专利名称：一种用于治疗股骨头坏死的复合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗股骨头坏死的复合制剂。
背景技术：
股骨头缺血性坏死是临床多发病和常见病，致残率高。它可引起股骨头塌陷、变形，最终导致髋关节功能障碍，本病为一不可逆过程。股骨头坏死的根本原因是血供障碍，并且病程的发展会造成进一步的血供障碍，引发股骨头坏死的加重，是一个恶性循环的发病过程，在股骨头坏死中，血管损伤、炎症导致的血管栓塞和骨内压升高是造成上述恶性循环的重要原因，这是股骨头坏死治疗中的难点。
股骨头坏死的治疗方法有手术治疗和非手术治疗，手术治疗主要是人工关节置换术，该方法只适合老年人，不适合从事重体力劳动的年轻人。非手术治疗主要是采取血管生成及扩血管的药物改善血供，但是，由于股骨头骨内压高，单纯应用血管生成因子很难诱导新血管生成。征对股骨头坏死的病理特征，本发明研制一种复合制剂，采用抗炎因子使坏死股骨头消炎减压，同时，应用促进血管生成的细胞因子诱导新的血管生成，变股骨头坏死恶性循环为良性循环，达到治疗股骨头坏死的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效治疗股骨头坏死的复合制剂，。
本发明的目的可通过以下的技术措施来实现由具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂复合而成。
本发明具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂复合的重量份比为5～8∶8～12。
本发明具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂重量份比为7∶10。
本发明所述具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂中细胞因子的含量为100～200μg/ml，其中脂质体由胆固醇与卵磷脂组成，胆固醇与卵磷酯的比值为1∶4。
本发明所述具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂中的细胞因子含量为100～200μg/ml，其中脂质体由胆固醇与卵磷脂组成，胆固醇与卵磷酯的比值为1∶4。
本发明具有促血管生成的细胞因子为血管内皮细胞生长因子(VEGF121)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、或血小板样生长因子(PDGF)。
本发明具有抗炎作用的细胞因子为肿瘤坏死因子(TNFRII-FC)、白细胞介素10(IL-10)或转化生长因子(TGF-β)。
由于细胞因子在体内的半衰期短，采用脂质体缓释技术，制备基因重组VEGF121及基因重组TNFRII-FC脂质体，用于股骨头坏死及骨创伤修复的治疗，取得明显的疗效。
采用新西兰兔，耳缘静脉注射马血清，臀肌注射醋酸泼尼松龙，制造激素性股骨头坏死动物模型，模型建立后，动物随机分为2组A组VEGF/TNFRII脂质体治疗组，B组未治疗对照组。骨穿刺针行经皮注射药物至股骨头。A组每只兔子左侧股骨头内分别注入VEGF/TNFRII脂质体，B组以同样方法经骨穿针注射同等量生理盐水作为对照组。于治疗后4周后，采用影像学方法观察股骨头结构变化，病理组织学观察骨组织、骨髓组织变化、骨组织内血管的变化。
普通X线检查显示VEGF/TNFRII治疗组左侧股骨头形态较右侧有显著改善，左侧股骨头关节面基本完整，无明显缺损区域(见图1)。
CT检查显示VEGF/TNFRII组左侧关节面较右侧清晰，骨密度较均一(见图2)。
墨汁灌注血管造影结果显示VEGF/TNFRII组可见血管网形成，潮线下、细小血管清淅可见。骺下血管分布及血管网的形成基本正常(见图3)。未治疗组墨汁灌注血管造影显示股骨头血管显著减少，灌注不全面，血管出现明显栓塞。(见图4)HE染色结果显示VEGF/TNFRII治疗组软骨细胞增生明显，骨小梁边有骨母细胞出现，骨髓腔造血组织增生，空骨陷窝减少，栓塞的血管旁边出现新生的血管，血管内皮细胞增生(见图5，6)。未治疗对照组股骨头坏死模型组HE染色显示骨膜不完整，软骨部分脱落，骨小梁稀疏变细，结构紊乱，有碎片出现，骨小梁骨细胞陷窝空疏，骨细胞核固缩；部分血管栓塞；骨髓腔内造血组织明显减少，脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状(见图7，8)。
上述的动物实验结果显示VEGF/TNFRII脂质体经直接穿刺介入治疗股骨头坏死，股骨头的空缺骨陷窝数明显减少，骨髓腔内脂肪细胞数量减少、体积明显缩小，软骨下区血管数目增多，血管内脂肪栓子消失。VEGF/TNFRII的治疗效果明显。
图1治疗组普通X线检查图片，显示股骨头关节面趋于完整缺损区基本消失；图2治疗组CT检查图片，显示左侧股骨头关节面较右侧完整，骨质结构清晰；图3治疗组墨汁灌注血管造影图片(×10)，显示股骨头血管墨汁染色显示血管增生，部分血管有再通；图4未治疗组墨汁灌注血管造影图片(×10)，显示股骨头血管墨汁染色显示血管闭塞，血管稀少，股骨头浅层血管几乎消失；图5治疗组HE染色结果图片(HE×200)，显示骨小梁中骨细胞数目增多，小梁周边骨母细胞增生，骨髓腔中造血组织明显增生；图6治疗组HE染色结果图片(HE×400)，显示骨小梁内见骨细胞增生，小梁周边出现较多的骨母细胞，空骨陷窝减少，骨小管及骨髓腔内血管增生，其中栓塞的血管旁边出现新生的血管。
图7未治疗组HE染色结果图片(HE×200)，显示骨小梁中出现新生骨细胞，骨髓腔中造血组织增生，但是数量明显少于A组。
图8未治疗组HE染色结果图片(HE×400)，显示血管出现栓塞，空骨陷窝较多。
具体实施例方式
上述血管内皮细胞生长因子(VEGF121)脂质体缓释剂按以下步骤制备(1)VEGF121基因克隆、表达(VEGF121基因序列参见GenBank AF214570)从HL60细胞中提取总RNA，设计上下游引物，RT-PCR扩增VEGF121基因，克隆到pET-24a表达载体中，将pET-24a/VEGF121重组子转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过表达筛选，得到VEGF121工程菌，通过细菌培养，IPTG诱导表达，得到重组VEGF121。
(2)重组VEGF121的复性与纯化将高效表达的菌体用TE缓冲液悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机高压破菌，离心，得到包涵体，包涵体用洗涤液洗涤，再用7mol/L盐酸胍溶解，溶解液透析于10mmol/L HCl中，加入固体尿素至其浓度为8mol/L，调节蛋白质浓度至0.2mg/mL，用5倍体积的复性液等容超滤，复性后蛋白质上弱阴离子交换(DEAE-Sepharose fast flow)柱，NaCl浓度线性梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰，透析去盐、浓缩，上Sephacryl S-100凝胶过滤色谱，收集目的蛋白洗脱峰。
(3)VEGF121脂质体的制备用二次乳化法制备VEGF121脂质体，具体操作如下取35mg VEGF121蛋白，浓缩至30ml，按1∶4取胆固醇200mg，卵磷脂800mg，用100ml二氯四甲烷溶解，将水相和有机相混合乳化，于旋转薄膜蒸发仪(转速80r/min)上减压蒸发至圆底烧瓶内，乳化液变成凝胶状黏稠液体时，再加入100ml PBS溶液继续减压蒸发，使缓冲液100ml中总脂质体含量1％，除去有机溶剂，将制备的混悬液再超声30min，即得试验用的VEGF脂质体缓释剂，取上述制备的液体加入甘露醇5g，10mg人血清白蛋白，分装于青霉素瓶中冷冻干燥。
上述肿瘤坏死因子(TNFRII-FC)受体脂质体缓释剂按以下制备采用上海复旦张江生物有限公司购买的TNFRII-FC蛋白质纯品，用二次乳化法制备TNFRII-FC脂质体，具体操作如下取35mg TNFRII-FC蛋白(冻干粉)，按1∶4取胆固醇200mg，卵磷脂800mg，用100ml二氯四甲烷溶解，将水相和有机相混合乳化，于旋转薄膜蒸发仪(转速80r/min)上减压蒸发至圆底烧瓶内，乳化液变成凝胶状黏稠液体时，再加入100ml PBS溶液继续减压蒸发，使缓冲液100ml中总脂质体含量1％，除去有机溶剂，将制备的混悬液再超声30min，即得试验用的VEGF脂质体缓释剂，取上述制备的液体加入甘露醇5g，10mg人血清白蛋白，分装于青霉素瓶中冷冻干燥。
根据实验动物的大小，取上述制得的血管内皮细胞生长因子(VEGF121)脂质体缓释剂和肿瘤坏死因子受体(TNFRII-FC)脂质体缓释剂，或取两种脂质体冻干粉，VEGF121与TNFRII-FC以重量份7∶10的比例溶于生理盐水，用于注射。也可取上述两种缓释剂以重量份5∶8或8∶12的比例溶于生理盐水，用于注射。
上述血管内皮细胞生长因子(VEGF121)也可用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、或血小板样生长因子(PDGF)替代，同样能起到治疗效果。
上述肿瘤坏死因子(TNFRII-FC)也可用白细胞介素10(IL-10)或转化生长因子(TGF-β)替代，同样能起到治疗效果。
权利要求
1.一种用于治疗股骨头坏死的复合制剂，其特征在于由具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂复合而成。
2.根据权利要求1所述的用于治疗股骨头坏死复合制剂，其特征在于具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂复合的重量份比为5～8∶8～12。
3.根据权利要求1所述的用于治疗股骨头坏死复合制剂，其特征在于具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂和具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂重量份比为7∶10。
4.根据权利要求1、2或3所述的用于治疗股骨头坏死复合制剂，其特征在于所述具有促血管生成的细胞因子脂质体缓释剂中细胞因子的含量为100～200μg/ml，其中脂质体由胆固醇与卵磷脂组成，胆固醇与卵磷酯的比值为1∶4。
5.根据权利要求1、2或3所述的用于治疗股骨头坏死的药物，其特征在于所述具有抗炎作用的细胞因子受体脂质体缓释剂中的细胞因子含量为100～200μg/ml，其中脂质体由胆固醇与卵磷脂组成，胆固醇与卵磷酯的比值为1∶4。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的用于治疗股骨头坏死复合制剂，其特征在于具有促血管生成的细胞因子为血管内皮细胞生长因子(VEGF121)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、或血小板样生长因子(PDGF)。
7.根据权利要求1、2、3或5所述的用于治疗股骨头坏死复合制剂，其特征在于具有抗炎作用的细胞因子为肿瘤坏死因子(TNFR-FC)、白细胞介素10(IL-10)或转化生长因子(TGF-β)。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗股骨头坏死的复合制剂，由具有促进血管生成作用的血管内皮细胞生长因子(VEGF121)脂质体缓释剂和具有抗炎作用的肿瘤坏死因子受体(TNFR－FC)脂质体缓释剂复合而成，其中VEGF121脂质体缓释剂与TNFR－FC脂质体缓释剂复合的重量份比为5～8∶8～12。本发明VEGF/TNFR脂质体缓释剂经直接穿刺介入治疗激素诱导的兔股骨头坏死，股骨头的空缺骨陷窝数明显减少，骨髓腔内脂肪细胞数量减少、体积明显缩小，软骨下区血管数目增多，血管内脂肪栓子消失；显示VEGF/TNFR的治疗效果明显。
文档编号A61K9/127GK1824298SQ20051012073
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者王小宁, 胡志明, 马骊 申请人:南方医科大学