专利名称：3－烷氧取代－2,5,7－三取代苯并吡喃－4－酮类化合物及其制备方法和包含该类化合 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，更具体涉及3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物、其制备方法及含此类化合物的药物组合物。该类化合物可用于预防和治疗SARS病毒和感冒病毒感染。
背景技术：
本发明以SARS病毒和HCoV-229E抗原型感冒病毒的3CL蛋白酶(3CLPro)为靶标设计的一类3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物及其制备方法。本发明还涉及该类化合物作为SARS病毒和HCoV-229E抗原型感冒病毒抑制剂应用于治疗和/或预防SARS病毒和感冒病毒感染。
冠状病毒属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，是一类球形、有包膜的正链RNA病毒，共有10余种，主要引起人和动物的呼吸道和肠道疾病。过去将冠状病毒分为3个组，I组和II组主要为哺乳动物和人冠状病毒，III组主要为禽类冠状病毒。其宿主范围严格，细胞培养条件较苛刻，人冠状病毒的适宜培养温度为33℃～35℃。
人冠状病毒分别属于OC43和229E两个抗原型，它是引起人类上呼吸道感染的病原，常引起成人的普通感冒，主要发生在冬季和早春。潜伏期为2～5天，病程持续6～7天。主要临床表现包括不适、鼻炎、头痛、咽痛及咳嗽，可有发热、声音嘶哑、胸腹痛等，偶可引起小儿哮喘突然发作以及成人慢性支气管炎加重。国外一些教科书指出，冠状病毒偶可引起严重的下呼吸道感染。各国报道的人群抗体阳性率不同，我国人群以往冠状病毒中和抗体阳性率在30％至60％，前苏联的抗体阳性率则在53％至97％。在美国华盛顿D.C.地区，连续4年的血清流行病学研究表明，冠状病毒占成人上呼吸道感染的10％-24％。在美国密执安州的一次家庭检查中，证明冠状病毒可以感染各个年龄组，0-4岁占29.2％，40岁以上占22％，在15-19岁年龄组发病率最高。冠状病毒HCV-229E是普通感冒病毒的一种，人类约30％的感冒由其引起。
传染性非典型性肺炎(简称“非典“)，又称严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，是由一种新型冠状病毒(SARS-CoV)引起的。这种新发现的病毒不属于上述3组中的任何一组，是一种新型冠状病毒。它可通过飞沫、粪便和尿液等多种途径传播。是传染性很强、病死率高的急性疾病。临床起病急，以发热(＞38℃)为首发症状，可伴有畏寒、头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；严重者出现呼吸加速，气促，或明显呼吸窘迫，进一步发展为呼吸困难甚至衰竭。病程一般为18～23天，重度患者更长，乙肝携带者和高年龄组人群的预后较差。自2002年11月起，SARS在亚洲开始流行，并迅速传播到全世界。传染性非典型肺炎病人中90％左右感染SARS病毒的人能够痊愈，致死率约为10％左右。2003年4月16日，世界卫生组织正式宣布SARS的病原体是一种新的冠状病毒，并正式命名为SARS病毒。SARS病毒为正链的单链RNA病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。
研究发现，SARS和感冒病毒中皆存在的一种称为3CL主蛋白酶的蛋白质，它在病毒的整个生活史中起关键调控作用。只有当病毒表达的聚蛋白被3CL蛋白酶切割生成功能蛋白后，病毒才能完成自身的复制功能(K.Anand，J.Ziebuhr，P.Wadhwani，J.R.Mesters，R.Hilgenfeld，Coronavirus main proteinase(3CLpro)structurebasis for design ofanti-SARS drugs，Science 300(2003)，1763-1767.)。因此，该蛋白酶是一个重要的药物设计靶点，而对该蛋白酶的研究也就成为研发治疗普通感冒和“非典”药物的主攻方向之一。到目前为止，感冒和SARS尚无特异性治疗和预防手段，特别是对SARS冠状病毒感染，尚无特异性抗病毒疗法。
近年来，“计算机辅助药物设计”(Computer-Aided Drug Design，CADD)已成为现代药物研究与开发的一个重要方法和工具。运用计算机辅助药物设计平均而言能缩短新药研究周期0.9年，节省研究与开发费用1.3亿美元。因此，CADD方法已广泛地应用于先导化合物的发现与优化。计算机辅助高通量虚拟已经成为目前常用的一种计算机辅助药物发现方法。其原理是运用超级计算机通过分子对接的方法在多达数百万的小分子化合物库中寻找可以与某一特定疾病靶标蛋白结合的化学结构，为进一步的分子、细胞、动物和临床研究提供高效可靠的小分子先导化合物。
综上所述，以3CL主蛋白酶作为靶标，结合CADD和各种水平的生物活性测试试验，设计并合成的小分子化合物，对开发抗病毒药物具有重要的现实意义。
通过CADD的方法，发明人已经找到了一个化合物，五羟黄酮-3-β-半乳糖苷(英文名为quercetin-3-d-galactoside或Hyperoside，俗名为金丝桃苷)，具有较强的SARS病毒和感冒病毒(229E抗原型)的3CL蛋白酶(3CL Mpro)双效抑制作用。这个天然产物可以从天然植物中，如金丝桃、蔓越橘(cranberry)、黄蜀葵花、鹿蹄草及山楂等，提取得到。本发明人已就该化合物申请专利(专利申请号200510024349.X)，并在此将该专利申请做为本申请的优先权提出。五羟黄酮-3-β-半乳糖苷被包含在式(I)的结构中，对应于本专利化合物IA-2(实施例4，斛皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖)；本申请的化合物为这个天然产物的衍生物，对化合物结构类型等都有广泛的扩展。而且分子结合活性和酶抑制活性也有一定的提高。
本发明所示化合物是通过计算机辅助设计，经药物合成得到，并运用表面等离子共振(BIAcore)实时测量它们与3CLPro的结合常数(KD)，揭示了具有较强的3CL蛋白酶的结合能力，证明了本发明化合物对SARS病毒和HCoV-229E抗原型感冒病毒的3CL蛋白酶的抑制作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供具有抗SARS病毒和HCoV-229E抗原型感冒病毒作用的新型3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物，其结构通式如式(I)所示。
本发明的另一个目的是提供以取代2-羟基苯乙酮为原料合成新型的3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供含3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物的药物组合物及其在抗病毒方面的应用。
本发明的优点在于可有效地抑制SARS病毒和HCoV-229E抗原型感冒病毒的3CL蛋白酶，通过阻断其催化活性，从而阻止病毒完成自身的转录、复制。因此可开发成为新的抗病毒药物。由于目前没有治疗SARS和感冒病毒的特效药，因此含有本发明化合物的药物组合物提供了一条通过抑制这些病毒蛋白酶的途径而达到预防和治疗SARS及感冒等疾病的目的。
本发明提供具有如下通式(I)结构的3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物 其中R1选自含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，或被苯基和芳香杂环并合，或被一个或多个选自卤素，C1-C6直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巯基，C1-C4酰基，芳香基Ar的基团所取代的芳香基Ar或5-7元芳香杂环。
R2选自C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基，C3-C7饱和或不饱和环烷基，芳香基Ar、和5-7元杂环基，以及具有下列结构的糖基
其中，Ar选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基和取代或未取代的联苯基，取代基可以是1-4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基、C1-C4酰基的基团；所述杂环基含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，并可任选地被苯基并合和/或被一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、巯基、C1-C4酰基、Ar的基团所取代。
R3和R4各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基及烷氧基，硝基，卤素，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟基，以及具有下列结构的糖基
R5、R6、R7和R8各自独立地选自氢，羟基，C1-C5的烷氧基及乙酰氧基。
本发明还提供本申请要求保护的化合物及其中间体化合物IV、V、VI、VII的制备方法。
方法一以槲皮黄酮为原料，分别经酚羟基保护，O-烷基化，脱保护制得，合成方法具体如反应式1所示1)将斛皮素与过量二氯二苯甲烷混匀，升温至170-200℃搅拌10-60分钟。冷至室温，所得固体柱层析分离得产物，从而得到2-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-3，5，7-三羟基-苯并吡喃-4-酮(化合物IV)；2)将IV、无机物与过量的R2X投入到适量得DMF中，惰性气体保护下，室温搅拌10-40小时，加水，有机溶剂萃取，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得产物，从而得到2-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-5，7-二羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮(化合物V)。
其中R2的定义与上面所述的相同，X选自氯或溴；3)将化合物V投入无水乙醇中，室温搅拌下，Pd/C催化氢化搅拌3-24小时，过滤，减压蒸除大部分溶剂，残余物柱层析或重结晶分离得产物，从而得到2-(3，4-二羟基苯基)-5，7-二羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮(IA)。
反应式1 3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物IA制备方法二以取代2-羟基苯乙酮为原料，分别经酚羟基保护，AFO反应，O-烷基化，脱保护制得，合成方法具体如反应式2所示1)选择性酚羟基苄基保护得到的邻羟基苯乙酮，与适当的取代醛在AFO(Algar-Flynn-Oyamada)反应条件(J.Med.Chem.2000，43，3752-3760)下化合得到目标物，从而得到2，5-二取代-7-苄氧基-3-羟基-苯并吡喃-4-酮(化合物VI)。
2)将步骤1)中得到的化合物与过量的R2X投入到适量DMF中，回流搅拌10-40小时，加水，有机溶剂萃取，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析或重结晶分离得产物，从而得到化合物2，5-二取代-7-苄氧基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮；其中R2的定义与上面所述的相同，X选自氯或溴。
3)以上面方法一的3)中类似的方法得到2，5-二取代-7-羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮(IB)。
反应式2 3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物IB制备其中R1，R2和R3的定义如上所述。
在两种方法的步骤(2)中所用的无机物为Na2CO3、K2CO3、NaHCO3以及无机碱，吡啶、三乙胺、二乙胺；惰性气体为氮气或氩气；萃取用有机溶剂为乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、乙醚。
在两种方法的步骤(3)中所用有机溶剂为乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙醇、异丙醇；反应温度在20-60℃；催化氢化用钯/碳催化剂，其中钯含量为5％～30％，本发明式(I)化合物的一个优选实施方案是如下3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物其中，R1为基团(II)
R2选自C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基，C3-C7饱和或不饱和环烷基，芳香基Ar、和5-7元杂环基，以及具有下列结构的糖基 R3和R4选自羟基；R5、R6、R7和R8各自独立地选自氢，羟基，C1-C5的烷氧基及乙酰氧基。
本发明式(I)化合物的另一个优选实施方案是如下3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物其中，R1为基团(II) R2的定义如前所述；R3选自氢，R4选自羟基。
本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物
其中，R1为结构基团(III) R2的定义如前所述；R3选自氢，R4选自羟基。
本发明式(I)化合物的第四个优选实施方案是如下3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物其中，R1为基团(III) R2的定义如前所述；R3和R4选自羟基。
本发明的另一个方面提供可用于预防和/或治疗病毒感染疾病的药物组合物，所述药物组合物含有式(I)所示3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。本发明的药物组合物可以用于预防和/或治疗病毒感染疾病。
本发明所提供的药用组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。该药用组合物也可以包含气味剂、香味剂等，其理想的比例是式(I)化合物作为活性成分占总重量比65％～99.5％，其余部分为占总重量比0.5-40％，或更好为1-20％，或最好为1-10％的药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液等。另外，在制剂配方的单位剂量中优选包含1mg-5000mg有效化合物。
口服制剂可以由本申请要求保护的化合物与维生素C及口服制剂中常用的药物载体和赋形剂制成。其中药物载体和赋形剂包括乳糖；淀粉及其衍生物类如玉米淀粉、羧甲基淀粉等；纤维素衍生物如甲基和乙基纤维素；明胶；无机类化合物如轻质氧化镁、滑石粉等；油如植物油等；包含剂如β-环糊精；以及二元醇类如聚乙二醇。口服制剂可做成片剂、胶囊、乳剂、溶液等，也可应用于固体分散片、脂质体制剂、靶向制剂和控释制剂等。在片剂中，可将含有有效量本专利化合物与含有酒石酸或拘橡酸混合组成的崩解剂一起制成泡腾片，当遇水时产生二氧化碳气体使片剂迅速崩解。
注射制剂的典型形式为粉针剂、混悬型注射剂等，配制注射剂所采用的药物可接受的稀释剂可以采用等渗盐水、5％葡萄糖水溶液、注射用水、茶油、大豆油、麻油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、聚氧乙烯蓖麻油；吐温80、卵磷脂、脱氧胆酸钠、蛋黄磷脂；醋酸、醋酸钠、乳酸、柠檬酸、酒石酸及钠盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠；明胶、羧甲基纤维素钠、果胶、山梨醇溶液、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯及乙酯、三氯叔丁醇；利多卡因；脑磷脂、大豆磷脂等。
如上所述的结构式(I)的化合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最佳优选为口服。最佳优选一次性服用的日剂量为0.02-200mg/kg体重，或分次服用的剂量为0.01-100mg/kg体重。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
式(I)化合物通过阻断3CL蛋白酶的催化活性，从而阻止病毒完成自身的复制。因而该类化合物可应用于治疗病毒感染疾病的药物。
具体实施例方式
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。
实施例12-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-3，5，7-三羟基-苯并吡喃-4-酮(化合物IV)的制备将5克斛皮素与10.5克二氯二苯甲烷加入到50毫升圆底烧瓶中，升温至180℃搅拌10分钟。冷至室温，所得固体柱层析分离(洗脱剂CH2Cl2/EtOAc＝85∶15)，得黄色固体产物IV 2.7克，收率39.1％。Mp239-240℃(lit.222-224℃)。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ6.22(1H，d)，6.50(1H，d)，7.26(1H，d)，7.44-7.60(10H，m)，7.80-7.83(2H，m)。
实施例22-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-3-O-β-D-四乙酰基吡喃葡萄糖-5，7-二羟基-苯并吡喃-4-酮(化合物V的一种)将0.3克IV，0.13克碳酸钾和0.4克四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖投入到50毫升圆底烧瓶中，氩气保护下，0℃搅拌2小时，转至室温，搅拌12小时，加适量水，乙酸乙脂萃取，干燥，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离(洗脱剂石油醚/EtOAc＝4∶1)得黄色固体产物0.16克，收率31.2％。MS-ESI 797[M+H]+。
实施例3斛皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(化合物IA的一种(IA-1))将0.16克V-1与30毫克Pd/C(30％)投入到10毫升无水乙醇中，室温搅拌下氢解反应24小时。过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离(洗脱剂石油醚/EtOAc＝2∶1)得斛皮素-3-O-β-D-四乙酰基吡喃葡萄糖62毫克。
将上述产物与8毫克甲醇钠投入到10无水甲醇中，室温搅拌1小时，加适量阳离子交换树脂中和(Dowex 50X4-400)，过滤，减压蒸除溶剂，所得固体用少量二氯甲烷洗得黄色固体22毫克，收率23.7％(两步总收率)。Mp 172-174℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ3.1-3.8(7H，m)，5.49(1H，d)，6.22(1H，d)，6.43(1H，d)，6.87(1H，d)，7.61(2H，m)。MS-ESI 465[M+H]+，HRMS(ESI)m/z ca1cd C21H21O12[M+H]+465.1033，found 465.1067。
实施例4斛皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖(化合物IA的一种(IA-2))将四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖替换成四乙酰-α-D-吡喃半乳糖，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-3，得橙黄色固体75毫克，Mp187-190℃，收率45.7％(后两步总收率)。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ3.20-3.62(7H，m)，5.37(1H，d)，6.19(1H，d)，6.40(1H，d)，6.82(1H，d)，7.51(1H，d)，7.66(1H，d)。MS-ESI 465[M+H]+，HRMS(ESI)m/z calcd C21H21O12[M+H]+465.1053，found 465.1067。
实施例5斛皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖(化合物IA的一种(IA-3))将四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖替换成四乙酰-α-D-吡喃阿拉伯糖，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-3，得黄色固体37毫克，Mp 41-44℃，收率40.7％(后两步总收率)。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ3.20-3.80(6H，m)，5.30(1H，d)，6.23(1H，d)，6.44(1H，d)，6.87(1H，d)，7.66(1H，d)，7.69(1H，d)。MS-ESI 435[M+H]+，HRMS(ESI)m/z calcd C20H19O11[M+H]+435.0927，found 435.0909。
实施例6斛皮素-3-O-β-L-吡喃岩藻糖(化合物IA的一种(IA-4))
将四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖替换成四乙酰-α-D-吡喃岩藻糖，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-3，得黄色固体63毫克，Mp 172-174℃，收率38.7％(后两步总收率)。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.02(3H，d)，3.30-3.60(5H，m)，5.36(1H，d)，6.23(1H，d)，6.44(1H，d)，6.86(1H，d)，7.56(1H，d)，7.71(1H，d)。MS-ESI 449[M+H]+，HRMS(ESI)m/z calcd C21H21O11[M+H]+449.1084，found 449.1087。
实施例73’，4’，7-三苄氧基-黄酮醇(化合物VI的一种)将1.21克4-苄氧基-2-羟基苯乙酮，1.59克3，4-二苄氧基苯甲醛投入到20毫升二氧六环/乙醇混合溶液中(3∶2)，冰浴冷却搅拌下，滴加40％氢氧化钾4毫升，完毕后转至室温搅拌66小时。125毫升二氯甲烷，水洗三次(3×40毫升)，干燥，过滤浓缩得固体直接投于下步反应。
将上述固体，5.4％氢氧化钠16毫升，二氧六环17毫升和无水乙醇47毫升混合，冰浴冷却搅拌下，滴加30％双氧水2.1毫升，完毕后保持0℃搅拌2小时，转为室温搅拌12小时。32毫升2M盐酸酸化，抽率，水洗，乙醇洗得黄色固体2.3克。收率42.7％(两步总收率)。
1H-NMR(400Hz，CDCl3)δ5.17(2H，s)，5.25(4H，s)，7.06(3H，m)，7.25-7.53(15H，m)，7.78(1H，d)，7.90(1H，s)，8.13(1H，d)。
实施例83-O-环己基-3’，4’，7-三苄氧基-黄酮醇(化合物VII的一种)
将VI-1 100毫克，溴代环己烷150毫克和碳酸钾50毫克投入到5毫升DMF中，氩气保护下，加热至100℃搅拌24小时，冷至室温，加入适量得水，乙酸乙脂萃取，干燥，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离(洗脱剂石油醚/EtOAc＝8∶1)得黄色固体90毫克。收率75.0％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.06-1.40(6H，m)，1.60(2H，m)，1.80(2H，m)，4.24(1H，m)，5.17(2H，s)，5.23(2H，s)，5.26(2H，s)，6.92(1H，d)，7.05(2H，d)，7.30-7.50(15H，m)，7.70(1H，d)，7.84(1H，d)，8.16(1H，d)。
实施例93-O-环己基-3’，4’，7-三羟基-黄酮醇(化合物IB的一种(IB-1))将80毫克VII-1，20毫克Pd/C(10％)投入到20毫升无水乙醇中，室温搅拌下氢解24小时，过滤，浓缩得到的残余物柱层析分离(洗脱剂石油醚/EtOAc＝2∶1)得黄色固体17毫克。Mp 98-100℃，收率36.2％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.06-1.40(6H，m)，1.60(2H，m)，1.80(2H，m)，4.24(1H，m)，6.85-6.92(3H，m)，7.47(1H，d)，7.57(1H，d)，7.90(1H，d)。MS-EI 368(M+)，286(100％)。HRMS(EI)m/z calcdC21H20O6(M+)368.1258，found 368.1260。
实施例103-[2-(2，5-二甲氧基苯基)-2-氧代-乙氧基]-3’，5’，7-三羟基-黄酮醇(化合物IB的一种(IB-2))将溴代环己烷替换成α-溴代-2，5-二甲氧基苯乙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例8-9，得黄色固体25毫克。Mp 138-140℃，收率25.0％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ3.72(3H，s)，3.79(3H，s)，5.33(2H，s)，6.84-6.91(4H，m)，7.16(2H，m)，7.26(1H，d)，7.59(2H，m)，7.88(1H，d)。MS-ESI 465[M+H]+。HRMS(ESI)m/z calcd C25H21O9[M+H]+465.1186，found 465.1164。
实施例113-O-环庚基-3’，4’，7-三羟基-黄酮醇(化合物IB的一种(IB-3))将溴代环己烷替换成溴代环庚烷，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例8-9，得黄色固体110毫克。Mp 68-70℃，收率75.0％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.20-1.60(8H，m)，1.87(4H，m)，4.45(1H，m)，6.85-6.91(3H，m)，7.45(1H，d)，7.57(1H，s)，7.89(1H，d)。MS-EI 382(M+)，286(100％)。HRMS(EI)m/z calcd C22H22O6(M+)382.1425，found 382.1416。
实施例123-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-2-基甲氧基)-3’，5’，7-三羟基-黄酮醇(化合物IB的一种(IB-4))将溴代环己烷替换成2-溴甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例8-9，得黄色固体90毫克。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ2.38(3H，s)，2.45(3H，s)，4.67(2H，s)，5.21(2H，s)，7.25-7.46(7H，m)，7.55(1H，s)，7.84(1H，d)，7.94(1H，s)，8.47(1H，d)，8.61(1H，s)。MS-ESI 460[M+H]+。
实施例133-(2-氧代-四氢呋喃-3-基氧基)-3’，5’，7-三羟基-黄酮醇(化合物IB的一种(IB-5))将溴代环己烷替换成3-溴代-二氢呋喃-2-酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例8-9，得黄色固体29毫克。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ4.69(2H，s)，5.20(2H，s)，7.31-7.46(4H，m)，7.55(2H，d)，7.73(1H，d)，7.84(1H，d)，7.94(1H，s)，8.06(1H，d)，8.48(1H，d)，8.62(1H，s)。MS-ESI 557[M+H]+。
实施例142-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-6-基)-3-羟基-7-苄氧基-苯并吡喃-4-酮(化合物VI的一种(VI-2))将3，4-二苄氧基苯甲醛替换成2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-6-甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例7，得黄色固体0.6克。收率15.5％(两步总收率)。MS-ESI 387[M+H]+。
实施例152-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-6-基)-3-O-环己基-7-苄氧基-苯并吡喃-4-酮(化合物VII的一种(VII-2))将VI-1替换成VI-2，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例8，得黄色固体200毫克。收率83.3％。MS-ESI 499[M+H]+。
实施例16
2-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-6-基)-3-O-环己基-7-羟基-苯并吡喃-4-酮(化合物IB的一种(IB-6))将100毫克VII-2，20毫克Pd/C(10％)投入到20毫升无水乙醇中，室温搅拌下氢解24小时，过滤，浓缩得到的残余物柱层析分离(洗脱剂石油醚/EtOAc＝2∶1)得黄色固体55毫克。Mp137-139℃，收率69.6％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.06-1.40(6H，m)，1.60(2H，m)，1.80(2H，m)，4.10(1H，m)，4.34(4H，t)，6.94(2H，m)，7.04(1H，d)，7.65(2H，m)，7.92(1H，d)。MS-EI 394(M+)，312(100％)。HRMS(EI)m/z calcd C23H22O6(M+)394.1431，found 394.1416。
实施例174-[2-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧六环-6-基)-7-羟基-苯并吡喃-4-酮-3-氧基]-丁酸甲酯(化合物IB的一种(IB-7))将溴代环己烷替换成γ-丁酸甲酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例15-16，得黄色色固体320毫克。Mp168-170℃，收率89.6％。
1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ1.86(2H，m)，2.42(2H，t)，3.56(3H，s)，3.97(2H，t)，4.34(4H，m)，6.92(2H，m)，7.03(1H，d)，7.55(2H，m)，7.91(1H，d)。MS-EI 412(M+)，101(100％)。HRMS(EI)m/z calcdC22H20O8(M+)412.1138，found 412.1159。
实施例18本发明部分化合物与SARS 3CL及HCV 3CL蛋白酶结合活性测定
SARS和HCV 3CL蛋白酶与3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物结合活性的筛选和动力学常数的测定基于SPR(表面等离子共振)原理，使用的仪器是Biacore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)。以下以SARS 3CL蛋白酶为例，HCV 3CL蛋白酶方法类似。
(1)SARS 3CL蛋白酶质粒(pQE30-SARS_3CLpro)的构建根据SARS 3GLprocDNA序列设计引物，包含Hind III和BamHI酶切位点，PCR扩增SARS 3CLpro片段，将酶切后的PCR产物和表达载体pQE30连接后鉴定正确，转化入大肠杆菌M15进行表达。
(2)SARS 3CL蛋白酶的表达及纯化将表达菌株M15(含pQE30-SARS_3CLpro质粒)接种到含有100μg/mL氨卞青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养8小时后转接至相同的新鲜培养基LB中，继续培养3小时至对数生长期，然后将温度降为22℃，加0.5mM IPTG继续诱导5小时。菌体经超声破碎后，4℃，14,000rmp离心，得到的上清液通过Ni柱亲和层析得高纯度的SARS 3Cl蛋白酶。
(3)SARS 3CL蛋白酶的偶联彻底清洗Biacore 3000机器后，用HBS-EP缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA and 0.005％(v/v)surfactant P20，pH 7.4)平衡机器至基线平稳。0.2M N-ethyl-N’-dimethylaminopropyl carbodiimide(N-乙基-N’-二甲基氨丙基碳二亚胺)和50mM N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)1∶1混和，以5μL/min进样7分钟以活化芯片表面。SARS 3CL蛋白酶用10mM乙酸钠，pH4.3，稀释至终浓度为25μg/ml以5μL/min流速进样，至偶联量为4000RU左右。最后，用1M盐酸乙醇胺，pH 8.5以5μL/min流速进样7分钟，封闭芯片表面，最终SARS3CL蛋白酶的偶联量为4000RU左右。
(4)化合物筛选化合物用100％DMSO溶解，母液浓度为10mM。用HBS-EP缓冲液稀释化合物，至终浓度为1μM和10μM，DMSO的终浓度为0.1％。根据待筛化合物与芯片上SARS 3CL蛋白酶的结合的RU(ResponseUnit，共振单位)值，判断化合物是否具有结合活性。有结合活性的化合物可进行详细的动力学实验。
(5)动力学测定SARS 3CL蛋白酶偶联完成后，平衡过夜至基线平稳，然后进行动力学测定。工作缓冲液用HBS-EP(含0.1％DMSO)，将3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物配成不同的浓度梯度，以30μl/min进样1min，解离2min，然后用相同缓冲液稳定2min。得到化合物与SARS3CL蛋白酶相互作用的传感图，再用Biacore分析软件中的1∶1(Langmuir)结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切的动力学和热力学常数。
(6)试验结果表1为3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物与SARS和HCV 3CL蛋白酶结合的实验测试结果。从表1可以看出，本发明化合物对SARS和HCV 3CL蛋白酶均有较强的结合活性。
表1.3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物与SARS和HCV 3CL蛋白酶结合的数据
实施例19本发明部分化合物抑制SARS病毒3CL蛋白酶的IC50测定(1)试验材料荧光底物Dabcyl-KNSTLQSGLRKE-Edans由上海生工生物技术服务有限公司合成。SARS冠状病毒3CL蛋白酶为本实验室利用细胞分子生物学方法，按照文献方法(Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，Tao Sun etc，Molecular cloning，expression，purification，and massspectrometric characterization of 3C-like Proteinase of SARS coronavirus，Protein Expression and Purification，2003，302-308)用pQE30载体(Qiagen)构建表达质粒pQE30-3CL，转化至大肠杆菌M15(Qiagen)中进行表达，并通过NTA-Ni柱层析的方法纯化获得。
(2)试验方法有结合活性的化合物可用荧光共振能量转移(FRET)的方法进行复筛和IC50值测定。实验中使用的底物为EDANS和Dabcyl标记的带有SARS 3CLpro特异性酶切位点的多肽，序列为EDANS-Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-(Dabcyl)-Met。用GENios酶标仪(TECAN)测定340nm激发光下不同反应体系在发射波长为488nm时荧光强度值的变化，反应连续测定1小时。抑制剂IC50值测定方法同上，即选用不同抑制剂的浓度，反应体系总体积为200μL，反应物浓度分别为3CL蛋白酶的终浓度为1μM，荧光底物的终浓度为10μM，化合物的终浓度分别为200μM～0.01μM。测定化合物IC50值时设定空白对照，即不加化合物，但加相同浓度DMSO的3CL蛋白酶样品以及单独荧光底物溶液的样品。每个样品设复孔，测定值取平均。根据不同浓度化合物存在条件下，SARS病毒3CL蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加待测化合物但加0.5％DMSO的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率。即含0.5％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制率为100％减去不同浓度抑制剂下酶的相对活性乘以100％。根据Logistic公式用origin软件进行非线性拟合计算测定化合物IC50值。公式A(I)/A0=1-11+(I/IC50)p]]>上述公式中，A0指加0.5％DMSO时的酶活性，A(I)指不同待测化合物浓度下的酶活性，I指待测化合物的浓度，p指μ因子。
(3)试验结果表2为3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物抑制SARS病毒3CL蛋白酶的IC50测定结果，进一步证明本发明化合物对SARS3CL蛋白酶具有较强的抑制活性。
表2.3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物抑制SARS病毒3CL蛋白酶的IC50测定结果。
实施例20包含本专利化合物的口服片剂的制备通法专利化合物125克维生素C 100克微粉硅胶 40克预胶化淀粉10克硬脂酸镁 适量将本专利化合物与维生素C、微粉硅胶等附加剂混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为黏合剂，湿法制粒，真空干燥。加入适量硬脂酸镁混合，压制成片剂500片，每片含专利化合物有效成分0.25克。
实施例21包含本专利化合物的口服液的制备通法专利化合物25克维生素C 50克蔗糖 100克羧甲基纤维素钠5克吐温 适量蒸馏水适量适量与上述附加剂加热混合均匀，冷却后再与维生素C及本专利化合物充分混合，配成1000毫升口服液。每10ml含专利化合物有效成分0.25克。
实施例22包含本专利化合物的胶囊的制备通法专利化合物125克维生素C 50克低取代羟丙基纤维素10克微粉硅胶 40克微晶纤维素适量70％乙醇 适量硬脂酸镁 适量将本专利化合物与维生素C、微粉硅胶及低取代羟丙基纤维素等附加剂混合均匀，用70％乙醇做湿润剂，湿法制粒，真空干燥。加入适量硬脂酸镁混合，装入1000枚硬胶囊，每枚硬胶囊含专利化合物有效成分0.125克。
实施例23包含本专利化合物的针剂的制备通法专利化合物300克45％乙醇 1350ml聚氧乙烯蓖麻油1500克将本专利化合物与45％乙醇及聚氧乙烯蓖麻油混合均匀，冷藏、过滤，灌装成1000小瓶，每小瓶含专利化合物有效成分0.3克。使用前用生理盐水250ml稀释，静脉滴注。
实施例24包含本专利化合物的泡腾片的制备通法酸颗粒部分专利化合物100克柠檬酸450克乳糖 50克碱颗粒部分NaHCO3390克乳糖 40克阿斯巴甜 10克桔味香精 4克将酸颗粒部分和碱颗粒部分分别混合制粒后，再将这两个部分充分混合，压制成250粒。每粒约重4克，含专利化合物有效成分0.25克。
产业上利用的可能性本发明的3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点，且本发明的化合物毒性很低。
本发明的3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物在计算机虚拟筛选以及在两种病毒3CL蛋白酶结合试验和酶抑制试验中均显示了阳性结果。应证了其病毒的作用机制。因此，本发明的化合物可用于制备抗病毒的药物。
权利要求
1.3-烷氧取代-2，5，7-三取代苯并吡喃-4-酮类化合物，如下式(I)表示， 其中R1选自含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，可被苯基和芳香杂环并合，或被一个或多个选自卤素，C1-C6直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巯基，C1-C4酰基，芳香基Ar的基团所取代的芳香基Ar或5-7元芳香杂环；R2选自C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基，C3-C7饱和或不饱和环烷基，芳香基Ar、和5-7元杂环基，以及具有下列结构的糖基 芳香基Ar选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基和取代或未取代的联苯基，取代基可以是1-4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基、C1-C4酰基的基团；所述杂环基含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，并可任选地被苯基并合和/或被一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、巯基、C1-C4酰基、芳香基Ar的基团所取代；R3和R4各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基及烷氧基，硝基，卤素，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，羟基，以及具有下列结构的糖基 R5、R6、R7和R8各自独立地选自氢，羟基，C1-C5的烷氧基及乙酰氧基。
2.按照权利要求1中所述化合物，其中R1为基团(II) R2的定义与权利要求1中的相同；R3和R4为羟基。
3.按照权利要求1中所述化合物，其中R1为结构基团(III) R2的定义与权利要求1中的相同；R3为氢，R4为羟基。
4.按照权利要求1中所述化合物，其中R1为基团(III) R2的定义与权利要求1中的相同；R3和R4为羟基。
5.按照权利要求1中式(I)化合物，其中R1为基团(II) R2的定义与权利要求1中的相同；R3为氢，R4为羟基。
6.一种制备如权利要求2所述化合物的方法，包括以下步骤1)将斛皮素与过量二氯二苯甲烷混匀，升温至170-200℃搅拌10-60分钟。冷却至室温，所得产物经固体柱层析分离从而得到2-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-3，5，7-三羟基-苯并吡喃-4-酮；2)将步骤1)中得到的化合物和无机物与过量的R2X投入到适量的DMF中，惰性气体保护下，室温搅拌10-40小时，加水，有机溶剂萃取，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析分离，从而得到化合物2-(2，2-二苯基-苯并[1，3]二氧五环-5-基)-5，7-二羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮；其中R2的定义同权利要求1中的相同，X选自氯或溴；3)将步骤2)中得到的化合物投入有机溶剂中，室温搅拌下，Pd/C催化氢化搅拌3-24小时，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析分离，从而得到化合物2-(3，4-二羟基苯基)-5，7-二羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮。
7.一种制备如权利要求3所述化合物的方法，包括以下步骤1)选择性酚羟基苄基保护得到的邻羟基苯乙酮，与适当的取代醛在AFO反应条件下化合得到目标物，从而得到化合物2，5-二取代-7-苄氧基-3-羟基-苯并吡喃-4-酮；2)将步骤1)中得到的化合物与过量的R2X投入到适量DMF中，回流搅拌10-40小时，加水，有机溶剂萃取，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析或重结晶分离得产物，从而得到化合物2，5-二取代-7-苄氧基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮；其中R2的定义同权利要求1中的相同，X选自氯或溴；3)以权利要求6中第3步类似的方法制备化合物2，5-二取代-7-羟基-3-烷氧基-苯并吡喃-4-酮。
8.如权利要求6或7所述的制备方法，其中步骤(2)中所用的无机物为Na2CO3、K2CO3、NaHCO3以及无机碱，吡啶、三乙胺、二乙胺；惰性气体为氮气或氩气；萃取用有机溶剂为乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、乙醚。
9.如权利要求6或7所述的制备方法，其中步骤(3)中所用有机溶剂为乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙醇、异丙醇；反应温度在20-60℃；催化氢化用钯/碳催化剂，其中钯含量为5％～30％。
10.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1所述化合物和赋形剂、载体或稀释剂。
11.按照权利要求10所述药物组合物，其中，制剂配方的单位剂量中包含1mg-5000mg权利要求1所述的化合物。
12.按照权利要求10所述药物组合物，其中，给药途径包含口服、鼻腔吸入、透皮吸收、肺部给药以及非肠道的注射给药。
13.按照权利要求10所述药物组合物，其中，日剂量为0.02-200mg/kg体重，或分次服用的剂量为0.01-100mg/kg体重。
14.权利要求1的化合物在制备用于治疗或预防由病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。
15.按照权利要求10所述包含权利要求1所述化合物的药物组合物，用于预防和治疗病毒感染及其相关疾病。
全文摘要
本发明涉及新型的3－烷氧取代－2，5，7－三取代苯并吡喃－4－酮类化合物其制备方法及其该类化合物在制备防治冠状病毒引起的SARS及感冒疾病的药物中的应用，其结构通式如式(I)所示。此类化合物可作为SARS病毒和HCoV－229E抗原型感冒病毒的3CL蛋白酶的双效抑制剂，从而阻止SARS病毒和感冒病毒的进一步复制。本发明还涉及以该类化合物为活性物质的药物制剂。目前没有治疗SARS和感冒病毒的特效药，因此含有本发明化合物的药物组合物通过抑制病毒蛋白酶的途径而达到预防和治疗SARS及感冒等疾病的目的。
文档编号A61P31/12GK1990479SQ20051013295
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者朱维良, 李剑, 潘春木, 陈莉莉, 陈刚, 罗成, 左之利, 柳红, 罗小民, 陈凯先, 沈旭, 蒋华良 申请人:中国科学院上海药物研究所, 新加坡理工学院