专利名称：二氢丁苯那嗪类及包含它们的药用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的二氢丁苯那嗪异构体、包含它们的药用组合物、制备它们的方法及它们的治疗用途。
背景技术：
丁苯那嗪(化学名1，3，4，6，7，11b-六氢-9，10-二甲氧基-3-(2-甲丙基)-2H-苯并(a)喹嗪-2-酮)自二十世纪五十年代后期已作为药物使用。丁苯那嗪最初作为抗精神病药使用，现在用于治疗运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐(hemiballismus)、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征，参见例如Jankovic等，Am.J.Psychiatry.(1999)Aug；156(8)1279-81和Jankovic等，Neurology(1997)Feb；48(2)358-62。
丁苯那嗪的主要药理作用是通过抑制人液泡单胺转运蛋白同工型2(hVMAT2)减少中枢神经系统内单胺(例如多巴胺、血清素和去甲肾上腺素)的供应量。该药物还阻断突触后的多巴胺受体。
丁苯那嗪是治疗多种运动过度的运动失调的有效和安全的药物，并且与经典的抗精神病药相反，未显示其导致迟发性运动障碍。然而，丁苯那嗪存在许多与剂量相关的副作用包括引起抑郁、帕金森氏征、嗜睡、神经质或焦虑、失眠和在罕见病例中引起抗精神病药(neuroleptic)的恶性综合征。
丁苯那嗪的中枢作用与利血平的非常类似，但与利血平不同的是其对VMAT1转运蛋白无活性。对VMAT1转运蛋白无活性意味着丁苯那嗪与利血平相比外周活性更小，因此不产生与VMAT1-相关的副作用例如低血压。
丁苯那嗪的化学结构在下
图1中显示。
图1-丁苯那嗪的结构化合物在3和11b碳原子上具有手性中心，因此理论上可存在合计4种异构形式，如图2显示。
图2-可能的丁苯那嗪异构体在图2中，用Cahn，Ingold和Prelog建立的“R和S”命名法定义每种异构体的立体化学，该命名法参见Jerry March的AdvancedOrganic Chemistry(高级有机化学)，第4版，John Wiley & Sons，NewYork，1992，109-114页。在图2和本专利申请的其它各处中，按照碳原子位置编号的顺序给出“R”或“S”的指示。因此，例如，RS是3R，11bS的速记符号。类似地，当出现3个手性中心时，如在下文描述的二氢丁苯那嗪中，按照碳原子2，3和11b的顺序列出“R”或“S”的指示。因此2S，3R，11bR异构体用速记形式表示为SRR等。
市场上可购买的丁苯那嗪是RR和SS异构体的外消旋混合物，将显示RR和SS异构体(下文个别或全称为反式丁苯那嗪，因为3和11b位氢原子具有反式的相对取向)是热力学最稳定的异构体。
丁苯那嗪的生物利用度多少有些低并且多变。丁苯那嗪被首过代谢广泛地代谢，通常在尿中很少或检测不到无变化的丁苯那嗪。主要代谢产物是二氢丁苯那嗪(化学名2-羟基-3-(2-甲丙基)-1，3，4，6，7，11b-六氢-9，10-二甲氧基-苯并(a)喹嗪)，其通过还原丁苯那嗪中的2-酮基形成，相信主要负责药物的活性(参见Mehvar等，DrugMetab.Disp，15，250-255(1987)和J.Pharm.Sci.，76，No.6，461-465(1987))。
目前已鉴定4种二氢丁苯那嗪异构体并对其特征进行了表征，它们全部衍生自更稳定的母体丁苯那嗪的RR和SS异构体，在3和11b位氢原子之间具有反式相对取向)(参见Kilbourn等，Chirality，959-62(1997)和Brossi等，Helv.Chim.Acta.，vol.XLI，No.193，pp 1793-1806(1958)。4种异构体是(+)-α-二氢丁苯那嗪、(-)-α-二氢丁苯那嗪、(+)-β-二氢丁苯那嗪和(-)-β-二氢丁苯那嗪。考虑4种已知的二氢丁苯那嗪异构体的结构如图3显示。
图3-已知的二氢丁苯那嗪异构体的结构Kilbourn等(参见Eur.J.Pharmacol.，278249-252(1995)和Med.Chem.Res.，5113-126(1994))研究了清醒大鼠脑内个体放射性标记的二氢丁苯那嗪异构体的特异性结合。他们发现(+)-α-[11C]二氢丁苯那嗪(2R，3R，11bR)异构体蓄积在与高浓度神经元膜多巴胺转运蛋白(DAT)和液泡单胺转运蛋白(VMAT2)有关的脑区。然而，基本上无活性的(-)-α-[11C]二氢丁苯那嗪异构体几乎均匀分布在脑内，提示不存在对DAT和VMAT2的特异性结合。该体内研究与证明(+)-α-[11C]二氢丁苯那嗪异构体对[3H]甲氧基丁苯那嗪的Ki比对(-)-α-[11C]二氢丁苯那嗪异构体的Ki高＞2000倍的体外研究相关。
迄今为止，就本申请人所知，尚未分离出衍生自不稳定的丁苯那嗪RS和SR异构体(下文个别或全称为顺式丁苯那嗪，因为3和11b位氢原子具有顺式相对取向)的二氢丁苯那嗪异构体并对其进行特征鉴定，并且至今未公布这些化合物的生物活性。
发明概述目前已发现衍生自不稳定的丁苯那嗪RS和SR异构体(“顺式”异构体)的二氢丁苯那嗪异构体不仅稳定而且具有异常好的生物学特性。特别是，某些异构体具有的受体活性曲线图提示具有许多优于目前使用的RR/SS丁苯那嗪的优点。例如，几种异构体虽然对VMAT2具有高度亲和力，但对多巴胺受体的结合明显减少或可忽略不计，提示它们不可能产生遇到丁苯那嗪时的多巴胺能副作用。未显示异构体抑制多巴胺转运蛋白(DAT)。此外，在大鼠中对几种异构体的研究已显示它们缺乏与丁苯那嗪有关的不需要的镇静副作用。镇静活性的缺乏可能归因于一些异构体对肾上腺素能受体的亲和力极低。而且，鉴于丁苯那嗪的副作用之一是抑郁，几种二氢丁苯那嗪异构体显示对血清素转运蛋白(SERT)的亲和力，表明它们可具有抗抑郁活性。
因此，第一方面，本发明提供3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪。
另一方面，本发明提供包含3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪和药学上可接受的载体的药用组合物。
本发明还提供基本上纯形式的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪，例如异构纯度大于90％，通常大于95％，且更优选大于98％。
术语“异构纯度”在本文是指3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪相对于所有异构形式的二氢丁苯那嗪的总量或浓度所占的量。例如，如果组合物中90％的总的二氢丁苯那嗪是3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪，那么异构纯度是90％。
本发明还提供基本上不含3，11b-反式-二氢丁苯那嗪的包含3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的组合物，优选含少于5％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪，更优选少于3％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪，且最优选少于1％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪。
另一方面，本发明提供3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪用于药物或治疗，例如治疗运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征或治疗抑郁。
在还一方面，本发明提供3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪在制备用于治疗运动过度的运动失调(例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征)或治疗抑郁的药物中的用途。
在又一方面，本发明提供预防或治疗需要这样的预防或治疗的患者运动过度的运动失调(例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征)或治疗抑郁的方法，该方法包括给予有效预防或治疗量3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪。
在此所用的术语“3，11b-顺式-”是指二氢丁苯那嗪结构中3-和11b-位氢原子处于顺式相对取向。因此本发明的异构体是式(I)化合物及其对映体(镜像)。
具有3，11b-顺式构型的二氢丁苯那嗪有4种可能的异构体，它们是2S，3S，11bR异构体、2R，3R，11bS异构体、2R，3S，11bR异构体和2S，3R，11bS异构体。本发明已分离和鉴定4种异构体，且另一方面提供3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的个体异构体。特别是，本发明提供(a)具有式(Ia)的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2S，3S，11bR异构体 (b)具有式(Ib)的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2R，3R，11bS异构体 (c)具有式(Ic)的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2R，3S，11bR异构体 和(d)具有式(Id)的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2S，3R，11bS异构体 本发明的个体新异构体的特征可表现在它们的光谱、光学和色性能。
优选的异构体是右旋(+)异构体。
不意味着任何具体的绝对构型或立体化学，4种新异构体的特征可以如下异构体AORD(甲醇，21℃)测量的旋光性；左旋(-)IR光谱(KBr固体)，1H-NMR光谱(CDCl3)和13C-NMR光谱(CDCl3)基本上如表1中描述。
异构体BORD(甲醇，21℃)测量的旋光性；右旋(+)IR光谱(KBr固体)，1H-NMR光谱(CDCl3)和13C-NMR光谱(CDCl3)基本上如表1中描述。
异构体CORD(甲醇，21℃)测量的旋光性；右旋(+)IR光谱(KBr固体)，1H-NMR光谱(CDCl3)和13C-NMR光谱(CDCl3)基本上如表2中描述。
异构体DORD(甲醇，21℃)测量的旋光性；左旋(-)IR光谱(KBr固体)，1H-NMR光谱(CDCl3)和13C-NMR光谱(CDCl3)基本上如表2描述。
每种异构体的ORD值在以下实施例中给出，但注意这样的值是通过实施例给出，并可根据异构体的纯度及受其它变量例如温度波动和残留溶剂分子作用的影响而改变。
对映体A、B、C和D可各自以基本上对映体的纯的形式或作为本发明其它对映体的混合物存在。
术语“对映体纯度”和“对映体纯”在本文是指给定的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪对映体相对于全部对映体和异构体形式的二氢丁苯那嗪总量或浓度占的量。例如，如果组合物中90％的总二氢丁苯那嗪以单一对映体形式存在，那么对映体纯度是90％。
通过实施例，在本发明各方面和每个实施方案中，每种选自异构体A、B、C和D的单一对映体可以以至少55％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％)的对映体纯度存在。
本发明的异构体也可以以一种或多种异构体A、B、C和D的混合物形式存在。这样的混合物可以是外消旋混合物或非外消旋混合物。外消旋混合物的实例包括异构体A和异构体B的外消旋混合物以及异构体C和异构体D的外消旋混合物。
药学上可接受的盐除非上下文需要，否则在本申请中涉及二氢丁苯那嗪及其异构体时，包括在其范围内的不仅包括二氢丁苯那嗪的游离碱，还包括其盐，特别是酸加成盐。
形成酸加成盐的具体酸包括pKa值小于3.5且更通常小于3的酸。例如，可由pKa范围从+3.5至-3.5的酸形成酸加成盐。
优选的酸加成盐包括那些用磺酸例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸和萘磺酸形成的那些酸加成盐。
可形成酸加成盐的一种特殊酸是甲磺酸。
可通过本文描述的方法或常规化学方法(例如描述于Pharmaceutical SaltsProperties，Selection，and Use(药用盐特性、选择和用途)，P.Heinrich Stahl(编辑)，Camille G.Wermuth(编辑)，ISBN3-90639-026-8，Hardcover，388页，2002年8月中的方法)制备酸加成盐。通常，可通过使化合物的游离碱形式与适当的碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应制备这样的盐；通常，用非水介质例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
盐通常是药学上可接受的盐。然而，药学上不可接受的盐也可制备成中间体形式，其可随后转化为药学上可接受的盐。这样的非药学上可接受的盐形式也形成本发明的一部分。
制备二氢丁苯那嗪异构体的方法在还一方面，提供制备本发明二氢丁苯那嗪的方法(方法A)，该方法包括使式(II)化合物 与一种或多种适合使式(II)化合物中2，3-双键水合的试剂反应，随后在需要时分离和分离需要的二氢丁苯那嗪异构体形式。
可用硼烷试剂例如二硼烷或硼烷-醚(例如硼烷-四氢呋喃(THF))，通过硼氢化作用使2，3-双键水合，得到中间体烷基硼烷加合物，接着使烷基硼烷加合物氧化并在碱存在下水解。硼氢化作用通常在干燥极性非质子溶剂例如醚(例如THF)中、通常在不提高的温度例如室温下进行。通常用氧化剂例如过氧化氢在碱存在下，使硼烷-烯烃加合物氧化，提供氢氧化物离子例如氢氧化铵或碱金属氢氧化物例如氢氧化钾或氢氧化钠。通常方法A的硼氢化-氧化-水解反应顺序提供二氢丁苯那嗪异构体，其中2-和3-位氢原子具有反式相对取向。
可通过还原丁苯那嗪得到二氢丁苯那嗪，然后使二氢丁苯那嗪脱水制备式(II)化合物。可用氢化铝试剂例如氢化铝锂，或氢硼化物试剂例如氢硼化钠、氢硼化钾，或氢硼化物衍生物例如烷基氢硼化物(例如三-仲-丁基氢硼化锂)还原丁苯那嗪。或者，可采用催化氢化作用例如经过兰氏镍或氧化铂催化剂进行还原步骤。进行还原步骤的合适条件在下文有更详细的描述，或可在美国2,843,591(Hoffmann-La Roche)和Brossi等，Helv.Chim.Acta.，XLI卷，193期，ppl793-1806(1958)中发现。
因为用作还原反应的起始材料的丁苯那嗪通常是RR和SS异构体(即反式-丁苯那嗪)的混合物，所以由还原步骤形成的二氢丁苯那嗪将在3-和11b位具有相同反式构型，并将采取一种或多种已知的在上文图3中所示的二氢丁苯那嗪异构体形式。因此方法A可包括采用已知的二氢丁苯那嗪异构体、使它们脱水形成烯烃(II)，然后用产生需要的本发明新的顺式二氢丁苯那嗪异构体的条件使烯烃(II)“再脱水”。
可用将醇脱水形成烯烃的多种标准条件将二氢丁苯那嗪脱水为烯烃(II)，参见例如J.March(同前)389-390页及其中的参考文献。这样的条件的实例包括用以磷为基础的脱水剂例如卤化磷或卤氧化磷(phosphorus oxyhalides)，例如POCl3和PCl5。作为直接脱水的替代，可将二氢丁苯那嗪的羟基转化为离去基团L例如卤素(例如氯或溴)，然后经历除去H-L的条件(例如在碱存在下)。可用化学技术人员熟知的方法将羟基转化为卤化物，例如通过与四氯化碳或四溴化碳在三烷基或三芳基膦例如三苯基膦或三丁基膦存在下反应。
用作还原反应的起始材料得到二氢丁苯那嗪的丁苯那嗪可从市场上购买或通过描述于美国2,830,993(Hoffmann-La Roche)的方法合成。
本发明还提供制备本发明二氢丁苯那嗪的方法(方法B)，该方法包括使式(III)化合物 经历将式(III)化合物中的2，3-环氧化物基团的环打开的条件，随后在需要时分离和分离需要的二氢丁苯那嗪异构体形式。
可根据用于打开过氧化物环的已知方法完成开环。然而，目前打开过氧化物环的优选方法是还原性开环，其可用还原剂例如硼烷-THF完成。通常在环境温度下，在极性非质子溶剂例如乙醚(例如四氢呋喃)中进行与硼烷-THF的反应，接着将由此形成的硼烷复合物在水和碱存在下，在溶剂的回流温度中加热水解。通常方法B产生二氢丁苯那嗪异构体，其中在2-和3-位的氢原子具有顺式相对取向。
可通过上文式(II)烯烃的环氧化作用制备式(III)的环氧化物化合物。可用化学技术人员熟知的条件和试剂进行环氧化反应，参见例如J.March(同前)，826-829页及其中的参考文献。通常，可用过酸例如间氯过苯甲酸(MCPBA)或过酸与其它氧化剂例如过氯酸的混合物产生环氧化作用。
当上文方法A和B的起始材料是对映体混合物时，该方法的产物将通常是成对对映体，例如外消旋混合物，可能夹杂非对映异构体杂质。可通过技术例如层析(例如HPLC)除去不需要的非对映异构体并且可通过化学技术人员已知的多种方法分离各对映体。例如，它们可通过以下途径分离(i)手性层析(在手性载体上的层析)；或(ii)与光学纯的手性酸形成盐，通过分级结晶分离两种非对映异构体的盐，然后从盐中释放二氢丁苯那嗪；或(iii)与光学纯的手性衍化剂(derivatising)(例如酯化剂)形成衍生物(例如酯)，分离生成的差向异构体(例如通过层析)，然后将衍生物转化为二氢丁苯那嗪。
一种分离从方法A和B各自获得的成对对映体的方法(已发现其特别有效)是用旋光活性形式的Mosher’s酸(例如以下显示的R(+)异构体)或其活性形式使二氢丁苯那嗪的羟基酯化 然后可通过层析(例如HPLC)分离生成的二氢丁苯那嗪的两种对映体的酯，然后在极性溶剂例如甲醇中用碱例如碱金属氢氧化物(例如NaOH)水解分离的酯，得到各二氢丁苯那嗪(dihydrobenazine)异构体。
作为将对映体混合物用作方法A和B中的起始材料，然后分离对映体的替代方法，可用单一对映体起始材料分别进行方法A和B，得到其中以单一对映体为主的产物。可如下制备烯烃(II)的单一对映体用三-仲-丁基氢硼化锂使RR/SS丁苯那嗪经历立体选择还原反应，得到二氢丁苯那嗪的SRR和RSS对映体混合物，分离对映体(例如通过分级结晶)，然后使分离的二氢丁苯那嗪的单一对映体脱水，得到绝大部分的或唯一的式(II)化合物的单一对映体。
方法A和B在方案1和2中各自有更详细的说明。
方案1
方案1说明具有2S，3S，11bR和2R，3R，11bS构型的各二氢丁苯那嗪异构体的制备，其中连接2-和3-位的氢原子以反式相对取向排列。该反应方案包括上文定义的方法A。
方案1中反应顺序的起点是购自市场的丁苯那嗪(IV)，其是丁苯那嗪的RR和SS旋光异构体的外消旋混合物。在每种RR和SS异构体中，3-和11b-位的氢原子都是以反式相对取向排列。作为使用可市售获得的化合物的代替，可根据描述于美国专利号2,830,993(具体参见实施例11)的步骤合成丁苯那嗪。
用氢硼化物还原剂三-仲-丁基氢硼化锂(“L-Selectride”)还原RR和SS丁苯那嗪的外消旋混合物得到已知的二氢丁苯那嗪2S，3R，11bR和2R，3S，11bS异构体(V)，其中为简化只显示了2S，3R，11bR异构体。通过用更多立体要求的L-Selectride作为氢硼化物还原剂代替氢硼化钠，使二氢丁苯那嗪的RRR和SSS异构体的形成降至最低或受抑制。
使二氢丁苯那嗪异构体(V)与脱水剂例如五氯化磷在非质子溶剂例如氯化烃(例如氯仿或二氯甲烷，优选二氯甲烷)中反应，形成不饱和化合物(II)，为成对对映体，在方案中只显示R-对映体。脱水反应通常在低于室温的温度例如在约0-5℃进行。
然后将不饱和化合物(II)经历立体选择性再水合，得到二氢丁苯那嗪(VI)及其镜像或对映体(未显示)，其中3-和11b-位氢原子以顺式相对取向排列，且2-和3-位氢原子以反式相对取向排列。立体选择性再水合作用通过用硼烷-THF在四氢呋喃(THF)中的氢硼化步骤完成，形成中间体硼烷复合物(未显示)，然后在碱例如氢氧化钠存在下用过氧化氢氧化。
然后可进行最初的纯化步骤(例如通过HPLC)，得到再水合反应顺序的产物(V)，为2S，3S，11bR和2R，3R，11bS异构体混合物，其中方案只显示2S，3S，11bR异构体。为分离异构体，在二氯甲烷中，在草酰氯和二甲氨基吡啶(DMAP)存在下用R(+)Mosher’s酸处理混合物，得到一对非对映异构酯(VII)(其中只显示一种非对映异构体)，其接着可用HPLC分离。然后用碱金属氢氧化物例如氢氧化钠水解各种酯，得到单一异构体(VI)。
在方案1显示的步骤顺序的变化中，RR/SS丁苯那嗪还原后，可分离生成的二氢丁苯那嗪的对映体混合物(V)，得到各对映体。可通过用手性酸例如(+)或(-)樟脑磺酸形成盐进行分离，通过分级结晶分离生成的非对映体，得到单一对映体的盐，然后从盐中释放游离碱。
可将分离的二氢丁苯那嗪对映体脱水得到烯烃(II)的单一对映体。然后将烯烃(II)再水合得到绝大部分的或唯一的顺式-二氢丁苯那嗪(VI)的单一对映体。这种变化的优点是不涉及Mosher’s酸酯的形成，从而避免通常用于分离Mosher’s酸酯的层析分离。
方案2说明具有2R，3S，11bR和2S，3R，11bS构型的各个二氢丁苯那嗪异构体的制备，其中连接于2-和3-位的氢原子以顺式相对取向排列。该反应方案包括上文定义的方法B。
方案2 在方案2中，通过还原丁苯那嗪得到二氢丁苯那嗪的2S，3R，11bR和2R，3S，11bS异构体(V)并按上文方案1描述的方法用PCl5脱水产生不饱和化合物(II)。然而，代替化合物(II)经历氢硼化作用的是，通过与间氯过苯甲酸(MCPBA)和过氯酸反应将2，3-双键转化为环氧化物。通常在约室温下，在醇溶剂例如甲醇中很方便进行环氧化反应。
然后用硼烷-THF作为亲电子还原剂使环氧化物(VII)经历还原性开环，得到中间体硼烷复合物(未显示)，然后在碱例如氢氧化钠存在下将其用过氧化氢氧化和裂解，得到二氢丁苯那嗪(VIII)的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS异构体混合物，为简化其中只显示2R，3S，11bR。在二氯甲烷中，在草酰氯和二甲氨基吡啶(DMAP)存在下，用R(+)Mosher’s酸处理异构体(VIII)混合物，得到一对差向异构体酯(IX)(其中只显示一种差向异构体)，然后可通过层析分离并按上文描述与方案1有关的方法将其在甲醇中用氢氧化钠水解。
相信化学中间体(II)和(III)是新的并代表本发明的进一步的方面。
生物学特性和治疗用途丁苯那嗪通过抑制脑内液泡单胺转运蛋白VMAT2和通过抑制突触前和突触后多巴胺受体发挥其治疗作用。
本发明的新的二氢丁苯那嗪异构体也是VMAT2抑制剂，异构体C和B产生的抑制度最大。与丁苯那嗪相似，本发明化合物对VMAT1(在外周组织和一些内分泌细胞中发现的VMAT同工型)的亲和力低，从而提示它们将不产生与利血平有关的副作用。化合物C和B对儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)、单胺氧化酶同工型A和B以及5-羟色胺同工型1d和1b也不产生抑制作用。
令人惊讶的是，虽然异构体C和B对于与VMAT2结合具有高度活性，但它们对VMAT2与对多巴胺受体的活性有明显分离，两种化合物对多巴胺受体结合的活性都很弱或不存在，并且缺乏多巴胺转运蛋白(DAT)结合活性。事实上，无一异构体表现明显的DAT结合活性。这提示化合物可能缺乏丁苯那嗪产生的多巴胺能副作用。异构体C和B也是肾上腺素能受体的弱活性或无活性抑制剂，这提示化合物可能缺乏常见于丁苯那嗪的肾上腺素能副作用。事实上，在大鼠的运动研究中，丁苯那嗪表现与剂量相关的镇静作用，然而在本发明的二氢丁苯那嗪异构体B和C给药后没有观察到镇静作用。
而且，异构体C和异构体B都是血清素转运体蛋白SERT的潜在抑制剂。抑制SERT是抗抑郁剂例如氟西汀(Prozac)发挥它们的治疗作用的一种机制。因此，与抑郁是丁苯那嗪公认的副作用迥然相反，异构体C和B抑制SERT的能力提示这些异构体可用作抗抑郁剂。
根据迄今为止已开展的研究，设想本发明的二氢丁苯那嗪化合物将有助于预防或治疗目前使用或计划用丁苯那嗪预防或治疗的疾病状态和病症。因此，通过实施例(但不得限制)，本发明的二氢丁苯那嗪化合物可用于治疗运动过度的运动失调，例如亨延顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽动障碍、迟发性运动障碍、张力障碍和图雷特氏综合征。
还设想本发明的二氢丁苯那嗪化合物可有助于治疗抑郁。
通常将化合物给药于需要这样给药的患者，例如人或动物患者，优选人。
通常化合物的给药量是有助于治疗或预防且通常是无毒的。然而，在某些情况下，本发明的二氢丁苯那嗪化合物给药的优点可超过任何毒性作用或副作用的缺点，在这种情况下可能需要考虑将化合物以与毒性程度相关的量给药。
化合物的典型日剂量范围从0.025毫克至5毫克每公斤体重，例如至多3毫克每公斤体重，且更典型为0.15毫克至5毫克每公斤体重，但在需要时给药剂量可以更高或更低。
通过实施例，可按最初的起始剂量12.5mg每天给药2至3次。可每3至5天将剂量每天增加12.5mg，直至医生确定达到个体的最大耐受和有效剂量。最后，化合物的给药量将与正在治疗的疾病或生理状态的性质相当，医生将慎重考虑给出的剂量方案产生的治疗益处及是否存在副作用。
药用制剂本发明还提供药用组合物形式的如上文定义的二氢丁苯那嗪化合物。
药用组合物可采用任何适合口服、胃肠外、局部、鼻内、支气管内、眼、耳、直肠、阴道内或经皮给药的形式。当预期将组合物胃肠外给药时，可将它们配制用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下给药或通过注射、灌注或其它释放途径直接释放至靶器官或组织。
适合口服给药的药用剂型包括片剂、胶囊、扁囊、丸剂、锭剂、糖浆剂、溶液、喷雾剂、粉剂、粒剂、酏剂和混悬剂、舌下含片、喷雾剂、糯米纸囊剂或贴剂和口腔贴剂。
可根据已知的技术配制含本发明的二氢丁苯那嗪化合物的药用组合物，参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，PA，USA。
因此，片剂组合物可包含单位剂量的活性化合物以及惰性稀释剂或载体，例如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇；和/或非糖衍生的稀释剂例如碳酸钠、磷酸钙、滑石、碳酸钙，或纤维素或其衍生物例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和淀粉例如玉米淀粉。片剂也可包含这样的标准成分作为粘合和制粒剂例如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例如可膨胀的交联聚合物例如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸酯)、防腐剂(例如对羟苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如BHT)、缓冲剂(例如磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液)和发泡剂例如枸橼酸盐/碳酸氢盐混合物。这样的赋形剂已众所周知，在此不需要详细讨论。
胶囊制剂可以是硬胶囊或软胶囊种类，并可包含固体、半固体或液体形式的活性成分。明胶胶囊可用动物明胶或其合成的或植物衍生的同等物形成。
虽然固体剂型(例如片剂、胶囊等)可被包衣或不包衣，但通常具有包衣，例如保护性薄膜包衣(例如蜡或清漆)或释放控制包衣。可将包衣(例如EudragitTM型聚合物)设计在胃肠道内需要的位置释放活性成分。因此，可选择包衣以便在胃肠道内某个pH条件下降解，从而在胃或回肠或十二指肠内选择性释放化合物。
代替包衣或除包衣之外，可使药物存在于固体基质中，该基质含释放控制剂，例如可适合在胃肠道内变化的酸碱度条件下选择性释放化合物的释放延缓剂。或者，基质材料或释放延缓包衣可采用易蚀聚合物(例如马来酸酐聚合物)的形式，该形式在剂型通过胃肠道时基本上是被连续腐蚀的。
局部使用的组合物包括软膏剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂、液体滴剂和插入物(例如眼内插入物)。可根据已知的方法配制这样的组合物。
胃肠外给药的组合物通常是无菌水或油溶液或精制的悬浮液，或可提供为精细分散的无菌粉末形式，与无菌水临时配制用于注射。
直肠或阴道内给药制剂的实例包括阴道栓剂或栓剂，其可用例如含活性化合物的外观可塑的或蜡质材料形成。
吸入给药的组合物可采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并可用粉末吸入装置或气溶胶分散装置以标准形式给药。这样的装置时众所周知的。对于吸入给药，粉末状制剂通常包含活性化合物和惰性固体粉末状稀释剂例如乳糖。
通常本发明化合物将以单位剂型存在，这样将通常包含足够的化合物以提供需要水平的生物活性。例如，预期口服给药的制剂可包含从2毫克至200毫克活性成分，更通常从10毫克至100毫克，例如12.5毫克、25毫克和50毫克。
活性化合物将以足够获得需要的治疗效应的量被给药于有需要的患者(例如人或动物患者)。
实施例以下非限制性实施例说明本发明的二氢丁苯那嗪化合物的合成和特性。
实施例1制备二氢丁苯那嗪的2S，3S，11bR和2R，3R，11bS异构体1A.还原RR/SS丁苯那嗪 在0℃用超过30分钟将四氢呋喃(135ml，135mmol，2.87当量)中的1M L-Selectride缓慢加入丁苯那嗪RR/SS外消旋化合物(15g，47mmol)在乙醇(75ml)和四氢呋喃(75ml)中的搅拌溶液内。完成添加后在0℃将混合物搅拌30分钟，然后任其升温至室温。
将混合物倾至碎冰(300g)上并加入水(100ml)。用乙醚(2×200ml)提取溶液并用水(100ml)冲洗合并的含醚提取液，用无水碳酸钾部分干燥。用无水硫酸镁完成干燥，过滤后，减压除去溶剂(避光，浴温＜20℃)得到淡黄色固体。
用石油醚(30-40℃)使固体淤浆化并过滤得到白色粉状固体(12 g，80％)。
1B.将还原的丁苯那嗪脱水
在0℃用超过30分钟将五氯化磷(32.8g，157.5mmol，2.5当量)分批加入来自实施例1A的还原的丁苯那嗪产物(20g，62.7mmol)在二氯甲烷(200ml)中的搅拌溶液内。完成添加后，在0℃将反应混合物再搅拌30分钟，将溶液缓慢倾至含碎冰(0℃)的2M碳酸钠水溶液中。一旦起初的酸性气体放出停止即用固体碳酸钠碱化(约pH12)混合物。
用乙酸乙酯(800ml)提取碱性溶液并用无水硫酸镁干燥合并的有机提取液。过滤后减压除去溶剂得到褐色油，将其通过柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯)纯化得到半纯化的烯烃(10.87g，58％)，为黄色固体。
1C.将实施例1B的粗品烯烃水合 在室温下，通过将1M硼烷-THF(155.6ml，155.6mmol，4.30当量)滴加入来自实施例1B的粗品烯烃(10.87g，36.11mmol)在干燥THF(52ml)中的溶液内来进行处理。搅拌反应物2小时，加入水(20ml)并用30％氢氧化钠水溶液将溶液碱化至pH12。
将30％过氧化氢水溶液(30ml)加入搅拌的碱性反应混合物中，将溶液加热至回流1小时，然后任其冷却。加入水(100ml)并用乙酸乙酯(3×250ml)提取混合物。将有机提取液合并，经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂得到黄色油状物(9g)。
以350mg每注射液用制备型HPLC(柱Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm，流动相己烷∶乙醇∶二氯甲烷(85∶15∶5)；UV 254nm，流量10ml min-1)纯化该油状物，接着真空浓缩需要的流分。然后使产物油溶于乙醚中并再次真空浓缩，得到上文显示的二氢丁苯那嗪外消旋物(5.76g，50％)，为黄色泡沫。
1D.制备Mosher’s酯衍生物 将R-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲苯基乙酸(5g，21.35mmol)、草酰氯(2.02ml)和DMF(0.16ml)加入无水二氯甲烷(50ml)并在室温将溶液搅拌45分钟。减压浓缩溶液并用无水二氯甲烷(50ml)再吸收残留物1次。用冰水浴冷却生成的溶液，加入二甲氨基吡啶(3.83g，31.34mmol)，接着是实施例1C固体产物(5g，15.6mmol)在无水二氯甲烷中的预干燥溶液(过4筛网)。在室温搅拌45分钟后，加入水(234ml)并用乙醚(2×200ml)提取混合物。将乙醚提取液用无水硫酸镁干燥，通过二氧化硅垫，用乙醚洗脱产物。
减压浓缩收集的乙醚洗脱液得到油状物，用柱层析(二氧化硅，己烷∶乙醚(10∶1))将其纯化。蒸发需要收集的柱流分并减压除去溶剂得到固体，用柱层析(二氧化硅，己烷∶乙酸乙酯(1∶1))将其进一步纯化得到3种主要成分，其部分溶于Mosher’s酯峰1和2。
以300mg装填3种成分的制备型HPLC(柱2×Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm，流动相己烷∶异丙醇(97∶3)，UV 254nm；流量10ml min-1)，然后真空浓缩需要的流分，得到纯化的Mosher’s酯衍生物峰1(3.89g，46.5％)峰2(2.78g，33％)
将对应于两个峰的流分水解以释放经鉴定且具有异构体A和B特征的各二氢丁苯那嗪异构体。相信异构体A和B各自具有一种以下结构 1E.水解峰1得到异构体A将20％氢氧化钠水溶液(87.5ml)加入Mosher’s酯峰1(3.89g，7.27mmol)的甲醇(260ml)溶液中并将混合物搅拌和加热至回流150分钟。冷却至室温后加入水(200ml)并用乙醚(600ml)提取溶液，经无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩。
将残留物用乙酸乙酯(200ml)溶解，用水(2×50ml)冲洗溶液，将有机相经无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩得到黄色泡沫。用柱层析(二氧化硅，梯度洗脱为乙酸乙酯∶己烷(1∶1)至乙酸乙酯)纯化该物质。合并需要的流分并减压除去溶剂。在乙醚中吸收残留物并再次减压除去溶剂得到异构体A(1.1g，47％)，为灰白色泡沫。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、质谱法、手性HPLC和ORD鉴定异构体A的特征，相信其或者具有2S，3S，11bR，或者具有2R，3R，11bS构型(未确定绝对立体化学)。异构体A的IR、NMR和MS数据在表1中显示，而手性HPLC和ORD数据在表3中显示。
1F.水解峰2得到异构体B将20％氢氧化钠水溶液(62.5ml)加入Mosher’s酯峰2(2.78g，5.19mmol)的甲醇(185ml)溶液中并将混合物搅拌和加热至回流150分钟。冷却至室温后加入水(142ml)并用乙醚(440ml)提取溶液，经无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩。
将残留物用乙酸乙酯(200ml)溶解，用水(2×50ml)冲洗溶液，将有机相经无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩。将石油醚(30-40℃)加入残留物中，将溶液再次真空浓缩得到异构体B(1.34g，81％)，为白色泡沫。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、质谱法、手性HPLC和ORD鉴定异构体B的特征，相信其或者具有2S，3S，11bR，或者具有2R，3R，11bS构型(未确定绝对立体化学)。异构体B的IR、NMR和MS数据在表1中显示而手性HPLC和ORD数据在表3中显示。
实施例2制备二氢丁苯那嗪的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS异构体2A.制备2，3-二氢丁苯那嗪按实施例1A的方法，用L-Selectride使含RR和SS丁苯那嗪对映体外消旋混合物(15g，47mmol)的四氢呋喃溶液还原，得到二氢丁苯那嗪的2S，3R，11bR和2R，3S，11bS对映体混合物(12g，80％)，为白色粉状固体。然后按实施例1B的方法，用PCl5使部分纯化的二氢丁苯那嗪脱水，得到2，3-二氢丁苯那嗪的11bR和11bS异构体(下文未显示其11bR对映体)的半纯化混合物(12.92g，68％)，为黄色固体。
2B.将得自实施例2A的粗品烯烃环氧化
将70％过氯酸(3.70ml，43mmol)的甲醇(215ml)溶液加入来自实施例2A的粗品烯烃(12.92g，42.9mmol)在甲醇(215ml)中的搅拌溶液内。将77％3-氯过氧苯甲酸(15.50g，65mmol)加入反应物中，在室温将生成的混合物避光搅拌18小时。
将反应混合物倾入饱和亚硫酸钠水溶液(200ml)中并加入水(200ml)。将氯仿(300ml)加入生成的乳液中并用饱和碳酸氢钠水溶液(400ml)碱化混合物。
收集有机层并用另外的氯仿(2×150ml)冲洗水层。将合并的氯仿层用无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂，得到褐色油状物(14.35g，产率＞100％-产物中可能残余溶剂)。该物质无需进一步纯化即可使用。
2C.将2B的环氧化物还原性开环 用15分钟用1M硼烷/THF(184.6ml，184.6mmol)缓慢处理来自实施例2B的粗品环氧化物(14.35g，42.9mmol，假定100％产率)在干燥THF(80ml)中的搅拌溶液。将反应物搅拌2小时，加入水(65ml)并搅拌，使溶液加热至回流30分钟。
冷却后，将30％氢氧化钠溶液(97ml)加入反应混合物，然后加入30％过氧化氢溶液(48.6ml)，将反应物搅拌并再加热至回流1小时。
用乙酸乙酯(500ml)提取冷却的反应混合物，经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂得到油状物。将己烷(230ml)加入油状物中并再减压浓缩溶液。
用柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯)纯化油状残留物。将需要的流分合并并减压除去溶剂。用柱层析(二氧化硅，梯度，己烷至乙醚)再次纯化残留物。将需要的流分合并并减压蒸发溶剂，得到淡黄色固体(5.18g，38％)。
2D.制备二氢丁苯那嗪的2R，3S，11bR和2S，3R，11bS异构体的Mosher’s酯衍生物 将R-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲苯基乙酸(4.68g，19.98mmol)、草酰氯(1.90ml)和DMF(0.13ml)加入无水二氯甲烷(46ml)中并在室温将溶液搅拌45分钟。减压浓缩溶液并在无水二氯甲烷(40ml)中再次吸收残留物。用冰水浴冷却生成的溶液，加入二甲氨基吡啶(3.65g，29.87mmol)，然后加入实施例2C的固体产物(4.68g，14.6mmol)在无水二氯甲烷(20ml)中的预干燥溶液(过4筛网)。在室温搅拌45分钟后，加入水(234ml)并用乙醚(2×200ml)提取混合物。将乙醚提取液经无水硫酸镁干燥，通过二氧化硅垫并用乙醚洗脱产物。
减压浓缩收集的乙醚洗脱液得到油状物，用柱层析(二氧化硅，己烷∶乙醚(1∶1))将其纯化。将需要收集的柱流分蒸发并减压除去溶剂得到粉红色固体(6.53g)。
以100mg装填固体的制备型HPLC(柱2×Lichrospher Si60，5μm，250×21.20mm；流动相己烷∶异丙醇(97∶3)；UV 254nm；流量10mlmin-1)，然后真空浓缩需要的流分得到固体，用石油醚(30-40℃)使其淤浆化并过滤收集得到纯化的Mosher’s酯衍生物峰1(2.37g，30％)峰2(2.42g，30％)将对应于两个峰的流分水解以释放经鉴定且具有异构体C和D特征的各二氢丁苯那嗪异构体。相信异构体C和D各自具有一种以下结构 2F.水解峰1得到异构体C将20％氢氧化钠水溶液(53ml)加入Mosher’s酯峰1(2.37g，4.43mmol)在甲醇(158ml)中的搅拌溶液内并将混合物搅拌回流150分钟。冷却后将水(88ml)加入反应混合物并用乙醚(576ml)提取生成的溶液。将有机提取液经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂。将乙酸乙酯(200ml)加入残留物，并用水(2×50ml)冲洗溶液。将有机溶液经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂。
用石油醚(30-40℃)处理残留物并过滤收集生成的悬浮固体。减压浓缩滤液并过滤收集第二批悬浮的固体。将两次收集的固体合并，减压干燥得到异构体C(1.0g，70％)。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、质谱法、手性HPLC和ORD鉴定异构体C的特征，相信其或者具有2R，3S，11bR，或者具有2S，3R，11bS构型(未确定绝对立体化学)。异构体C的IR、NMR和MS数据在表2中显示，而手性HPLC和ORD数据在表4中显示。
2G.水解峰2得到异构体D将20％氢氧化钠水溶液(53ml)加入Mosher’s酯峰2(2.42g，4.52mmol)在甲醇(158ml)中的搅拌溶液内并将混合物搅拌回流150分钟。冷却后将水(88ml)加入反应混合物并用乙醚(576ml)提取生成的溶液。将有机提取液经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂。将乙酸乙酯(200ml)加入残留物中，并用水(2×50ml)冲洗溶液。将有机溶液经无水硫酸镁干燥，过滤后减压除去溶剂。
用石油醚(30-40℃)处理残留物并过滤收集生成的悬浮橙色固体。使该固体溶于乙酸乙酯∶己烷(15∶85)并用柱层析(二氧化硅，梯度乙酸乙酯∶己烷(15∶85)至乙酸乙酯)纯化。合并需要的流分并减压除去溶剂。用石油醚(30-40℃)使残留物淤浆化并过滤收集生成的悬浮液。减压干燥收集的固体得到异构体D(0.93g，64％)，为白色固体。
用1H-NMR、13C-NMR、IR、质谱法、手性HPLC和ORD鉴定异构体D的特征，相信其或者具有2R，3S，11bR，或者具有2S，3R，11bS构型(未确定绝对立体化学)。异构体D的IR、NMR和MS数据在表2中显示，而手性HPLC和ORD数据在表4中显示。
在表1和2中，用KBr压片(disc)确定红外光谱。用Varian GeminiNMR波谱仪(200MHz.)在氘化氯仿溶液中进行1H NMR光谱。用Varian Gemini NMR波谱仪(50MHz)在氘化氯仿溶液中进行13C NMR光谱。用Micromass Platform II(ES+条件)波谱仪获得质谱。在表3和4中，在24℃下，在甲醇溶液中用Optical Activity PolAAr 2001仪器获得旋光色散数据。用带UV检测器的HP1050 HPLC层析仪测量HPLC保留时间。
表1和2-光谱数据
表3和4-层析和ORD数据
实施例3制备异构体B和制备甲磺酸盐的替代方法3A.还原RR/SS丁苯那嗪 用30分钟将四氢呋喃(52ml，52mmol，1.1当量)中的1MSelectride缓慢加入丁苯那嗪外消旋物(15g，47mmol)在四氢呋喃(56ml)中的冷却(冰浴)、搅拌的溶液内。完成添加后，任由混合物升温至室温并再搅拌6小时。TLC分析(二氧化硅，乙酸乙酯)显示只残留极少量起始材料。
将混合物倾至碎冰(112g)、水(56ml)和冰醋酸(12.2g)的搅拌的混合物中。用乙醚(2×50ml)冲洗生成的黄色溶液并缓慢加入固体碳酸钠(约13g)使其碱化。边搅拌边将Pet-醚(30-40℃)(56ml)加入混合物中，过滤收集粗产物β-DHTBZ，为白色固体。
使粗制固体溶于二氯甲烷(约150ml)并用水(40ml)冲洗生成的溶液，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩至约40ml。形成白色固体的稠密悬浮液。加入Pet-醚(30-40℃)(56ml)并在实验室温度将悬浮液搅拌15分钟。过滤收集产物并用pet-醚(30-40℃)(40至60ml)在滤器上冲洗直至雪白，在室温风干后得到β-DHTBZ(10.1g，67％)，为白色固体。TLC分析(二氧化硅，乙酸乙酯)显示只有一种成分。
3B.制备和分级结晶外消旋β-DHTBZ的樟脑磺酸盐加热使实施例3A的产物和1当量(S)-(+)-樟脑-10-磺酸溶于最小量甲醇。任由生成的溶液冷却，然后用乙醚缓慢稀释直至生成的固体沉淀物的形成结束。过滤收集生成的白色结晶固体并用乙醚冲洗，然后干燥。
使樟脑磺酸盐(10g)溶于热的无水乙醇(170ml)和甲醇(30ml)的混合物中。搅拌生成的溶液并任其冷却。2小时后过滤收集形成的沉淀物(2.9g)，为白色结晶固体。使结晶材料样品与过量饱和的碳酸钠水溶液和二氯甲烷在分液漏斗中振荡。将有机相分离，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。用pet-醚(30-40℃)研磨残留物并再次浓缩有机溶液。用Chirex(S)-VAL和(R)-NEA 250×4.6mm柱对该盐进行手性HPLC分析，用己烷∶乙醇(98∶2)洗脱液以1ml/分钟的流速洗脱，显示分离的β-DHTBZ浓缩在一种对映体中(对映体过量约80％)。
使浓缩的樟脑磺酸盐(14g)溶于热的无水乙醇(140ml)并加入丙-2-醇(420ml)。搅拌生成的溶液，在1分钟内开始形成沉淀物。任由混合物冷却至室温并搅拌1小时。将形成的沉淀物过滤收集，用乙醚冲洗并干燥得到白色结晶固体(12g)。
使结晶物质与过量的饱和碳酸钠水溶液和二氯甲烷在分液漏斗中振荡。将有机相分离，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。用pet-醚(30-40℃)研磨残留物并再次浓缩有机溶液，得到(真空干燥后)(+)-β-DHTBZ(6.6g，ORD+107.8°)。分离的对映体的对映体过量＞97％。
3C.制备异构体B用超过10分钟将五氯化磷(4.5g，21.6mmol，1.05当量)的二氯甲烷(55ml)溶液稳定地加入实施例3B的产物(6.6g，20.6mmol)在二氯甲烷(90ml)中的搅拌、冷却(冰水浴)溶液内。完成添加后，将生成的黄色溶液再搅拌10分钟，然后倾至碳酸钠(15g)在水(90ml)和碎冰(90g)中的快速搅拌的混合物内。将混合物再搅拌10分钟并移至分液漏斗中。
一旦分离出各相，即将褐色二氯甲烷层除去，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到粗品烯烃(约6.7g)中间体，为褐色油状物。TLC分析(二氧化硅，乙酸乙酯)显示粗产物内无(+)-β-DHTBZ残留。
在无水四氢呋喃(40ml)中吸收粗品烯烃(干燥的氮气气氛)并用超过15分钟边搅拌边加入硼烷的THF(1 M溶液，2.5当量，52ml)溶液。然后在室温将反应混合物搅拌2小时。TLC分析(二氧化硅，乙酸乙酯)显示反应混合物中无烯烃中间体残留。
将氢氧化钠(3.7g)的水(10ml)溶液、过氧化氢水溶液(50％，约7ml)先后加入正在搅拌的反应混合物中，将形成的两相混合物搅拌回流1小时。此时有机相的TLC分析(二氧化硅，乙酸乙酯)显示出现如异构体B预期的Rf的产物。还显示特征性非极性成分。
任由反应混合物冷却至室温并将其倾入分液漏斗。将上面的有机层除去并减压浓缩以除去大部分THF。使残留物在乙醚(稳定的(BHT)，75ml)中吸收，用水(40ml)冲洗，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到淡黄色油状物(8.1g)。
用柱层析(二氧化硅，乙酸乙酯∶己烷(80∶20)，增加至100％乙酸乙酯)纯化黄色油状物，收集需要的柱流分、合并并减压浓缩得到苍白色油，将其用乙醚(稳定的，18ml)处理并减压浓缩得到异构体B(2.2g)，为淡黄色固体泡沫。
用实施例3B列出的条件进行的手性HPLC证实已经产生的异构体B的对映体过量(e.e.)大于97％。
用Bellingham Stanley ADP220旋光计测量旋光度得到[αD]为+123.5°。
3D.制备异构体B的甲磺酸盐通过使1当量来自实施例3C的异构体B与1当量甲磺酸的混合物溶于最小量乙醇、然后加入乙醚制备异构体B的甲磺酸盐。过滤收集形成的生成白色沉淀物并真空干燥得到甲磺酸盐，产率约为85％而纯度(通过HPLC)约为96％。
实施例4用[3H]二氢丁苯那嗪结合试验筛选VMAT-2结合活性二氢丁苯那嗪是对VMAT-2非常有效和选择性的抑制剂，与这种液泡转运蛋白高亲和力(nM范围)结合。多年来已将[3H]二氢丁苯那嗪作为放射性配体成功用于标记人、牛和啮齿动物脑内的VMAT-2(例如Scherman等J.Neurochem.50，1131-1136(1988)；Near等Mol.Pharmacol.30，252-257(1986)；Kilbourn等Eur.J.Pharmacol.278，249-252(1995)；和Zucker等Life Sci.69，2311-2317(2001))。
用下文描述的试验测定4种二氢丁苯那嗪异构体A、B、C和D抑制VMAT-2转运蛋白的能力。
方法和材料成年大鼠(Wistar品系)前脑膜的制备基本上如Chazot等(1993)Biochem.Pharmacol.45，605-610所述。成年大鼠纹状体液泡膜的制备基本上如于Roland等(2000)，JPET 293，329-335所述。在25℃将10μg膜与[3H]二氢丁苯那嗪(18-20 nM)在50 mM HEPES pH8.0(测试缓冲液)中培养60分钟，在GF/B玻璃纤维滤器上真空速滤收集结合的放射性配体。在2μM未标记丁苯那嗪的存在下，在并行样品中确定非特异性结合。在β-计数器的闪烁液中计算放射性。以一式三份测定4种测试化合物(异构体A、B、C和D)的完全浓度范围(对数和半对数单位)(范围10-11-10-4M)。使测试化合物和丁苯那嗪以10 mM的贮备浓度溶于DMSO，然后在测试缓冲液中制备稀释液。对每种化合物都进行3种独立实验。用GraphPad Prism 3.2软件包对数据进行分析和曲线拟合。
结果最初，制备成年大鼠前脑P2膜标本(Chazot等，1993)并按原始的方案中所述测定。这产生极低水平的特异性结合活性。
然后制备成年大鼠纹状体液泡标本，这产生显著水平的稳定的特异性[3H]二氢丁苯那嗪结合位点(5-6pmol/mg蛋白)。这与公开的资料(Roland等，2000)非常相符。该制备用于所有后来的测定。
表5-测试化合物的竞争性结合参数
3种独立实验的数据以均数±SD表示。KI值的确定以公开的大鼠纹状体KD值1.2nM(Roland等，2000)为基础。
根据总KI值的总的药理学曲线图是异构体C＞异构体B＞异构体D＞＞异构体A。
值得注意的是，异构体B和异构体A都产生狭窄的竞争曲线，这最适合双位结合模型。
异构体A具有高亲和力(KI＝59nM)和低亲和力位点(KI＜5.9μM亲和力)，各自促成约50％总位点。这可提示异构体A可以区分不同的纹状体VMAT-2结合位点。
实施例5VMAT功能测试A.VMAT2功能测试如实施例3中所述。由此，将大鼠纹状体P2膜标本(Chazot等，1993)再悬浮并在冰冷的蒸馏水中均化。加入25 mMHEPES和100 mM酒石酸钾(pH7.5，4℃)使渗透性恢复。然后将标本以20,000×g(4℃)离心20分钟。将生成的S3部分除去，加入硫酸镁(得到终浓度为1 mM，pH7.5，4℃)，将混合物以100,000×g离心45分钟。最后的P4部分包含用于测试的突触泡。
将100μl(约2.5μg蛋白)突触泡的等分试样与增加浓度的测试化合物C和B(在10-2M DMSO贮备液中新鲜制备)预温育30分钟(浓度范围10-9M-10-4M)，然后在30℃在测试缓冲液(25mM HEPES，100mM酒石酸钾，1.7mM抗坏血酸，0.05mM EGTA，0.1mM EDTA，2mM ATP-Mg2+，pH7.5)中，在[3H]多巴胺(30nM终浓度)的存在下温育3分钟。然后加入含2mM MgSO4而不是2mM ATP-Mg2+的冰冷的缓冲液测试缓冲液(pH7.5)终止反应，并通过浸在0.5％聚乙烯亚胺中的Whatman滤器速滤。用Brandel Harvester用冷缓冲液冲洗滤器3次。用液体闪烁计数器对截留在滤器上的放射性进行计数，通过在4℃测定吸收的液泡[3H]多巴胺确定非特异性结合。方法的依据描述于Ugarte YV等(2003)Eur.J.Pharmacol.472，165-171中。用10μM丁苯那嗪确定选择性吸收的VMAT-2。
化合物C(表观IC50＝18±2 nM)和化合物B(表观IC50＝30±3 nM)都通过VMAT-2转运蛋白抑制[3H]多巴胺吸收入大鼠纹状体液泡，这种功能性亲和力(曲线图C＞B)类似于用[3H]二氢丁苯那嗪结合试验确定它们各自的结合亲和力。
B.VMAT1功能测试与VMAT2分离、单独具有VMAT1的天然组织非常有限。然而，丁苯那嗪对VMAT2比对VMAT1的亲和力高至少200倍，可将这种差别用于阻断功能测试中VMAT2的影响(Erickson等(1996)PNAS(USA)93，5166-5171)。基本上如Moshharov等(2003)J Neurosci.23，5835-5845中所述，从年轻成年SD大鼠中分离肾上腺嗜铬细胞。由此，在冰冷的PBS中切开肾上腺，除去腺体的荚膜和皮质，绞碎残留的髓质。用PBS冲洗多次后，在30℃将组织与无Ca2+胶原酶IA溶液(250U/ml)温育30分钟并轻轻搅拌。冲洗消化的组织3次并将分裂的细胞以3000rpm离心得到沉淀物，将其悬浮于PBS中。按对脑标本描述的同一方式分离液泡部分。
将100μl(约2.5μg蛋白)突触泡与增加浓度的测试化合物(按前文结合试验所述制备)预培养30分钟(浓度范围10-9M-10-4M)。该测试在30℃在[3H]多巴胺(30nM终浓度)存在下，在测试缓冲液(25mMHEPES，100mM酒石酸钾，1.7mM抗坏血酸，0.05mM EGTA，0.1mMEDTA，2mM ATP-Mg2+，pH7.5)中进行3分钟。在10μM丁苯那嗪(在该浓度选择性阻断VMAT2)存在下测定吸收的[3H]多巴胺。在4℃通过测量吸收的液泡[3H]多巴胺确定非特异性吸收。然后加入含2mMMgSO4而不是2mM ATP-Mg2+的pH7.5的冰冷的缓冲液测试缓冲液终止反应，并通过浸在0.5％聚乙烯亚胺中的Whatman滤器速滤。用Brandel Harvester用冷缓冲液冲洗滤器3次并用液体闪烁计数器对截留在滤器上的放射性进行计数。
在10μM丁苯那嗪存在下，化合物B和化合物C对[3H]多巴胺吸收的抑制都弱，两种化合物的IC50值都大于10-5M。这说明两种化合物对VMAT-1的亲和力都低。而且，数据显示两种化合物对VMAT-2比对VMAT-1的选择性至少高2个数量级。
实施例6受体和转运蛋白结合研究对4种二氢丁苯那嗪异构体A、B、C和D进行特异性结合试验以测定它们结合至下文描述的受体和转运蛋白的能力。结果在表6列出。
(a)肾上腺素α2A受体参考文献S.Uhlcn等J.Pharmacol.Exp.Ther.，2711558-1565(1994)来源人重组昆虫Sf9细胞配体1 nM[3H]MK-912载体1％DMSO培养时间/温度60分钟@25℃培养缓冲液75 mM Tris-HCl，pH 7.4，12.5 mM MgCl2，2 mM EDTA非特异性配体10μM WB-4101Kd0.6 nMBmax4.6 pmole/mg蛋白特异性结合95％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制(b)肾上腺素α2B受体参考文献S.Uhlen等Eur.J.Pharmacol.，33(1)93-1-1(1998)
来源人重组CHO-K1细胞配体2.5nM[3H]萝芙素(Rauwolscine)载体1％DMSO培养时间/温度60分钟@25℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，1mM EDTA，12.5mM MgCl2，pH7.4，0.2％BSA，在25℃非特异性配体10μM哌唑嗪Kd2.1nMBmax2.1pmole/mg蛋白特异性结合90％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制(c)多巴胺D1受体参考文献Dearry等，Nature，34772-76(1990)来源人重组CHO细胞配体1.4nM[3H]SCH-23390载体1％DMSO培养时间/温度2小时@37℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗坏血酸，0.001％BSA非特异性配体10μM(+)-布他拉莫Kd1.4nMBmax0.63pmole/mg蛋白特异性结合90％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制
(d)多巴胺D2L受体参考文献Bunzo等，Nature，336783-787(1988)来源人重组CHO细胞配体0.16nM[3H]螺哌隆载体1％DMSO培养时间/温度2小时@25℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗坏血酸，0.001％BSA非特异性配体10μM氟哌啶醇Kd0.08nMBmax0.48pmole/mg蛋白特异性结合85％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制(e)多巴胺D3受体参考文献Sokoloff等，Nature，347146-151(1990)来源人重组CHO细胞配体0.7nM[3H]螺哌隆载体1％DMSO培养时间/温度2小时@37℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，pH7.4，150nM NaCl，1.4nM抗坏血酸，0.001％BSA非特异性配体25μtM S(-)-舒必利Kd0.36nMBmax1.1pmole/mg蛋白特异性结合85％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制
(f)咪唑啉I2(中枢)受体参考文献Brown等，Brit.J.Pharmacol.，99803-809，(1990)来源Wistar大鼠大脑皮质配体2nM[3H]咪唑克生载体1％DMSO培养时间/温度30分钟@25℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH7.4，在25℃非特异性配体1μM咪唑克生Kd4nMBmax0.14pmole/mg蛋白特异性结合85％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制(g)Sigma σ1受体参考文献Ganapathy等，Pharmacol.Exp.Ther.，289251-260，(1999)来源人jurkat细胞配体8nM[3H]氟哌啶醇载体1％DMSO培养时间/温度4小时@25℃培养缓冲液50mM K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH7.5非特异性配体10μM氟哌啶醇Kd5.8nMBmax0.71pmole/mg蛋白特异性结合80％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制
(h)Sigmaσ2受体参考文献Hashimoto等，Eur.J.Pharmacol.，236159-163，(1993)来源Wistar大鼠脑配体3nM[3H]艾芬地尔载体1％DMSO培养时间/温度60分钟@37℃培养缓冲液50mM Tris-HCl，pH7.4非特异性配体10μM艾芬地尔Kd4.8nMBmax1.3pmole/mg蛋白特异性结合85％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制(i)血清素转运蛋白(SERT)参考文献Gu等，J.Biol.Chem.，269(10)7124-7130，(1994)来源人重组HEK-293细胞配体0.15nM[125I]RTI-55载体1％DMSO培养时间/温度3小时@4℃培养缓冲液100mM NaCl，50mM Tris-HCl，1μM亮抑酶肽，10μMPMSF，pH7.4非特异性配体10μM丙咪嗪Kd0.17nMBmax0.41pmole/mg蛋白特异性结合95％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制
(j)多巴胺转运蛋白(DAT)参考文献Giros等，Trends Pharmacol.Sci.，1443-49(1993)Gu等，J.Biol.Chem.，269(10)7124-7130(1994)来源人重组CHO细胞配体0.15nM[125I]RTI-55载体1％DMSO培养时间/温度3小时@4℃培养缓冲液100mM NaCl，50mM Tris-HCl，1μM亮抑酶肽，10μMPMSF，pH7.4非特异性配体10μM诺米芬新Kd0.58nMBmax0.047pmole/mg蛋白特异性结合90％定量方法放射性配体结合显著性标准≥50％最大刺激或抑制表6
实施例7酶测试测试异构体B和C抑制参与CNS内单胺处理的酶，即儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)、单胺氧化酶A和单胺氧化酶B的能力。使用的测试方法在下文描述而结果在表7列出。
(a)儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制来源猪肝底物3mM儿茶酚+S-腺苷-L-[3H]蛋氨酸载体1％DMSO预培养时间/温度无培养时间60分钟@37℃培养缓冲液100mM磷酸钾，10mM MgCl2，含12单位/ml腺苷脱氨酶的3mM DTT，pH7.4定量方法[3H]guiacol定量显著性标准≥50％最大刺激或抑制(b)单胺氧化酶MAO-A抑制来源人重组体底物50μM犬尿胺(kynuramine)载体1％DMSO预培养时间/温度15分钟@37℃培养时间60分钟@37℃培养缓冲液100mM KH2PO4，pH7.4定量方法4-羟基喹啉的荧光分光光度计法定量显著性标准≥50％最大刺激或抑制(c)单胺氧化酶MAO-B抑制来源人重组体底物50μM犬尿胺载体1％DMSO预培养时间/温度15分钟@37℃培养时间60分钟@37℃培养缓冲液100mM KH2PO4，pH7.4定量方法4-羟基喹啉的荧光分光光度计法定量显著性标准≥50％最大刺激或抑制表7
实施例8细胞测试用以下测试条件测定异构体B和C对人胚肾细胞吸收血清素(5-羟色胺)的抑制能力目标人HEK-293细胞载体0.4％DMSO培养时间/温度10分钟@25℃培养缓冲液5mM Tris-HCl，7.5mM HEPES，120mM NaCl，5.4mMKCl，1.2mM CaCl2，1.2mM MgSO4，5mM葡萄糖，1mM抗坏血酸，pH7.1定量方法将吸收的[3H]血清素定量显著性标准相对于fluxetine反应对[3H]血清素吸收的抑制≥50％
结果显示化合物B是拮抗剂并在10μM浓度时对血清素吸收的抑制为56％。化合物B的IC50是7.53μM。
还显示化合物C是拮抗剂并在10μM浓度时对血清素吸收的抑制为86％。化合物B的IC50是1.29μM。
实施例95-HT1D/1B结合测试用根据描述于Millan，MJ等(2002)Pharmacol.Biochem.Behav.71，589-598的测试方法测定化合物B和化合物C结合至5-HT1D/1B受体的能力。用[N-甲基3H]GR-125743作为5-HT1D和5-HT1B受体的放射性配体。将成年SD大鼠前脑P2膜(Chazot等，1993)用于测试。所用的测试缓冲液是室温下pH7.7的含4 mM氯化钙、0.1％抗坏血酸和10μM帕吉林的50mM Tris-HCl。用5-HT(10μM)定义非特异性结合。在室温下与1nM[3H]GR-125743温育1小时，用预浸在0.1％聚乙烯亚胺中的GF/B滤器的Brandel Harvester速滤终止反应，然后用冰冷的缓冲液(补充0.1％BSA)冲洗3次。使用的10-10-10-4M剂量范围。用GraphPad Prism 4软件包分析生成的竞争曲线。
化合物B和C都很少取代[3H][N-甲基]GR-125743结合于大鼠前脑膜(IC50值＞10-4M)，提示B和C对5-HT1D/B受体的亲和力都低。
实施例10用Caco-2吸收测试确定二氢丁苯那嗪异构体A、B、C和D的肠内渗透性Caco-2吸收测试是对药物体内肠道吸收进行体外评估的成熟系统-参见Meunier等，Cell Biology and Toxicology(细胞生物学和毒理学)，11187-194，Wils等，Cell Biology and Toxicology，10393-397，以及Gres等，Pharm Sci，15(5)726-732。
该测试依赖Caco-2细胞在微孔过滤器上培养约21天时分化为肠细胞的能力。在培养期间，Caco-2细胞经历自发性形态学和生物化学改变，在顶端表面产生边界清楚的刷状缘的极化单层，以及紧密的细胞连接。因此，这些细胞可用作分析药物渗透性的体外模型。
可通过将化合物各自加至顶端或基底外侧室从2个方向测定跨Caco-2单层的吸收顶端至基底外侧或基底外侧至顶端。在不同时间点，从接收室收集样品，分析吸收率作为测定的跨单层的表观渗透系数(Papp)。
Papp值反映测试物通过跨细胞(通过细胞膜)和旁细胞(通过细胞间的紧密连接)两种途径渗透的综合。这些途径的相对作用取决于pKa、分配系数(log D)、分子半径和在给定pH中测试物的电荷。然后可根据化合物通过Caco-2单层的渗透性用Papp值将化合物分出等级次序。
用Caco-2吸收模型确定4种二氢丁苯那嗪异构体A、B、C和D在50μM的表观渗透系数(Papp)并参照相对于化合物的低、中和高度渗透性进行分级。将放射性标记的参照标准甘露醇(低)、水杨酸(中)和睾酮(高)用于建立渗透性的等级次序。通过测定1小时后每种二氢丁苯那嗪测试物在供给和接收室中的浓度评估其Papp值。在顶端至基底外侧方向，在pH7.4跨细胞单层中确定吸收。使用于评估Papp值的Caco-2细胞在12孔平板中的Transwell插入物上生长26天。通过经上皮的电阻(Ohm-cm2)和荧光黄(Lucifer Yellow)方法在吸收测试之前和之后确定单层完整性。
材料和方法在甲醇中制备50mM的甘露醇、水杨酸和睾酮的贮备液。在测试当天，将参照标准物在pH 7.4的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中稀释，得到终浓度为50μM。然后将放射性标记的14C-甘露醇、3H-睾酮和14C-水杨酸加入它们对应的未标记的介质中，得到最终的比活性为0.35-0.65μCi/mL。在DMSO中制备浓度为50mM的二氢丁苯那嗪异构体样品。将每种贮备液进一步稀释在HBSS缓冲液(pH7.4)中，得到50μM的最终工作浓度。
如下制备Caco-2细胞悬浮液。将传代数为29的一管Caco-2原始细胞(ID号Caco-29-080299)(美国典型培养物保藏中心(VA，USA))解冻并放入含Caco-2培养基的150cm2烧瓶内培养。融合后，除去培养基并用5ml PBS冲洗细胞。加入并与0.25％胰蛋白酶-EDTA(每烧瓶2.0ml)在37℃培养约10分钟后分离细胞。在显微镜下监测细胞分离并加入10mL Caco-2培养基终止分离。通过台盼蓝排除法评估细胞活力和浓度。一旦确定细胞密度和活力，即将Caco-2细胞稀释在培养基中得到最终的工作浓度为2.0×105细胞/ml。Caco-2培养基包含Dulbecco’s改进的Eagle培养基、10％胎牛血清、100μM非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
在5％CO237℃水套培养箱中将Costar聚碳酸酯膜(0.4μm孔径)与Caco-2培养基预平衡1小时。将顶室内含物除去并用500μl Caco-2细胞悬浮液(200 000细胞/ml)代替。在5％CO237℃水套培养箱中将细胞进一步培养26天。
测定前，将所有单层用HBSS冲洗2次并用Millicell-ERS计量器测量它们经上皮的电阻(TEER)。减去无细胞时获得的TEER值作为本底信号。只将TEER值超过150 Ohm-cm2的单层用于吸收测试实验。
所有吸收实验都在pH7.4平行进行3次。从顶端至基底外侧方向评估每种参照标准物和二氢丁苯那嗪测试物的吸收率。在测试开始时留出每种工作溶液(50μM参照标准和测试物)的等分试样(100μl)用于确定起始浓度(C0)。
吸收实验从用500μl含测试物或参照化合物的Hanks平衡盐溶液代替供给室内含物开始。将细胞再送回CO2培养箱进行吸收测试。1小时后从接收和供给室收集100μl样品并用于确定回收百分数。将放射性标记的参照标准物(甘露醇、水杨酸和睾酮)用作质量控制并作为二氢丁苯那嗪测试物的等级对照。
在吸收实验结束时，通过监测荧光黄从顶端至基底外侧面的泄漏量评估各细胞单层的完整性。从顶端和基底外侧室除去所有溶液。用1.5ml新鲜HBSS充满基底外侧室，而用0.5ml 120μg/ml荧光黄溶液充满顶室。将细胞再送回培养箱1小时，然后收集100μl样品并用SpectraMax 340PC-读板器在428nm进行分光光度计定量。
将20μl体积每种放射性标记的样品加入10ml闪烁合剂(ScintiSafe 30％)中并用液体闪烁分析器计数(1900CA Tri-Carb)至多5分钟。
用液体层析-串联/质谱(LC-MS/MS)法分析Caco-2细胞培养物中存在的二氢丁苯那嗪。
用公式Papp＝dQ/dt×1/A×1/C0(cm/sec)计算表观渗透系数，其中dQ/dt是化合物的弥散率(μg/sec或整合面积/sec)，A是总的细胞膜表面积(cm2)，而C0是起始浓度(μg/mL或整合面积/sec)。
将不同二氢丁苯那嗪测试物的顶端至基底外侧的Papp值与参照标准的Papp值比较。结果在表8显示。二氢丁苯那嗪化合物C、D和A各自的Papp值为21.14×10-6、24.87×10-6和25.52×10-6cm/sec，其可与睾酮参照标准相比。
化合物B的Papp值为11.98×10-6cm/sec，其类似于水杨酸参照标准。
表8
化合物C、D和A的Papp值接近睾酮值，提示这些化合物在caco-2模型中具有高度渗透性，而化合物B的Papp值在水杨酸和睾酮值之间，提示其在Caco-2模型中具有中度渗透性。这些结果提示4种二氢丁苯那嗪异构体应当通过体内肠上皮高度吸收。
实施例11比较丁苯那嗪与二氢丁苯那嗪异构体B和C的镇静性能在大鼠中进行一项研究以确定本发明的二氢丁苯那嗪异构体是否具有镇静性能。用下文列出的方法将异构体对大鼠自主活动能力的效应与丁苯那嗪和氟哌啶醇产生的效应进行比较。
方法将研究开始时重量为200-250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠(查尔斯河实验室，Saint-Germain/L′Arbresle，法国)用于研究。将大鼠以每笼2或3只圈养在III型Makrolon笼内，房间内设定以下环境条件温度20±2 ℃，湿度最低45％，换气＞12每小时，光/暗循环为12h/12h[在7:00a.m.开始]。开始研究前让大鼠适应它们的条件至少5天。无限制地为大鼠提供食物(Dietex，Vigny，France，参考811002)和水(水瓶中的自来水)。
在实验当天新鲜制备各测试化合物的玉米油溶液。将氟哌啶醇制备在羟乙基纤维素中，以0.5％制备在去离子水中。载体或测试化合物以单一剂量(0.3、1、3和10mg/kg，2mL/kg腹腔注射)给药。参照化合物氟哌啶醇(1mg/kg)是腹腔注射(i.p.)(2mL/kg)给药。
在低光密度(最大50勒克斯)的房间中，将动物放置于摄像机下的有机玻璃笼子内。给药后45分钟和3小时，用视频图像分析器(Videotrack，View Point，法国)在20分钟时间段确定活动能力。给药后1小时记录参照组(氟哌啶醇)的活动能力。判断能走动的运动的数量和持续时间以及不活动的持续时间。活动能力测量结束时(45分钟和3小时)，将有机玻璃笼子内的眼睑闭合和唤醒按以下评分眼睑闭合0(正常)眼睑广泛地打开1眼睑轻度下垂2上睑下垂，眼睑下垂约一半3眼睑完全关闭唤醒1极低，木僵，昏迷，很少或无应答2低，少许木僵，《呆滞》，少许头部或躯体运动3有些低，轻微木僵，少许探索样运动，伴有不动期4正常，警觉，探索样运动/缓慢僵硬5有些高，轻度兴奋，紧张，突然疾走或停住6非常高，高度警觉，兴奋，突然发作性奔跑或躯体运动在两个20分钟时间段(给药后45分钟和3小时)用视频图像分析器(Videotrack，ViewPoint，Lyon，France)确定能走动(大)的运动的发生次数和持续时间(秒)以及不活动的持续时间(秒)。用放于有机玻璃笼子上的摄像机进行图像示踪，记录所有活动能力。将摄像机记录的图像数字化，并用以下方法将数字图像点的重力中心位移进行示踪和分析测量点的重力中心的位移速度并设定两个阈值定义运动类型阈值1(高速)和阈值2(低速)。当动物运动且点(spot)的重力中心的位移速度超过阈值1时，将该运动视为能活动的运动。当动物保持不动时，速度低于阈值2，将该运动视为不活动。
结果的12个单一值以均数±SEMs表示。采用ANOVA(单向)和Dunnett’s t-检验，用KruSkal-Wallis非参数检验，随后用Mann &Whitney U-检验对镇静cotation进行统计学分析。p值＜0.05表示具显著性。
实验方案组大小n＝12组1参照，氟哌啶醇(1mg/kg腹腔注射)组2载体对照组(2ml/kg腹腔注射)组3丁苯那嗪(0.3mg/kg腹腔注射)组4丁苯那嗪(1mg/kg腹腔注射)组5丁苯那嗪(3mg/kg腹腔注射)组6丁苯那嗪(10mg/kg腹腔注射)组7异构体C(0.3mg/kg腹腔注射)组8异构体C(1mg/kg腹腔注射)组9异构体C(3mg/kg腹腔注射)组10异构体C(10mg/kg腹腔注射)组11异构体B(0.3mg/kg腹腔注射)组12异构体B(1mg/kg腹腔注射)组13异构体B(3mg/kg腹腔注射)组14异构体B(10mg/kg腹腔注射)
结果
**单向ANOVA和Dunnett’s检验与载体组显著差异(p，0.01)。
结果证明给药后45分钟和3小时，丁苯那嗪产生剂量依赖的镇静效应，而异构体B和异构体C在任何时间都无镇静效应，即使异构体C在给药后3小时显示轻微且不显著的运动过度效应。
实施例12药用组合物(i)片剂制剂-I通过将50mg二氢丁苯那嗪与作为稀释剂的197mg乳糖(BP)以及作为润滑剂的3mg硬脂酸镁混合，并用已知的方法压紧形成片剂制备含本发明的二氢丁苯那嗪的片剂组合物。
(ii)片剂制剂-II通过将化合物(25mg)与氧化铁、乳糖、硬脂酸镁、白色玉米淀粉和滑石混合，并用已知的方法压紧成片剂制备含本发明的二氢丁苯那嗪的片剂组合物。
(iii)胶囊制剂通过将100mg本发明的二氢丁苯那嗪与100mg乳糖混合并将生成的混合物填充入标准不透光的硬明胶胶囊内制备胶囊制剂。
等价物很容易明白在不脱离本发明的原理下即可对上文描述的本发明的具体实施方案进行许多修饰和改变。所有这样的修饰和改变都打算包括在本申请书内。
权利要求
1.3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪。
2.基本纯形式的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪，例如异构纯度大于90％，典型大于95％且更优选大于98％。
3.根据权利要求1或权利要求2的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪，其为(+)-异构形式。
4.一种组合物，它包含基本上无3，11b-反式-二氢丁苯那嗪的3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪。
5.一种组合物，它包含3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪且含小于5％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪，优选小于3％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪，且更优选小于1％的3，11b-反式-二氢丁苯那嗪。
6.根据权利要求4或权利要求5的组合物，其中3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪是(+)-异构体。
7.3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2S，3S，11bR异构体，它具有式(Ia)
8.3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2R，3R，11bS异构体，它具有式(Ib)
9.3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2R，3S，11bR异构体，它具有式(Ic)
10.3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪的2S，3R，11bS异构体，它具有式(Id)
11.一种3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪异构体，当在21℃甲醇中测定时，它具有-114.6°的ORD[αD]值。
12.一种3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪异构体，当在21℃甲醇中测定时，它具有约+123°的ORD[αD]值。
13.一种3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪异构体，当在21℃甲醇中测定时，它具有+150.9°的ORD[αD]值。
14.一种3，11b-顺式-二氢丁苯那嗪异构体，当在21℃甲醇中测定时，它具有-145.7°的ORD[αD]值。
15.一种二氢丁苯那嗪异构体，其光谱学特征在本文表1中列出，而层析和任选的ORD特征在本文表3中列出。
16.一种二氢丁苯那嗪异构体，其光谱学特征在本文表2中列出，而层析和任选的ORD特征在本文表4中列出。
17.二氢丁苯那嗪异构体A，它具有本文表1中列出的光谱学特征、本文表3中列出的层析特征并具有左旋的旋光性。
18.二氢丁苯那嗪异构体B，它具有本文表1中列出的光谱学特征、本文表3中列出的层析特征并具有右旋的旋光性。
19.二氢丁苯那嗪异构体C，它具有本文表2中列出的光谱学特征、本文表4中列出的层析特征并具有右旋的旋光性。
20.二氢丁苯那嗪异构体D，它具有本文表2中列出的光谱学特征、本文表4中列出的层析特征并具有左旋的旋光性。
21.前述权利要求中任一项定义的二氢丁苯那嗪，它为游离碱形式。
22.权利要求1至20中任一项定义的二氢丁苯那嗪，它为酸加成盐形式。
23.根据权利要求22的二氢丁苯那嗪，其中所述盐是甲磺酸盐。
24.前述权利要求中任一项定义的二氢丁苯那嗪，它用于药物或治疗，例如治疗运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征或治疗抑郁。
25.一种药用组合物，它包含权利要求1至23中任一项定义的二氢丁苯那嗪以及药学上可接受的载体。
26.权利要求1至23中任一项定义的二氢丁苯那嗪在制备用于治疗运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征或治疗抑郁的药物中的用途。
27.一种预防或治疗需要这样的预防或治疗的患者的运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征或治疗抑郁的方法，该方法包括给予有效预防或治疗量的权利要求1至23中任一项定义的二氢丁苯那嗪。
28.一种制备权利要求1至23中任一项定义的二氢丁苯那嗪的方法，该方法包括使式(II)化合物 与适合将式(II)化合物中的2，3-双键水合的一种或多种试剂反应，其后在需要时分离和离析所需的二氢丁苯那嗪异构体形式。
29.一种制备权利要求1至23中任一项定义的二氢丁苯那嗪的方法，该方法包括使式(III)化合物 经历用于使式(III)化合物中的2，3-环氧化物基团开环的条件，其后在需要时分离和离析所需的二氢丁苯那嗪异构体形式。
30.一种制备权利要求29定义的式(III)化合物的方法，该方法包括使权利要求27定义的式(II)的烯烃化合物与适合形成环氧化物基团的氧化剂(例如过氧酸)反应。
31.一种制备权利要求28定义的式(II)化合物的方法，该方法包括用脱水剂例如卤化磷或卤氧化磷使3，11-反式-二氢丁苯那嗪脱水。
32.一种式(II)化合物
33.一种式(III)化合物
34.权利要求1至23中任一项定义的化合物的Mosher’s酸酯。
全文摘要
本发明提供二氢丁苯那嗪的新异构体、单一对映体及其混合物，其中二氢丁苯那嗪是3，11b－顺式－二氢丁苯那嗪。还提供制备新异构体的方法、包含它们的药用组合物以及它们在治疗运动过度的运动失调例如亨廷顿氏病、偏侧颤搐、老年性舞蹈病、抽搐、迟发性运动障碍和图雷特氏综合征中的用途。
文档编号A61K31/473GK1980924SQ200580012044
公开日2007年6月13日 申请日期2005年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者I·克拉克, R·特尔特尔, G·约翰斯顿, 罗伯特·特莱德盖茨 申请人:剑桥实验室(爱尔兰)有限公司