专利名称：一种可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及医学模型技术领域，尤其涉及肿瘤血管形成模型的制备方法，特别是鼻咽癌血管形成模型的制备方法。
背景技术：
新生血管的生成是肿瘤得以生长、发展的必备条件之一。当前，定量分析肿瘤血管生成的方法多采用肿瘤微血管密度(microvascular density，MVD)计数等，主要是针对血管内皮标记的抗体，采用免疫组织化学方法来评价肿瘤的血管生成情况。可见，这是一项有创性的检查，检查的正确性依赖于组织取材是否准确，且无法对同一肿瘤血管生成情况进行动态连续观察。鉴于此，研究者们尝试用影像学的方法如CT、MRI等来推断活体内肿瘤的血管生成，并取得了些有价值的结果，但是，总的说来，影像学技术要么有射线的损伤作用如CT，要么有外加对比剂的干扰作用如MRI，而且，这些仪器都比较昂贵，且必须专门人员操作，所以对于实验室的普及是不现实的。
随着当前分子生物学、细胞生物学的巨大发展，无创伤成像技术(如小动物的光成像)的不断发展和完善及其他们的有机结合，20世纪90年代，“分子成像”应运而生。分子成像对于人们对肿瘤的认识和研究意义重大，因此，美国国立癌症研究所NCI(National CancerInstitute，NCI)将“肿瘤成像”列为1997-1998年度六个“重大科学机遇”之一。
鼻咽癌是居住在台湾、香港、新加坡和我国南方的中国人群中最常见的一种肿瘤。我国南方几省是世界上鼻咽癌的高发区，发病率居世界首位，严重威胁着我国人们的健康。
发明内容
本发明目的是提供一种的可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法。
本发明所述的可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，包括以下步骤第一步用荧光蛋白基因转染鼻咽癌细胞；第二步用胰蛋白酶消化转染鼻咽癌细胞并离心富集，取105～106个活细胞悬液接种在裸鼠前腋皮下或爪垫。
本发明所述的荧光蛋白受激发光激发后，在荧光显微镜下可见明亮的荧光。常用的荧光蛋白有增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)等。本发明最好用增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)。
本发明所述的编码绿色荧光蛋白(EGFP)的基因序列由Clontech公司的质粒pEGFP-N1得到，结构如图1所示。
本发明所述的可视化鼻咽癌模型的制备方法，鼻咽癌细胞是鼻咽癌细胞株5-8F、鼻咽癌细胞株6-10B、鼻咽癌细胞株CNE2其中一种。其中鼻咽癌细胞株5-8F是高成瘤、高转移鼻咽癌细胞株，中山大学引进，鼻咽癌细胞株6-10B是成瘤但不转移的鼻咽癌细胞株，中山大学引进，鼻咽癌细胞株CNE2是从中国医学科学院肿瘤研究所引进。
本发明可视化鼻咽癌模型的制备方法，第一步中，绿色荧光蛋白基因转染鼻咽癌细胞的方法可以是如阳离子脂质体法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法和使用基因枪转染。本发明转染最好是阳离子脂质体转染法。
本发明所述的阳离子脂质体法，是本领域常用的阳离子转染方法，可以参考(Chishima T，Miyagi Y，Wang X，et al.Visualization of the metastatic process by green fluorescentprotein expression.Anticancer Res，1997；17(4A)2377-2384)。本发明所使用的阳离子脂质体是LipofectamineTM2000(Invitrogen life technology)。还可以使用本领域已知的阳离子脂质体。可以根据本领域技术人员已知的方法得到阳离子脂质体优选的使用用量和形式。
本发明所述的阳离子转染法，具体含有以下步骤在微量离心管中准备溶液A、B，其中A液组成为50μl OPTI-MEM和5μl lipofectamine2000，B液组成为50μl OPTI-MEM和3μg的质粒pEGFP-N1。将A、B两液混合后室温放置半小时，然后将混合液滴加在转染细胞表面，放置在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养6小时，弃去转染液，换不含抗生素的1640完全培养液；然后0.25％胰蛋白酶消化，稀释培养，加入G418筛选，亚克隆获得EGFP转染的鼻咽癌细胞。
本发明所述的OPTI-MEM购自Invitrogen life technology公司；lipofectamine2000购自Invitrogen life technology公司；本发明所述的G418为新霉素，购买于sigma公司；RPMI-1640培养基，胰蛋白酶，购自Sigma公司。
本发明所述的可视化鼻咽癌模型的制备方法，第二步中用作模型的脊椎动物是哺乳动物，可以是家兔、大鼠、小鼠等常用实验动物。用作模型的脊椎动物还可以是灵长类动物。本发明所述的脊椎动物最好是裸鼠或SCID鼠。
本发明所述的可视化鼻咽癌模型的制备方法的一个较佳技术方案是采用阳离子脂质体法将质粒pEGFP-N1导入鼻咽癌细胞，接着加G418筛选，获得EGFP转染鼻咽癌细胞；用胰蛋白酶消化转染细胞并离心富集，接种105～106个活细胞于裸鼠前腋皮下或爪垫。为了不影响细胞活性，必须将收集的细胞置于冰上，且整个过程在40分钟内完成。
本发明所述的可视化鼻咽癌模型的制备方法，第二步中，可视化鼻咽癌模型的荧光检测是借助本领域技术人员已知的仪器和方法。整体绿色荧光检测是借助整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS实现的。
本发明所述的荧光检测可以借助整体荧光成像系统适时跟踪观察皮下或爪垫肿瘤的生长过程及肿瘤血管形成的情况。
本发明的优点是1借助整体荧光成像系统观察，可以适时跟踪观察皮下或爪垫肿瘤的生长过程，这对于早期进行肿瘤的治疗研究具有开拓性的意义；2由于本发明可以适时跟踪肿瘤的血管形成，作为初步筛选抑制肿瘤血管生成的药物具有广阔的应用前景，对探讨通过抑制肿瘤血管生成来治疗肿瘤将具有重要指导意义。
图1质粒pEGFP-N1结构2EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B，荧光显微镜采集的图片(放大400倍)。
图3EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种5小时后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图4EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种48小时后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图5EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种4天后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图6EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种7天后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图7EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种23天后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图8EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B裸鼠皮下接种40天后，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图9EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F，荧光显微镜采集的图片(放大400倍)。
图10EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F裸鼠爪垫瘤体血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图11EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F裸鼠皮下瘤体血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图12EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2，荧光显微镜采集的图片(放大400倍)。
图13EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的7天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图14EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的10天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图15EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的14天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图16EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的20天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图17EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的25天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
图18EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下接种后的35天血管图，整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS采集的图片。
具体实施例方式
以下是本发明的具体实施例，但不限于所述实施例。
实施例1可适时跟踪观察鼻咽癌生长模型的制备第一步制备EGFP转染人鼻咽癌细胞。
转染前24小时分别将鼻咽癌细胞6-10B按2×105接种于24孔板中，含15％小牛血清、无抗生素的1640培养基中培养，待细胞生长至约80％融合度时弃培养基，用不含血清的1640液洗涤细胞2次，再加1ml不含血清的1640继续培养，待细胞生长至约90％以上融合度时进行细胞转染。在微量离心管中准备溶液A、B。A液50μl OPTI-MEM+5μl lipofectamine2000；B液50μl OPTI-MEM+3μg质粒pEGFP-N1。将A、B两液混合后室温放置半小时，然后将混合液均匀滴加在转染细胞表面，颠倒混匀，放置37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养6小时，弃去转染液，换不含抗生素的1640完全培养液。
24小时后，将24孔板中的细胞用0.25％胰酶消化后，按1∶5转入6孔板培养，24小时待细胞贴壁后，倒置荧光显微镜观察发绿色荧光的细胞数量，当100倍放大时，每个视野中发绿色荧光的细胞数不少于5个时，进行G418抗性筛选，逐步提高G418浓度500-2000μg/ml，10-15天后，停止用药；待G418抗性克隆长至肉眼可见大小时，挑选表达GFP的阳性克隆于24孔培养板中，继续培养，倒置荧光显微镜观察其是否继续发出绿色荧光，对表达GFP的人鼻咽癌细胞株阳性克隆进行扩大培养，继续倒置荧光显微镜观察荧光，获得非G418依赖的EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2。其倒置荧光显微镜观察结果如图2所示。
第二步EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B皮下接种在小鼠上。
EGFP转染鼻咽癌细胞6-10B生长至90％左右时，0.25％胰酶消化，血球记数板计数细胞数，500rpm离心3分钟浓缩细胞，加适量预冷的无血清1640原液调节细胞数，接种0.08ml细胞悬液于(含105～106个活细胞)5～6周龄的裸鼠前腋皮下。为了不影响细胞活性，必须将收集的细胞置于冰上，且40分钟内完成。
适时跟踪观察裸鼠皮下鼻咽癌生长过程借助整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS适时跟踪观察鼻咽癌细胞裸鼠接种后5小时观察，即可见直径约0.4cm弥散的荧光团，见图3；2天后，弥散的荧光团明显缩小、集中，约0.2cm左右，见图4；4天后，荧光团的荧光呈现明显集中的趋势，大小仍然约0.2cm左右，没有明显变化，见图5；第七天观察，可见GFP肿瘤明显生长、扩大，见图6；第23天观察，可见GFP肿瘤明显生长、扩大，见图7；40天后，处死，见图8。从图3～8可看出，随着时间推移，瘤体的形成、生长、发展过程，可适时跟踪观察。
实施例2一、可视化鼻咽癌血管形成模型的建立第一步制备EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F。
同实施例1，获得非G418依赖的EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F。见图9。
第二步EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F在裸鼠爪垫接种。
EGFP转染鼻咽癌细胞5-8F生长至90％左右时，0.25％胰酶消化，血球记数板计数细胞数，500rpm离心3分钟浓缩细胞，加适量预冷的无血清1640原液调节细胞数，裸鼠后肢爪垫内侧皮下接种0.05ml(含105～106个活细胞)40分钟内完成。
二、可视化鼻咽癌血管形成模型的观察结果。
早期荷瘤裸鼠的生活、活动状态没有明显影响，借助整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS观察，在明亮荧光肿瘤的衬托下，诱生的新生血管清晰可辨，“黑色蜘蛛网”布满瘤体。荧光观察结果见图10、11。
实施例3一、适时跟踪观察鼻咽癌血管形成模型的建立第一步制备EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2。
同实施例1，获得非G418依赖的EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2。见图12。
第二步EGFP转染鼻咽癌细胞CNE2在裸鼠皮下接种。
接种方法同实施例1。
二、可视化鼻咽癌血管形成模型的观察结果。
早期荷瘤裸鼠的生活、活动状态没有明显影响，借助整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS观察，在明亮荧光肿瘤的衬托下，诱生的新生血管清晰可辨，“黑色蜘蛛网”布满瘤体。
借助整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS，对同一肿瘤的血管形成进行长期适时跟踪观察。荧光观察结果第7天，见图13；第10天，见图14；第14天，见图15；第20天，见图16；第25天，见图17；第35天，见图18；从图13-18可以看出，随着时间的延长，血管的数量、密度和总长度呈现增长的趋势。
权利要求
1.一种可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，包括以下步骤首先用绿色荧光蛋白基因转染鼻咽癌细胞；然后用胰蛋白酶消化转染鼻咽癌细胞并离心富集，取105～106个活细胞悬液接种在裸鼠前腋皮下或爪垫，建立可视化鼻咽癌血管形成模型，以适时跟踪肿瘤的生长及肿瘤血管的形成。
2.权利要求1所述的可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，其特征是所用的鼻咽癌细胞是6-10B、CNE2、5-8F其中一种。
3.权利要求1所述的可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，其特征是绿色荧光蛋白转染鼻咽癌细胞方法是阳离子脂质体法。
4.权利要求1、2或3所述的可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，含有以下步骤采用阳离子脂质体法将质粒pEGFP-N1导入鼻咽癌细胞，接着加G418筛选，获得EGFP转染鼻咽癌细胞；用胰蛋白酶消化转染细胞并离心富集，接种105～106个活细胞于裸鼠前腋皮下或爪垫。
全文摘要
本发明为一种可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，涉及医学模型技术领域。本发明可视化鼻咽癌血管形成模型的制备方法，包括以下步骤首先用绿色荧光蛋白基因转染鼻咽癌细胞；然后用胰蛋白酶消化转染鼻咽癌细胞并离心富集，取10
文档编号A61K49/00GK1824330SQ20051012087
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者姚开泰, 丁彦青, 刘腾飞, 任彩萍 申请人:南方医科大学