专利名称：含有fgf2作为有效成分的治疗或预防哮喘和慢性阻塞性肺病的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2，或碱性成纤维细胞生长因子，bFGF)作为有效成分的、用于预防和治疗哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的药剂。本发明还涉及由卵清蛋白(OA)和双链RNA(dsRNA)诱发的COPD和Th1哮喘小鼠模型。
背景技术：
过去20年中，哮喘的流行几乎加倍，而如今哮喘影响8-10％的世界人口。哮喘是一种气道慢性炎性紊乱，以对非特定刺激的气道高反应性(AHR)和气道重塑为特征，而气道重塑与所涉及的要素如成纤维细胞和肌成纤维细胞结构和功能的变化相关。哮喘大体分为支气管哮喘和心源性哮喘，但通常哮喘是指单纯性支气管哮喘。
连同哮喘一起，最具代表性的肺病之一是慢性阻塞性肺病(COPD)，但以伴随有气道阻塞而与哮喘相区别。COPD居世界范围内死亡原因的第四位，在10种最严重的疾病中，只有COPD的发病率在提高。气道和软组织持续发炎导致细支气管和软组织的病理变化而引起COPD，因而以闭塞性细支气管炎和肺气肿(软组织破坏)为特征。慢性阻塞性肺病的例子有慢性阻塞性支气管炎、慢性细支气管炎和肺气肿。
哮喘和这些慢性阻塞性肺部疾病的治疗依靠使用抗炎药剂或支气道扩张剂。糖皮质激素、白三烯调节剂和茶碱是代表性的抗炎药剂。
虽然糖皮质激素具有强的药效，但对特定的靶标不起作用，而是抑制所有的免疫和抗炎反应，这意味着糖皮质激素也抑制必要的免疫反应，具有严重的副作用，要求吸入治疗。白三烯调节剂具有较少的副作用，但受限于药效，因而不能独立控制哮喘而只能用作辅助剂。茶碱也存在药效弱和副作用的问题。
因此需要开发具有强的药效但更少副作用的哮喘治疗药剂。而对于开发这样的药剂来说，首先要全面理解哮喘的发展机理。
普遍接受的理论是辅助T细胞1型(Th1)或辅助T细胞2型(Th2)分泌对哮喘发展起重要作用的细胞因子，更确切的说，来自于Th1和Th2的细胞因子失衡引起哮喘(Th1/Th2假说)(Mosmann等人，J.Immunol.，1362348-57，1986；Robinson等人，N.Engl.J.Med.，326298-304，1992；Grunig等人，Science，2822261-3，1998；Richter等人，Am.J.Respir.CellMol.Biol.，25385-91，2001)。然而，由细胞因子诱发哮喘的准确机理尚未得到解释。
由活化的Th2淋巴细胞产生的白细胞介素-13(IL-13)是哮喘发病机理的关键细胞因子(Grunig等人，Science，2822261-3，1998)。这一结论得到如下研究结果的支持，在患过敏症的哮喘动物模型中，通过抑制IL-13的表达抑制气道高反应性，但通过气道给予重组IL-13时，再次诱发气道高反应性(Marsha等人，Science，2822258-2261，1998)。IL-13转基因小鼠显示的组织学报告与哮喘患者中观察到的结果相似，IL-13的过度表达诱发气道炎症、加速粘液分泌以及上皮细胞纤维化(Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999)。
IL-13可以通过促进炎症细胞尤其是嗜酸性粒细胞侵入提高AHR的观点仍很流行(Hargreave等人，J.Allergy clin.Immunol.，78825-32，1986)。然而，近来的证据却显示不存在嗜酸性粒细胞侵入时，仍然可以诱发AHR(Venkayya等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.26202-8，2002)。
已知转化生长因子β1(TGF-β1)或血管内皮生长因子(VEGF)参与IL-13诱发的哮喘的发病机理(Lee等人，Nat.Med.，101095-1103，2004)。
TGF-β1作为治疗组织创伤的关键要素，诱导组织纤维化，而组织纤维化是气道重塑的主要病理变化。更准确的说，TGF-β1使成纤维细胞变为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞分泌的胶原多于静止型成纤维细胞，组织纤维化导致气道重塑(Vignola等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，156591-599，1997)。这与以前的研究结果是一致的，即IL-13转基因小鼠中，肺的纤维化主要通过TGF-β1依赖性途径诱发(Lee等人，J.Exp.Med.，194809-21，2001)。
在组织纤维化过程中，TGF-β1诱导成纤维细胞生长因子-2(FGF2或碱性成纤维细胞生长因子，bFGF)、其受体-1(FGFR-1)或FGF受体-2(FGFR-2)的分泌。已知FGF2与内皮细胞或平滑肌细胞的增殖有关，且在血管生成中起重要作用(Nugent等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.32115-20，2000)。然而，FGF2在哮喘和AHR发病机理中的作用仍然存在疑问。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种细胞因子，其通过血液毛细管提高血浆蛋白的渗透性，促进细胞分化和迁移，促使重整细胞的蛋白酶分泌。VEGF还通过抑制细胞凋亡参与新生血管的维持，通过抑制神经原抗原参与免疫应答的调节，以及参与细胞的生长和分裂。本发明者表明在IL-13和VEGF之间，存在针对抗原和外界物质的免疫应答有关的正反馈环(Lee等人，Nat.Med.，101095-1103，2004)。然而VEGF介导的哮喘的发病机理中，FGF2的作用还尚未阐明。
干扰素-γ(IFN-γ)是Th1分泌的、与哮喘发病机理有关的另一种关键细胞因子。更具体的说，IFN-γ是Th1淋巴细胞中分泌的作为病原体抵抗剂的物质(Fong等人，J.Imunol.，1432887-93，1989)，已知用于抑制Th2细胞因子的生成(Mosann等人，J.Immunol.，1362348-57，1986)。基于Th1/Th2假说，认为IFN-γ抑制哮喘仍存在争议。根据与上述观点相矛盾的前述研究，在IFN-γ转基因小鼠中观察到与哮喘患者相似的气道重塑(Wang等人，J.Exp.Med.，1921587-1600，2000)，特别是哮喘的严重程度与IFN-γ的增多显著相关(Corrogan等人，Lancet11129-32，1988；Mognan等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1611790-6，2000)。
该反驳观点还得到如下研究结果的支持，即广泛使用的哮喘治疗药剂如皮质甾类、β2-肾上腺素拮抗剂、甲基黄嘌呤衍生物抑制Th1的免疫应答，而不抑制Th2免疫应答。因此，采用强调促进Th2免疫应答重要性的Th1/Th2假说解释哮喘的发病机理受到限制。
同时，COPD参与哮喘的发病机理也没有得以阐明。也就是说，COPD的发展和进展还没有得到解释，因此在开发COPD治疗药剂之前，需要对上述的准确机理给出全面的解释。
根据使用转基因小鼠的最近研究结果，已经被证明参与哮喘发病机理的IFN-γ(Wang等人，J.Exp.Med.，1921587-600，2000)和IL-13(Zheng等人，J.Clin.Invest.，1061081-93，2000)是诱发与人类COPD类似病理现象的要素。如前所述，细胞因子大多在免疫细胞中分泌，表明免疫应答在COPD的发病机理中发挥重要作用。IFN-γ和IL-13是减轻气道和软组织炎症的重要因素。为了治疗由炎症引发的创伤，在气道和肺上皮细胞恢复过程中，攻击者和防卫者之间的平衡尤其重要(Lee等人，J.Exp.Med.，200377-89，2004)，攻击者占优或者防卫者缺乏可能引起COPD。
本发明者研究了FGF2在IL-13、TGF-β1、VEGF和IFN-γ介导的哮喘和COPD的发病机理中的作用，证实FGF2抑制由IL-13刺激的VEGF诱发的或者IFN-γ诱发的AHR，以及抑制由气道和软组织中炎症引发的肺气肿，所以FGF2可以有效用于哮喘和COPD的预防和治疗。
此外，本发明者通过产生由卵清蛋白和双链RNA诱发的Th1哮喘和COPD动物模型，这些模型能够通过有效和有效率的实验来开发哮喘和COPD治疗药剂，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题本发明的一个目的是提供一种含有FGF2作为有效成分的、用于预防和治疗哮喘和COPD的药剂。
本发明的另一目的是提供一种由过敏原如卵清蛋白(OA)和双链RNA(dsRNA)诱发的Th1哮喘或COPD小鼠模型。
技术方案本发明提供一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的、用于治疗和预防哮喘的药剂。
本发明提供一种预防和治疗以由IL-13(白细胞介素-13)过度表达诱发为特征的哮喘的药剂。
本发明提供一种预防和治疗以由IFN-γ(干扰素-γ)过度表达诱发为特征的哮喘的药剂。
本发明提供一种含有FGF2以抑制IL-13活性为目的的、用于治疗和预防哮喘的药剂。
本发明提供一种含有FGF2以抑制VEGF活性为目的的、用于治疗和预防哮喘的药剂。
本发明提供一种含有FGF2以抑制TGF-β1(转化生长因子-β1)活性为目的的、用于治疗和预防哮喘的药剂。
本发明提供一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的、用于治疗和预防COPD的药剂。
本发明提供一种预防和治疗以由IFN-γ(干扰素-γ)过度表达诱发为特征的COPD的药剂。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其特征在于将过敏原如卵清蛋白和双链RNA直接给予气道中。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中所述动物为小鼠。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，包括如下步骤(1)通过鼻腔内给予5-15μg聚肌胞苷酸、双链RNA以及50-100μg卵清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中在上述步骤(1)中使用10μg双链RNA致敏动物。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中在上述步骤(1)中使用75μg卵清蛋白致敏所述动物，10天后，在上述步骤(2)中使用50μg卵清蛋白致敏所述动物。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中所述哮喘是非嗜酸性的。
本发明提供一种由本发明的方法制备的Th1哮喘或COPD动物模型。
本发明提供一种Th1哮喘或COPD动物模型，其中所述动物为小鼠。
本发明提供一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的IL-13、VEGF或TGF-β1抑制剂。
本发明提供一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的纤维化、气道炎症、AHR或气道重塑抑制剂。
下面将详细描述本发明。
本发明提供一种含有FGF2作为有效成分的、用于预防或治疗哮喘的药物组合物。更准确的说，本发明提供一种用于预防和治疗以由IL-13(白细胞介素-13)或IFN-γ(干扰素-γ)过度表达诱发为特征的哮喘的药剂。本发明提供的药剂其特征是抑制IL-13(白细胞介素-13)、VEGF或TGF-β1(转化生长因子-β1)的活性。
哮喘分为支气管哮喘、心源性哮喘等，但单纯性支气管哮喘被看作是哮喘。哮喘以气道高反应性和气道重塑为特征。
气道重塑由对过敏原、炎症或刺激的免疫应答提高而引发。一旦免疫应答提高，T-细胞就分泌细胞因子(一种细胞内信号递质子)。分泌的细胞因子诱导炎性细胞迁移进组织，引起气道内的慢性炎症，导致气道结构的改变。
AHR也被认为是哮喘发病机理的重要因素，AHR将哮喘和其他呼吸道疾病相区别。AHR伴随有气道平滑肌增生、收缩以及上皮细胞和肺部软组织的纤维化，这些都是气道重塑的特征。因此，气道炎症、AHR和气道重塑彼此紧密相关，也就是说，对其中一种症状的治疗可能会对其他症状产生意想不到的治疗，同一药剂可应用于气道炎症、AHR和气道重塑这些所有的症状。
在Th2细胞因子IL-4转基因小鼠(IL-4 TG(+))中显示的AHR水平与野生型(WT)对照的AHR水平相似(图1A)，而在Th2细胞因子IL-9转基因小鼠(IL-9(+)/IL-13(+/+))中显示的AHR水平与野生型(WT)对照组的AHR水平相比有所提高。然而，在IL-13敲除小鼠(IL-9(+)/IL-13(-/-))中AHR被抑制，表明由IL-9过度表达诱导的哮喘被IL-13所介导(见图1B)。
为了证实上述研究结果，制备IL-13转基因小鼠以研究气道高反应性与TGF-β1和VEGF之间的关系，而已知TGF-β1和VEGF的过度表达由IL-13引起。结果是，与野生型对照中的AHR相比，IL-13转基因小鼠中AHR被增强(见图2)。
IL-13转基因小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中，TGF-β1和VEGF的浓度也提高了，意味着IL-13诱导的AHR受到下游分子如TGF-β1和VEGF的调节。
通过证实IL-13介导的AHR受到SU1498作用的抑制证明了通过下游分子VEGF调节IL-13介导的AHR(见图4)，所述SU1498是受体2的信号阻断剂。
IL-13介导的哮喘的发病机理中FGF2的作用尚未阐明。因此，本发明者力图解释FGF2的作用，最后证实FGF2对于治疗由VEGF和TGF-β1诱发的哮喘的特有症状是十分有效的，其中VEGF和TGF-β1的水平受IL-13的调节。在动物模型中，阻断FGF2导致VEGF浓度的提高(见图5)，并进一步引起AHR的提高(见图6)。这一结果与其他实验结果是一致的，即在FGF2缺乏的小鼠中，阻断VEGF引起AHR的抑制(见图6)。
下述研究结果支持FGF2对IL-13或VEGF诱导的哮喘的药效。
FGF2通过鼻腔内给予IL-13介导的Th2哮喘模型，随后考察FGF2的影响。结果是，FGF2缓解对乙酰甲胆碱的气道高反应性(见图20)，降低支气管肺泡灌洗液(BAL)中炎性细胞的数目(见图21)，并抑制IL-13和VEGF的表达(见图22)，上述两者都是Th2哮喘的关键介导物。组织学试验的结果证实FGF2几乎将支气管壁的过度增生和闭塞减轻至肺组织的正常状态(见图23)。总之，证实了FGF2抑制VEGF和IL-13的表达，导致AHR和炎症得以抑制。因此，FGF2可以有效用于治疗哮喘。
至于影响IL-13介导的哮喘的下游分子TGF-β1，以前的研究报道在TGF-β1转基因小鼠中观察到气道重塑(Lee等人，J.Exp.Med.，200377-389，2004)，并且由IL-13引发的支气管纤维化取决于TGF-β1(Lee等人，J.Exp.Med.194809-821，2001)。在TGF-β1转基因小鼠中，TGF-β1严重诱发气道阻力和闭塞(见图7)，并且乙酰甲胆碱抑制AHR(见图8)。
为了证实在IL-13介导的哮喘中FGF2和TGF-β1之间的关系，测量了FGF2敲除小鼠中的AHR。结果是，在FGF2敲除小鼠中没有观察到TGF-β1对AHR的抑制(见图9)。这一结果表明AHR没有受到TGF-β1自身的抑制，而是受到与TGF-β1共同表达的FGF2的抑制。也就是说，当FGF2存在时，TGF-β1的增加降低AHR，但不存在FGF2时，TGF-β1不能抑制AHR的升高。
上述结果证实了FGF2和TGF-β1之间如下的联合作用；一旦气道组织受到伤害，免疫系统就开始工作。气道平滑肌细胞和成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，导致诱发纤维化。此时，FGF2诱导气道平滑肌细胞和成纤维细胞增殖以补充TGF-β1的缺乏，同时诱导肌成纤维细胞转变为气道平滑肌细胞和成纤维细胞。结果是FGF2诱导肌成纤维细胞转变为成纤维细胞，导致肌成纤维细胞数目的降低，意味着FGF2抑制气道重塑，同时抑制AHR。
为了解释FGF2对气道重塑的抑制，测量了FGF2敲除小鼠中的胶原浓度和AHR。结果是，FGF2敲除小鼠的肺中，分泌胶原的成纤维细胞数目少于野生型对照中的成纤维细胞数目(见图10)。结果表明，因为细胞的增殖没有受到FGF2的诱导，成纤维细胞的数目降低，使得在这些细胞中分泌的胶原的浓度也降低。还考察了乙酰甲胆碱对AHR的影响。结果是，在野生型小鼠中，AHR没有受到乙酰甲胆碱的过多影响，但在FGF2敲除小鼠中，AHR明显提高(见图9)。上述结果表明，在从IL-13至TGF-β1的途径中，FGF2的缺乏阻止成纤维细胞的增殖和肌成纤维细胞向成纤维细胞的转变，导致气道重塑。此外，对乙酰甲胆碱敏感响应的成纤维细胞的数目持续降低，使AHR很高。因此，FGF2可以有效地用于IL-13和TGF-β1介导的哮喘的治疗。
除了IL-13，IFN-γ(一种Th1细胞因子)在哮喘的发病机理中发挥重要作用。以前的许多研究支持这样的观点Th1细胞因子，尤其是IFN-γ与哮喘紧密相关。然而还没有建立Th1介导的哮喘模型。这是因为大多数哮喘的研究都集中于Th1/Th2假说，其强调Th2活化作用对哮喘发病机理的重要性。因此，目前建立了嗜酸性粒细胞或免疫球蛋白E(IgE)过度表达的哮喘模型。
与此相反，根据最近的报道，不管是否嗜酸性的炎症都可以诱导AHR(Venkayya R，Am J Respir Cell Mol Biol 2002；26202-8)，并且非嗜酸性哮喘患者的数目占所有哮喘患者的一半以上(Douwes等人，Thorax，57643-8，2002)。因此，需要建立用于哮喘研究的Th1型哮喘模型。
因此，本发明者制备了由IFN-γ诱导的Th1哮喘或COPD动物模型，研究了FGF2在其中的作用。结果是，本发明者发现FGF2可以有效的用于治疗IFN-γ介导的哮喘和COPD。
因而除了提供预防和治疗哮喘的药剂，本发明提供了用于预防和治疗COPD的药剂，所述药剂含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分。COPD可以通过IFN-γ(干扰素-γ)的过度表达诱发。
首先，研究了IFN-γ介导的哮喘中IFN-γ与FGF2之间的关系。用RT-PCR测量了IFN-γ转基因小鼠肺中FGF2的表达。结果是，与野生型对照不同，在转基因小鼠中，FGF2的表达显著受到抑制(见图13)。结果表明FGF2的表达受到IFN-γ信号转导通路的下调。
其次，研究了IFN-γ诱发的气道炎症和AHR的发病机理中FGF2的作用。从IFN-γ转基因小鼠(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))中消除FGF2基因，然后测量AHR。另外，还测量了炎性细胞的数目和与细胞因子相关的炎症的水平。结果是，在缺乏FGF2基因的IFN-γ转基因小鼠(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))中，AHR和炎症显著提高(见图14A和14B)。在IFN-γ转基因小鼠中，提高的VEGF水平对FGF2缺乏诱发的AHR和炎症提高中发挥重要作用(见图14C)。上述结果表明FGF2也可以有效地用于治疗IFN-γ诱导的气道炎症和AHR。
研究了在1FN-γ介导的Th1哮喘模型中FGF2的活性。结果是，FGF2降低了对乙酰甲胆碱的AHR(见图27)，表明FGF2可以有效地用于治疗IFN-γ介导的哮喘。
将FGF2给予Th1哮喘和COPD小鼠，然后检测FGF2在其中的疗效。
经过FGF2的治疗，小鼠BAL中炎性细胞的数目(见图26)和对乙酰甲胆碱的AHR(见图36)降低。
除了AHR，在小鼠中观察到实质细胞凋亡，实质细胞凋亡是COPD的一种特征症状。FGF2的存在与否影响AHR和实质细胞凋亡。给予FGF2后，不仅IFN-γ小鼠中的AHR降低(见图27)，而且由IFN-γ诱导的实质细胞损伤也降低(见图28和29)。FGF2的给予还使得由IFN-γ诱发的组织损伤和肺泡损伤或者肺气肿缓解(见图30和31)。
如前所解释的那样，哮喘和COPD模型中，FGF2降低了AHR并抑制肺泡损伤，表明FGF2可以有效用作预防和治疗哮喘和COPD的药剂。
本发明的含有FGF2作为有效成分的、用于预防和治疗哮喘和COPD的药剂可以包括占组合物总重量0.0001-50重量％的有效成分。
除FGF2外，本发明的治疗药剂还可以包括具有与FGF2相同或相似功能的一种或多种有效成分。
除上述有效成分外，本发明的治疗药剂还可以包括一种或多种药学可接受的适于给予的载体。可以选择药学可接受的载体，或可以通过混合一种以上的选自如下的成分来制备盐水、无菌水、林格氏液(Ringer′ssolution)、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽葡萄糖溶液、甘油和乙醇。可以添加其他常用的添加剂，如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为了制备可注射的溶液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，还可以另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。针对每种疾病或根据成分，本发明的组合物可以通过Remington′s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA中描述的方法进一步制备成适宜的形式。
本发明的治疗药剂可以口服或肠胃外给药(例如静脉内注射、皮下注射、腹腔内注射、局部或鼻腔内注射)。优选肠胃外给药，更优选鼻腔内给药。组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给予方法、排泄方式以及疾病严重程度决定。
本发明的治疗药剂的有效剂量为每天0.005～10mg/kg，优选每天0.05～1mg/kg。给药频率为每天一次或优选每天数次。
本发明的治疗药剂可以单独给予或者随外科手术、激素疗法、化学疗法和生物反应调节剂一起给予，以预防和治疗哮喘和COPD。
将本发明的FGF2通过鼻腔内给予小鼠以考察其毒性。结果是，在小鼠中FGF2预计的LD50值远大于1,000mg/kg，因此经评估FGF2是一种安全的物质。
本发明进一步提供了Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其特征在于将过敏原如卵清蛋白和双链RNA直接给予气道中。
所述制备方法包括如下步骤(1)通过鼻腔内给予5-15μg聚肌胞苷酸、双链RNA以及50-100μg清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。在上述步骤(1)中，用于致敏的双链RNA的量优选为10μg。卵清蛋白的量优选为75μg。10天后，在上述步骤(2)中，用于第二次致敏的卵清蛋白量优选为50μg。
此处提及的哮喘可以是非嗜酸性的。
本发明提供由上述方法制备的Th1哮喘或COPD动物模型。
所述动物可以包括所有可用于生物实验的哺乳动物，优选小鼠。
与Th1哮喘或COPD动物模型的制备相关，在病毒复制过程中产生的双链RNA(dsRNA)强烈诱导IFN-α和IFN-γI型干扰素，显示出体内抗病毒活性(Guidotti等人，Annu.Rev.Immunol.，1965-91，2001)。I型干扰素促进IL-12和IFN-γ的生成，能通过刺激T细胞致敏以及树突细胞的成熟诱导获得性免疫应答(Londhe等人，FEBS Lett.，55333-8，2003)。因此，在用dsRNA治疗后，本发明者制备出患有由Th1通路诱发的哮喘的动物模型。
用于制备动物模型的dsRNA的序列和长度不受限制，只要它们可以诱发Th1哮喘。其可以商购得到，且优选聚肌胞苷酸(polyI:C)。
在患有Th1通路诱发的哮喘的小鼠中，AHR提高(见图15)，并且淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞的数目增加。但嗜酸性粒细胞的数目没有增加。作为介导物，只有与Th1活性有关的IP-10显著提高(见图16和图17)。上述结果表明非嗜酸性的气道炎症由OA和dsRNA诱发。在支气管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ的水平和血液中抗原特异性IgG1和IgG2的水平也提高(见图18和图19)。结果是，OA和dsRNA的气道致敏由IFN-γ和抗原特异性IgG2a所诱导，而抗原特异性IgE没有参与。上述结果证实了Th1哮喘动物模型的成功建立。
本发明的动物模型还显示出COPD的症状，即肺大小和容量增大，肺泡受到损坏，并由于胶原含量的增加诱发严重的纤维化(见图28～图31)。
上述结果证实了本发明的Th1哮喘小鼠也可用作COPD模型。
本发明的动物模型经证实是将过敏原(卵清蛋白，OA)和双链RNA(dsRNA)直接给予气道中产生的Th1或非嗜酸性的哮喘模型，可有效用于开发治疗哮喘和COPD的药剂。
图1A是显示在IL-4转基因小鼠中观察到的AHR组图。
图1B是显示在IL-9(-)/IL-13(+/+)，IL-9(-)/IL-13(-/-)，IL-9(+)/IL-13(+/+)和IL-9(+)/IL-13(-/-)转基因小鼠中观察到的AHR图。
图2是显示IL-13转基因小鼠和野生型对照之间的AHR对比图。
图3是显示在支气管肺泡灌洗液(BAL)中，IL-13转基因小鼠和野生型对照之间VEGF和TGF-β1表达水平的对比图。
图4是显示给予VEGF受体-2抑制剂SU1498后，IL-13转基因小鼠和野生型对照中观察到的AHR图。
图5是显示在支气管肺泡灌洗液(BAL)中，FGF2敲除小鼠和野生型对照之间VEGF和TGF-β1表达水平的对比图。
图6是显示FGF2或FGF2和VEGF敲除小鼠中观察到的AHR图。
图7是显示TGF-β1转基因小鼠和野生型对照之间AHR的对比图。
图8是显示TGF-β1转基因小鼠和野生型对照中观察到AHR随时间的变化图。
图9是显示给予TGF-β1后，野生型对照或FGF2敲除小鼠中AHR随时间的变化图。
图10是显示FGF2敲除小鼠和野生型对照的肺组织中胶原含量的对比图。
图11是显示IFN-γ转基因小鼠和野生型对照之间AHR的对比图。
图12是显示IFN-γ转基因小鼠和野生型对照中，支气管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表达水平的图。
图13是显示在IFN-γ转基因小鼠和野生型对照的肺组织中FGF2表达水平的琼脂糖凝胶照片。
图14A是显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中，支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数(T)、巨噬细胞数(M)、淋巴细胞数(L)、嗜中性粒细胞数(N)以及嗜酸性粒细胞数(E)的图。
图14B是显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中观察到的与乙酰甲胆碱相关的AHR的图。
图14C显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中，支气管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表达水平的图。
图15是显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，对乙酰甲胆碱的AHR的变化图。
图16是显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数、嗜中性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数的图。
图17是显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中细胞因子(VEGF、IL-5、IL-13和IP-10)表达水平的图。
图18是显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ表达水平的图。
图19是显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，血清中过敏原特异性抗体(IgG1和IgG2a)的生成图。
图20是显示在Th2哮喘模型小鼠和野生型对照中给予重组体FGF2(rFGF2)后观察到的与乙酰甲胆碱剂量相关的AHR的图。
图21是显示在Th2哮喘小鼠和野生型对照中，给予重组体FGF2(rFGF2)后测量的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数、嗜中性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数的图。
图22是显示在Th2哮喘小鼠和野生型对照中，给予重组体FGF2(rFGF2)后观察到的支气管肺泡灌洗液(BAL)中细胞因子(VEGF、IL-13、IL-5和IP-10)的浓度的图。
图23是在给予重组体FGF2(rFGF2)之前和之后，Th2哮喘小鼠和野生型对照的肺组织的病理照片。
图24是显示严重哮喘患者的诱导痰中嗜酸性细胞与非嗜酸性细胞的比例的图。
图25是显示根据疾病的严重程度，哮喘患者的诱导痰中IL-4和IFN-γ的表达模式图。
图26是显示当过度表达诱发剂强力霉素存在或不存在时，在有条件的IFN-γ转基因小鼠和野生型对照中，支气管肺泡灌洗液中的细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数、嗜中性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数的图。
图27是显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)，IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中，与乙酰甲胆碱相关的AHR的图。
图28是显示受FGF2存在或不存在影响的IFN-γ转基因小鼠肺大小的照片。
图29是显示IFN-γ转基因小鼠的肺容量随FGF2存在或不存在的变化图。
图30是显示IFN-γ转基因小鼠的肺在FGF2存在或不存在时的纤维化程度。
图31是显示在FGF2存在或不存在时，IFN-γ转基因小鼠软组织破坏的肺组织的组织学检查组图。
具体实施例方式
本发明实施以及目前优选的实施方案在如下实施例中进行描述。
然而，本领域所属技术人员可以理解的是，可以根据本申请所公开的内容在本发明的范围和精神内做出修改和改进。
实施例1由IL-13过度表达诱发的哮喘以及TGF-β1和VEGF的相关性为了研究由IL-13诱发的哮喘的发病过程，制备了IL-13转基因小鼠，并测量了每只小鼠的AHR。还研究了IL-13过度表达对TGF-β1和VEGF表达的影响。
1-1 IL-13转基因小鼠的制备通过常规方法(Zhou Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999；Tang等人，J.Clin.Invest.，982845-2853，1996；Ray等人，J.Clin.Invest.，1002501-2511，1997)产生IL-13转基因小鼠。为了使IL-13候选基因在气道中的选择性表达成为可能，含有IL-13候选基因的结构与启动子相连(B.Stripp and J.Whitsett，University of Cincinnati)，使用诱导10kDaClara细胞蛋白(CC10)表达的启动子。为了产生可诱导的转基因小鼠，在这样的小鼠中，外界嵌入的基因表达能从外界调节，通过将CC10启动子与反四环素控制的反式活化因子(rtTA)和人生长激素(hGH)基因连接制备pKS-CC10-rtTA-hGH(Ray等人，J.Clin.Invest.，982501-2511，1997)。用Elutip-D柱(Schleicher and Schuell Inc，USA)纯化质体DNA，并使用显微注射用缓冲液(0.5mM Trsi-HCl，25mM EDTA，pH 7.5)进行透析。根据此处引用的文献，通过前核内(intrapronuclei)显微注射进行CBA和C57BL/6小鼠的杂交，将上述的质体DNA嵌入得到的F2卵子，得到转基因小鼠。为了评价转化作用，将0.5mg/ml的强力霉素(dox)水溶液随机给予转基因小鼠和野生型对照，然后从每只小鼠得到支气管肺泡灌洗液(BAL)以研究IL-13的水平。
1-2 IL-13转基因小鼠中的AHR为了证实IL-13转基因小鼠中哮喘的发病过程，观察了哮喘的最具代表性的症状AHR。根据本领域公知的常规方法，AHR可以通过剂量反应曲线斜率(DRS，Pediatric Allergy and Immunology，14；193，2003)和增强的中止(Penh，Mckinley等人，Clinical&ExperimentalImmunology，136224-231，2004)进行研究。Penh可以按如下计算用呼气峰压(PEP)除以吸气峰压(PIP)，然后用中止乘以计算出的数。具体地说，上述实施例1-1制备的转基因小鼠中，在从第二次致敏起24小时和48小时后，用乙酰甲胆碱喷雾3分钟，诱发AHR。通过全身体积描记仪每10秒测量呼气峰压和吸气峰压，共记录3分钟，然后用平均值作为数据(图2)。图2显示IL-13转基因小鼠和野生型对照中AHR的研究结果。
如图2所示，与野生型对照相比，IL-13转基因小鼠中的AHR提高。
1-3 IL-13过度表达对VEGF和TGF-β1表达的影响进行了如下实验研究由IL-13过度表达诱发的AHR与IL-13信号转导通路的下游调节剂VEGF和TGF-β1的相关性。将带有SP45管的管子放入上述实施例1-1制备的转基因小鼠的气道中以得到支气管肺泡灌洗液(BAL)，用含有0.1％BSA和0.05mm EDTA的灭菌盐水冲洗，然后离心处理。在得到的BAL上清液中，使用ELISA试剂盒(CalBiotech，USA)测量VEGF和TGF-β1的水平(图3)。图3是显示在支气管肺泡灌洗液(BAL)中，从IL-13转基因小鼠和野生型对照中得到的VEGF和TGF-β1的表达水平的图。
如图3所示，在BAL中，从具有由IL-13过度表达诱发的AHR的转基因小鼠得到的TGF-β1和VEGF的浓度增大。结果表明由IL-13诱发的AHR受下游调节剂TGF-β1和VEGF的调节，该结论得到以下实施例1-4结果的支持。
1-4 VEGF阻断剂对AHR的抑制为了证实上述实施例1-3的结果，将10mg/kg的VEGF受体-2阻断剂SU1498(EMD Bioscience，USA)给予实施例1-1制备的小鼠腹腔中，一天给予一次(图4)。图4是显示给予VEGF受体-2阻断剂SU1498后，IL-13转基因小鼠和野生型对照中观察到的AHR的图。
如图4所示，由IL-13诱发的AHR受到VEGF受体-2阻断剂的抑制，表明由IL-13诱发的AHR通过信号转导经由VEGF而发生。
实施例2FGF2在IL-13诱发的哮喘的发病机理中的作用为了研究FGF2在IL-13引发的哮喘的发病机理中的作用以及下游调节剂TGF-β1和VEGF的作用，观察了FGF2敲除(-/-)小鼠中的AHR和气道重塑。
2-1 FGF2缺乏诱发的AHR进行了如下实验以考察FGF2和AHR的联系。FGF2敲除小鼠购自Jackson Lab(CA，USA)。采用与实施例1-2和实施例1-3中描述的相似的步骤研究了BAL中对乙酰甲胆碱的AHR(DRS)以及VEGF和TGF-β1的浓度，证明AHR以及VEGF和TGF-β1的浓度提高(图5和图6)。图5是显示在BAL中，从FGF2敲除小鼠和野生型对照中得到的VEGF和TGF-β1的表达水平的图。图6是显示如实施例1-4描述的用VEGF阻断剂治疗的FGF2敲除小鼠和FGF2敲除小鼠中观察到的AHR的图。
如图5所示，相对于野生型对照，FGF2敲除小鼠的VEGF浓度提高了，表明AHR提高，这与图6显示的结果是一致的。
如图6所示，FGF2敲除小鼠中，AHR提高了，而VEGF阻断剂能抑制AHR。这一结果表明由FGF2缺乏诱发的AHR受VEGF的调节，更准确的说，给予FGF2抑制VEGF的表达，使得FGF2成为用于预防和治疗由VEGF通路介导的哮喘的药剂的有前景侯选物。
2-2 由FGF2缺乏引发的气道重塑为了研究FGF2和气道重塑的联系，进行了如下实验，包括测量与气道重塑相伴随的细胞增殖和转化。
FGF2敲除小鼠购白Jackson Lab(CA，USA)。采用常规方法取出肺组织，根据生产者的说明，使用Sircol胶原测定试剂盒(Biocolor assay，Northern Ireland)测定组织中的胶原浓度，该浓度可用作细胞增殖和转化测量的指数(图10)。图10是显示从FGF2敲除小鼠和野生型对照中取出的肺组织中胶原的浓度。
如图10所示，在FGF2敲除小鼠的胶原浓度远低于野生型对照中的胶原浓度。
因此，FGF2敲除小鼠的肺中分泌胶原的成纤维细胞的数目降低，这是因为成纤维细胞转变为肌成纤维细胞并迁移，导致成纤维细胞的数目降低。结果诱发气道重塑。
上述实验结果证实FGF2抑制气道重塑和AHR，因此FGF2可以有效用于治疗哮喘。
实施例3TGF-β1引发的哮喘的发展为了研究由IL-13诱发的TGF-β1表达所介导的哮喘的发病机理，使用与实施例1-1中描述的相似步骤制备TGF-β1转基因小鼠，并进行如下实验。
3-1 TGF-β1引发的气道重塑采用与上述实施例1-2所描述的相似的步骤研究了由气道重塑产生的AHR(图7)。图7是显示TGF-β1转基因小鼠和野生型对照之间随时间的AHR的对比图。图8是显示TGF-β1转基因小鼠和野生型对照之间随时间的AHR对乙酰甲胆碱的对比图。
如图7所示，TGF-β1诱发严重的气道阻力，Penh的结果支持这一结论。然而，如图8所示，AHR对乙酰甲胆碱却受到抑制。这一结果表明TGF-β1的过度表达仅参与哮喘特征症状中的气道重塑。
3-2 TGF-β1对AHR抑制中FGF2的作用如上述实施例3-1所阐明的，测量了FGF2敲除小鼠中AHR以研究TGF-β1对AHR抑制中FGF2的作用(图9)。图9是显示给予TGF-β1(R&D system，USA)后，观察到随时间变化，野生型对照和FGF2敲除小鼠中的AHR的图。
如图9所示，在FGF2敲除小鼠中，TGF-β1对AHR抑制更弱，表明TGF-β1对AHR抑制不是因为TGF-β1自身，而是因为与TGF-β1共表达的FGF2。也就是说，TGF-β1的上调对AHR的抑制与FGF2相关。
实施例4由IFN-γ引发的哮喘的发生以及FGF2在其中的作用制备由IFN-γ诱发的哮喘模型，而IFN-γ是COPD和严重哮喘的重要介导物。为了证实FGF2的作用，采用与实施例1中描述的类似的步骤在IFN-γ转基因小鼠中进行了如下实验。
4-1 IFN-γ过度表达引起AHR提高使用上述实施例1-2中描述的步骤测量了转基因小鼠中的AHR(图11)。然后采用与上述实施例1-3所使用的相同方法测量了AHR、VEGF、TGF-β1和IP-10蛋白的水平(图12)，其中IP-10蛋白的表达由BAL中的IFN-γ所诱发。图11是显示IFN-γ转基因小鼠和野生型对照之间AHR的对比图。
如图11所示，在IFN-γ转基因小鼠中，AHR被均匀提高。
如图12所示，由Th2表达的IL-13所诱发的VEGF和TGF-β1的浓度在转基因小鼠中并没有增大，但与Th2不相关的IP-10蛋白(干扰素诱导蛋白10)增多了。这一结果表明在该实施例中，转基因小鼠中所诱导的AHR是IFN-γ特异性的。
4-2 FGF2在IFN-γ过度表达诱发的AHR发生过程中的作用IFN-γ过度表达对FGF2表达的影响为了研究FGF2在IFN-γ过度表达诱发的AHR发生过程中的作用，测量了IFN-γ转基因小鼠中FGF2的表达水平(图13)。采用常规的方法从野生型和转基因小鼠的肺组织中提取RNA，随后进行RT(反转录)-PCR。简言之，就是根据生产者的说明使用TRIzol试剂(LifeTechnology，USA)从分别取白野生型和转基因小鼠的1g肺组织中提取总RNA。使用RT-PCR试剂盒(Promega，USA)以分离的总RNA为模板进行RT-PCR以合成cDNA。使用上游引物(5′-ACT CAC ATT CGA AACCCC AAA C-3′)和下游引物(5′-CGT CAG ATC GCC TGG AGA C-3′)、使用1μg合成的cDNA作模板进行PCR，以扩增FGF2特异性的cDNA。PCR如下进行在95℃预变性8分钟，在95℃变性1分钟，在56℃退火1分钟，在72℃聚合1分钟，从变性到聚合共进行35个循环，在72℃最后延伸10分钟。图1 3表示琼脂糖凝胶照片，显示在IFN-γ转基因小鼠和野生型对照的肺组织中FGF2特异性cDNA的扩增。
如图13所示，在IFN-γ转基因小鼠中，FGF2的表达受到抑制，表明FGF2的表达被IFN-γ所抑制。
FGF2对IFN-γ过度表达诱发的AHR的作用为了检查FGF2对气道炎症的发病机理和IFN-γ诱发的AHR的作用，测量了具有不同基因型小鼠在BAL中的炎性细胞数目、炎症所涉及蛋白的水平(图14)。按照前述的方法产生所述小鼠(Zhou Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999；Tang等人，J.Clin.Invest.，982845-2853，1996；Ray等人，J.Clin.Invest.，1002501-2511，1997)。图14中，+表示靶基因过度表达的小鼠，-表示靶基因缺乏的小鼠。图14A显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)和IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中，取自支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数(T)、巨噬细胞数(M)、淋巴细胞数(L)、嗜中性粒细胞数(N)以及嗜酸性粒细胞数(E)。图14B显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中与乙酰甲胆碱相关的AHR。图14C是显示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)转基因小鼠中，支气管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表达水平的图。
如图14所示，在IFN-γ转基因小鼠中FGF2基因缺乏导致由IFN-γ诱发的AHR提高和炎性细胞密度的提高，使得气道炎症加重。这一结果表明FGF2有效用于治疗由IFN-γ引发的哮喘。
实施例5通过给予FGF2抑制IL-13介导的Th2哮喘进行如下实验研究FGF2蛋白对IL-13介导的Th2哮喘的抑制作用。
重组体FGF蛋白(rFGF2)购白Phamacia-Upjohn Co(意大利)。
为了产生AHR小鼠模型，通过腹腔注射75μg卵清蛋白(OA)和2mg明矾两次致敏BALB/c小鼠(Jackson Lab，USA)，10天后，通过鼻腔内给予50μg卵清蛋白再次致敏该小鼠以诱发哮喘。如此得到的小鼠称为Th2哮喘。
通过鼻腔内给予转基因小鼠10μg/head rFGF2，每天一次，共给予4天，野生型对照不给予，而只是给予盐水，然后根据上述实施例1-2和实施例1-3所述的步骤测量对乙酰甲胆碱AHR的水平(图20)，炎性细胞的数目(图21)，以及介导物如VEGF、IL-13、IL-5和IP-10的浓度(图22)。
图20表示在Th2哮喘模型小鼠和野生型对照中给予重组体FGF2后观察到的与乙酰甲胆碱剂量相关的AHR。图21显示在Th2哮喘小鼠和野生型对照中，给予重组体FGF2(rFGF2)后测量的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数、嗜中性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数。图22显示在Th2哮喘小鼠和野生型对照中，给予重组体FGF2(rFGF2)后观察到的支气管肺泡灌洗液(BAL)中细胞因子(VEGF、IL-13、IL-5和IP-10)的浓度。
如图20所示，与rFGF2未处理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2处理的Th2哮喘小鼠对乙酰甲胆碱的AHR的抑制作用更为明显。
如图21所示，与rFGF未处理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2处理的Th2哮喘小鼠的BAL中的炎性细胞的数目显著降低。
如图22所示，与rFGF未处理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2处理的Th2哮喘小鼠中，Th2哮喘的重要介导物IL-13和VEGF的浓度显著降低。然而，已知与Th2哮喘不相关的IL-5和IP-10的表达没有改变。
在rFGF2处理后，还对哮喘小鼠的支气管壁进行了组织学分析(图23)。图23为在给予重组体FGF2(rFGF2)之前(A)和之后(B)，Th2哮喘小鼠和野生型对照的肺组织的病理照片。
如图23所示，由于rFGF2处理的小鼠的支气管壁组织学分析结果(B)，通过给予rFGF2可使支气管壁的过度增生和闭塞减轻至正常水平(C)。
上述结果证实了FGF2抑制VEGF和IL-13的表达，导致Th2介导的AHR和气道炎症得到抑制。因此，FGF2可有效用于预防和治疗哮喘。
实施例6通过给予FGF2抑制由IFN-γ介导的Th1哮喘和COPD进行如下实验研究在IFN-γ介导的Th1哮喘小鼠中FGF2的抑制活性。
重组体FGF2蛋白购自Phamacia-Upjohn Co.(意大利)。IFN-γ介导的Th1哮喘小鼠按照如下方法产生。
6-1 通过卵清蛋白和双链RNA制备Th1哮喘和COPD动物模型通过鼻腔内单独或共同给予10μg合成的dsRNA聚肌胞苷酸(PolyIC，Sigma，USA)和75μg卵清蛋白(OA)四次，致敏BALB/c小鼠(Jackson Lab，USA)。10天后，通过鼻腔内给予50μgOA致敏小鼠，以诱发哮喘。所得到的小鼠称为Th1哮喘小鼠。阴性对照小鼠仅给予磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
(1)Th1哮喘特征的证实为了证实小鼠是否已诱发Th1哮喘，根据实施例1-2和实施例1-3描述的步骤测量了对乙酰甲胆碱的AHR(图15)，BAL中炎性细胞的数目(图16)以及介导物如VEGF、IL-13、IL-5和IP-10的浓度(图17)。
图15显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，对乙酰甲胆碱的AHR的变化。图16显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数、巨噬细胞数、淋巴细胞数、嗜中性粒细胞数以及嗜酸性粒细胞数。图17显示将过敏原(OA)和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中细胞因子(VEGF、IL-5、IL-13和IP-10)的表达水平。
如图15所示，在OA和dsRNA诱发的哮喘小鼠中，对乙酰甲胆碱的AHR提高。
如图16所示，小鼠中淋巴细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的数目增加，但嗜酸性粒细胞的数目没有改变。
如图17所示，作为介导物，小鼠中只有IP-10明显提高。
上述结果表明非嗜酸性的气道炎症由OA和dsRNA诱发。
此外，为了证实上述Th1哮喘是否由IFN-γ诱发，测量了支气管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ、IgG1和IgG2a的水平(图18和图19)。图18表示将OA和dsRNA单独或共同给予后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ的表达水平。图19表示将OA和dsRNA单独或共同给予后，血清中过敏原特异性抗体(IgG1和IgG2a)的生成图。
如图18和图19所示，BAL中IFN-γ的水平至少提高3倍，血清中IgG1和IgG2的水平也提高了。上述结果表明由OA和dsRNA诱发的哮喘与IFN-γ和抗原特异性IgG2a相关，而与参与Th2哮喘的IgE无关。
(2)COPD特征的证实为了证实上述小鼠中是否已诱发COPD，测量了肺大小和肺容量以及胶原的浓度(图28、图29和图30)，图28D代表小鼠肺大小的图。图29D代表小鼠肺容量的图。图30D代表转基因小鼠肺中的纤维化水平。
如图28D、图29D和图30D所示，Th1哮喘小鼠中，肺大小和肺容量以及胶原的浓度明显增大，表明小鼠具有COPD的特征。随肺大小和容量以及胶原浓度提高，肺组织损伤、肺泡破坏以及肺气肿是COPD的典型症状，如图31所示，这些症状也伴随着小鼠。
图31A表示Th1哮喘小鼠中软组织破坏的肺组织的组织学照片。如图31所示，IFN-γ转基因小鼠的肺中观察到由软组织破坏引起肺泡区域变大，这是COPD的典型症状之一。
肺大小和容量的增大和肺泡中细胞凋亡与胶原含量的提高证实了严重的纤维化。
上述结果证实了Th1哮喘小鼠可有效用作显示COPD发病机理的COPD模型。
6-2 给予FGF2对Th1哮喘的抑制进行如下实验研究FGF2蛋白是否能抑制IFN-γ介导的Th1哮喘小鼠中的哮喘。上述实施例6-1产生的小鼠称为Th1哮喘实验小鼠组。根据实施例5使用的相同的步骤，将重组体FGF2给予实施例6-1制备的Th1哮喘小鼠和野生型对照。然后使用实施例1-2中描述的步骤，测量两组中对乙酰甲胆碱的AHR。
图27表示给予rFGF2后，Th1哮喘小鼠和野生型对照中观察到的与乙酰甲胆碱剂量相关的AHR。
如图27所示，与未经rFGF2处理的小鼠相比，rFGF2处理小鼠中，对乙酰甲胆碱的AHR大为降低。
图28表示rFGF2处理的Th1哮喘小鼠和rFGF2未处理的小鼠之间肺大小比较的照片。
如图28所示，rFGF2处理小鼠的肺大小比rFGF2未处理的Th1哮喘小鼠的小。
上述结果表明FGF2减轻IFN-γ转基因小鼠的特性哮喘症状，因此可以有效用于治疗IFN-γ诱导的哮喘。
6-3 给予FGF2对COPD的抑制进行如下实验研究FGF2对COPD的抑制作用。根据实施例5所描述的步骤，将重组体FGF2给予上述实施例6-1制备的转基因小鼠和野生型对照。然后，测量了这些小鼠中的肺大小和容量以及胶原浓度，这些都是COPD的主要指标(图28、图29和图30)。图28A、B、C和D显示正常小鼠和COPD小鼠的肺大小，图29显示了这些小鼠的肺容量。图30A、B、C和D显示给予rFGF后或未给予时，野生型对照和COPD小鼠的肺中的纤维化水平。图31表示在FGF2存在或不存在时，IFN-γ转基因小鼠软组织破坏的肺组织的病理照片。
如图28C和D以及图29C和D所示，在给予rFGF2之后，肺容量显著减小。如图30C和D所示，给予COPD小鼠rFGF2使得胶原浓度也显著降低。肺大小和容量的减小以及胶原含量的降低表明rFGF2可有效用于COPD的治疗，如图31所示。
图31表示COPD小鼠中软组织破坏的肺组织的病理照片。如图31A所示，与rFGF2处理组(A)的肺不同，rFGF2未处理小鼠(B)的肺中由软组织的细胞凋亡引起的肺泡区域变大，这是COPD患者的典型症状之一，表明给予rFGF2可有效治疗COPD。
上述结果证实肺大小和容量、肺泡中细胞凋亡和胶原含量均参与COPD小鼠的纤维化，给予FGF2可有效治疗那些病理症状。
实施例7人哮喘模型中IFN-γ的过度表达进行如下实验研究人哮喘是否由IFN-γ过度表达和非嗜酸性的细胞诱发。从取自215位成年哮喘患者的痰液显示可逆性气道阻塞，根据常规的方法，使用sprimetry法测量了他们的肺活量。还进行了乙酰甲胆碱支气管试验以测试肺功能(图24)。图24表示在严重哮喘患者的诱导痰中嗜酸性与非嗜酸性细胞的比例。如图24所示，证实超过一半的患者患有非嗜酸性哮喘，而不是嗜酸性哮喘。
为了证实哮喘介导因素，测量了IL-4和IFN-γ的水平(图25)。图25显示根据疾病的严重程度，在哮喘患者的诱导痰中，IL-4和IFN-γ的表达模式。
如图25所示，严重哮喘患者中，与Th1哮喘有关的IFN-γ的表达提高，但与Th2哮喘有关的IL-4的表达却没有改变。结果表明人类哮喘患者，尤其是严重哮喘患者，患有IFN-γ介导的非嗜酸性Th1哮喘。
工业实用性如前所述，本发明的含有FGF2作为有效成分的治疗药剂可以有效用于预防和治疗纤维化、气道炎症、气道高反应性、气道重塑、哮喘和COPD。此外，使用卵清蛋白和双链RNA开发的哮喘和COPD动物模型还可以有效用于开发哮喘和COPD的治疗药剂。
本领域所属技术人员可以理解，可以容易地将上述说明书中公开的构思和具体实施方案用作修改或设计其他实施方案的基础，以实现与本发明相同的目的。本领域所属技术人员还可以理解，这些等同的实施方案不会背离如所附权利要求中所提出的本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的治疗或预防哮喘的药剂。
2.如权利要求1所述的治疗或预防哮喘的药剂，其中所述哮喘由IL-13(白细胞介素-13)过度表达诱发。
3.如权利要求1所述的治疗或预防哮喘的药剂，其中所述哮喘由IFN-γ(干扰素-γ)过度表达诱发。
4.如权利要求1所述的治疗或预防哮喘的药剂，其中FGF2抑制IL-13的活性。
5.如权利要求1所述的治疗或预防哮喘的药剂，其中FGF2抑制VEGF的活性。
6.如权利要求1所述的治疗或预防哮喘的药剂，其中FGF2抑制TGF-β1(转化生长因子-β1)的活性。
7.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的药剂。
8.如权利要求7所述的治疗或预防COPD的药剂，其中所述COPD由IFN-γ(干扰素-γ)过度表达诱发。
9.一种Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其特征在于将过敏原如卵清蛋白和双链RNA直接给予气道中。
10.如权利要求9所述的Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中所述动物为小鼠。
11.如权利要求9或10所述的Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，包括如下步骤(1)通过鼻腔内给予5-15μg聚肌胞苷酸、双链RNA以及50-100μg卵清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。
12.如权利要求11所述的Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中在步骤(1)中使用10μg双链RNA致敏所述动物。
13.如权利要求11所述的Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中在步骤(1)中使用75μg卵清蛋白致敏所述动物，10天后，在步骤(2)中使用50μg卵清蛋白致敏所述动物。
14.如权利要求9-13中任一项所述的Th1哮喘或COPD动物模型的制备方法，其中所述哮喘是非嗜酸性的。
15.一种Th1哮喘或COPD动物模型，其通过权利要求9-13中任一项来制备。
16.如权利要求15所述的Th1哮喘或COPD动物模型，其中所述动物为小鼠。
17.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的IL-13活性抑制剂。
18.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的VEGF活性抑制剂。
19.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的TGF-β1活性抑制剂。
20.一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子-2)作为有效成分的纤维化、气道炎症、气道高反应性或气道重塑抑制剂。
全文摘要
本发明涉及一种含有FGF2(成纤维细胞生长因子－2或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))作为有效成分的、用于治疗或预防哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的药剂。本发明还涉及由卵清蛋白和双链RNA诱发的Th1哮喘和COPD小鼠动物模型。本发明的含有FGF2的治疗药剂可用于治疗或预防气道纤维化、气道炎症、气道高反应性、气道重塑、哮喘和COPD。此外，由卵清蛋白和双链RNA诱发的Th1哮喘和COPD小鼠动物模型还可用于开发哮喘和COPD的治疗药剂。
文档编号A61K38/18GK1953765SQ200580015391
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者金润根, 姜寿亨, 金炳文, 孙美苑 申请人:东亚制药株式会社, 金润根