专利名称：促进诱导血管分化的含肝细胞生长因子的制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的制剂，包括作为活性成分的肝细胞生长因子。
背景技术：
肝细胞生长因子(下文中为HGF)最初是作为成熟肝细胞的生长因子鉴定出来的，其基因(cDNA)已于1989年被克隆出来(参见非专利文献1和2)。
迄今为止，HGF对多种细胞以及肝细胞发挥诸多生物学活性，例如细胞增殖，促进细胞迁移，形态发生诱导，细胞死亡抑制等(参见非专利文献3-6)。
HGF的生物学活性通过其受体，即c-Met酪氨酸激酶进行表达。HGF具有多种生物学活性，并对遭受多种损伤的不同组织具有修复和保护的功能。
血管新生促进活性是HGF对组织进行再生和保护的功能之一。HGF不仅能够刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，还在体内表现出显著的血管新生诱导活性(参见非专利文献7-10)。
然而，以上所涉及的文献中没有任意一篇对HGF促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞有所描述。
JP-A-89869/1996[专利文献2]JP-A-172207/1994[非专利文献1]Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，1984，vol.122，p.1450-1459[非专利文献2]Nature，1989，vol.342，p.440-443[非专利文献3]The Journal of Cell Biology，1985，vol.129，p.1177-1185[非专利文献4]The Journal of Biochemistry，1986，vol.119，p.591-600[非专利文献5]International Review of Cytology，1999，vol.186，p.225-260[非专利文献6]Kidney International，2001，vol.59，p.2023-2038[非专利文献7]The Journal of Cell Biology，1992，vol.119，p.629-641[非专利文献8]Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，1993，vol.90，p.1937-1941[非专利文献9]Circulation，1998，vol.97，p.381-390[非专利文献10]Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384发明内容近来，血管发生的概念发生了较大的变化。确切地说，认为成年人中的血管发生只能从现有的血管内皮细胞的增殖和迁移形成，然而，目前认为还存在着这样一种可能性，即当涉及到血流中的内皮祖细胞时，认为是仅发生在胚胎阶段的血管发生型的血管再生有可能作为血管发生的结果而发生。基于这样的假设，在今天看来，通过应用内皮祖细胞或内皮细胞发展治疗血管再生的方法是可以期待的。
因为成年人的内皮祖细胞来源于骨髓，因此本发明的目的就在于提供促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的制剂。
本发明新近发现(1)通过HGF给药在外周血中内皮祖细胞的表达有所增加，(2)这样的增加来源于骨髓细胞，和(3)HGF促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞。在这些发现的基础上，本发明人进行了进一步的研究并完成了本发明。
首先，本发明涉及促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的制剂，其中包含HGF。
其次，本发明涉及通过向哺乳动物施用HGF促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的方法，并且还涉及HGF在生产用于促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的药物中的应用。
再者，本发明涉及与含有HGF的诱导分化制剂一起培养骨髓细胞，以及将从骨髓细胞分化而来的内皮祖细胞或内皮细胞移植入哺乳动物的方法，或者是对骨髓细胞进行培养，再将增殖的骨髓细胞移植入哺乳动物，同时施用含有HGF的促进诱导分化制剂，以及诱导移植的骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的方法。
此外，本发明还涉及用于促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的基因药物，包括引入HGF基因和HGF。
本发明的促进诱导血管分化的制剂能够加速诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞。内皮祖细胞分化为内皮细胞，而内皮细胞则发挥源于血管发生型的血管新生或血管再生过程的作用。因为本发明的制剂能够促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞，因此其可用于治疗需要血管新生或血管再生的疾病。
此外，通过在存在本发明中促进诱导分化制剂的条件下培养骨髓细胞，可以产生从骨髓细胞分化而来的内皮祖细胞或内皮细胞。这样得到的内皮祖细胞或内皮细胞可以在再生医药领域中作为血管新生或血管再生的移植细胞。
图1所示为肺毛细血管受损的受体小鼠外周血中来自骨髓细胞部分的FlK-1抗体的表达分布。
图2所示为肺毛细血管受损的受体小鼠肺部的组织学发现。
图3所示为肺毛细血管受损的受体小鼠肺毛细血管的免疫荧光染色。
优选实施方式本发明中使用的HGF是公知的物质。采用多种方法制备的HGF可用于本发明中，只要其纯度足以被用作医用制剂。就HGF的生产过程而言，例如，HGF可通过培养产生HGF的原始培养细胞或已建立的细胞系的细胞，从培养上清液等中分离HGF并对所分离的HGF进行纯化得到。或者，也可以通过向合适的载体中整合编码HGF的基因，将所述载体插入适当的宿主细胞进行其转化并从所转化细胞的培养上清液中收集目的重组HGF的遗传工程技术获得重组HGF(参见，例如JP-A-111382/1993；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967)。
对上述宿主细胞并没有特殊的限制，常规用于遗传工程技术中的多种宿主细胞，例如大肠杆菌，酵母，动物细胞等都可以使用。所得到的HGF，只要其具有与天然HGF基本相同的作用可以在其氨基酸序列中包含一个或多个(例如几个)氨基酸的替换，缺失，添加和/或插入。类似地，HGF可以包含糖链的替换，缺失和/或添加。在本文中，在氨基酸序列中的“一个或多个氨基酸的缺失，替换，添加或插入”是指某一数量的天然存在(一个至若干个氨基酸)的氨基酸可以通过诸如遗传工程技术，位点特异性突变诱导等公知的技术方法缺失，替换，添加和/或插入所述氨基酸序列中。
同样，“包含糖链的替换，缺失和/或添加的HGF”是指，例如，(1)通过用酶对天然糖基化的HGF进行处理从而去除糖链获得的糖基化缺失的HGF，(2)其氨基酸序列在糖基化位点发生了突变从而抑制糖基化的HGF，或(3)其氨基酸序列以在不同于天然糖基化位点的位点发生糖基化的方式进行突变的HGF。
此外，HGF还包括与HGF的氨基酸序列具有至少60％或更高同源性，优选80％或更高同源性，更优选90％或更高同源性，以及更优选95％或更高同源性的蛋白质，并且具有诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的活性。上述的氨基酸序列之间的“同源性”通常是指当对所述蛋白质的一级结构进行比较时，构成氨基酸序列的氨基酸残基之间的同源性水平。
只要其具有与天然HGF基本相同的作用，应用于本发明中的HGF可以具有在其C末端的羧酸根(-COO-)，酰胺基(-CONH2)或酯基(-COOR)以及羧基(-COOH)。在本文中，涉及到通常用作口服给药的酯等，可被低级烷基(例如，甲基，乙基，丙基，环戊基，苯甲基，苯乙基等)，芳基(例如，苯基，α-萘基等)，新戊酰基氧甲基任选取代的酯中的R。此外，可用于本发明中的HGF可以包括在其N-末端的甲硫氨酸残基的氨基被保护基团(例如，诸如甲酰基，乙酰基等的酰基)保护的HGF，其中通过体内对N-末端进行剪切产生的谷氨酰基变成焦谷氨酸的HGF等等。
在本发明中，“内皮祖细胞”是指分化成内皮细胞，主要是分化成血管内皮细胞的细胞。
因为本发明中的促进诱导分化的制剂能够加速诱导骨髓细胞分化成参与血管发生型血管新生或血管再生的内皮祖细胞或内皮细胞，所以其可被用于包括人的哺乳动物(例如，牛，马，猪，绵羊，狗，猫等)需要血管新生或血管再生疾病中。这些疾病包括，例如，下肢动脉硬化闭塞症，心肌梗塞，缺血性小肠炎，缺血性结肠炎，脑梗死等。因为血管新生或血管再生是在治疗烧伤或创伤的过程中观察到的血管生成中的生理现象之一，所以本发明的诱导血管分化的制剂也可以用来治疗烧伤和创伤。
此外，由于内皮祖细胞分化成了内皮细胞，因此可以参与受损血管内皮的修复。因此，诱导血管分化的本发明制剂可用于与血管内皮损伤相关的如下疾病中血管内皮的修复和再生例如弥散性血管内凝血；小血管中的血小板性血栓形成；血栓症；动脉硬化；糖尿病的动脉硬化；由诸如抗肿瘤制剂(例如，doxorubin等)引起的血管内皮损伤；由吸烟毒性引起的血管内皮损伤；诸如风湿性关节炎，多肌炎和多动脉炎的自身免疫疾病；由诸如淋巴瘤，白血病，胃癌等恶性肿瘤疾病的并发症引起的血管内皮损伤；由细菌或病毒感染或免疫接种引起的血管内皮损伤。
用于促进诱导血管分化的本发明的制剂可采用多种剂型，例如液体制剂，固体制剂，胶囊等，然而，通常都是单独用HGF，或用HGF以及常规载体配制成注射剂，吸入剂，栓剂或口服给药的制剂。上述注射剂可以是水性注射剂或油性注射剂。
在水性注射剂的情况下，可以下方式进行制备将HGF溶于，例如，通过适当地将诸如如下物质的药用载体加入水性溶剂(例如，可注射的水，纯净水等)制备的溶液中，然后按公知的方法将所述溶液经过滤器等过滤，灭菌，并填充于无菌容器中等渗制剂(例如氯化钠，氯化钾，甘油，甘露醇，山梨醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，缓冲液(例如，磷酸缓冲液，乙酸缓冲液，硼酸缓冲液，碳酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸缓冲液，ε-氨基己酸(aminocarproic)缓冲液等)，防腐剂(例如，对-羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸乙酯，对-羟苯甲酸丙酯，对-羟苯甲酸丁酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠，乙二胺四乙酸钠，硼酸，硼砂等)，增稠剂(例如，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，稳定剂(例如，亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸，二丁基羟基甲苯等)，pH调节剂(例如，盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等)。此外，也可以使用诸如醇(例如，乙醇等)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇等)，或非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80，聚氧乙烯氢化蓖麻油50等)的适当的增溶剂。
在油性制剂的情况下，可将蓖麻油，大豆油等用作油性溶剂，并可将苯甲酸苄酯，苯甲醇等用作增溶剂。所得的可注射溶液通常填充于安瓿或小管中。在所述注射制剂中，HGF的含量一般调节为约0.0002-0.2W/V％，优选为约0.001-0.1W/V％。优选地可将诸如注射液的液体制剂在经过冷冻保存或冷冻干燥去除水分后进行保存。在使用之前，可将所述冷冻干燥的制剂在可注射用的蒸馏水中重新溶解。
在可口服给药制剂的情况中，剂型包括，例如，片剂，粒剂，细粒剂，粉剂，胶囊，液剂，乳剂，悬剂，糖浆等。这些制剂可通过常规方法制备。在粒剂和片剂的情况中，可通过使用诸如赋型剂(例如，乳糖，白砂糖，葡萄糖，淀粉，结晶纤维素等)，润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石，硬脂酸，硬脂酸钙等)，崩解剂(例如，淀粉，羧甲基纤维素钠，碳酸钙等)，粘合剂(例如，淀粉糊，羟丙基纤维素溶液，羧甲基纤维素溶液，阿拉伯树胶溶液，明胶溶液，海藻酸钠溶液等)等的药用添加剂进行制备。同样，粒剂或片剂可用适当的包衣剂(例如，明胶，白砂糖，阿拉伯树胶，巴西棕榈蜡等)，肠衣剂(例如，醋酸邻苯二甲酸纤维素，甲基丙烯酸共聚物，邻苯二甲酸羟丙基纤维素，羧甲基乙基纤维素等)等进行包衣。
在胶囊的情况中，可以适当地选择增强流动性和润滑性的诸如硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石和轻质无水硅酸的公知赋型剂；在压力下增加流动性的结晶纤维素或乳糖；以及上述的崩解剂。可将HGF与上述的赋型剂均匀地混合或成粒，或者可将所述颗粒用适当的包衣剂进行包衣，然后填充入胶囊中，或者可将所述颗粒用加入甘油，山梨醇等赋予塑性增加的胶囊基质(例如，明胶)进行封装。如果需要，可向所述胶囊制剂中加入着色剂或防腐剂(例如，二氧化硫，对-羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸乙酯，对-羟苯甲酸丙酯，对-羟苯甲酸丁酯等)。除了常规的胶囊制剂，所述胶囊制剂还可采用肠衣胶囊，抗胃酸的胶囊，控释胶囊等形式。
在肠衣胶囊制剂的情况下，将用肠衣剂包衣的HGF，或加入了适当赋型剂的HGF填充至常规的胶囊中。或者，可将HGF单独，或加入了上述适当赋型剂的HGF封装入肠衣胶囊，或封装入由含有肠聚合物的基质材料形成的胶囊中。
在糖浆的情况中，可适当的选择并使用稳定剂(例如，乙二酸四乙酸钠等)，悬剂(例如，阿拉伯树胶，羧甲基纤维素等)，矫正剂(例如，简单糖浆，葡萄糖等)，香味剂等。
此外，可使用常规的栓剂基质(例如，可可脂，月桂油，甘油明胶，大粒凝胶(macrpgol)，Witepsol等)通过常规的配置方法等制备栓剂。
再者，可采用常规的配制方法生产吸入制剂。在吸入制剂的配制中，可以采用任意的添加剂，只要其通常被应用于吸入制剂中。例如，除了促进剂，还可以使用以上所述的赋型剂，粘合剂，润滑剂，防腐剂，稳定剂，等渗剂，pH调节剂和矫正剂(例如，柠檬酸，薄荷醇，甘草酸铵，甘氨酸，香料等)。作为促进剂，液化气体促进剂，压缩气体等也可以使用。液化气体促进剂包括，例如，诸如选择性的含氯氟烃(例如，HCFC-22，HCFC-123，HCFC-134a，HCFC-142等)，液化石油醚，二甲醚等的氟化烃。所述压缩气体包括，例如，可溶性气体(例如，二氧化碳气体，一氧化二氮气体等)和惰性气体(例如氮气等)。
此外，用于本发明中的HGF可与生物可降解的聚合物一起配制成缓释制剂。在HGF的缓释制剂中，可以期待维持血液水平，减少给药频率，缓解副作用等的效果。可以根据，例如，在Drug DeliverySystem(药物传递系统)第3章1986(CMC出版，日本)中描述的常规方法制备这种缓释制剂。用于本发明的生物可降解聚合物可适当地从公知的生物可降解聚合物中选择，其包括，例如，多糖(例如，淀粉，葡聚糖，脱乙酰壳多糖等)，蛋白质(例如，胶原，明胶等)，聚氨基酸(例如，聚谷氨酸，聚赖氨酸，聚亮氨酸，聚丙氨酸，聚甲硫氨酸等)，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物，聚己酸内酯，聚β-羟基丁酸，聚苹果酸，聚酸酐，延胡索酸-聚乙二醇-乙烯吡咯烷酮共聚物等)，聚(原酸酯)，聚烷基氰基丙烯酸(例如，聚甲基-α-氰基丙烯酸等)，聚碳酸酯(例如，聚碳酸亚乙烯酯，聚碳酸亚丙基酯等)，其中优选聚酯，并更优选聚乳酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。当使用聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物时，在为期两周至三个月的缓释时间，优选为两周至一个月的情况中，乳酸/乙醇酸的成分比(mol％)为约100/0-50/50，尽管这样的比例会随缓释时间的变化而变化。这些聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物的平均分子量通常为5,000-20,000。可参照公知的方法，例如JP-A-28521/1986描述的方法，制备聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。虽然对HGF与生物可降解聚合物的混合比例没有限制，但一般而言，所使用的HGF与所述生物可降解聚合物的比例为约0.01W/W％至30W/W％。
根据所述剂型，适应症，疾病的程度，年龄等等，可对上述制剂中的HGF含量进行适当的调节。
本发明的促进诱导血管分化的制剂可包含适当的其它医药用活性成分，只要这些成分不与本发明的目的相抵触。这些活性成分的实例包括，例如，冠状血管扩张药(亚硝酸戊酯，硝酸异山梨醇酯(isosorbidnitrate)，硝化甘油，唑嘧胺(trapidil)等)，β-阻断剂(例如，氧烯洛尔(oxprenolol)，山羊豆苷(carteolol)，布库洛尔(bucumolol)，布非洛尔(bufetolol)，心得安(propranolol)，吲哚洛尔(pindolol)等)，钙抗拮剂(例如，硫氮草酮(diltiazem)，戊脉安(verapamil)，硝苯吡啶(nifedipine)，硝苯苄胺啶(nicardipine)等)，用于外周循环病症的制剂(例如，前列地尔(alprostadil)，阿法环糊精(alfadex)，舒血管素(kallidinogenase)，生育酚(tocopherol)，烟酸环己醇酯(nicomol)等)，抗心律失常药(例如，adimarin，普鲁卡因酰胺(procaineamide)，利多卡因(lidocaine)等)，降血压剂(例如，速尿灵(furosemide)，三氯噻嗪(trichloromethiazide)，肼苯哒嗪(hydralazine)，交感神经阻滞药，钙拮抗剂等)，抗血脂制剂(例如，安妥明(clofibrate)，帕伐他丁(pravastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，尼可莫尔(nicomol)等)，抗凝血剂(例如，肝素，杀鼠灵(warfarin)，双香豆素(dicumarol)，阿斯匹林等)，血栓溶解剂(例如，尿激酶等)，抗糖尿病制剂(例如，甲苯磺丁脲(tolbutamide)，氯磺丙脲(chlorpropamide)，acetahexamide，格列本脲(glibenclamide)，甲福明二甲双胍(metformin)，阿卡波糖(acarbose)等)，抗炎药(例如，双氯高灭酸钠(diclofenac sodium)，布洛芬(ibuprofen)，茚甲新(indomethacin)等)，抗生素(例如，头孢克肟(cefixime)，头孢地尼(cefdinir)，氧氟沙星(ofloxacin)，tosfloxacin等)，抗真菌药(例如，氟康唑(fluconazole)，伊曲康唑(itraconazole)等)，等等。
同样，含有这些活性成分的制剂可以与本发明的制剂组合使用。只要可以实现本发明的目的，对这些药物活性成分就没有限制，且可以适当的混合比例或组合比例对这些活性成分进行使用。
根据其剂型，可通过适当的给药途径对本发明的促进诱导血管分化的制剂进行给药。例如，可通过静脉内，动脉内，皮下或肌内等途径注射给药。注射剂量为通常基于HGF为0.001mg至1000mg，优选0.01mg至100mg，其可以通过分开的方式，以每天一次或每天几次的方式进行适当给药，尽管可根据患者的病症，年龄，体重等进行适当的调节。
本发明的促进诱导血管分化的制剂可在体外用于促进骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞。至于骨髓细胞，任意哺乳动物包括人类的骨髓细胞都可以使用，虽然优选使用游走的骨髓细胞。例如，可通过公知的方法收获人骨髓细胞，将其悬浮于细胞培养液中，接种于塑料培养皿中，并进行培养从中仅收集游走细胞。随后，将所述游走的骨髓细胞与本发明的促进诱导血管分化剂共培养。至于细胞培养液，可以使用常规的培养液，例如，DMEM，MEM，RPMI1640，IMDM等。尽管可以向上述的细胞培养液中加入诸如胎牛血清的常用于细胞培养的添加剂，从移植免疫学的方面考虑优选地还是使用无血清的细胞培养液。在促进诱导血管分化的制剂中，HGF的浓度为约1ng/mL至约100ng/mL。培养条件采用的是在常规细胞培养中的条件，例如，在约35℃±2℃，5％二氧化碳存在的条件等。将如此培养的骨髓细胞培养一至五周，使其分化成内皮祖细胞或内皮细胞。根据以上获得的源自骨髓细胞的诱导分化的内皮祖细胞或内皮细胞可用作器官移植所需要的细胞。
更具体地，从患有下肢动脉硬化闭塞症(arteriosclerotic obliterans)的患者的骨髓细胞分化和增殖的内皮祖细胞或内皮细胞可以，例如，对由下肢动脉硬化性闭塞症引起的患者肌体的坏死溃疡部分进行肌肉注射来进行移植。根据这一过程，有可能从所述患者本身的骨髓细胞获得大量患有下肢动脉硬化闭塞症患者移植所需要的内皮祖细胞或内皮细胞。
此外，移植还包括另一实施方案，包括培养骨髓细胞，将所获得的增殖、未分化的骨髓细胞作为用于移植的细胞，以及给受体施用本发明的促进诱导血管分化的制剂。根据这一方法，由于从患有下肢动脉硬化闭塞症患者收集的少量骨髓细胞可以被培养和增殖，而大量所得的骨髓细胞可以在施用本发明的促进血管分化制剂的同时重新返回患者，因此可在所述患者体内有效地发生诱导移植的骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞。
至于那些用于上述移植中的骨髓细胞，从移植免疫学的角度考虑，优选那些从待移植的个体自身收集来的细胞。
近年来，已有关于使用HGF进行基因治疗的报道(参见Circulation，1997，vol.96，No.3459；Nature Medicine，1999，vol.5，p.226-230；Circulation，1999，vol.100，No.1672；Gene Therapy，2000，vol.7，p.417-427)，并建立了这种基因治疗的技术。本发明包括基因治疗方法，包括导入用于诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的HGF基因，以及施用上述HGF。下文将对HGF基因治疗进行详细描述。
在本文中，“HGF基因”是指能够表达HGF的基因。更具体地，本发明列举了一种基因，其中HGF的cDNA被整合入合适表达载体(非病毒载体，病毒载体)中，如非专利文献2；日本专利2,777,678；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967；或Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，vol.172，p.321.所述。编码HGF的cDNA碱基序列在以上文献中已有描述，且也在诸如Genebank的数据库中进行了注册。根据以上序列数据，例如，可以通过使用适当的DNA片段作为PCR引物，对来自肝脏等的mRNA进行RT-PCR，从而进行HGF的cDNA克隆。本领域技术人员基于诸如Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室出版(1989)的基础书籍可以很容易完成这样的克隆。
此外，用于本发明中的HGF不仅限于上述的基因，任意的HGF基因都可以用作本发明的HGF基因，只要其表达与HGF具有基本相同活性的蛋白质。换言之，在可与上述cDNA在严谨条件下杂交的DNA，和编码由上述cDNA所编码的氨基酸序列中一至多个氨基酸(优选几个氨基酸)被替换，缺失，添加和/或插入的蛋白质的DNA中，任意编码具有HGF活性的蛋白的DNA都包含在本发明所使用的HGF基因的范围中。这样的DNA可方便地通过常规的杂交方法，PCR方法等获得，尤其是参考诸如上述的Molecular Cloning的基础文献。
应用于本发明中HGF基因可采用与上述HGF蛋白相同的方式施用，用来诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞。
当给患者施用含有作为活性成分的HGF基因的基因治疗剂时，可以采用诸如在Basic Technology of Gene Therapy，Separate Volume ofExperimental Medicine published by Yodosha，日本，1996；GeneIntroduction and Expression Analysis Method，Separate Volume ofExperimental Medicine，Yodosha出版，日本，1997；Gene TherapyDevelopment Research Handbook，edited by The Japan Society of GeneTherapy，NTS出版，日本，1999中描述的常规方式进行这种施用。
剂型可包括多种适用于上述每种给药方式的公知形式。根据患者的目标疾病，年龄和体重等，可以对所述制剂中的DNA含量进行适当的控制，通常，本发明中的DNA含量为0.0001至100mg，优选为0.001至10mg。
此外，HGF基因和HGF可以各自独立地使用或组合使用。
下面，通过以下实施例对本发明进行说明，但并非是对本发明的限制。除非另有说明，百分数(％)是指重量百分数％。
实施例1受体小鼠在日本大阪大学，建立了转有增强绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6转基因小鼠品系。根据Morishita等人在Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384中的描述，将收集到的13.5天GFP胚胎的胎肝的肝细胞移植入在移植前用12Gy剂量辐射过的C57BL/6雄性小鼠体内。移植三周之后，超过95％的循环白细胞(外周白细胞)都完全被GFP小鼠来源的骨髓细胞所替换的那些小鼠被用作该实验中的受体小鼠。
肺毛细血管损伤的诱导和治疗向受体小鼠鼻内灌注猪胰腺弹性蛋白酶(200单位/kg，Sigma，StLouis，MO)。弹性蛋白酶灌注三周之后，所述受体小鼠在其肺部表现出了肺气肿，并观察到了受损的肺毛细管。此时，将诱导成肺气肿的受体小鼠随机分成两组，即介质给药组和HGF给药组，对这两组小鼠分别进行腹膜内注射均衡饮食和每天一次，每次1mg/kg的剂量的HGF，共12天。
组织学解剖在20cm H2O的压力下，使用4％的低聚甲醛-PBS(磷酸缓冲盐水)对所述受体小鼠的肺进行固定，根据常规方法制备石蜡包块切片，用苏木精-曙红(HE)对石蜡切片染色。使用抗-GFP抗体(Abcam，剑桥，英国)检测GFP并用3，3’-二氨基联苯胺显色。
为了鉴定GFP-阳性细胞的表型，可使用抗-CD34和抗-CD45抗体(Pharmingen，圣迭戈，加利福尼亚州)对所述冷冻切片进行免疫荧光染色。
使用具有抗-Sca-1包衣微珠的磁细胞分拣系统(Miltenvi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)对从每只小鼠收集到的Sca-1+外周血细胞(得自骨髓细胞的表面抗原)进行分离。使用FACS Calibur(自动细胞分析和分拣装置，BD，圣何塞，加利福尼亚州)进行流式细胞计数，在所分离到的Sca-1+外周血中测定内皮祖细胞或内皮细胞的细胞分布，其中作为血管内皮生长因子受体(VEGF)之一的Sca-1和Flk-1的表达可用作指数。使用荧光素异硫氰酸酯标记的抗Sca-1抗体检测Sca-1，而使用藻红蛋白(荧光红色素)标记的抗-Flk-1抗体(Pharmingen)可以检测Flk-1。
结果在肺毛细血管受损的受体小鼠中Flk-1阳性细胞的分布如图1所示。与对照组[HGF(-)]相比，HGF给药组[HGF(+)；灰线]中的整个细胞分布都向右迁移。该结果说明Flk-1阳性细胞，即内皮祖细胞或内皮细胞在HGF给药组中有所增加。
在对受体小鼠的肺组织切片观察中发现，在接受弹性蛋白酶的受体小鼠的肺毛细管受到破坏，而在HGF给药组中，可以观察到肺毛细管几乎与没有接受弹性蛋白酶的对照组的受体小鼠的肺毛细管具有基本相同的程度(参见图2)。通过免疫荧光染色对所述受体小鼠进行的组织学观察结果说明，在HGF给药组中的肺毛细管内皮细胞是从GFP-小鼠的骨髓细胞分化而来的(参见图3)。
这样的结果说明从骨髓细胞分化而来的内皮祖细胞或内皮细胞可进一步被诱导分化成新的再生肺毛细血管。
实施例2方法从每只小鼠获得总共0.5-1.0ml外周血。通过Ficoll-Hypaque密度梯度(Lymphosepal；IBL，Gunma，日本)分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用RBC裂解缓冲液(0.15M NH4Cl，0.01M KHCO3，0.1mM EDTA-2Na，pH 7.2)去除红细胞。用FITC标记的抗鼠Sca-1抗体(BD Pharmingen，圣迭戈，加利福尼亚州)，PE标记的抗鼠胎肝激酶1/血管内皮生长因子受体2(Flk-1/VEGF-R2)(BD Pharmingen)和APC标记的抗c-kit抗体(BD Pharmingen)对与外周EPC一致的Sca-1+/Flk-1+/c-kit+细胞进行染色，并使用FACSCalibur(BD，圣何塞，加利福尼亚州)进行分析。
结果与盐水处理的小鼠相比，HGF处理使得含有EPC类群的PBMC的数量有所增加。在HGF处理小鼠中，循环的Sca-1+/Flk-1+/c-kit+细胞的数目有所增加(表1)。这些结果说明HGF诱导了从骨髓进入循环系统的，与EPC表型一致的，外周Sca-1+/Flk-1+/c-kit+细胞数量的增加，且肺实质也因此接受了更多来自骨髓的祖细胞。
表1在盐水处理和HGF处理小鼠中PBMC和Sca-1+/Flk-1+/c-kit+细胞的数量
所示值为平均值±SEM×105细胞/ml。*表示与盐水处理的小鼠有显著性差异(P＜0.05)。
工业实用性本发明的促进诱导血管分化的制剂可用作促进诱导骨髓细胞分化为内皮祖细胞或内皮细胞的医用制剂。因为使用这样的内皮祖细胞或内皮细胞发生血管新生或血管再生，所以本发明的促进诱导血管分化的制剂可应用于再生药物的领域。
权利要求
1.促进诱导骨髓细胞分化成内皮祖细胞或内皮细胞的制剂，包括作为活性成分的肝细胞生长因子。
全文摘要
本发明提供了促进诱导骨髓细胞向能够分化成内皮细胞的内皮祖细胞进行分化的制剂，包括作为活性成分的肝细胞生长因子，且这样的制剂可应用于药物疗法或再生药物领域中。
文档编号A61K38/18GK1929856SQ20058000743
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月7日 优先权日2004年3月9日
发明者久保裕司, 石沢兴太, 佐佐木英忠, 中村敏一 申请人:株式会社东北宏桥技术, 克霖固鲁制药股份有限公司