGII水平，各组无差异；与对照组大鼠相比，模型组大鼠肾脏脏器指数升高85％，各给药组大鼠亦升高。与对照组大鼠相比，模型组大鼠尿蛋白水平升高119.3％，losartan组、本发明化合物31组大鼠分别较模型组降低34.9％及47.0％。
表23.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型的各项指标的影响(造模后24周)
#P＜0.05，vs control group表24.本发明化合物31对链脲霉素所致大鼠糖尿病肾病模型尿蛋白的影响(造模后24周)
#P＜0.05，vs control group，*P＜0.05，vs model group本发明化合物31抗肾功能不全的作用机制研究(一)本发明化合物31对细胞凋亡的影响1.荧光显微镜检测凋亡细胞方法取指数生长期的人肾小管上皮细胞(HKC)，加入适量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用DMEM/F12培养基(含20％小牛血清)制备成浓度为104/ml的细胞悬液，于24孔板中每孔接种0.5ml。将平板置于37℃、5％CO2培养箱，24小时后加不同浓度药物。继续作用所需时间。收集HKC细胞，PBS洗一次，离心，去上清，4℃，4％多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS洗一次，加入Hoechst 33342(终浓度为10μg/ml)，37℃染色5-10分钟。离心除去染液，滴片，Olympus荧光显微镜下观察并照相。
结果细胞核形态变化为凋亡细胞最典型的特征，也是判断凋亡细胞的基本参数。凋亡细胞的主要形态学变化包括，细胞核固缩，染色体DNA广泛断裂，断片沿核膜浓聚成多型性高密度颗粒区；核膜皱缩，崩解后包裹染色体片段弥散于细胞浆。细胞全面皱缩，细胞膜皱缩外突，但细胞膜包裹细胞器或核片段形成凋亡小体。Hoechst 33342是一种亲脂性染料，可跨膜进入细胞对DNA进行染色。本研究采用荧光染色方法观察了cisplatin合用不同浓度本发明化合物31(2-50μmol/L)作用24小时的HKC细胞形态变化。用荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色，在紫外光的激发下，发出蓝色荧光。从图可见cisplatin组凋亡细胞特征性形态明显，染色体DNA断裂并聚集成细小的凝聚块，并可见到凋亡小体。随着本发明化合物31药物浓度的加大，镜下凋亡细胞比例逐渐渐少，(见图3)2.本发明化合物31对cisplatin诱导的HKC细胞染色体DNA断裂的影响方法取指数生长期的人肾小管上皮细胞(HKC)，加入适量含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用DMEM/F12培养基(含20％小牛血清)制备成浓度为104/ml的细胞悬液，于培养瓶中接种4ml。将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱，24小时后加不同浓度药物。继续作用所需时间。收集2×106个细胞，用PBS洗涤两次，重悬于0.5ml细胞消化液中(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，25mmol/L EDTA pH8.0，0.1mg/ml Proteinase K)，混匀后，50℃保温12小时，消化后，细胞用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，水相再用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两次除蛋白，所得水相用2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA，用醋酸钠(3mol/L)或醋酸铵(2.5mol/L)助沉，12000g/min取各管离心，取上清18μl，加5μl上样缓冲液，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下观察并照相。
结果细胞凋亡最主要的生化标志是内源性钙-镁离子依赖性核酸内切酶被激活，选择性降解染色体核小体间DNA，导致细胞DNA广泛断裂，形成大小不一的DNA片段，甚至单聚或寡聚核小体，从而在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的、间隔180～200bp的“DNA梯子”样条带。本文以cisplatin作为对照药，用不同浓度的本发明化合物31(2-50μmol/L)合同cisplatin作用于HKC细胞36小时，进行琼脂糖凝胶电泳，由图可见随着本发明化合物31浓度的加大，cisplatin诱导的“DNA梯子”样条带逐渐减弱，呈一定的剂量依赖性。本发明化合物31对10μmol/L cisplatin诱导的HKC凋亡具有明显的抑制作用。(见图4)(二)抗氧化作用1.本发明化合物31对Fe2+-L-cys诱发肝微粒体脂质过氧化的影响方法取大鼠肝微粒体(蛋白含量约为15mg/ml)0.1ml；加入不同浓度的药物和试剂(1)不同药物浓度10μl；(2)1mmol/L FeSO450μl；(3)10mmol/L L-半胱氨酸20μl；(4)PBS(pH7.4)0.82ml。合计为1ml。在37℃环境中反应30min；加20％TCA 0.3ml终止反应；2000rpm离心15min；取上清1.0ml加0.67％硫代巴比妥酸(TBA)0.6ml，沸水加热10min；冷却后，在532nm处测OD值，计算抑制率。
结果本发明化合物31在体外对Fe2+-L-半胱氨酸诱发的肝微粒体脂质过氧化作用具有一定的抑制作用，且在10ug/ml达到最大抑制浓度，抑制率为32.3％。作用弱于酚羟基化合物S-3-1。(见表25，图5)表25.本发明化合物31对Fe2+-L-cys诱发肝微粒体脂质过氧化的影响
2.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织脂质过氧化水平的影响方法上述药效学实验(本发明化合物31对顺铂所致大鼠急性肾损伤的保护实验)中大鼠，取肾组织匀浆(每克肾组织制备匀浆10ml)，按下述方法测定各组大鼠肾组织脂质过氧化水平，比较各给药组间差异。肾组织匀浆丙二醛(MDA，malondialdehyde)测定如下取0.1ml匀浆，加入0.1ml 10％SDS，室温静置20min；加2ml 0.1N HCl和1.0ml 1％TBA，混匀，100℃水浴，40min；冷却后加4ml正丁醇，振荡3～5min，萃取，3000rpm离心10min；取上层正丁醇液0.2ml加至96孔板中，用酶标仪在532nm处测定OD值；标准曲线以四乙氧基丙烷(TEP)0、20、40、60、80、100μmol/L作为标准。
结果给大鼠腹腔单次注射6mg/kg cisplatin后4天，肾组织脂质过氧化水平明显高于对照组(P＜0.05)，cisplatin合用本发明化合物31组、合用Benazapril组大鼠肾组织脂质过氧化水平降低，其中cisplatin合用本发明化合物31(30mg/kg)组大鼠肾组织脂质过氧化水平与cisplatin组相比下降45.2％(P＜0.05)。本发明化合物31在体内具有一定的抗脂质过氧化作用。(见表26)表26.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织脂质过氧化水平的影响(n＝10)
#P＜0.05 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model3.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织谷胱甘肽水平的影响方法上述药效学实验(本发明化合物31对cisplatin所致大鼠急性肾损伤的保护实验)中大鼠，取肾组织匀浆(每克肾组织制备匀浆10ml)，按下述方法测定各组大鼠肾组织谷胱甘肽水平，比较各给药组间差异。肾组织匀浆巯基(-SH)含量测定(DTNB法)如下(1)总GSH(T-SH)0.5ml组织匀浆加入1.5ml的0.2mol/L Tris缓冲液(pH8.2)，0.1ml 0.01mol/L DTNB，7.9ml无水乙醇，使得总体积为10ml；试剂空白同样制备；标准曲线取还原型谷胱甘肽(GSH)0、125、250、500、1000μmol/L作为标准；上述颜色反应15min后，在室温下3000g离心15min；取上清0.2ml加至96孔板中，用酶标仪在410nm处测OD值。
(2)非蛋白结合型GSH(NP-SH)2.5ml组织匀浆加入2ml双蒸水，0.5ml50％TCA，不断摇动10～15min，3000g离心15min；试剂空白同样制备；标准曲线同上；1.0ml滤液或上清液中加入2.0ml 0.4mol/L Tris(pH8.9)，0.1ml0.01mol/L DTNB，摇匀；DTNB加入后5min内，取上清0.2ml加至96孔板中，用酶标仪在412nm处测OD值。
(3)蛋白结合型GSH(PB-SH)其值即为T-SH测量值减去NP-SH测量值。
结果给大鼠腹腔单次注射6mg/kg cisplatin后4天，肾组织总GSH(T-GSH)、蛋白结合型GSH(PB-GSH)水平均低于对照组(P＜0.01)，非蛋白结合型GSH(NB-GSH)水平无明显变化。cisplatin合用Benazapril组、cisplatin合用本发明化合物31组大鼠肾组织总GSH(T-GSH)、蛋白结合型GSH(PB-GSH)水平亦下降，与cisplatin组相比无明显变化。(见表27)表27.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织谷胱甘肽水平的影响(n＝10)
##P＜0.01 vs control(三)与肾素-血管紧张素-TGF-β通路相关的机制1.体外检测本发明化合物31对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用方法反应底物HHL以缓冲液(HEPES 50mM，NaCl 300mM，pH＝8.3)配成10mM，ACE以缓冲液配成80mU/ml，每一药物浓度均设对照管，依次如下表加药
37℃，振摇反应30min后加125ul1N HCl终止反应；各管(实验管和对照管)加入1.5ml乙酸乙酯振摇萃取，取上层乙酸乙酯1.0ml；120℃、30min挥发干乙酸乙酯，加水1ml溶解，紫外228nm处测吸收值。ACE活性以如下公式(A228-A228control)×5.6×10-3；以加水管为对照计算各加药管的抑制率。
结果体外通过检测在血管紧张素转化酶作用下HHL反应生成马尿酸(Hippuricacid)的量来判断血管紧张素转化酶的活性。本发明化合物31体外在10-9mol/L、10-8mol/L浓度下对血管紧张素转化酶具有微弱的抑制作用。(见表28)表28.本发明化合物31在体外对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用
2.本发明化合物31对TGF-β1受体结合试验的拮抗作用方法将Balb/c 3T3或NIH 3T3细胞接种到96孔板，培养条件为37℃，5％CO2，DMEM培养基(含10％胎牛血清)。培养2-4天后，在细胞接近融合时，将培养液换成结合缓冲液(50mmol/L HEPES中含有NaCl，KCl，MgSO4和CaCl2)，加入100pmol/L[125I]TGF-β1激发试验，同时加入受试化合物。细胞培养4小时后，弃去培养基，用冰冷的结合缓冲液洗涤细胞。测定10nmol/L TGF-β1的非特异性结合。细胞溶解在Triton X-100缓冲液中，测定放射性。
结果实验结果见表29，本发明化合物31对TGF-β1受体结合具有一定的抑制作用。
表29.本发明化合物31在体外对TGF-β1受体结合试验的拮抗作用
3.本发明化合物31对cisplatin致急性肾损伤大鼠血浆TGF-β1升高的抑制作用方法(1)标准曲线制作设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积均为100μl。第八孔为空白对照。
(2)加样待测品孔中每孔各加入已激活的待测样品100μl。将反应板置37℃120min。洗板用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干。
(3)每孔中加入第一抗体工作液50μl。将反应板充分混匀后置于37℃60min。洗板用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干。
(4)每孔加酶标抗体工作液100μl。将反应板置37℃60min。洗板用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干。
(5)每孔加入底物工作液100μl，置于37℃暗处反应5～10min。
(6)每孔加入1滴终止液混匀。
(7)在492nm处测定OD值。
(8)结果计算所有OD值均减去空白值后计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、32pg/ml对OD值作标准曲线，根据该标准曲线计算相应的TGF-β1值。
结果上述cisplatin所致急性肾损伤大鼠模型，腹腔注射6mg/kg cisplatin后4天，血浆TGF-β1水平较对照组动物增加72.8％(P＜0.05)，与cisplatin模型组相比，cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物31 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠血浆TGF-β1水平分别下降44.5％(P＜0.05)、60.8％(P＜0.01)、61.4％(P＜0.01)(见表30)表30.本发明化合物31对cisplatin致急性肾损伤大鼠血浆TGF-β1水平的影响(n＝10)
#P＜0.05 vs control，*P＜0.05 vs cisplatin model，**P＜0.01 vs cisplatin model4.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠血浆TGF-β1水平的影响方法同本发明化合物31对cisplatin致急性肾损伤大鼠血浆TGF-β1升高的抑制作用结果结果见表31。与假手术组相比，模型组大鼠血浆TGF-β1水平在术后12周无明显变化；术后16周开始升高，较假手术组升高40.7％。术后16周losartan组、benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降35.7％、9.3％、16.7％、39.9％。
表31.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠血浆TGF-β1水平的影响
**P＜0.01 vs model group5.RT-PCR观察本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠肾组织TGF-β1mRNA表达的影响方法肾组织总RNA提取(1)在经过DEPC处理过的50ml离心管中放置0.5g液氮冻存的肾组织，加入5ml Trizol试剂，用匀浆器充分匀浆约1～2min，随后Vortex振荡混匀，冰浴10min。
(2)加入1.75ml氯仿，充分振荡或上下来回颠倒数次，稍静止后出现分层，随即于4℃，12000rpm离心15min。
(3)将上清(水相)转移于另一支干净50ml离心管中，注意不要吸到中间层的蛋白沉淀。加入等体积的异丙醇(4℃预冷)混匀。4℃，12000rpm离心20min。
(4)沉淀即所需要的总RNA，倒掉上清后，加入1.5ml 75％乙醇，晃荡洗涤一次并小心地倒掉乙醇。再12000rpm离心几秒钟，用Tip头吸干上清。然后加入200μl DEPC处理过的水溶解沉淀，储存于-20℃待用。
(5)吸20μl RNA提取液加DEPC处理水至400μl，于260nm及280nm测OD值。若OD260nmOD280nm＞2，则所测RNA较纯。由1OD260nm＝40μg/mlRNA推算RNA浓度。
大鼠TGF-β1引物Sense primer5’ATG GTG GAC CGC AAC AAC 3’Anti-sense primer5’CCA AGG TAA CGC CAG GAA T大鼠β-actin引物Sense primer5’GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3’Anti-sense primer5’CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C 3’RT-PCR反应体系(Add nuclease-free water to total volume 50μl)
反应条件
电泳取RT-PCR产物40μl，加6×上样缓冲液8μl，于1.7％琼脂糖凝胶电泳(恒压70V)，拍照。
结果上述药效学实验(本发明化合物31对cisplatin所致大鼠急性肾损伤的保护实验)中大鼠肾组织RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察DNA条带强弱。结果cisplatin组大鼠的DNA条带强于对照组；cisplatin合用benazapril组、cisplatin合用本发明化合物31组大鼠的DNA条带弱于cisplatin组大鼠，通过半定量分析分别下降42.0％、14.2％、44.5％(见图6，7)。benazapril和本发明化合物31均能不同程度地抑制cisplatin诱导的大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达增高。
6.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠血浆AngII水平的影响方法
血管紧张素II(ANG II)放免分析测定大鼠腹腔注射35mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，用毛细玻璃管于眼底静脉丛取血1ml，置于冰水浴冷却的酶抑制剂抗凝管中，摇匀，即刻再置入冰水浴中冷却，待离心时取出。4℃1000rpm离心5min，分离血浆(在-20℃可保存2月)。
步骤在冰水浴中按下表加样
摇匀，室温放置15min、3500rpm离心15min，吸去上清，再测定各管沉淀物的放射性Bi(cpm)。
结果计算结合百分率计算设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，则计算公式如下BB0%=B-NSBB0-NSB×100%]]>Logit计算公式如下Logit=B/B0%100-B/B0%]]>以标准浓度取常用对数值为横坐标，对应的logit值为纵坐标作标准曲线。待测样品ANG II浓度即可根据标准曲线得出。
结果上述cisplatin所致急性肾损伤大鼠模型，腹腔注射6mg/kg cisplatin后4天，血浆ANGII水平较对照组动物增加279.6％(P＜0.01)，与cisplatin单药组相比，cisplatin合用bennazapril组、cisplatin合用本发明化合物31 10mg/kg组、cisplatin合用本发明化合物31 30mg/kg组大鼠血浆Ang II水平分别下降44.3％(P＜0.05)、45.0％(P＜0.01)、60.2％(P＜0.01)(见表32)。cisplatin与本发明化合物31合用组大鼠的血浆Ang II水平亦升高，各实验组间血浆Ang II水平无显著性差异。
表32.本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠血浆Ang II水平的影响(n＝10)
##P＜0.01 vs control，**P＜0.01 vs cisplatin model
7.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠血浆AngII水平的影响方法同本发明化合物31对cisplatin所致急性肾损伤大鼠血浆ANG II水平的影响。
结果结果见表33。与假手术组相比，模型组ANGII水平在术后16周升高23.9％，术后16周benazepril组、本发明化合物31 10mg/kg组、本发明化合物31 30mg/kg组与模型组相比分别下降18.3％、7.7％、39.8％；losartan组与模型组相比有所升高。
表33.本发明化合物31对5/6肾切除模型大鼠血浆AngII水平的影响
(四)与胶原形成和分解相关的机制1.底物酶谱法分析本发明化合物31对HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响方法根据Heussen等的方法加以改进。取对数生长期的HT-1080细胞，消化后进行细胞计数，以1×105/孔的密度接种于24孔培养板中，培养过夜。次日每孔加入含有一定浓度药物和对照溶剂的培养基培养12h。弃培养上清，PBS洗三次，然后换无血清加药培养基300μl继续培养12小时。收集细胞培养上清，4℃，200g离心10min去除细胞碎片，上清液于-20℃储存备用，细胞消化计数。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参考文献进行。配制一定体积的8％分离胶和5％浓缩胶，分离胶中含0.1％(w/v)明胶。按细胞数折算出相同细胞数所对应的培养上清体积，并按此体积加样电泳(上样缓冲液中不含DTT)。电泳完毕后，剥离凝胶，以蒸馏水漂洗后，移入100ml 2.5％TritonX-100溶液中，在摇床上低速摇动以洗脱SDS。30min后，换新的TritonX-100溶液继续洗脱30min。凝胶移入100ml明胶酶缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10mmol/L CaCl2，200mmol/LNaCl，1μmol/L ZnCl2)中，37℃恒温温育16小时。蒸馏水漂洗后，凝胶以0.1％考马斯亮蓝R-250染液染色4小时，蒸馏水漂洗后，在脱色液(冰醋酸∶甲醇∶水∶＝10∶45∶45)中脱色1-2h，至对照组出现明显、清晰的负染条带。凝胶扫描照相，负染条带的宽度和亮度反映明胶酶的活性，用Gel-Pro Analyzer 3.1软件对负染条带密度扫描并进行半定量分析。
结果IV型胶原是细胞外基质的重要组成成分，明胶酶(gelatinase)或称IV型胶原酶能降解组成基质膜的IV型胶原，其活性是影响IV型胶原降解重要因素之一。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将HT1080细胞分泌到培养上清中的明胶酶和它们的活性形式按分子量大小分开，经TritonX-100去除和蛋白结合的SDS后，明胶酶能恢复其蛋白降解活性。药物作用细胞后，如果影响到明胶酶表达和分泌的调节通路，则分泌到培养上清中的各种形式的明胶酶的含量将发生变化。如果把明胶掺入到凝胶液中使之与丙烯酰胺共价聚合，在适宜的反应条件下，明胶酶就能降解其周围的明胶，蛋白降解区不能被考马斯亮蓝染色，所以在明胶酶的活性区域附近就能出现一条负染带。肿瘤细胞分泌的明胶酶越多，带的亮度和宽度也就越大。用这种底物酶谱法(Zymography)观察本发明化合物31对HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响，结果表明在cisplatin作用下HT1080细胞分泌明胶酶比对照组明显减少；cisplatin合用本发明化合物31组明胶酶分泌增加，且具有一定的浓度依赖关系。(见图8)2.底物酶谱法分析本发明化合物31对大鼠肾系膜细胞(rMC)分泌基质金属蛋白酶能力的影响方法细胞改用大鼠肾系膜细胞(rat mesangial cell，rMC)方法同底物酶谱法分析本发明化合物31对HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响。
结果用底物酶谱法(Zymography)观察本发明化合物31对大鼠肾系膜细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响，结果表明在cisplatin作用下HT1080细胞分泌明胶酶比对照组减少；本发明化合物31组可使rMC明胶酶分泌增加，且具有一定的浓度依赖关系。(见图9)
权利要求
1.一种如通式(I)所示的化合物 其中X选自O，NH；W选自CO，CH2；R选自C1-C6直链或支链的烷基；R3选自未取代或取代的N-吡咯基，(吡咯环上的取代基为-R10，其中R10选自H，COOH，C1-C4羰烷基，烷氧羰基，未取代或取代的苯羰基，苯环上的取代基为H，卤素，C1-C4甲氧基，NO2)；未取代单取代或多取代的咪唑基或吡唑基(咪唑基或吡唑基上的取代基选自H，C1-C6烷基，CF3，CHO，CO2H，CO2C2H5)；取代的N-吲哚基，(吲哚环上的取代基为H，C1-C4烷羰基)；NHR11，其中R11选自-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4”，未取代、单或多取代的苯基(苯环上的取代基为H，卤素，OH，羧基，C1-C4酯基，C1-C4羧基烷氧基，C-四氮唑基，等)，取代苯基烷基(C1-C4)；R6选自H，C1-C4烷基，NO2；R7选自H，OH，C1-C4烷氧基；R8选自H，C1-C8烷基，烷氧基，硝基；
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，如通式(Ia)所示 其中X、R、R6、R7和R8的定义和权利要求1相同；R11选自C6H5-，p-HOC6H4-，p-HO2CC6H4-，p-EtO2CC6H4-，m-HO2CCH2OC6H4-，3’-HO-4’-HO2CC6H3-，3’-HO2C-4’-HOC6H3-，3’-Cl-4’-HO2CC6H3-，-CH2CH2C6H4-OH-4’，-CH(CO2CH3)CH2C6H4-OH-4’，
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，如通式(Ib)所示 其中X，R，R6，R7，R8的定义和权利要求1相同；R12选自N-(取代的吡咯基)即( 其中R10选自2’-COCH3，2’-CO2CH3，2’-CO2H，2’-CO2C2H5，2’-COC6H5，3’-CO-C6H5，2’-CO-C6H4-Cl-4”，3’-CO-C6H4-Cl-4”，2’-CO-C6H4-OCH3-4”，3’-CO-C6H4-OCH3-4”，2’-CO-C6H4-NO2-4”，3’-CO-C6H4-NO2-4”)；N-(取代的咪唑基)即( 其中R10a或R10b选自CH3，CO2H，CO2C2H5，)；或吡唑基即( 其中R10c或R10d选自CH3，C3H7，CF3，CO2H，CO2C2H5)；N-(3’-取代的吲哚基)即、
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物，选自式(Ia)所代表的以下化合物的群组之一， 其中，R-X＝NH，R11＝苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝H R-X＝NH，R11＝3’-Cl-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OCH2CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-OH-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-CO2Et-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-OH-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-CO2H-4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-OH-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝NCH3，R11＝3’-Cl-4’-CO2H-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR＝NCH(CH3)2，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR＝NCH(CH3)2，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝R8＝HR-X＝O，R11＝苯基，R6＝C2H5，R7＝OCH3，R8＝HR-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝3’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝C4H9R-X＝O，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝R8＝OCH3R-X＝O，R11＝1’-甲氧羰基-2’-(4”-羟苯基)-乙基，R6＝NO2，R7＝OH，R8＝CH3R-X＝NH，R11＝(4”-羟苯基)-乙基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R11＝4’-(1”，2”3”，4”-四唑-5”)-苯基，R6＝H，R7＝OCH3，R8＝NO2
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物，选自式(Ib)所代表的以下化合物的群组之一， 其中，R-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-甲基羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-甲基羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-苯羰基吡咯基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-[3’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-甲基羰基吲哚基)，R7＝OCH3，R6＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3’-甲基羰基吲哚基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-(2’-苯羰基吡咯基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-[2’-(4”-甲氧基苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-[2’-(4”-氯苯羰基)吡咯基]，R6＝R7＝R8＝HR-X＝O，R12＝N-2’-(4”-硝基苯羰基)吡咯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-甲酰基吡咯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(4′-CO2H-5′-CH3咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(4′-CO2C2H5-5′-CH3咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2′-CO2C2H5-咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(2′-CO2H-咪唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3′-CF3-4′-CO2C2H5-吡唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-(3′-C3H7-5′-CO2C2H5-吡唑基)，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-CO2C2H5-吡咯基，R6＝R7＝R8＝HR-X＝NH，R12＝N-2’-CO2H-吡咯基，R6＝R7＝R8＝H
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，该化合物还包括其药用盐、水合物、酯或前体药物。
7.制备如权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，i)用取代的3-羧基香豆素、与相应的取代胺类化合物缩合；或ii)用各种取代的苯胺类化合物与氯代乙酰氯进行反应，得到的中间体与三氯氧磷及二甲基甲酰胺反应，生成取代的3-氯甲基喹啉，然后其氯甲基与相应的各种取代吡咯类化合物1-位氮反应，所得产物水解后得各种目的化合物。
8.根据权利要求7中任一制备方法，其特征在于，所述的反应所用的反应试剂包括三氯化磷、三氯氧磷、五氯化磷、二氯亚砜、草酰氯、乙酸酐、1，二环己基碳化亚胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1，3-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺(EDCI)、乙酸酐、三氯氧磷和二甲基甲酰氨；所用的催化剂包括三级胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷基吡啶；所用的有机溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甲苯、二氯甲烷、乙二醇二甲醚，1，2-二氯乙烷、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
9.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如权利要求1-6所述
的任一化合物及药用载体。
10.根据权利要求9的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、液体口服液、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。
11.如权利要求1-6任一化合物作为制备转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂中的应用，从而作为制备抑制治疗肾脏疾患的药物中的应用。
12.如权利要求1-6任一化合物作为制备血管紧张素II(AII)转化酶受体拮抗剂中的应用。
13.如权利要求1-6任一化合物在制备治疗心脑血管疾患的药物中的应用。
14.如权利要求1-6任一化合物在制备治疗II型糖尿病的药物中的应用。
15.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的心脑血管疾患是高血压、心、脑栓塞、心肌梗塞、脑中风。
16.如权利要求1-6任一化合物在制备治疗肝硬化、前列腺肥大的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了新结构类型的香豆素及二氢喹啉酮衍生物及其药用盐、这类化合物的制备方法、含有这类化合物的药物组合物，特别是用于制备治疗慢性肾衰、糖尿病、高血压和心脑血管疾患以及肝硬化和前列腺肥大药物中的应用。
文档编号A61K31/4704GK1955175SQ200510116739
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者谢平, 陈晓光, 徐世平, 李洪艳, 李兰敏, 周艳丽, 刘悦, 罗志刚, 焦晓臻, 郑旭光 申请人:中国医学科学院药物研究所