专利名称：预防和治疗代谢性骨病的含有α－芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗代谢性骨病的药物组合物，其含有作为活性成分的α-芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
背景技术：
代谢性骨病如骨质疏松症通常是由于骨中的蛋白质、钙、磷等的减少所引起。发生骨质疏松与年龄和性别无关，并且发生率随着年龄的增加而增加，尤其是在绝经后的妇女中存在高发生率。最近，由于全球人口老龄化，骨质疏松患者的数量已经不断地增加，因此现已需要开发一种有效预防和治疗骨质疏松症的药物。
目前骨质疏松症可用的治疗剂包括二膦酸盐、激素类药物、维生素D及其类似物、降钙素和钙。代表性的二膦酸盐包括阿仑膦酸盐(Merk and Co.，Ltd.)、利塞膦酸盐(Hoffman-La Roche Ltd.)、唑来膦酸盐(Novatis AG；EP Patent No.275,821)、伊本膦酸盐(Hoffman-La Roche Ltd.；US Patent No.4,942,157)和米诺膦酸盐(Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd.；EP Patent No.354,806)。二膦酸盐是骨质疏松的主要治疗剂；然而，它们的缺点在于经胃肠道的低吸收率和当没有遵守复杂的施用指导时可能引起食道炎。
激素类药物的实例包括雷洛昔芬(Eli Lilly and Co.)、屈洛昔芬(droloxyfene)(Pfizer Inc.；EP Patent No.54168)、lasopoxifene(Pfizer Inc.)、FC-1271(homosmedical Co.and Orion Corp.，WO96/07402)、TES-424(Ligand Co.and Weyers Co.，US Patent No.5,948,775)。然而，激素类药物具有引起乳腺癌和子宫癌的风险，因此它们有限制地用作需要长期施用的骨质疏松症治疗剂。
此外，维生素D及其类似物非常昂贵并且其对于骨质疏松的疗效没有明确确定；降钙素相对昂贵并要求困难的施用途径；并且尽管钙已知几乎不引起副作用，但是它只能有效预防骨质疏松，而没有治疗效果。
发明内容
因此，本发明的主要目的是提供一种用于预防和治疗代谢性骨病的新药物组合物，其具有良好的活性和低副作用。
根据本发明的一个方面，提供一种用于预防和治疗代谢性骨病药物组合物，其包含作为活性成分的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物 其中，A是O、S、CH2、O-N＝CH或O-N＝C(CH3)；X是H或卤素；Y是N或CH；Z是O或NH；R1是H或C1～4烷基；R2是未取代的或取代的芳基或杂芳基。
根据本发明的另一方面，提供式(1)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于预防和治疗代谢性骨病的用途。
根据本发明的又一方面，提供使用式(1)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物预防和治疗代谢性骨病的方法。
结合附图，本发明的以下说明将使得本发明上述和其它目的和特征显而易见，附图分别显示如下图1a和1b当切除卵巢诱导骨质疏松的经产小鼠经皮下注射根据本发明的化合物时，所观察的骨密度(BMD)变化；和图1b和2b当切除卵巢诱导骨质疏松的经产小鼠口服施用根据本发明的化合物时，所观察的BMD变化。
具体实施例方式
在式(1)化合物中，R2可以是芳基基团如苯基或萘基，或5-或6-元的含有至少一个选自O、S和N的元素的杂环芳环，如吡啶、嘧啶、唑酮、1，3，4-噻二唑、乙氧香豆素(cromene)、吲哚、吗啉、硫代吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪、N-乙酰基哌嗪、吡咯烷酮、哌啶酮、唑烷酮(oxazolidinone)、噻唑烷酮(thiazolidinone)和咪唑啉酮。
由R2表示的这种芳基或杂芳基基团可以被至少一种取代基所取代，所述取代基选自卤素、氰基、硝基、C1～4卤烷基、C1～4卤烯基、羟基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～6环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、1，3-二氧杂环戊-2-基、1，3-二氧杂环己-2-基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4酰氧基、C1～4烷羰基、C1～4烷羰氧基、C3～6环烷羰氧基、C1～4烷氧羰基、C1～4二烷氨基C1～4烷氧基、含有至少一个N或O的C2～5杂环C1～4烷氧基、2-吗啉乙氧基、2-(哌啶-1-基)乙氧基、未取代的或取代的含N杂芳基、未取代的或取代的氨基和未取代的或取代的氨基C1～2烷基。
未取代的或取代的氨基或氨基C1～2烷基由-(CH2)n-NR3R4表示，其中n是0、1或2，R3和R4各自独立是H、C1～8烷基、C1～8卤烷基、羟基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～8环烷基、C3～8环烷基C1～4烷基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～8环烷氧基C1～4烷基、C1～8烷基磺酰基、含有至少一个N、O或S的C2～7杂环C1～4烷基或任选取代的芳基；或R3和R4可以和与它们连接的氮原子一起融合形成杂环。
由R2表示的芳基或杂芳基基团的含N杂芳基取代基可以是吡咯基、咪唑基、唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、四唑基、吲唑基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、异喹啉基和喹唑啉基，并且它可以进一步被至少一种选自以下的取代基所取代卤素、氰基、硝基、C1～6卤烷基、C1～6卤烯基、羟基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～8环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4酰氧基、C1～4烷羰基、C1～4烷羰氧基、C3～8环烷羰氧基、C1～4烷氧羰基、C1～4二烷氨基和SO2NR5R6，所述SO2NR5R6中的R5和R6各自独立为H或C1～6烷基。
式(1)化合物的代表性实例包括示于表1a-1l和后面的表3a-3n中的化合物。
表1a
表1b
表1c
表1d
表1e
表1f
表1g
表1h
表1i
表1j
表1k
表1l 在式(1)化合物中，优选其中A是O或O-N＝C(CH3)；X是H、F或Cl，Y是CH，Z是O，R1是甲基和R2是取代的或未取代的芳基。
尤其优选的是具有式(1a)的化合物 其中A是O或O-N＝C(CH3)；X表示H、F或Cl；Ab是至少一个选自以下的基团卤素、C1～4卤烷基、C1～4卤烯基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～6环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、1，3-二氧杂环戊-2-基、1，3-二氧杂环己-2-基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4二烷氨基C1～4烷氧基、含有至少一个N或O的C2～5杂环C1～4烷氧基、2-吗啉乙氧基、2-(哌啶-1-基)乙氧基、未取代的或取代的含N杂芳基、未取代的或取代的氨基和未取代的或取代的氨基C1～2烷基。
式(1)化合物的具体实例包括(E)-甲基2-(2-((4-辛基苯氧基)甲基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(环丙基甲氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基-丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(1-甲基丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基-丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(2-吗啉基乙氧基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(1，3-二氧杂环己-2-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯乙基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-己氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-氰基甲氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(4-甲基piperizan-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-氟-4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((2-氟-4-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(吗啉基甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(N-甲基-N-苯氨基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-((4-甲基piperizan-1-基)甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((5-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；和(E)-甲基2-(2-((6-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
本发明的组合物也可以包含式(1)化合物的生理和药学上可接受的盐作为活性成分。药学上可接受的盐可以是无毒和水溶性盐。其代表性实例包括碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如镁盐和钙盐；铵盐如四甲基铵盐；胺盐如三乙胺、甲胺、二甲胺、环戊胺、苄胺、苯乙胺、哌啶、一乙醇胺、二乙醇胺、三(羟甲基)-氨基甲烷、赖氨酸、精氨酸和N-甲基-D-葡糖胺(glucarmine)盐；无机酸盐如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸和硝酸盐；有机酸盐如乙酸、乳酸、酒石酸、苯甲酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、羟乙磺酸(isetionic)、葡糖醛酸和葡糖酸盐；水合物；和溶剂化物如醇化物(例如，乙醇化物)。
用于本发明中的式(1)化合物可以通过欧洲专利出版物No.278,595描述的方法制备。例如，式(1a)化合物可以通过在碱存在下使式(2)化合物与式(3)化合物反应来制备。
其中，X，Y，A和Ab限定同上。
此外，在上面反应中用作起始物质的式(2)化合物可以按反应方案1进行制备反应方案1 其中，X限定同上；Q是卤素如碘、溴和氯。
如反应方案1中所示，式(2)化合物可以通过包括以下步骤的方法制备式(4)的芳基卤化合物(优选Q是碘或溴)与三异丙基硼酸盐在碱如正丁基锂存在下进行反应，并用酸溶液，例如盐酸，处理反应获得的混合物，以形成式(5)化合物(见W Li et al.，J.Org.Chem.，67，5394，2002)；式(5)化合物与式(6)的α-卤甲氧基丙烯酸甲酯(优选Q是碘或溴)在钯催化剂例如Pd(OAc)2或Pd(PPh3)4和无机盐例如K2CO3、Na2CO3、K2PO4或Cs2CO3存在下进行反应，以形成式(7)化合物，所述式(6)化合物是从作为起始物质的丙酸甲酯按照公开于R.E.Ireland et al.，J.Org.Chem.，56，3572，1991和D.M.Hodgson et al.，Synlett，32，1995的方法制备而得；并且用N-溴琥珀酰亚胺处理式(7)化合物。
一种特定的式(2)化合物，(E)-甲基-2-(2-溴甲基苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯(即，X是氢的式(2)化合物)可以通过公开于欧洲专利出版物No.278,595的方法制备。
式(3)化合物也可以按常规的方式制备，并且特别是具有作为A基团的O-N＝C(CH3)的那些化合物可以按公开于韩国专利No.31195和31196的方法获得，其中A是氧和Ab是氨基的那些化合物可按公开于Hassen，J.et al.，Chemical Review，102，1359，2002的方法获得。
此外，式(1a)化合物可以按反应方案2所示的步骤制备反应方案2 其中，X、Ab和Q限定同上。
按照反应方案2，式(1a)化合物可以通过包括以下步骤的方法制备用N-溴琥珀酰亚胺处理式(8)卤甲苯化合物(优选Q是碘或溴)以形成式(9)苄基溴化合物；式(9)化合物与式(3a)酚化合物反应形成式(10)化合物；使式(10)化合物与三异丙基硼酸盐在碱例如正丁基锂存在下进行反应，并用酸溶液例如盐酸处理反应获得的混合物，以形成式(11)化合物；和使式(11)化合物与式(6)化合物在钯催化剂例如Pd(OAc)2和Pd(PPh3)4和无机盐例如K2CO3、Na2CO3、K2PO4或Cs2CO3存在下进行反应。
用于上述方法中的式(3a)化合物可以按已知方法制备，Ab具有氨基基团的所述化合物可以按公开在Hassen，J.et al.，ChemicalReview，102，1359，2002和Wolfe，J.P.et al.，J.Org.Chem.，65，1158，2000的方法合成，Ab具有-NR3R4的所述化合物(式(3a-1)化合物)可以按反应方案3所示的步骤制备。
反应方案3 其中，R3和R4与上述限定相同的含义；L是卤素或OSO2CF3；PG是甲基、苄基或三烷基甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)。
也就是说，式(3a-1)化合物可以通过对式(12)化合物的胺化，然后对从胺化反应中获得的式(13)化合物进行脱保护基来制备。
式(12)化合物的胺化反应可以按常规的胺化方法实施(见Smith，M.B.et al.，Advanced Organic Chemistry，5thEd.，pp 850-893，2001)，脱保护基可以按常规的脱保护基方法实施(见Greene，T.W.et al，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdEd.，pp 23-148，1999)。胺化反应可以在惰性溶剂中、在钯催化剂、碱和膦配体存在下实施。代表性的钯催化剂包括但不限于乙酸钯(II)、氯化钯(II)、溴化钯(II)、二氯双(三苯基膦)钯(II)、四(三苯基膦)合钯(0)和三(二苯亚甲基丙酮)二钯(0)。代表性膦配体包括但不限于2，2’-双(二苯基膦)-1，1’-二萘基(BINAP)、三邻甲苯基膦、三叔丁基膦、1，1’-双(二苯基膦)二茂铁、双[(2-二苯基膦)-苯基]醚(DPEphos)、2-二环己基二苯膦基(phosphanyl)-2’-二甲氨基二苯基、2-(二叔丁基膦)二苯基、9，9’-二甲基-4，6-双(二苯基膦)氧杂蒽(Xanthaphos)及其外消旋物。代表性的碱包括叔丁醇钠(t-BuONa)和无机盐(例如，K2CO3、Na2CO3、K2PO4或Cs2CO3)。代表性的惰性溶剂包括1，4-二氧杂环己烷、甲苯、苯、乙腈、二甲基甲酰胺和四氢呋喃。钯催化剂和膦配体可以以催化量使用，优选量为基于式12化合物的0.1-10摩尔％。胺化可以在80-150℃下于惰性气体如氩气或氮气中实施3-30分钟。
同样也如反应方案3所示，式13化合物可以通过还原含硝基的式14化合物，然后对反应获得的含氨基化合物，即式15化合物，进行烷化作用来制备。
而且，具有取代的氨甲基基团(-CH2-NR3R4)Ab的式(3a)化合物(式(3a-2)化合物)可以通过如反应方案4所示的方法制备。
反应方案4 其中，R3和R4限定同上。
也就是说，式(3a-2)化合物可以按常规方法通过式(16)醛化合物的胺化进行制备。反应方案4的胺化可以在还原剂的存在下于惰性溶剂中实施。还原剂的实例包括但不限于硼氢化钠(NaBH4)、硼氢化氰钠(NaBH3CN)和三乙酸基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)。
式(1)化合物作为活性成分与药学上可接受载体一起用于治疗或预防代谢性骨病的药物组合物中。代表性的药学上可接受载体包括赋形剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂和调味剂。如果必要的话，本发明组合物可以进一步包括其它增进健康的成分如维生素C。
本发明的药用组合物可以配制成不同剂型，如片、胶囊、粉、颗粒和溶液例如悬剂、乳剂和糖浆，以及其它用于口服和肠胃外施用的剂型。本发明药物组合物可以以单剂量或分剂量施用。在肠胃外给药施用的情况下，活性成分的典型日剂量为0.5-5mg/kg体重，优选1-4mg/kg体重；在口服施用的情况下，为5-50mg/kg体重，优选10-40mg/kg体重。然而，应该理解的是活性成分的实际施用量应该根据各种相关因素确定，包括治疗条件、选择的施用途径、患者个体的年龄、性别和体重以及患者症状的严重程度；因此，上述剂量没有在任何方面限制发明范围的意图。
按照本发明的其它方面，提供一种用于治疗或预防代谢性骨病如骨质疏松的健康食品或饮品组合物，其包含式(1)化合物作为活性成分。可以应用式(1)化合物的代表性食品和饮品包括但不限于肉类、饮料、巧克力、零食、甜食、匹萨饼、速食面、各种面条、口香糖、冰激凌、酒精饮料和维生素制剂。在健康食品或饮品组合物中，式(1)化合物可以应用的量为组合物重量的0.1-80％。
以下将结合实施例进一步详细描述本发明。然而，应该理解的是本发明不受具体实施例限制。
实施例1制备(E)-甲基-2-(2-((4-(环丙基甲基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号267)步骤1)13.3ml(0.1mol)的2-溴-5-氯甲苯溶解于200ml无水THF，并将27.7ml(0.12mol)硼酸三异丙酯加入其中。在干冰-丙酮浴中将反应混合物冷却至-78℃后，将48ml(0.12mol)的2.5Mn-BuLi(在己烷中)向其中滴加1小时，移除干冰-丙酮浴，并向其中加入150ml的3N HCl。搅拌所得的混合物1小时，并用100ml乙酸乙酯分两部分萃取分离的水层两次。混合有机层，用盐水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥，并减压过滤以去除溶剂。残留物从10％乙酸乙酯/己烷中再结晶，得到13.8g(产率81％)白色固体的4-氯-2-甲基硼酸。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 8.07(dd，1H，J＝5.7Hz，2.8Hz)，7.28-7.26(m，2H)，2.76(s，3H)步骤2)将13.8g(80mmol)的步骤1所得化合物、3.1g(2.7mmol)四(三苯基膦)合钯和42.7g(200mmol)K3PO4相继置于烧瓶中，然后向其中加入450ml二氧杂环己烷和90ml水。向其中加入16.2g(67mmol)的(E)-甲基-2-碘-3-甲氧基-2-丙烯酸酯后，将混合物在90℃下搅拌22小时并冷却至室温，然后向其中加入200ml乙酸乙酯。用50ml的乙酸乙酯分成两份萃取分离的水层两次，合并有机层，并用100ml水和100ml的盐溶液洗涤。所得溶液经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对浓缩物进行柱色谱，其中使用10％乙酸乙酯/己烷作为洗提剂，获得12.6g(产率78％)白色固体的(E)-甲基-2-(4-氯-2-甲苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.56(s，1H)，7.22-7.14(m，2H)，7.03(d，1H，J＝8.2Hz)，3.83(s，3H)，3.70(s，3H)，2.15(s，3H)步骤3)将9.7g(40mmol)步骤2中所得化合物溶解于200ml四氯化碳中，然后向其中加入0.7g(4mmol)AIBN和7.9g(44mmol)N-溴琥珀酰亚胺。混合物回流5小时，然后冷却至室温。反应混合物用50ml水洗涤两次，并用50ml的盐溶液分成多份洗涤，经无水MgSO4干燥，并减压蒸馏获得油状的含有少量起始物质的(E)-甲基-2-(2-溴甲基-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
步骤4)将0.6g(1.8mmol)步骤3中所得化合物溶解于5ml乙腈中，向其中加入0.5g(3.6mmol)K2CO3和0.27g(1.8mmol)4-环丙基甲氧基苯酚，获得的混合物回流15小时，然后减压蒸馏以去除溶剂。向残留物中加入30ml乙酸乙酯，所得混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对浓缩物进行柱色谱，获得0.6g(产率85％)白色固体的(E)-甲基-2-(2-((4-(环丙基甲氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.58(s，1H)，7.55(d，J＝2.4Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.1Hz，2.1Hz，1H)，7.07(d，J＝8.1Hz，1H)，6.83(s，4H)，4.85(s，2H)，3.82(s，3H)，3.73(d，J＝7.2Hz，2H)，3.69(s，3H)，1.27-1.22(m，1H)，0.65-0.59(m，2H)，0.35-0.30(m，2H)实施例2制备(E)-甲基-2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号274)步骤1)将20.5g(100mmol)2-溴-5-氯甲苯溶解于200ml四氯化碳，向其中加入0.2g(1mmol)AIBN和19.6g(110mmol)N-溴琥珀酰亚胺，获得的混合物回流2小时并冷却至室温。反应混合物用50ml水洗涤两次并用50ml盐溶液洗涤，经无水MgSO4干燥，减压蒸馏以获得含有少量起始物质的油状物。将该油状物溶解于20ml己烷，并在室温下重结晶，得到22.7g(产率80％)2-溴-1-溴甲基-5-氯苯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.50(d，1H，J＝8.7Hz)，7.45(d，1H，J＝2.4Hz)，7.15(dd，1H，J＝8.7Hz，2.4Hz)，4.53(s，2H)步骤2)
将1.42g(5mmol)步骤1中所得化合物溶解于20ml乙腈，向其中加入1.38g(10mmol)K2CO3和0.84g(5mmol)4-(2-甲氧基乙氧基)苯酚，回流15小时。反应混合物减压蒸馏以去除溶剂，并向其中加入20ml乙酸乙酯。获得的混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。使用20％乙酸乙酯/己烷对该浓缩物进行柱色谱，获得1.76g(产率95％)的1-(2-溴-5-氯苄氧基)-4-(2-甲氧基乙氧基)苯。
步骤3)在烧瓶中，将1.8g(4.8mmol)步骤2中所得化合物溶解于10ml无水THF，向其中加入1.34ml(5.8mmol)硼酸三异丙酯。烧瓶经干冰-丙酮浴被冷却至-78℃，向混合物滴加2.3ml(5.8mmol)的2.5Mn-BuLi(在己烷中)15分钟。保持反应混合物1小时后，移除干冰-丙酮浴，并将5ml的2N HCl加到混合物中。搅拌混合物1小时后，分离水层并用10ml乙酸乙酯分两份萃取两次。合并有机层，用盐溶液洗涤，经无水MgSO4干燥，并减压过滤以去除溶剂。残留物从乙酸乙酯/己烷中重结晶，获得1.12g(产率69％)的2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基硼酸。
步骤4)将1.1g(3.3mmol)步骤3中所得化合物、0.17g(0.15mmol)四(三苯基膦)合钯和1.96g(9.0mmol)K2CO3置于烧瓶中，并向其中加入5ml二氧杂环己烷和1ml水。向其中加入0.73g(3.0mmol)(E)-甲基-2-碘-3-甲氧基-2-丙烯酸酯后，将所得混合物在90℃下混合22小时。将该混合物冷却至室温，并向其中加入10ml乙酸乙酯。分离水层并用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，用水洗涤，然后用20ml盐溶液洗涤，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对获得的残留物进行柱色谱，其中使用20％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得0.87g(产率71％)的(E)-甲基-2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.58(s，1H)，7.56(d，J＝2.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.1Hz，2.1Hz，1H)，7.00(d，J＝8.0Hz，1H)，6.83(s，4H)，4.85(s，2H)，4.06(t，J＝6.1Hz，2H)，3.82(s，3H)，3.73(t，J＝6.1Hz，2H)，3.70(s，3H)，3.44(s，3H)进行与实施例1和2相似的步骤以获得如表1a-1l所示的α-芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物，所得代表性化合物的1H-NMR和MS分析结果示于表2a-2c。
表2a
表2b
表2c
实施例3制备(E)-甲基-2-[2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)-4-氯苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号386)步骤1)方法1将526mg(2.0mmol)的1-(苄氧基)-3-溴苯、209μl(2.4mmol)的吗啉、283mg(2.8mmol)的叔丁醇钠、9mg(0.005mmol)的三(二亚苄基)二钯(O)和19mg(0.015mmol)的(±)-BINAP置于烧瓶中，向其中加入5ml的甲苯，在80℃下搅拌混合物20小时。反应混合物冷却至室温，向其中加入20ml乙酸乙酯，并通过Cellite过滤。获得的过滤物减压浓缩，并对残留物进行柱色谱，使用30％的乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得430mg(产率80％)的4-(3-(苄氧基)苯基)吗啉。
方法2除了在气密微波反应器中在120℃下进行反应之外，重复方法1的步骤，获得450mg(产率85％)的4-(3-(苄氧基)苯基)吗啉。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.44-7.32(m，5H)，7.18(t，1H，J＝8.7Hz)，6.55-6.53(m，3H)，5.04(s，2H)，3.84(t，4H，J＝4.7Hz)，3.14(t，4H，J＝4.9Hz)步骤2)将400mg(1.4mmol)步骤1中所得化合物溶解于10ml甲醇和5ml乙酸乙酯混合物中，并向其中加入32mg的10％钯/碳。混合物置于氢化反应器中，在氢压为30-40psi下保持36小时，通过Cellite过滤，并减压浓缩。对获得的残留物进行柱色谱，使用5％的甲醇/二氯甲烷作为洗脱剂，获得240mg(产率80％)固体形式的3-吗啉基苯酚。
熔点116-118℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.13(t，1H，J＝8.3Hz)，6.50(dd，1H，J＝8.3，2.5Hz)，6.40-6.32(m，2H)，4.73(s，1H)，3.85(t，4H，J＝4.8Hz)，3.15(t，4H，J＝4.8Hz)；MS(EI)M+C10H13NO2的计算值179.0946，实测值179步骤3)将58mg(0.42mmol)的(E)-甲基-2-(2-溴甲基-4-氯)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯溶解于2ml乙腈中，向其中加入110mg(0.84mmol)K2CO3和50mg(0.28mmol)的吗啉基苯酚，混合物回流15小时。反应混合物减压蒸馏以去除溶剂，并向其中加入10ml的乙酸乙酯。获得的混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对浓缩物进行柱色谱，使用20％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得70mg(产率60％)油状物的(E)-甲基-2-[2-((3-吗啉基苯氧基)甲基-4-氯苯基)]-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58(s，1H)，7.56-7.09(m，4H)，6.54-6.39(m，3H)，4.95(s，2H)，3.87-3.83(m，4H)，3.81(s，3H)，3.68(s，3H)，3.07-3.02(m，4H)；MS(EI)M+C22H24ClNO5的计算值417.1343，实测值417实施例4制备(E)-甲基-2-[2-((3-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号388)步骤1)将10.91g(100mmol)的3-氨基苯酚溶解于100ml甲苯，并向其中加入18.5g(220mmol)碳酸氢钠和16.0ml(110mmol)的1，5-二溴戊烷，然后回流所得混合物17小时。反应混合物冷却至室温，并向其中加入100ml水和100ml乙酸乙酯。分离水层，并用100ml的乙酸乙酯分两份萃取两次，合并有机层，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对浓缩物进行柱色谱，使用20％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得12.9g(产率73％)固体的3-(哌啶-1-基)苯酚。
熔点112-114℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.09(t，1H，J＝7.9Hz)，6.52(dd，1H，J＝8.3，2.3Hz)，6.41(t，1H，J＝2.3Hz)，6.26(dd，1H，J＝8.2，2.4Hz)，4.60(s，1H)，3.17-3.12(m，4H)，1.69-1.55(m，6H)；MS(EI)M+C10H15NO的计算值177.1154，实测值177步骤2)将96mg(0.33mmol)的(E)-甲基-2-(2-溴甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯溶解于2ml乙腈，并向其中加入58mg(0.42mmol)K2CO3和50mg(0.28mmol)的步骤1中所得化合物，然后使混合物回流15小时。反应混合物减压蒸馏以去除溶剂，并向其中加入10ml乙酸乙酯。获得的混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用20％乙酸乙酯/氯己烷作为洗脱剂，获得56mg(产率52％)白色固体的(E)-甲基-2-[2-((3-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
熔点64-66℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58(s，1H)，7.53-7.06(m，5H)，6.55-6.34(m，3H)，4.93(s，2H)，3.81(s，3H)，3.69(s，3H)，3.15-3.10(m，4H)，1.68-1.54(m，6H)；MS(EI)M+C23H27NO4的计算值381.194，实测值381(10，M+)，205(11)，145(36)，43实施例5制备(E)-甲基-2-[2-((4-(N-异丁氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号425)和(E)-甲基-2-[2-((4-(N-异丁基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号426)步骤1)将1.2g(3.6mmol)(E)-甲基-2-(2-溴甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯溶解于20ml乙腈，向其中加入1.0g(7.2mmol)K2CO3和0.57g(3.6mmol)2-氟-4-硝基苯酚，然后回流混合物15小时。反应混合物减压蒸馏以去除溶剂，向其中加入50ml乙酸乙酯。获得的混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥，并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用30％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得1.07g(产率82％)白色固体的(E)-甲基-2-[2-((2-氟-4-硝基苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
步骤2)将1.0g(2.7mmol)的步骤1中所得化合物溶解于5ml甲醇和5ml乙酸乙酯混合物中，并向其中加入200mg的10％钯/碳。将所得混合物置于氢化反应器中，将氢气引入其中并搅拌混合物18小时。反应混合物通过Cellite过滤，并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用40％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得0.84g(产率92％)的(E)-甲基-2-[2-((2-氟-4-氨基苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
步骤3)将150mg(0.45mmol)的步骤2中所得化合物溶解于2ml二氯甲烷，向其中加入134mg(0.63mmol)NaBH(OAc)3和41μl(0.45mmol)异丁基醛。在室温下搅拌6小时后，用饱和碳酸氢钠处理反应混合物，并分离水层，用10ml二氯甲烷分两份萃取两次。合并有机层，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用20％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得103mg(产率60％)油状的(E)-甲基-2-[2-((4-(N-异丁氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.59(s，1H)，7.58-7.56(m，1H)，7.34-7.29(m，2H)，7.16-7.13(m，1H)，6.76-6.70(m，1H)，6.38-6.21(m，2H)，4.90(s，2H)，3.79(s，3H)，3.68(s，3H)，3.54(bs，1H)，2.83(d，J＝6.6，2H)，1.88-1.79(m，1H)，0.96-0.94(m，6H)步骤4)将70mg(0.18mmol)的步骤3中所得化合物溶解于1.5ml二氯甲烷中，并向其中加入57mg(0.27mmol)NaBH(OAc)3和30μl(0.40mmol)甲醛。在室温下搅拌22小时后，用饱和碳酸氢钠水溶液处理反应混合物，分离水层并用10ml二氯甲烷萃取两次。合并有机层，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用20％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得50mg(产率73％)油状的(E)-甲基-2-[2-((4-(N-异丁基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.60(s，1H)，7.59-7.57(m，1H)，7.34-7.30(m，2H)，7.16-7.13(m，1H)，6.82-6.76(m，1H)，6.45-6.23(m，2H)，4.91(s，2H)，3.80(s，3H)，3.68(s，3H)，2.98(d，J＝7.2，2H)，2.86(s，3H)，2.03-1.94(m，1H)，0.91-0.88(m，6H)实施例6制备(E)-甲基-2-[2-((3-(吗啉基甲基)苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化合物编号404)步骤1)将1.2g(4.0mmol)(E)-甲基-2-(2-溴甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯溶解于20ml乙腈，向其中加入1.11g(8.0mmol)K2CO3和0.59g(4.8mmol)3-羟基苯甲醛，然后回流混合物15小时。反应混合物减压蒸馏以去除溶剂，并向其中加入50ml乙酸乙酯。获得的混合物用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用30％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得0.98g(产率75％)白色固体的(E)-甲基-2-[2-((3-甲酰苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
步骤2)将326mg(1.0mmol)的步骤1中所得化合物溶解于5ml二氯甲烷，并向其中加入297mg(1.4mmol)NaBH(OAc)3和87μl(1.0mmol)吗啉。在室温下搅拌4小时后，用饱和碳酸氢钠水溶液处理反应混合物，分离水层，并用20ml二氯甲烷分两份萃取两次。合并有机层，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用3％甲醇/氯仿作为洗脱剂，获得385mg(产率97％)油状的(E)-甲基-2-[2-((3-(吗啉基甲基)苯氧基)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.57(s，1H)，7.54-7.51(m，1H)，7.31-7.28(m，2H)，7.17-7.14(m，2H)，6.89-6.86(m，2H)，6.80-6.79(m，1H)，4.95(s，2H)，3.78(s，3H)，3.68(s，3H)，3.65-3.61(m，4H)，3.44(m，2H)，2.44-2.34(m，4H)实施例7制备(E)-甲基-2-[2-((6-(吡咯烷-1-基)吡啶)-4-基氧)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯(化学编号415)步骤1)方法1在干燥的微波反应器中，放置526mg(2.0mmol)的2-(苄氧基)-6-溴吡啶和1.70ml(20mmol)吡咯烷，并利用微波使混合物在150℃下反应10分钟。反应混合物与20ml水混合。用100ml乙酸乙酯分两份萃取两次，经无水干燥分离有机层，并保持减压以去除溶剂。对由此获得的残留物进行柱色谱，使用10％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得485mg(产率95％)的2-(苄氧基)-6-(吡咯烷-1-基)吡啶。
方法2)在干燥的微波反应器中引入氩气，并将526mg(2.0mmol)2-(苄氧基)-6-溴哌啶、200μl(2.4mmol)的吡咯烷、283mg(2.8mmol)的叔丁醇钠、9mg(0.005mmol)的三(二亚苄基丙酮)二钯(O)(0.5mol％的Pd)、19mg(0.015mmol，1.5mol％)的(±)-BINAP和3ml的甲苯置于其中，然后搅拌混合物并利用微波使混合物在120℃下反应10分钟。反应混合物用20ml乙酸乙酯稀释，经Cellite过滤，并使其保持减压以去除溶剂。对残留物进行柱色谱，使用10％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得470mg(产率92％)的2-(苄氧基)-6-(吡咯烷-1-基)吡啶。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.23(m，6H)，6.03-5.99(m，1H)，5.89-5.85(m，1H)，5.36(s，2H)，3.45-3.39(m，4H)，2.00-1.93(m，4H)；MS(EI)M+C9H12N2O的计算值164.095，实测值254(23，M+)，163(52)，91(100)，70(40)，65(40)步骤2)将450mg(1.7mmol)步骤1中所得化合物溶解于5ml甲醇和5ml乙酸乙酯混合物中，并向其中加入30mg的10％钯/碳。获得的混合物置于氢化反应器中并在其中引入氢气，在室温下搅拌混合物18小时。反应混合物经Cellite过滤，并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用50％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得260mg(产率92％)的6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-醇。
熔点154-158℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.26(td，1H，J＝8.7，0.8Hz)，5.75-5.70(m，1H)，5.25-5.21(m，1H)，4.65(s，1H)，3.45-3.39(m，4H)，2.00-1.93(m，4H)；MS(EI)M+C9H12N2O的计算值164.095，实测值164(52，M+)，135(45)，70(85)，66(28)，43(100)步骤3)在干燥的反应器中，在63mg(0.46mmol)K2CO3和50mg(0.30mmol)步骤2中所得的化合物中加入4ml的乙腈。搅拌所得的混合物20分钟，并向其中加入104mg(0.36mmol)的(E)-甲基-2-(2-溴甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。获得的混合物回流16小时、冷却，减压蒸馏以去除溶剂，然后向其中加入10ml的乙酸乙酯。分离有机层，用水洗涤两次，经无水MgSO4干燥并减压浓缩。对残留物进行柱色谱，使用30％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，获得70mg(产率64％)的(E)-甲基-2-[2-((6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸酯。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58(s，1H)，7.56-7.13(m，5H)，5.97-5.25(m，2H)，5.25(s，2H)，3.79(s，3H)，3.68(s，3H)，3.43-3.36(m，4H)，2.04-1.92(m，4H)；MS(EI)M+C21H24N2O4的计算值368.1736，实测值368(31，M+)，205(44)，163(46)，145(100)，103(36)，40(74)进行与实施例3-7相似的步骤以获得各种α-芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物，由此获得的代表性化合物的1H-NMR和MS分析结果示于表3a-3n。
表3a
表3b
表3c
表3d
表3e
表3f
表3g
表3h
表3i
表3j
表3k
表3l
表3m
表3n 检验实施例1对破骨细胞形成的抑制作用在上述实施例中制备的α-芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物对破骨细胞增殖的抑制活性检验如下。
(1-1)分离破骨细胞的前体和诱导它们分化为成熟的破骨细胞首先，如下分离含有破骨细胞前体细胞的骨髓样品。在通过折断颈部处死7-9周大的雌性小鼠后，在无菌条件下切除股骨和胫骨，同时去除附着其上的软组织。切除长骨的两端后，将1ml含0.1％胶原酶(Gibco)、0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA(Gbico)的酶溶液用26#针头注射器注射到骨髓腔的一端，随后收集骨髓。搅拌收集到的骨髓30分钟后，收集沉淀的骨髓细胞，在补充有10％FBS的α-最小基本培养基(α-MEM)中培养24小时。然后，将作为破骨细胞前体的非附着细胞等分到培养板中，其中细胞密度为每孔2×105细胞，并且在补充有20ng/ml巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF，Peprotech，USA)、30ng/ml RANKL(Peprotech，USA)和0.3、1.0或3μM实施例化合物的α-MEM中培养8天。除了不添加实施例化合物之外，在相同条件下培养对照细胞。
(1-2)评估对破骨细胞(TRAP-阳性多核细胞)形成的抑制作用细胞培养8天后，附着细胞用PBS清洗，并用柠檬酸-乙酸-甲醛固定5分钟。所固定的细胞在含有萘酚AS-BI磷酸盐的乙酸盐缓冲液(pH5.0)、fast Garnet GBC溶液和7mM酒石酸盐缓冲液(pH5.0)中、于37℃下培养1小时来进行TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色。染色后，认为具有3个或更多核的TRAP-阳性多核细胞是破骨细胞(见，Minkin，C.，Calcif.Tissue Int.34285-290.1982)，实施例化合物(0.3、1.0和3.0μM)对破骨细胞形成的抑制活性与对照组进行的比较示于表4a和4b。
表4a
表4b
正如表4a和4b所示，本发明的α-芳基甲氧基丙烯酸酯化合物对破骨细胞的形成具有极好的抑制作用。
(1-3)评估对破骨细胞再吸收活性的抑制作用为了评估在实施例中合成的化合物对破骨细胞再吸收活性的抑制作用，在磷酸钙包被的培养板上(OAASTM，OCT，Korea)进行分化细胞的培养(Choi et al.，Eur.J.Immuol.312179-2188，2001)。完成培养后，用蒸馏水清洗培养板，向培养板加入50μl/孔的5％次氯酸钠。培养板静置5分钟，再次用蒸馏水清洗以去除附着细胞，并在室温下干燥。随后，用Image Pro Plus software(MediaCybernetics Verl.3.0)对所形成的再吸收凹点的面积进行计算。用实施例化合物处理的破骨细胞的再吸收凹点的面积与对照组相比的减少百分率(％)显示在表5中。
表5
正如从表5所见，与对照组相比，用实施例化合物之一处理的培养板中的再吸收凹点面积显著降低，并且当使用超过0.1μM的任意一种实施例化合物时，破骨细胞的再吸收活性几乎被完全抑制。这个结果证明本发明的α-芳基甲氧基丙烯酸酯化合物具有对抗破骨细胞的极好抑制活性。
检验实施例2细胞毒性检验(2-1)抗破骨细胞前体的细胞毒性为了检验实施例化合物抗破骨细胞前体的毒性，将前体细胞等分到96孔微板中，其密度为每孔2×105细胞，分别用2、4和8μM的检验化合物处理，并在补充有20ng/ml M-CSF(Peprotech，USA)的α-MEM中用37℃的培养箱(5％CO2)培养48小时。在结束培养前3小时，向每个孔加入50μl的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴)溶液(50μg/ml)。完成细胞培养时，移除上清液，使沉淀的染料与100μl的异丙醇/0.04N HCl在室温下反应30分钟以使其溶解。在550nm处测量孔的吸光度，相对于对照组(规定为100)的每孔相对吸光度示于表6中。
表6
正如从表6所见，本发明的α-芳基甲氧基丙烯酸酯化合物几乎没有抗未分化骨髓细胞的细胞毒性。
(2-2)抗破骨细胞的细胞毒性检验为了检验实施例化合物的抗破骨细胞毒性，将人骨肉瘤衍生细胞系，MG-63(ATCC No.CRL-1427)细胞用0.1、0.3、1.0和3.0μM的实施例化合物处理，并在补充有10％FBS(胎牛血清)的DMEM中培养。按照(2-1)的方法测量细胞毒性，结果显示在表7a和7b中。
表7a
表7b
正如从表7a和7b所见，实施例化合物几乎没有抗破骨细胞的细胞毒性。
检验实施例3临床试验(3-1)经卵巢切除的雌性小鼠(对照)的骨密度(BMD)确定本发明编号274和388的化合物对由卵巢切除引起骨质疏松的雌性小鼠的作用按如下方法检验。
具体地，经腹部施用10mg/kg体重的盐酸氯胺酮(Ketara)和0.15ml/kg体重的2％盐酸甲苯噻嗪(Roupun)的混合物麻醉作为对照的雌性小鼠后，将每个小鼠的腰背部双侧剃净，用10％的聚烯吡酮-碘擦洗、随后用70％酒精擦拭处理暴露的皮肤以准备无菌手术。在腹部的中央区域切出1cm的切口，仔细辨别卵巢，避免破坏主要器官如肝和隔膜。卵巢用缝合线绑扎，然后切除。之后，将各器官复位到其原来位置，然后用缝合线以间断的方式缝合切口。卵巢切除后，小鼠被注射0.088mg/kg体重的庆大霉素以防止感染。
为研究小鼠BMD的变化，在卵巢切除前和卵巢切除后8周的每2周使用骨密度仪XCT 540 Research SA(Stratec，Germany)测量骨密度。具体地，在0.1mm×0.1mm体积元上进行BMD的测量，其中松质骨的阈值为280mg/cm2和密质骨的阈值为500mg/cm2，通过Scout扫描(10mm/秒)确定在胫骨近中心端的分析位点。通过CT扫描(7mm/秒)对确定位点的3个切片测定BMD，并且在相同的位点实施两次或多次测量。
(3-2)确定雌性经产小鼠卵巢切除后的BMD将各称重为250-350g的经产小鼠依照(3-1)的方法实施卵巢切除。卵巢切除后从第二天到第12周，小鼠分别每天一次皮下注射0.5和1mg/kg体重的编号274和388的化合物。作为选择，小鼠每天口服施用2.5和7.5mg/kg的编号274和388的化合物。在小鼠卵巢切除前和卵巢切除后的第二周到第11周期间测量BMD。
图1a和1b显示使用编号274化合物获得的结果，其中没有用编号274化合物处理的对照组显示BMD降低(皮下注射4.0％，口服施用6.3％)，而用编号274化合物处理过的小鼠，在皮下注射的情况下显示BMD没有降低，在口服施用的情况下BMD几乎没有增加(0.8％)。
另一方面，图2a和2b显示使用编号388化合物获得的结果，其中没有用编号388化合物处理的对照组8周后显示BMD突然降低(皮下注射15.4％；口服施用15.6％)，而用编号388化合物处理的小鼠显示BMD水平突然降低(皮下注射在0.5mg/kg为5.0％和在1mg/kg为6.7％；口服施用在2.5mg/kg为10.6％和在7.5mg/kg为10.2％)。
由此，能够总结出本发明的α-芳基甲氧基丙烯酸酯化合物可以有效预防和治疗骨质疏松。
检验实施例4药代动力学(4-1)体外药代动力学实施例化合物的代谢稳定性通过利用自人肝制备的微粒体样品进行检验。
每20μM的化合物与1mg/ml的肝微粒体进行反应，并确定化合物的半衰期和一小时稳定度。结果示于表8中。
表8
以上结果证明本发明的α-芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物具有高代谢稳定性。
(4-2)使用雌性小鼠的体内药代动力学(4-2-1)化合物施用和血清分离将各称重约为250g的雌性小鼠分成每组5只小鼠的组。小鼠用乙醚麻醉，在它们的股骨动脉和静脉分别插入导管，经静脉注射分别施用0.5mg/kg体重的化合物234和274，和5mg/kg体重的化合物388、404和415。作为选择，给小鼠口服施用15mg/kg体重的化合物274和10mg/kg体重的化合物234。
静脉注射后在第0、5、10、15和30分钟和第1、2、4、6、9和12小时，或口服施用后第0、10、20和40分钟和第1、2、4、6、9和12小时，从小鼠股动脉采集0.3ml的血样。血样在冰浴中保持30分钟并在3000rpm下离心10分钟获得上清液(血清)。上清液样品在-20℃储存。
(4-2-2)确定血清中化合物的浓度在以下试验中，使用HPLC级甲醇和乙腈(Merck)并使用HPLC系统(Shimadzu LC-10AD)。
标准溶液分别在甲醇中溶解化合物234、274、388、404和415到1mg/ml的浓度以得到贮液。贮液用甲醇稀释获得浓度分别为40、20、10、2、1、0.5、0.2、0.05和0.02μg/ml的标准溶液。
标准校准曲线使用校准浓度0.002、0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、1、2和4μg/ml准备标准校准曲线。
将每10μl如上制备的标准溶液加入100μl的正常血清样品中并稀释10倍。将250μl的乙腈加入所得溶液中并离心混合物10分钟获得上清液。将300μl上清液通过在氮气中蒸发而干燥并加入50μl的甲醇进行重组。通过HPLC分析20μl所得的溶液以制备标准校准曲线。HPLC用Shimadzu ODS2柱(4.6×250mm)实施，其中使用甲醇/水(90/10(v/v))混合物作为移动相，流速1.2ml/分钟，并在240nm处测量吸光度。
获得的标准校准曲线表现出良好的线性。
提取在(4-2-1)中获得的100μl血清样品放置在1ml的微管中，并且向其中加入10μl的甲醇。在离心管中加入250μl的乙腈被加到并离心混合物10分钟获得上清液。300μl的上清液在氮气中通过蒸发干燥并加入50μl甲醇进行重组。20μl所获得溶液通过上面的HPLC方法进行分析。
(4-2-3)确定药代动力学参数将血清样品中化合物的平均浓度对施用后经过的时间绘制半对数图，药代动力学参数通过应用WinNonlin程序(PharsightCorporation)被确定为开放性非房室模型。药代动力学参数的平均值显示在表9中。
表9
如表9中所示，经I.V.施用的本发明的化合物的半衰期为3.5-11小时。这个结果显示本发明的化合物用作药物具有合适的体内稳定性。
检验实施例5体内毒性检验为了确定在实施例中制备的化合物的急性毒性，将各称重约为20g的6周大无特定病原(SPF)大鼠分成每组10只大鼠的组。
在皮下施用的情况下，每种化合物溶解在5％PEG400溶液中，浓度为20mg/ml，所得溶液用5％PEG400连续稀释为浓度5、2.5、1.25和0.625mg/ml，稀释液一次以10ml/kg体重的剂量皮下注射大鼠。
在口服施用的情况下，每种化合物溶解在大豆油中，浓度为180mg/ml，所得溶液用大豆油连续的稀释为浓度80、20和5mg/ml，稀释液一次以20ml/kg体重的剂量对大鼠口服施用。
使用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 4.0)作为溶剂用于制备注射和口服制剂。
化合物施用后的两周内，观测大鼠的死亡率、临床症状和体重变化，对血样实施血液学和生化检验。然后，处死大鼠，用肉眼检查内部器官，以检查胸腔和腹腔中的器官是否有任何反常迹象。
根据施用途径的化合物LD50值显示在表10中。
表10
正如在表10中所示，大部分化合物仅表现出低水平的毒性。
尽管已经对主题发明的一些优选实施方案进行了描述和举例说明，但是其中可以不脱离所附权利要求限定的本发明精神来进行各种变化和修改。
权利要求
1.式(1)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于预防和治疗代谢性骨病的用途 其中，A是O、S、CH2、O-N＝CH或O-N＝C(CH3)；X是H或卤素；Y是N或CH；Z是O或NH；R1是H或C1-4烷基；R2是未取代的或取代的芳基或杂芳基。
2.权利要求1的用途，其中R2的芳基是苯基或萘基。
3.权利要求1的用途，其中R2的杂芳基是5-或6-元的杂环芳环，其含有至少一个选自O、S和N的元素。
4.权利要求3的用途，其中杂芳基选自吡啶基、嘧啶基、唑-5-酮基、1，3，4-噻二唑基、乙氧香豆素-2-基、乙氧香豆素-4-基和吲哚基。
5.权利要求1的用途，其中所述化合物的R2的取代芳基或杂芳基基团具有至少一个取代基，所述取代基选自卤素、氰基、硝基、C1～4卤烷基、C1～4卤烯基、羟基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～6环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、1，3-二氧杂环戊-2-基、1，3-二氧杂环己-2-基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4酰氧基、C1～4烷羰基、C1～4烷羰氧基、C3～6环烷羰氧基、C1～4烷氧羰基、C1～4二烷氨基C1～4烷氧基、含有至少一个N或O的C2～5杂环C1～4烷氧基、2-吗啉乙氧基、2-(哌啶-1-基)乙氧基、未取代的或取代的含N杂芳基、未取代的或取代的氨基和未取代的或取代的氨基C1～2烷基。
6.权利要求5的用途，其中未取代的或取代的氨基或氨基C1～2烷基由-(CH2)n-NR3R4表示，其中n是0、1或2，R3和R4各自独立为H、C1～8烷基、C1～8卤烷基、羟基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～8环烷基、C3～8环烷基C1～4烷基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～8环烷氧基C1～4烷基、C1～8烷基磺酰基、含有至少一个N、O或S的C2～7杂环C1～4烷基、或任选取代的芳基，或R3和R4和与它们连接的氮原子一起融合形成杂环。
7.权利要求5的用途，其中含N杂芳基选自吡咯基、咪唑基、唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、四唑基、吲唑基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、异喹啉基和喹唑啉基。
8.权利要求5的用途，其中取代的含N杂芳基具有至少一个取代基，所述取代基选自卤素、氰基、硝基、C1～6卤烷基、C1～6卤烯基、羟基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～8环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4酰氧基、C1～4烷羰基、C1～4烷羰氧基、C3～8环烷羰氧基、C1～4烷氧羰基、C1～4二烷氨基和SO2NR5R6，其中R5和R6各自独立为H或C1～6烷基。
9.权利要求1的用途，其中所述化合物由式(1a)表示 其中，A是O或O-N＝C(CH3)；X是H、F或Cl；Ab是至少一个基团，其选自卤素、C1～4卤烷基、C1～4卤烯基、C1～8烷基、C2～8烯基、C2～4炔基、C3～6环烷基、C1～8烷氧基、C1～4烷氧基C1～4烷基、C3～6环烷基C1～4烷基、C1～4二烷氧基C1～4烷基、1，3-二氧杂环戊-2-基、1，3-二氧杂环己-2-基、C2～8烯氧基、C2～4炔氧基、C3～6环烷基C1～4烷氧基、羟基C1～4烷基、C1～4二烷氨基C1～4烷氧基、含有至少一个N或O的C2～5杂环C1～4烷氧基、2-吗啉乙氧基、2-(哌啶-1-基)乙氧基、未取代的或取代的含N杂芳基、未取代的或取代的氨基和未取代的或取代的氨基C1～2烷基。
10.权利要求1的用途，其中所述化合物选自(E)-甲基2-(2-((4-辛基苯氧基)甲基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(环丙基甲氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基-丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(1-甲基丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基-丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(2-吗啉基乙氧基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(1，3-二氧杂环己-2-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯乙基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-己氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-氰基甲氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(4-甲基piperizan-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-氟-4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((2-氟-4-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(吗啉基甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(N-甲基-N-苯氨基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-((4-甲基piperizan-1-基)甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((5-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；和(E)-甲基2-(2-((6-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
11.权利要求1的用途，其中所述化合物抑制破骨细胞的形成或再吸收活性。
12.权利要求1的用途，其中所述代谢性骨病是骨质疏松症。
13.一种甲氧基丙烯酸酯衍生物，选自(E)-甲基2-(2-((4-辛基苯氧基)甲基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(环丙基甲氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(2-甲氧基乙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(1-甲基丙氧基)苯氧基)甲基)-4-氟苯基)-3-甲氧基-丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(2-吗啉基乙氧基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(1，3-二氧杂环己-2-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(烯丙氧基)苯乙基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-己氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(((({1E}-1-(3-(n-氰基甲氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧)甲基)苯基-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-吗啉基苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(4-甲基piperizan-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-异丁基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((4-(N-环丙基甲基-N-甲氨基)-2-氟苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-氟-4-(哌啶-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((2-氟-4-吗啉基苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(吗啉基甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-(N-甲基-N-苯氨基)苯氧基)甲基)-4-氯苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((3-((4-甲基piperizan-1-基)甲基)苯氧基)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；(E)-甲基2-(2-((5-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯；和(E)-甲基2-(2-((6-(吗啉基)吡啶-2-基氧)甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸酯。
全文摘要
本发明涉及特定α－芳基甲氧基丙烯酸酯衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于预防和治疗代谢性骨病的用途。
文档编号A61K31/165GK1968687SQ200580020330
公开日2007年5月23日 申请日期2005年6月22日 优先权日2004年6月22日
发明者金范泰, 闵容基, 李连洙, 许政宁, 李 赫, 朴鲁均, 金正根, 金世源, 高鲜一 申请人:韩国化学研究院, 奥斯考泰克公司