治疗胰腺癌的组合物和方法

专利名称：：治疗胰腺癌的组合物和方法本申请要求了2004年3月24日提交的美国临时申请No.60/555,809的权利，在此并入它的全部内容作为参考。
背景技术：
：本发明涉及生物科学的领域，更具体地是涉及癌症研究的领域。具体地说，本发明涉及了组合物，该组合物包含能抑制编码PCDH1、CDH3或GPR107的基因的表达的核酸。在一些实施方案中，该化合物是对应于这些基因的子序列的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。
背景技术：
：西方国家中，胰管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma，PDACa)是癌症死亡的第五个主要的原因，在任何恶性程度下都是致死率最高的几种癌症之一，5年的存活率仅有4％。在美国，每年估计有30700名病人被诊断为胰腺癌，而且近30000名病人死于胰腺癌。绝大部分患者在该疾病的晚期得到诊断，在这个阶段该疾病对现有的疗法都不起反应，而病人只能生存几个月。只有手术切除才有可能治愈PDACa，但是只有10-20％的PDACa患者能接受可能根治的切除，而且即使在根治性手术后，也有80-90％的患者会出现复发而死于PDACa。在也接受吉西他滨(gemcitabine)和/或放射线化学治疗的患者中，术后的结果或生活质量出现一些改善，但是这些方法对患者长期生存的影响却极小，因为PDACa会对任何一种治疗方法都有强烈的抗性。基于这种原因，对大多数患者的治疗都集中于缓解病情上。因此，当前对于胰腺癌的治疗来说十分紧迫的问题是建立一种新的PDACa分子治疗方法和鉴定出新的PDACa治疗性分子靶物。发明的公开本发明是基于一个惊人的发现，即抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表达可以有效地抑制多种癌细胞的细胞生长，包括那些PDACa中涉及的细胞。本申请中所描述的发明部分地基于这一发现。本发明提供了抑制细胞生长的方法。在所述方法中，提供了包括将细胞与包含小干扰RNA(siRNA)的组合物接触，该siRNA抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表达的方法。本发明也提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。这些方法包括给受试者施用包含小干扰RNA(siRNA)的组合物，其中siRNA可与来自PCDH1，CDH3或GPR107的序列特异性地杂交。本发明的另一方面，提供了在生物样本的细胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因表达的方法。通过以足够抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因的表达的量将双链核糖核酸(RNA)分子导入细胞，可以抑制所述基因的表达。另一方面，本发明涉及例如在所提供的方法中有用的产品，其包括核酸序列，载体以及包含它们的组合物。在所述产品中提供了siRNA分子，所述siRNA分子具有这样的性质当它们被导入到表达PCDH1，CDH3或GPR107基因的细胞中时，抑制这些基因的表达。这样的分子中包括那些包含了有义和反义链的分子，其中所述有义链包含与PCDH1，CDH3或GPR107靶序列相对应的核糖核苷酸序列，而其中所述反义链包含与该有义链互补的核糖核苷酸序列。所述分子的有义链和反义链互相杂交形成双链分子。本申请中使用的术语“生物体”是指任何有生命的、包括至少一个细胞的实体。有生命的生物体可以像例如单真核细胞那样简单，或者像哺乳动物包括人那样复杂。本申请中使用的术语“生物样本”是指一个完整的生物体或生物体的组织、细胞或组成部分的亚类(subset)(如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜索(amnioticcord)血、尿液、阴道液和精液)。此外，“生物样本”还可指匀浆、裂解产物、提取物、细胞培养物或组织培养物，其由完整的生物体或其组织、细胞或组成部分的亚类，或其级分或部分制备。最后，“生物样本”指培养基，例如在其中生物体已经增殖的营养肉汤或凝胶，该培养基中包含细胞组分，例如蛋白质或核酸分子。本发明重点描述了抑制细胞生长的方法。通过使细胞同PCDH1，CDH3或GPR107的小干扰RNA(siRNA)的组合物接触来抑制细胞生长。该细胞进一步同转染增强剂相接触。细胞以体外、体内或离体提供。受试者是哺乳动物，如人、非人的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。所述细胞是胰管细胞。或者，所述细胞是肿瘤细胞(即癌细胞)，如癌细胞或腺癌细胞。例如，所述细胞是胰管腺癌细胞。抑制细胞生长意味着处理的细胞与未处理的细胞相比，增殖的速率较低，或生存力(viability)降低。通过本领域中已知的增殖测定法来测定细胞生长。术语“siRNA”是指一种双链的RNA分子，它阻断目标mRNA的翻译。采用了将siRNA导入细胞的标准技术，其中包括DNA为模板由其转录RNA的技术。siRNA包含有义的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、反义的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、或二者。所述siRNA可能包含两个互补的分子，或者可以如此构建，以使得单个转录本同时具有来自目的基因的有义和互补的反义序列，例如发夹结构，在一些实施方案中，这导致微小RNA(miRNA)的产生。本方法用来改变例如由于细胞的恶性转化而导致PCDH1，CDH3或GPR107的表达上调的细胞中的基因表达。在靶细胞中，siRNA同PCDH1，CDH3或GPR107的转录本相结合导致细胞产生PCDH1，CDH3或GPR107的减少。该寡核苷酸的长度为至少约10个核苷酸，并可与天然存在的PCDH1，CDH3或GPR107转录本一样长。优选地，该寡核苷酸的长度为大约19个到大约25个核苷酸。最优选地，该寡核苷酸的长度少于大约75个，大约50个，或大约25个核苷酸。在哺乳动物细胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107表达的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA寡核苷酸的例子包括分别含有靶序列例如SEQIDNOs22，23或24的核苷酸的寡核苷酸。设计具有在靶细胞中抑制基因表达的能力的双链RNA的方法是已知的(参见如美国专利No.6,506,559，在此并入它的全部内容作为参考)。例如，由Ambion网站可得到用于设计siRNAs的计算机程序(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。该计算机程序可从Ambion，Inc.获得，其根据下面的步骤来选择用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目标位点的选择1.以转录本的起始密码子AUG开始，向下游寻找AA二核苷酸序列。记录每一处AA和其3’端相邻的19个核苷酸的出现作为可能的siRNA目标位点。Tuschl等人不推荐在5’和3’非翻译区(UTR)和起始密码子附近区域(75个碱基以内)设计siRNA(TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro.GenesDev13(24)3191-7(1999))，因为这些区域可能更富含调节蛋白的结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将可能的目标位点同适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等等)进行对比，并排除任何与其他编码序列具有显著的同源性的靶序列。推荐使用BLAST，其可以在NCBI服务器上找到，网址为www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着基因的长度来选择几个靶序列来评价。本发明还包含分离的核酸分子，其包含靶序列的核酸序列，例如SEQIDNOs22，23和24的核苷酸，或者与SEQIDNOs22，23和24的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子。本文使用的“分离的核酸”是指脱离它们的原本的环境(如，若其为天然存在的，则指自然环境)，并由此合成性地由其自然状态改变的核酸。本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA以及它们的衍生物。当分离的核酸是RNA或它的衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应被替换为“u”。本文使用的术语“互补”是指核酸分子的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”是指两个核酸或化合物或相关的核酸或化合物或者其组合之间的物理或化学的相互作用。互补核酸序列在适当的条件下杂交以形成稳定的双螺旋(duplex)结构，其包含极少的错配或不包含错配。对本发明而言，具有5个或更少的错配的两个序列被认为是互补的。而且本发明的分离的核苷酸的有义和反义链通过杂交可以形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选的实施方案中，这样的双螺旋在每10个配对中包含不多于1个错配。在一个特别优选的实施方案中，双螺旋的两条链完全互补，这样的双螺旋不含有错配。对于PCDH1，CDH3或GPR107，核酸分子的长度分别小于3851，3205或6840个核苷酸。例如，所述核酸分子的长度小于约500，约200或约75个核苷酸。本发明还包括含有一种或多种本文所述的核酸的载体，以及含有该载体的细胞。本发明的分离的核酸用于抗PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA，或者编码该siRNA的DNA。当所述核酸用于siRNA或者编码siRNA的DNA时，有义链优选长于约19个核苷酸，更优选长于21个核苷酸。本发明部分地基于下面的发现在胰管腺癌(PDACa)中，同非癌性胰组织相比，编码PCDH1，CDH3或GPR107的基因过量表达。PCDH1，CDH3或GPR107的cDNA长度为3851，3205或6840个核苷酸。PCDH1，CDH3或GPR107的核酸序列和多肽序列分别显示在SEQIDNO1和2，3和4或5和6。这些序列数据也可通过下面的登录号得到。PCDH1(CFUPC)L11370，NM_002587CDH3X63629，NM_001793GPR107NM_032925，NM_020960，(KIAA1624R39794)AB046844包含SEQIDNOs22，23和24的siRNAs的转染导致PDACa细胞系的生长抑制。PCDH1(CFUPC)属于原钙黏着蛋白家族(protocadherinfamily)，其是钙依赖的细胞-细胞粘附的分子的钙黏着蛋白超家族(cadherinsuperfamily)中最大的亚族。许多原钙黏着蛋在中枢神经系统中高表达，它们可能在神经回路发生和突触传递调节中发挥作用(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993.FrankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002)。但是，PCDH1在胰腺癌细胞中十分丰富，中枢神经系统中却不丰富(图3A)，它的功能还不清楚。CDH3也是钙黏着蛋白家族中一个典型成员(ShimoyamaY，YoshidaT，TeradaM，ShimosatoY，AbeO，HirohashiS.MolecularcloningofahumanCa2+-dependentcell-celladhesionmoleculehomologoustomouseplacentalcadherinitslowexpressioninhumanplacentaltissues.JCellBiol.，1091787-94.1989)，它们通过其保守的胞内域与联蛋白(catenins)和细胞骨架(cytoskeletons)连接，介导控制细胞极性、分化、运动和细胞生长的信号转导(ChristoforiG.Changingneighbors，changingbehaviorcelladhesionmolecules-mediatedsignalingduringtumorprogression.EMBOJ.，22，2318-2323，2003)。但是，与E-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白不同，CDH3的功能还不清楚。在乳腺和卵巢中观察到了它的表达，在乳腺癌和前列腺癌中报道了表达的丧失(loss)，尽管乳腺癌中的P-钙黏着蛋白的表达与较差的预后相关联((PeraltaSolerA，KnudsenKA，SalazarH，HanAC，KeshgegianAA.P-cadherinexpressioninbreastcarcinomaindicatespoorsurvival.Cancer，861263-1272.1999)。GPR107(KIAA1624)是有七次跨膜结构(seventransmembrane)的G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)的一种。当前有很大一部分处方药靶向一个或多个GPCR，而对于大部分主要的治疗区域，在某种程度上通过几种以GPCR为基础的药物起作用。很明显，就药物发现的潜力而言，GPCRs的排位是最高的。如Northern印迹分析(图3C)所示，GPR107在正常的心脏、胎盘、骨骼肌、前列腺、睾丸、卵巢和脊髓中无限制地表达。但是，GPR107在重要的生命器官中丰度较低，这说明靶向这些分子可望在人体内产生较低的毒性。抑制细胞生长的方法本发明涉及通过抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表达来抑制细胞生长，即癌细胞生长。PCDH1，CDH3或GPR107的表达，例如，通过特异性地靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干扰RNA(siRNA)而被抑制。PCDH1，CDH3或GPR107靶物包括，例如，SEQIDNOs22，23和24的核苷酸。在非哺乳动物细胞中，已显示双链RNA(dsRNA)对基因表达发挥很强的特异的沉默作用，这被称为RNA干扰(RNAi)(SharpPA.RNAianddouble-strandRNA.GenesDev.1999Jan15；13(2)139-41.)。dsRNA被含有RNaseIII基序的酶加工成20-23个核苷酸的dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)。所述siRNA与多组分核酸酶复合物一起特异地靶向互补的mRNA(HammondSM，BernsteinE，BeachD，HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.Nature.2000Mar16；404(6775)293-6；HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11；418(6894)244-51.)。在哺乳动物细胞中，由20或21-merdsRNA构成的、具有19个互补的核苷酸和3’末端非互补的胸腺嘧啶或尿嘧啶二聚体的siRNA，已显示具有基因特异性的knock-down作用而不导致基因表达的全局性变化(ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，YalcinA，WeberK，TuschlT.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001May24；411(6836)494-8.)。另外，含有核内小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)U6或聚合酶IIIH1-RNA启动子的质粒有效地产生这种募集第III类RNA聚合酶III的短RNA，从而能够组成性地抑制其目标mRNA(MiyagishiM，TairaK.U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3′overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechnol.2002May；20(5)497-500.；BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCellsScience.296(5567)550-553，April19，2002.)。通过将细胞与含有PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的组合物接触来抑制细胞生长。进一步将该细胞与转染试剂接触。合适的转染试剂是本领域已知的。抑制细胞的生长意味着同没有暴露于所述组合物的细胞相比，细胞以更低的速率增殖或具有降低的生存力。通过本领域已知的方法，如MTT细胞增殖试验来测定细胞生长。所述PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的单一靶物。或者，所述siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的多个靶物。例如，所述组合物含有定向于PCDH1，CDH3或GPR107的2个，3个，4个，或5个或者更多靶序列的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA。PCDH1，CDH3或GPR107靶序列是指与PCDH1，CDH3或GPR107基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人PCDH1，CDH3或GPR107基因的5’端非翻译(UT)区、开放阅读框(ORF)或者3’端非翻译区。或者，所述siRNA是同PCDH1，CDH3或GPR107基因表达的上游或下游调节序列(modulator)互补的核酸序列。上游和下游调节序列的例子包括同PCDH1，CDH3或GPR107基因启动子结合的转录因子、同PCDH1，CDH3或GPR107多肽相互作用的激酶或磷酸酶、PCDH1，CDH3或GPR107启动子或者增强子。同目标mRNA杂交的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA减少或抑制由PCDH1，CDH3或GPR107基因编码的PCDH1，CDH3或GPR107多肽产物的产生，这是通过与正常的单链mRNA转录本结合，从而干扰翻译，并由此干扰所述蛋白的表达。所以本发明的siRNA分子可定义为它们在严格的条件下，同来自PCDH1，CDH3或GPR107基因的mRNA或cDNA特异性杂交的能力。对本发明而言，术语“杂交”或“特异性杂交”用于指在“严格的杂交条件”下，两种核酸分子杂交的能力。术语“严格的杂交条件”是指在此条件下，通常是在核酸的复杂混合物中，核酸分子与其靶序列杂交，而与其它序列不发生可检测的杂交。严格的条件是序列依赖性的，而且在不同的环境下是不同的。序列越长，特异性杂交的温度越高。详细的关于核酸杂交的指导见于Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)。一般而言，在特定的离子强度和pH值条件下，严格条件选择为比特定序列的熔点(Tm)低大约5-10℃。所述Tm是指(在特定离子强度、pH值和核酸浓度下)大约50％的与靶物互补的探针同靶序列在平衡状态杂交的温度(由于靶序列过量存在，在Tm下，平衡时50％的探针被占据)。严格的条件也可以通过添加去稳定试剂如甲酰胺达到。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少为背景的2倍，优选是背景杂交的10倍。下面可为示例性的严格杂交条件50％的甲酰胺，5xSSC和1％SDS，孵育温度为42℃；或者5x的SSC和1％SDS，孵育温度为65℃，在0.2x的SSC和0.1％SDS在50℃洗涤。本发明的siRNA的长度小于约500个，约200个、约100个、约50个，或约25个核苷酸。优选地，该siRNA长度为约19个到约25个核苷酸。示例性的用于生产PCDH1，CDH3或GPR107siRNA的核酸序列分别包含SEQIDNos22，23或24的核苷酸序列作为靶序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可在靶序列的反义链的3’末端添加核苷酸“U”。待添加的“U”的数目最少为约2个，一般情况是约2个到约10个，优选约2个到约5个。添加的“U”在该siRNA的反义链的3’末端形成单链。细胞是任何表达或过表达PCDH1，CDH3或GPR107的细胞。该细胞是上皮细胞如胰管细胞。或者，该细胞是肿瘤细胞，例如如癌、腺癌、母细胞瘤、白血病、骨髓瘤或者肉瘤。所述细胞是胰管腺癌细胞。PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA以能同mRNA转录本相结合的形式直接导入细胞。或者，编码PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的DNA在载体中。载体通过例如下面的方式来产生将PCDH1，CDH3或GPR107靶序列克隆到表达载体中，其可操作地连接于调控序列，所述调控序列以使得两条链都(通过DNA分子的转录)表达的方式位于该PCDH1，CDH3或GPR107序列的侧翼，(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。由第一个启动子(如克隆的DNA的3’启动子序列)转录与PCDH1，CDH3或GPR107mRNA反义的RNA分子，另外由第二个启动子(如克隆的DNA的5’启动子)转录出PCDH1，CDH3或GPR107mRNA的有义链的RNA分子。有义和反义链在体内杂交以产生siRNA构建体用于使PCDH1，CDH3或GPR107基因沉默。或者，用两种构建体来产生siRNA构建体的有义和反义链。克隆的PCDH1，CDH3或GPR107也可编码具有二级结构，如发夹结构的构建体，其中单个转录本同时具有来自靶基因的有义序列和互补的反义序列。由任意的核苷酸序列组成的环序列可以位于有义和反义序列之间以形成发夹环结构。因此，本发明也提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是与同来自PCDH1，CDH3或GPR107的mRNA或cDNA特异性杂交的序列相对应的核糖核苷酸序列。在更优选的实施方案中，[A]是与选自SEQIDNos22，23和24的核苷酸的序列相对应的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区同序列[A’]杂交，然后形成由[B]区组成的环。环序列的长度优选可为约3个到约23个核苷酸。例如，环序列可选自下列序列(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供具活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438)。CCC，CCACC或者CCACACCJacque，J.M.，Triques，K.，andStevenson，M(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature，Vol.418435-438。UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，andTocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradationofdouble-strandedRNAbyanactivityinXenopuslaevisgerminalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4)1639-1644。UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，andSharp，P.A.(2002)KillingthemessengerShortRNAsthatsilencegeneexpression.NatureReviewsMolecularCellBiology4457-467。例如，本发明优选的带有发夹环结构的siRNAs如下所示。在下列的结构中，所述环序列可选自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环序列是UUCAAGAGA(DNA序列为ttcaagaga(SEQIDNO35))。GACAUCAAUGACAACACAC-[B]-GUGUGUUGUCAUUGAUGUC(SEQIDNO22的靶序列)GGAGACAGGCUGGUUGUUG-[B]-CAACAACCAGCCUGUCUCC(SEQIDNO23的靶序列)GUGGCUCUACCAGCUCCUG-[B]-CAGGAGCUGGUAGAGCCAC(SEQIDNO24的靶序列)PCDH1，CDH3或GPR107序列侧翼的调控序列是相同的或者是不同的，使得它们的表达可以被独立地调节，或者以时间的或空间的方式调节。通过将PCDH1，CDH3或GPR107基因模板克隆到载体中，可以在细胞内转录出siRNAs，其中所述表达载体包括，例如，来自于核内小RNA(snRNA)U6或者人H1RNA启动子的RNA聚合酶III转录单位。为了将载体引入到细胞中，可使用转染促进剂(transfectionenhancingagent)。将FuGENE(RocheDiagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(WakopureChemical)用作转染促进剂。根据标准的方法，在体外检测PCDH1，CDH3或GPR107mRNA中多个部分的寡核苷酸和互补寡核苷酸在肿瘤细胞(如使用胰腺细胞系，例如胰管腺癌(PDACa)细胞系)中减少PCDH1，CDH3或GPR107的能力。利用PCDH1，CDH3或GPR107的特异性抗体或其它检测策略测定，与没有候选siRNA组合物存在下培养的细胞相比，与候选siRNA组合物接触的细胞中PCDH1，CDH3或GPR107基因产物减少。然后，检测在体外的基于细胞或无细胞的分析中使PCDH1，CDH3或GPR107的产生减少的序列对于细胞生长的抑制作用。在小鼠或大鼠体内检测在体外基于细胞分析中抑制细胞生长的序列，以确证在具有恶性新生物的动物中PCDH1，CDH3或GPR107产生的减少及肿瘤细胞生长的降低。治疗恶性肿瘤的方法患有以过表达PCDH1，CDH3或GPR107为特征的肿瘤的患者通过施用PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA来治疗。在患有或具有发生例如胰管腺瘤(PDACa)的危险的患者中，siRNA疗法被用来抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表达。通过标准的方法来鉴定这些患者的具体肿瘤类型。胰管腺瘤(PDACa)例如通过CT，MRI，ERCP，MRCP，计算机X线断层摄影术(computertomography)或超声波来诊断。如果治疗在受试者中产生临床有益效果，例如PCDH1、CDH3或GPR107的表达减少，或肿瘤的大小、患病率(prevalence)或转移可能性的降低等等，则该治疗是有效的。当预防性应用治疗时，“有效”是指治疗阻碍或防止肿瘤的形成，或者防止或缓解肿瘤的临床症状的症状。有效性是结合任何用于诊断或治疗特定的肿瘤种类的已知方法来确定的。siRNA治疗是通过以编码本发明的siRNA的标准载体和/或基因递送系统，例如通过递送合成的siRNA分子对患者施用siRNA来进行的。通常，合成的siRNA分子被化学稳定化，以防止体内核酸酶降解。制备化学稳定化的RNA分子的方法在本领域是已知的。通常，这样的分子包含修饰的骨架(backbones)和核苷酸以防止核糖核酸酶的作用。其它的修饰也是可能的，如胆固醇结合的siRNA已显示了改善的药学性质(Songetal.NatureMed.9347-351(2003))。合适的基因递送系统可包括脂质体，受体介导的递送系统(receptormediateddeliverysystems)，或病毒载体例如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等等。治疗的核酸组合物被配制到可药用的载体中。治疗的组合物也可以包括如上所述的基因递送系统。可药用的载体是适合施用于动物的生物相容性赋形剂(vehicle)，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能产生医学上预期效果的量，所述医学上预期效果例如在受治疗的动物中减少PCDH1，CDH3或GPR107的产生，减少细胞生长如增殖，或者减少肿瘤生长。胃肠外施用，如静脉内、皮下、肌肉内和腹膜内递送途径，可以用来递送PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA组合物，对于胰腺癌的治疗，腹腔动脉、脾动脉或肝总动脉直接注入都是有用的。任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者身材的大小(size)、身体的表面积、年龄、所施用的具体核酸、性别、施用的时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。静脉内施用的核酸的剂量为大约106至1022个拷贝的所述核酸分子。以标准方法施用多核苷酸，如通过注射到如肌肉或皮肤组织的间质间隙(interstitialspace)中、导入到循环系统中或体腔中，或者通过吸入或吹入。多核苷酸也与可药用的液体载体，例如水性或部分水性的液体载体一起通过注射或其他途径递送给动物。多核苷酸同脂质体(如阳离子或阴离子脂质体)相结合。多聚核酸中包括靶细胞表达所需要的遗传信息，如启动子。除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有同本发明所属领域中普通技术人员的所通常理解的相同的意义。虽然与本文所描述的方法和材料类似或等价的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但是合适的方法和材料如下所述。这里所提到的出版物、专利申请、专利和其它的参考文献全部以其全文并入本文作为参考。在矛盾的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的，而不是限制性的。附图简述图1描述了通过RT-PCR显示在PDACa细胞中过量表达PCDH1(A)和CDH3(B)的确认结果的照片。来自同一个体的显微切割的正常胰管上皮细胞(正常)和生命器官(肺、心脏、肝、肾和骨髓)的样品，通过半定量RT-PCR进行对比。图2描述了显示PDACa组织中免疫组织化学结果的照片。在胰管腺癌细胞中观察到CDH3蛋白过量表达，但是正常的胰管中却没有。图3描述了每个胰腺癌靶基因在正常成年组织中的表达谱的Northern印迹分析的照片。(A)PCDH1，(B)CDH3和(C)GPR107。图4描述了显示用siRNAknockdownPDACa细胞PK-45P中内源PCDH1的效果的照片。图4(A)显示RT-PCR的结果。该结果证实，通过转染siRNA表达载体410si而不是通过EGFPsi，确认了PCH1mRNA的knockdown作用。410si被特异性地设计为用于PCDH1mRNA序列，而EGFP用于EGFPmRNA的序列。转染48小时后收获RNA进行分析。用ACTB将输入的cDNA进行归一化。图4(B)是显示集落形成试验的结果的照片。其显示用410si转染载体一周后集落的数目急剧减少，其中410si已通过RT-PCR证明有效地knockdownPCDH1。图4(C)是显示MTT测定结果的条形图。它也显示了用410si转染的而不是通过EGFPsi的生长细胞的数目急剧减少。图5描述了显示用siRNAknockdownPDACa细胞KLM-1中内源CDH3的效果的照片。图5(A)显示RT-PCR的结果。其通过转染siRNA表达载体si24而不是通过EGFPsi转染证实了CDH3mRNA的knockdown作用。si24被特异性地设计为用于CDH3mRNA序列，而EGFPsi则用于EGFPmRNA序列。转染48小时后收获RNA进行分析。用ACTB将输入的cDNA进行归一化。图5(B)是显示集落形成试验的结果的照片。其显示用si24转染一周后细胞中集落的数目明显减少，所述si42载体已通过RT-PCR证明有效地knockdownCDH3。图5(C)是显示MTT测定结果的条形图。它也显示用si24转染的而不是通过EGFPsi的生长细胞数的急剧减少。图6描述了用siRNAknockdownPDACa细胞KLM-1中内源GPR-107的效果的照片。图6(A)显示RT-PCR的结果。该结果通过转染siRNA表达载体1003si而不是通过EGFPsi，证实了GPR-107mRNA的knockdown作用。1003si特异性地设计为用于GPR-107mRNA序列，而EGFPsi则用于EGFPmRNA序列。转染48小时后收获RNA进行分析。用ACTB将输入的cDNA进行归一化。图6(B)是显示集落形成试验的结果的照片。其显示用1003si转染一周后细胞中集落的数目减少，所述1003si已通过RT-PCR证明有效地knockdownGPR-107。图6(C)是显示MTT测定结果的条形图。它也显示用1003si转染的而不通过EGFPsi的生长细胞数减少。实施本发明的最佳方式本发明将在下面的实施例中做进一步的描述，其并没有限制如权利要求中所述的本发明的范围。[实施例1]通用方法细胞系和组织样品人胰腺细胞系PK45P，KLM1和MIA-PaCa2(ATCC编号CRL-1420)得自日本东北大学发育、衰老和癌症研究所生物医学研究细胞资源中心(CellResourceCenterforBiomedicalResearch，InstituteofDevelopment，AgingandCancer，TohokuUniversity)。所有的细胞都是公众可获得的。利用cDNA微阵列分离PDACa细胞中过表达的基因cDNA微阵列玻片的制作方法已经有描述(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。对每个表达谱分析，都制备双份的包含大约23040个DNA点的cDNA微阵列片，以减少实验波动。简单的说，从18个胰腺癌组织显微切割的PDACa细胞和正常胰管上皮中纯化出总RNA。进行基于T7的RNA扩增，以获得足够用于微阵列实验的RNA。通过分别使用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(AmershamBiosciences)进行逆转录，对来自PDACa细胞和正常胰管上皮的扩增RNA的等分试样进行标记。杂交、洗涤和检测如前面描述进行(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。接着，在上调的基因中，关注PCDH1，CDH3和GPR107这三个基因，因为它们在超过50％的已知癌症中的表达率超过5.0，而根据我们以前对29种正常人组织中基因表达的数据，它们在正常的主要生命器官中的表达水平相对比较低(Saito-HisaminatoA，KatagiriT，KakiuchiS，NakamuraT，TsunodaT，NakamuraY.Genome-wideprofilingofgeneexpressionin29normalhumantissueswithacDNAmicroarray.DNARes.，935-45，2002)。PCDH1和CDH3的半定量RT-PCR将来自显微切割的PDACa细胞和正常胰管上皮细胞的RNA通过基于T7的体外转录(EpicentreTechnologies)经过两轮扩增，并合成为单链cDNA。制备每个单链cDNA的合适的稀释物用于随后的PCR扩增，其通过监控β-肌动蛋白(ACTB)作为定量对照。本发明人采用的引物序列为对于PCDH1为5’-AGAAGGAGACCAAGGACCTGTAT-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-AGAACTTTATTGTCAGGGTCAAGG-3’(SEQ.ID.NO.8)对于CDH3为5’-CTGAAGGCGGCTAACACAGAC-3’(SEQ.ID.NO.9)和5’-TACACGATTGTCCTCACCCTTC-3’(SEQ.ID.NO.10)对于ACTB为5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.ID.NO.12)所有的反应包括在GeneAmpPCR系统9700(PEAppliedBiosystems)上在94℃起始变性2分钟；然后进行21个(对ACTB)或28-32个(对PCDH1和CDH3)94℃30秒，58℃30秒，和72℃1分钟的循环。免疫组织化学将经甲醛固定和石蜡包埋的PDACa切片，用小鼠抗-CDH3单克隆抗体(BDTransductionLaboratories)进行免疫染色用于CDH3表达。将脱掉石蜡的组织切片置于pH6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中，并在高压灭菌器中加热至108℃15分钟用于抗原挽救(antigenretrieval)。将切片分别用稀释度为1∶10或1∶100的CDH3的第一抗体在湿度箱中在室温下温育一小时，并用过氧化物酶标记的葡聚糖聚合物然后用二氨基联苯胺(DAKOEnvisionPlusSystem；DAKOCorporation，Carpinteria，CA)来显色。最后用苏木精对切片进行复染。对于阴性对照的样品，省略了第一抗体。Northern印迹分析将人的多组织Northern印迹(Clontech)与[α-32P]dCTP标记的PCR产物进行杂交，所述PCR产物是通过上面描述的引物扩增的。按照供应商推荐的方法进行预杂交、杂交和洗涤。印迹在-80℃下用增感屏放射自显影5天。psiU6BX质粒的构建将编码siRNA的DNA序列插入如下面的质粒序列(SEQIDNo26)中(-)表示的核苷酸485-490的缺口中。据报道snRNAU6基因由RNA聚合酶III转录，RNA聚合酶III产生在3’末端具有尿苷的短转录本。使用人胎盘DNA作为模板，及引物组5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQIDNo27)和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQIDNo28)，通过PCR扩增包含启动子区的snRNAU6基因的基因组片段。纯化该产物并使用TA克隆试剂盒按照供应商(Invitrogen)的规程克隆到pCR质粒载体中。将含有snRNAU6基因的BamHI和XhoI片段纯化并克隆到pcDNA3.1(+)质粒的核苷酸1257-56片段，该片段是用引物组5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNo29)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNo30)通过PCR扩增的。将连接的DNA用作PCR的模板，其引物为5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQIDNo31)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQIDNo32)。将该产物用HindIII消化，其随后自连接以产生psiU6BX载体质粒。作为对照，通过将双链寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo34)克隆到载体psiU6BX中的BbsI位点而制备psiU6BX-EGFP。表达siRNA的构建体siRNA的核苷酸序列是使用可从Ambion网站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)得到的siRNA设计计算机程序进行设计的。简单地说，用于siRNA合成的核苷酸序列使用下面的规程来选择。siRNA目标位点的选择1.从每个基因转录本的起始密码子AUG开始，向下游搜索AA二核苷酸序列。将每一处AA和3’端相邻的19个核苷酸的出现记录为可能的siRNA目标位点。Tuschl等不推荐在5’和3’非翻译区(UTR)和起始密码子附近区域(75个碱基以内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白的结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物会干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将可能的目标位点同适当的基因组数据库(人类、小鼠、大鼠等等)进行对比，以淘汰掉与其他编码序列具有显著的同源性的靶序列。3.选择合格的靶序列用于合成。沿着基因的长度选择几个靶序列用于评价。下面显示用于基因PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的寡核苷酸。每个寡核苷酸是靶序列的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列的组合。发夹环结构的核苷酸序列和靶序列分别显示在SEQIDNO19到SEQIDNO21和SEQIDNO22到SEQIDNO24(从每一个发夹环结构序列中去除了核酸内切酶识别位点)。用于PCDH1的siRNA表达载体的插入序列410si5’-CACCGACATCAATGACAACACACTTCAAGAGAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO13)和5’-AAAAGACATCAATGACAACACACTCTCTTGAAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO14)用于CDH3的siRNA表达载体的插入序列si245’-CACCGGAGACAGGCTGGTTGTTGTTCAAGAGACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAGGAGACAGGCTGGTTGTTGTCTCTTGAACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO16)用于GPR107的siRNA表达载体的插入序列1003si5’-CACCGTGGCTCTACCAGCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAGTGGCTCTACCAGCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO18)作为对照的siRNA表达载体的插入序列EGFPsi(对照)5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO34)每个序列的序列号(SEQIDNO)在表1中列出集落形成/MTT测定将PK45P，KLM1和MIA-PaCa2之中的人PDACa细胞系铺到直径10-cm的盘中(5X105个细胞/盘)，并根据制造商的说明使用Lipofectamine2000(Invitrogen)或FuGENE6(Roche)以包含EGFP靶序列(EGFP)的psiU6BX和包含靶序列的psiU6BX进行转染。通过500mg/ml的遗传霉素(Geneticin)筛选细胞一周。最初的细胞在转染48小时后收获，并通过RT-PCR分析以证实对于PCDH1，CDH3和GPR107的knockdown。RT-PCR的引物与上面的相同。这些细胞也可用吉姆萨液(Giemsasolution)染色并进行MTT分析，从而分别评价集落的形成和细胞数。[实施例2]用siRNA方法减少基因PCDH1，CDH3或GPR107的表达和癌细胞的生长抑制在先前的研究中，通过结合激光显微切割和点样了27000个基因的全基因组cDNA微阵列，建立了PDACa精确的表达谱。本发明者通过与正常的胰管上皮(其被认为是PDACa的来源)的表达谱比较，在PDACa细胞中鉴定了超过200个基因作为上调的基因(NakamuraT，FurukawaY，NakagawaH，TsunodaT，OhigashiH，MurataK，IshikawaO，Ohgaki，KashimuraN，MiyamotoM，HiranoS，KondoS，KatohH，NakamuraY，andKatagiriT.Genome-widecDNAmicroarrayanalysisofgene-expressionprofilesinpancreaticcancersusingpopulationsoftumorcellsandnormalductalepitheliumcellsselectedforpuritybylasermicrodissection.Oncogene，2004Feb9，正式印刷前的电子发布稿(Epub))。根据这些PDACa细胞的表达谱，本发明人选择了三个过量表达的基因，使用来自显微切割的PDACa细胞的cDNA通过RT-PCR(图1A，B)或通过免疫组织化学(图2)，确证了PCDH1和CDH3在PDACa中的过量表达。(1)PCDH1(原钙黏着蛋白，Protocadherin1)(Genbank登录号NM_002587；SEQIDNo.1，2)为了研究PCDH1对PDACa细胞生长和存活的影响，本发明人通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术特异性地knockdownPCDH1在PDACa细胞系中的内源表达。如Northern印迹分析(图3A)所示，PCDH1在正常的心脏、胎盘和前列腺中不受限制地表达。它在主要的生命器官中丰度不高，这说明靶向这些分子将预期在人体内产生较低的毒性。转染产生siRNA的载体很清楚地导致一种设计用于PCDH1的siRNA，410si的内源性表达的减少(图4A)。该siRNA对于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成测定(图4B)和MTT测定(图4C)中导致了急剧的生长抑制。这些发现强烈地暗示PCDH1在PDACa细胞中的过表达与癌细胞生存力相关。PCDH1和其它原钙黏着蛋白被支持在细胞表面上通过它们的钙黏着蛋白结构域发生嗜同种受体相互作用(homophilicinteraction)，并且调节细胞骨架构象、细胞运动或细胞生长的胞内信号转导(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993，FrankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002.)。根据我们的数据，PCDH1可能通过其在细胞-细胞粘附中的嗜同种受体相互作用调节胰腺癌细胞生长的正信号。(2)CDH3(P-钙黏着蛋白，P-cadherin)(Genbank登录号NM001793；SEQIDNo.3，4)本发明人通过RT-PCR(图1B)和免疫组织化学(图2)确证CDH3在PDACa细胞中的过量表达。并根据微阵列数据和RT-PCR(图1B)，在我们的PDACa表达谱中超过200个上调的基因中CDH3过量表达是最显著的谱之一。如Northern印迹分析(图3B)所示CDH3在正常的胸腺、前列腺、卵巢和气管中不受限制地表达。它在主要生命器官中丰度不高，这说明靶向这些分子将预期在人体内产生较低的毒性。为了探讨CDH3对PDACa细胞生长或存活的影响，本发明人通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术特异性地knockdownCDH3在PDACa细胞系中的内源表达。转染产生siRNA的载体清楚地导致一种设计用于CDH3的siRNA，si24的内源性表达(图5A)。该siRNA对于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成测定(图5B)和MTT测定(图5C)中导致了急剧的生长抑制。这些发现强烈地暗示了CDH3在PDACa细胞中过表达与癌细胞生存力以及细胞间相互作用相关，而且这个分子可涉及来自细胞间相互作用的信号转导。PDACa有极强的侵略性，而且CDH3在PDACa细胞中的高表达也可与它们的侵略性和转移潜力有关。(3)GPR107(G蛋白偶联受体107)(Genbank登录号AB046844；SEQIDNo.5，6)本发明人确定此孤儿(orphan)GPCR作为胰腺癌的靶物，但其功能和配体未知。如Northern印迹分析(图3C)所示，GPR107在正常的心脏、胎盘、骨骼肌、睾丸、卵巢和脊髓中不受限制地表达。为了研究GPR107对于PDACa细胞生长或存活的影响，本发明人通过siRNA特异性地knockdown其GPR107在PDACa细胞系中的内源表达。转染产生siRNA的载体清楚地导致一种设计用于GPR107的siRNA，1003si的内源性表达的减少(图6A)。该siRNA对于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成测定(图6B)和MTT测定(图6C)中导致了急剧的生长抑制。这些发现强烈地暗示了GPR107在PDACa细胞中的过表达与癌细胞生存力相关。总之，本发明人鉴定了三种在PDACa细胞中过量表达的膜型分子，而且这三个分子都可能与癌细胞生长相关，这说明这些膜型分子是治疗致死性的胰腺癌的理想的分子靶物。工业适用性本发明人已显示了特异性靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干扰RNA(siRNA)抑制细胞生长。因此，这种新的siRNA是用于开发抗癌药物的有用的靶物。例如，阻碍PCDH1，CDH3或GPR107表达或者防止它们活性的试剂可以用作抗癌剂，特别是用于治疗胰腺癌，例如胰管腺癌(PDACa)的抗癌剂。尽管已经结合本发明具体实施方案对本发明进行了详细描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的前提下可以对本发明进行各种变动和修改。序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(OncotherapyScience，Inc.)<120>治疗胰腺癌的组合物和方法<130>ONC-A0406P<150>US60/555,809<151>2004-03-24<160>35<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3851<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(118)..(3300)<223><400>1cgcaaagccgccgggctgctgcgcccagagccagccggagccggagccggagcccgaact60gcagctccagccccagccgtgcggagccgcagcccaggccggggccggcggcggctc117atggacagcggggcgggcggccggcgctgcccggaggcggccctcctg165MetAspSerGlyAlaGlyGlyArgArgCysProGluAlaAlaLeuLeu151015attctggggcctcccaggatggagcacctgaggcacagcccaggccct213IlcLeuGlyProProArgMetGluHisLeuArgHisSerProGlyPro202530ggggggcaacggctactgctgccctccatgctgctagcactgctgctc261GlyGlyGlnArgLeuLeuLeuProSerMetLeuLeuAlaLeuLeuLeu354045ctgctggctccatccccaggccacgccactcgggtagtgtacaaggtg309LeuLeuAlaProSerProGlyHisAlaThrArgValValTyrLysVal505560ccggaggaacagccacccaacaccctcattgggagcctcgcagccgac357ProGluGluGlnProProAsnThrLeuIleGlySerLeuAlaAlaAsp65707580tatggttttccagatgtggggcacctgtacaagctagaggtgggtgcc405TyrGlyPheProAspValGlyHisLeuTyrLysLeuGluValGlyAla859095ccgtaccttcgcgtggatggcaagacaggtgacattttcaccaccgag453ProTyrLeuArgValAspGlyLysThrGlyAspIlePheThrThrGlu100105110acctccatcgaccgtgaggggctccgtgaatgccagaaccagctccct501ThrSerIleAspArgGluGlyLeuArgGluCysGlnAsnGlnLeuPro115120125ggtgatccctgcatcctggagtttgaggtatctatcacagacctcgtg549GlyAspProCysIleLeuGluPheGluValSerIleThrAspLeuVal130135140cagaatggcagcccccggctgctagagggccagatagaagtacaagac597GlnAsnGlySerProArgLeuLeuGluGlyGlnIleGluValGlnAsp145150155160atcaatgacaacacacccaacttcgcctcaccagtcatcactctggcc645IleAsnAspAsnThrProAsnPheAlaSerProValIleThrLeuAla165170175atccctgagaacaccaacatcggctcactcttccccatcccgctggct693IleProGluAsnThrAsnIleGlySerLeuPheProIleProLeuAla180185190tcagaccgtgatgctggtcccaacggtgtggcatcctatgagctgcag741SerAspArgAspAlaGlyProAsnGlyValAlaSerTyrGluLeuGln195200205gctgggcctgaggcccaggagctatttgggctgcaggtggcagaggac789AlaGlyProGluAlaGlnGluLeuPheGlyLeuGlnValAlaGluAsp210215220caggaggagaagcaaccacagctcattgtgatgggcaacctggaccgt837GlnGluGluLysGlnProGlnLeuIleValMetGlyAsnLeuAspArg225230235240gagcgctgggactcctatgacctcaccatcaaggtgcaggatggcggc885GluArgTrpAspSerTyrAspLeuThrIleLysValGlnAspGlyGly245250255agccccccacgcgccagcagtgccctgctgcgtgtcaccgtgcttgac933SerProProArgAlaSerSerAlaLeuLeuArgValThrValLeuAsp260265270accaatgacaacgcccccaagtttgagcggccctcctatgaggccgaa981ThrAsnAspAsnAlaProLysPheGluArgProSerTyrGluAlaGlu275280285ctatctgagaatagccccataggccactcggtcatccaggtgaaggcc1029LeuSerGluAsnSerProIleGlyHisSerValIleGlnValLysAla290295300aatgactcagaccaaggtgccaatgcagaaatcgaatacacattccac1077AsnAspSerAspGlnGlyAlaAsnAlaGluIleGluTyrThrPheHis305310315320caggcgcccgaagttgtgaggcgtcttcttcgactggacaggaacact1125GlnAlaProGluValValArgArgLeuLeuArgLeuAspArgAsnThr325330335ggacttatcactgttcagggcccggtggaccgtgaggacctaagcacc1173GlyLeuIleThrValGlnGlyProValAspArgGluAspLeuSerThr340345350ctgcgcttctcagtgcttgctaaggaccgaggcaccaaccccaagagt1221LeuArgPheSerValLeuAlaLysAspArgGlyThrAsnProLysSer355360365gcccgtgcccaggtggttgtgaccgtgaaggacatgaatgacaatgcc1269AlaArgAlaGlnValValValThrValLysAspMetAsnAspAsnAla370375380cccaccattgagatccggggcatagggctagtgactcatcaagatggg1317ProThrIleGluIleArgGlyIleGlyLeuValThrHisGlnAspGly385390395400atggctaacatctcagaggatgtggcagaggagacagctgtggccctg1365MetAlaAsnIleSerGluAspValAlaGluGluThrAlaValAlaLeu405410415gtgcaggtgtctgaccgagatgagggagagaatgcagctgtcacctgt1413ValGlnValSerAspArgAspGluGlyGluAsnAlaAlaValThrCys420425430gtggtggcaggtgatgtgcccttccagctgcgccaggccagtgagaca1461ValValAlaGlyAspValProPheGlnLeuArgGlnAlaSerGluThr435440445ggcagtgacagcaagaagaagtatttcctgcagactaccaccccgcta1509GlySerAspSerLysLysLysTyrPheLeuGlnThrThrThrProLeu450455460gactacgagaaggtcaaagactacaccattgagattgtggctgtggac1557AspTyrGluLysValLysAspTyrThrIleGluIleValAlaValAsp465470475480tctggcaaccccccactctccagcactaactccctcaaggtgcaggtg1605SerGlyAsnProProLeuSerSerThrAsnSerLeuLysValGlnVal485490495gtggacgtcaatgacaacgcacctgtcttcactcagagtgtcactgag1653ValAspValAsnAspAsnAlaProValPheThrGlnSerValThrGlu500505510gtcgccttcccggaaaacaacaagcctggtgaagtgattgctgagatc1701ValAlaPheProGluAsnAsnLysProGlyGluValIleAlaGluIle515520525actgccagtgatgctgactctggctctaatgctgagctggtttactct1749ThrAlaSerAspAlaAspSerGlySerAsnAlaGluLeuValTyrSer530535540ctggagcctgagccggctgctaagggcctcttcaccatctcacccgag1797LeuGl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