金黄色葡萄球菌的氨基酸通透酶phep的制作方法

专利名称：金黄色葡萄球菌的氨基酸通透酶phep的制作方法
技术领域：
本发明涉及由致病微生物表达的抗原性多肽，包含抗原性多肽的疫苗，和针对抗原性多肽的治疗性抗体。
微生物导致影响全世界数百万人的许多致死或致残的疾病。目前控制微生物的方法包括使用抗微生物剂(抗生素)和抗感染剂。已经证明了这些方法是有问题的，因为对这些药剂的暴露带来了显著的选择压力，导致产生了抗性微生物，它们能够避免抗微生物剂的作用。例如，已经发现了微生物变得抗三氯森，即一种添加到很多家庭和工业环境中使用的抗感染剂中的药剂。
一个可论证的严重问题是许多重要致病微生物的抗生素抗性菌株的进化。
发生了抗生素抗性的致病微生物的一个实例是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是一种细菌，其正常生活环境是大约20-40％正常健康人的鼻子的表皮衬，并且通常存在于人的皮肤上，而不导致伤害。但是，在某些环境中，特别是当皮肤受到破坏时，该微生物会导致感染。这在医院中是一个特殊问题，患者在医院中可能进行手术程序和/或服用免疫抑制药物。这些患者由于他们接受的治疗，更容易受到金黄色葡萄球菌的感染。近年来出现了金黄色葡萄球菌的抗性菌株。甲氧苯青霉素抗性菌株是常见的，并且这些抗性菌株中的许多也抗其它抗生素。目前，没有针对金黄色葡萄球菌的有效接种程序。在美国，金黄色葡萄球菌感染是每年发生的二百万医院感染中的13％的原因。这表示260,000人患金黄色葡萄球菌感染，其中60-80,000死亡。
因此，金黄色葡萄球菌是能够导致广泛威胁生命的疾病，包括败血症、心内膜炎、关节炎和毒性休克的主要人类病原体。通过微生物的多样性及其毒力中涉及的成分的供应确定该能力。致病性是多因素的，并且没有显示一种成分负责特殊的感染，参见Projan，S.J.&Novick，R.P.(1997)，The Staphylococci in Human Disease(Crossley，K.B.& Archer，G.L.，eds.)pp.55-81.
在感染开始时，并且随着其进展，微生物的需要和环境改变，并且由金黄色葡萄球菌产生的毒力决定因子的相应改变而反映出来。在感染开始时，对于病原体，重要的是粘附于宿主组织，并且产生细胞表面相关的附着蛋白的大的库。这些包括胶原蛋白、纤维蛋白原和纤连蛋白结合蛋白。病原体也具有通过产生减少吞噬作用或干扰细胞被循环抗体识别的能力而避开宿主的防御系统。
感染灶通常是脓肿，并且生物的数量增加。金黄色葡萄球菌具有通过产生细胞密度感受肽监测其自身细胞密度的能力。与由细胞饥饿的开始引起的生理改变相关的肽聚集引发了毒力决定因子的产生从粘附蛋白转变为参与侵入和组织穿透的成分。这些包括广泛的溶血素、蛋白酶和其它降解酶。
在感染过程中，金黄色葡萄糖产生的毒力决定因子是反应于环境和生理刺激而产生的。这些刺激将依赖于体内的生态位，并且将随着感染进展而改变。对体内条件的了解很少，很可能一些成分仅仅在该环境中产生。因此，这些是以前的技术不能发现的潜在的疫苗成分。
很多疫苗是由灭活或减毒的病原体制备的，这些病原体被注射到个体中。免疫的个体是通过产生体液(抗体)和细胞(溶胞性T细胞CTL′s)应答而应答的。例如，通过热灭活病毒并且用诸如甲醛的交联剂处理而制备肝炎疫苗。用作疫苗的减毒病原体的一个实例是通过对活病原体减毒而制备的脊髓灰质炎疫苗。
但是，将减毒生物用于某些疾病的疫苗是有问题的，因为缺乏关于状况的病理学和减毒性质的了解。对于某些病毒剂，这是特殊的问题，因为病毒，特别是逆转录病毒，具有易错复制周期，这导致病毒基因中的可存活突变。这可以导致对以前用作疫苗的抗原决定因子的改变。
所谓的亚单位疫苗(这样的疫苗，即其中免疫原是由特定致病微生物表达的蛋白或复合物的片段或亚单位)的开发已经是大量医学研究的焦点。对于鉴定用于开发亚单位疫苗的候选分子的需要是明显的，其中的原因之一是因为最近控制致病生物的常规化学治疗方法受到了抗生素抗性发展的破坏。
本发明涉及致病微生物感染期间表达的抗原性多肽及其在接种中的用途。
根据本发明的第一方面，提供了由选自下组的分离的核酸序列编码的抗原性多肽，或其部分
i)

图1所示的核酸序列；ii)如(i)的核酸序列，其编码由致病生物表达的多肽；iii)与上述(i)或(ii)的序列杂交的核酸序列；和iv)(i)、(ii)或(ii)中定义的核酸序列的遗传密码简并得到的核酸序列，所述抗原性多肽或其部分用作药物。
在一种优选实施方案中，所述药物是疫苗。
在本发明的优选方面，编码本发明的第一方面的抗原性多肽的核酸序列选自i)图2所示的核酸序列；ii)如(i)的核酸序列，其编码由致病生物表达的多肽；iii)与上述(i)或(ii)的序列杂交的核酸序列；和iv)(i)、(ii)或(ii)中定义的核酸序列的遗传密码简并得到的核酸序列。
编码本发明的第一方面的抗原性多肽的核酸可以在严格杂交条件下与图1或图2所示的核酸序列或其互补链退火。
严格杂交/洗涤条件是本领域公知的。例如，核酸杂交体在60℃下0.1xSSC，0.1％SDS中洗涤后是稳定的。本领域公知，如果已知核酸的序列，可以计算最优杂交条件。例如，可以通过进行杂交的核酸的GC含量确定杂交条件。参见Sambrook et al(1989)Molecular Cloning；ALaboratory Approach。计算在指定同源性的核酸分子之间实现杂交的严格条件的通式是Tm＝81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺)。
编码本发明的第一方面的抗原性多肽的核酸可以包含图1或2所示序列或在核酸残基水平与图1或2所示核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，例如98％，或99％同一性的序列。
如本领域公知，“同一性”是指通过比较序列确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，同一性也表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，例如由所述序列串之间的匹配所确定的。可以容易地计算同一性(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，AND Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。尽管存在许多测量两个多核苷酸或两个多肽序列间的同一性的方法，该术语是本领域公知的(Sequenee Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.；481073(1988)。常用于测量两个序列间的同一性的方法包括，但不限于Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)中描述的那些。确定同一性的优选方法设计为得到测试的序列间的最大匹配。将确定同一性的方法编辑为计算机程序。优选的确定两个序列间同一性的计算机程序包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleid Acids Research12(1)(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Atschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol. 215403(1990))。
编码本发明第一方面的抗原性多肽的核酸可以包含第一方面的序列的片段，其长度至少是30个碱基，例如，40、50、60、70、80或90个碱基。
编码本发明的第一方面的抗原性多肽的核酸序列可以是基因组DNA、cDNA或RNA，例如mRNA。
本发明的第一方面的抗原性多肽可以是细胞膜蛋白，例如，整合膜蛋白。
本发明的第一方面的抗原性多肽可以具有通透酶活性。此处用到的“通透酶”涉及作为将特定分子转运到细胞内或细胞外的通道起作用的细胞膜蛋白。
优选地，本发明第一方面的抗原性多肽参与将一个或多个氨基酸转运到细胞内或细胞外，例如，所述多肽可以具有苯丙氨酸通透酶活性。
优选地，本发明第一方面的抗原性多肽由致病生物，例如细菌、病毒或酵母表达。优选地，致病生物是细菌。
细菌可以选自下组金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、结核分枝杆菌、B族链球菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏球菌；A族链球菌；布氏疏螺旋体；Coccidiodes immitis；Histoplasmasapsulatum；B型脑膜炎奈瑟氏球菌；弗氏志贺氏菌；大肠杆菌；流感嗜血杆菌。
优选地，细菌是葡萄球菌属的菌种。更优选地，细菌是金黄色葡萄球菌。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明第一方面的抗原性多肽与此处定义的生物的传染性致病性相关。
在本发明的进一步优选的方面，抗原性多肽包括图1或3所示氨基酸序列的全部或部分。
此处用到的“部分”可以包括长度是至少10、15、20或30个氨基酸的多肽片段。
本发明第一方面的抗原性多肽可以包含非蛋白抗原，如多糖抗原。
此处用到的术语“多肽”通常的意义包含多个由肽键连接在一起的氨基酸残基。其可以与肽、蛋白、寡肽或寡聚物互换使用，并且表示相同的含义。术语“多肽”也意欲包括多肽的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物基本上保留了与参比蛋白相同的生物活性或功能。
根据本发明的第二方面，提供了包含编码本发明第一方面的多肽的核酸序列的载体。
本发明第二方面的载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。载体可以包括介导细胞特异性表达的转录控制序列(启动子序列)，例如，细胞特异性、诱导型或组成型启动子序列。载体可以是适于原核或真核基因表达的表达载体，例如，载体可以包含一个或多个选择标记和/或自主复制序列，其促进载体在真核细胞或原核宿主中的维持(Sambrook etal(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY及其中的参考文献；Marston，F(1987)DNA Cloning TechniquesA Practical Approach VolIII IRL Press，Oxford UK；DNA CloningF M Ausubel et al，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。自主维持的载体称作附加型载体。
启动子是本领域公知的术语，并且可以包括增强子元件，其是通常位于基因的转录起始位点5’的顺式作用核酸序列(增强子也可以位于基因序列的3’，或甚至位于内含子序列，因此是不依赖于位置的)。增强子活性反应于反式作用转录因子(多肽)，已经证明该因子特异性结合于增强子元件。转录因子的结合/活性(参见EukaryoticTranscription Factors，David S Latchman，Academic Press Ltd，SanDiego)反应于许多环境因素，包括中间代谢物(如葡萄糖、脂质)、环境效应物(如光、热)。
启动子元件也包括所谓的TATA盒和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列，它们的功能是选择转录起始位点。这些序列也结合功能包括但不限于促进RNA聚合酶的转录起始选择的多肽。
本发明第二方面的载体可以包括转录终止或聚腺苷酸化序列。这也可以包括内部核糖体进入位点(IRES)。载体可以包括排列在双顺反子或多顺反子表达盒中的核酸序列。
根据本发明的第三方面，提供了制备本发明任何前述方面的重组抗原性多肽的方法，包括(i)提供用本发明第二方面的载体转化/转染的细胞；(ii)在适于产生所述多肽的条件下生长所述细胞；和(iii)从所述细胞或其生长环境纯化所述多肽。
在第三方面的方法的一个优选方面，载体编码所述重组多肽，因此给所述重组多肽提供了分泌信号，以促进所述多肽的纯化。
根据本发明的第四方面，提供了用本发明第二方面的载体转化或转染的细胞或细胞系。
在本发明的一种优选实施方案中，所述细胞是原核细胞，例如，酵母或细菌，如大肠杆菌。或者所述细胞是真核细胞，例如，真菌细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、哺乳动物细胞，例如COS、CHO细胞、Bowes黑素瘤和其它合适的人类细胞或植物细胞。
根据本发明的第五方面，提供了包含至少一种本发明第一方面的抗原性多肽或其部分的疫苗。优选地，所述疫苗进一步包含载体和/或佐剂。
此处用到的“其部分”可以包括抗原性多肽的片段或亚单位，其中所述片段或亚单位足够诱导接受者中的抗原应答。
本发明的第五方面的疫苗可以是亚单位疫苗，其中疫苗的免疫原性部分是本发明第一方面的抗原性多肽的片段或亚单位。
术语佐剂和载体以以下方式解释。一些多肽或肽抗原含有B细胞表位，但不含T细胞表位。可以通过在多肽/肽中引入T细胞表位或通过将多肽/肽缀合于诸如含有多个T细胞表位的匙孔血蓝蛋白或破伤风类毒素的免疫原载体蛋白而显著增强免疫应答。然后由抗原呈递细胞摄取缀合物，加工，并且由人类白细胞抗原(HLA′s)II类分子进行呈递。这使得T细胞能够辅助将T细胞对载体来源的表位的特异性给予对最初的抗原性多肽/肽具有特异性的B细胞。这可以导致抗体产生、分泌和同种型转换的增加。
佐剂是通过调节免疫细胞的活性而增强对抗原的特异性免疫应答的物质或程序。佐剂的实例包括，例如，共刺激分子的激动抗体、弗氏佐剂、胞壁酰二肽、脂质体。因此，佐剂是免疫调节剂。载体是一种免疫原性分子，当与第二种分子结合时，增强对后者的免疫应答。
在本发明的另一方面，提供了对动物进行抗致病微生物免疫的方法，包括给所述动物施用至少一种本发明第一方面的多肽或其部分。优选地，多肽是本发明第五方面的疫苗的形式。
在本发明的优选方法中，动物是人。
优选地，本发明第一方面的抗原性多肽或第五方面的疫苗可以通过静脉内、肌内、皮下直接注射而进行送递。此外，可以口服疫苗或抗原性多肽。可以在药学可接受的载体中施用多肽或疫苗，所述载体如各种水性或脂质介质，如用于制备肌内和皮下施用的可注射制剂的无菌盐水。可以使用常规悬浮剂和分散剂。其它施用方式，如植入，例如持续的低剂量释放的生物可观察药丸，对本领域技术人员是显而易见的。
优选地，疫苗抗细菌菌种-金黄色葡萄球菌。
也可以明确，所述疫苗或抗原性多肽可以有效预防或缓解除人之外的动物的状况，所述动物例如，但不限于家养宠物(如家养动物，如猫和狗)、家畜(如牛、羊、猪)和马。
根据本发明的另一方面，提供了与本发明的至少一种抗原性多肽或其部分结合的抗体，或至少其有效结合部分。
在本发明的优选方面，所述抗体是多克隆或单克隆抗体。
在本发明进一步优选的方面，所述抗体是由重组方法制备的嵌合抗体，以含有所述抗体的可变区和人抗体的不变或恒定区。
在本发明的进一步优选的方面，所述抗体是通过重组方法人源化的抗体，以组合所述抗体的互补决定区与人抗体的恒定(C)区和来自可变(V)区的构架区。
优选地，给所述抗体提供标记物，包括常规标记或标志，例如放射性和/或荧光和/或表位标记或标志。
优选地，所述多肽的所述人源化单克隆抗体是作为表达载体中的融合多肽而制备的，所述表达载体合适地适于原核或真核细胞的转染或转化。
也称作免疫球蛋白的抗体是蛋白分子，它们具有对外来分子(抗原)的特异性。免疫球蛋白(Ig)是一类结构相关的蛋白，它们由两对多肽链组成，即一对轻(L)(低分子量)链(κ或λ)，和一对重(H)链(γ、α、μ、δ和ε)，所有四条链通过二硫键连接在一起。H和L链都具有有助于抗原结合的区域和在一个Ig分子与另一个Ig分子之间高度可变的区域。此外，H和L链含有不可变区或恒定区。
L链由两个结构域组成。羧基末端结构域在特定类型的L链之间是基本相同的，并且称作“恒定”(C)区。氨基末端结构域在L链和L链之间不同，并且形成抗体的结合位点。由于其可变性，其被称作“可变”(V)区。
Ig分子的H链有几种类型，即α、μ、σ、α和γ(其中有几个亚类)。组装的Ig分子由两个相同H和L链的一个或多个单位组成，其名称来自于其具有的H链。因此，存在五种Ig同种型IgA，IgM，IgD，IgE和IgG(其中四个亚类基于H链的不同，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。关于抗体结构及其各种功能的更详细内容可以参见UsingAntibodiesA laboratory manual，Cold Spring Harbour LaboratoryPress。
嵌合抗体是重组抗体，其中小鼠或大鼠抗体的所有V区与人抗体C区组合。人源化抗体是重组杂交抗体，其将来自于啮齿类抗体V区的互补决定区与来自人抗体V区的构架区融合在一起。也使用了来自人抗体的C区。互补决定区(CDRs)是抗体重链和轻链这两者的N-末端结构域内的区域，V区的大部分可变性都限制于此处。这些区域形成了抗体分子表面的环。这些环提供了抗体和抗原之间的结合表面。
来自非人动物的抗体激发对外来抗体的免疫应答，并且将其从循环中去除。当注射到人受试者中时，嵌合和人源化抗体的抗原性都降低，因为重组杂交抗体内的啮齿类(即外来)抗体量减少，而人抗体区不引起免疫应答。这导致较弱的免疫应答，并且减少抗体的清除。当在人类疾病的治疗中采用治疗性抗体时，这显然是需要的。人源化抗体设计为具有较少“外来”抗体区域，因此认为比嵌合抗体的免疫原性更低。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述抗体是调理抗体。
调理素是促进对上述外来体的吞噬作用的试剂。吞噬作用是由巨噬细胞和多形白细胞介导的，并且包括摄入和消化微生物、破坏或死亡的细胞、细胞碎屑、不溶的颗粒和活化的凝血因子。因此，调理抗体是提供相同功能的抗体。调理素的实例是抗体的Fc部分或补体C3。
在本发明的另一方面，提供了包含编码本发明的人源化或嵌合抗体的核酸序列的载体。
在本发明的另一方面，提供了包含载体的细胞或细胞系，所述载体编码本发明的人源化或嵌合抗体。细胞或细胞系可以用编码本发明的人源化或嵌合抗体的载体转化或转染。
在本发明的另一方面，提供了产生此处描述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
在本发明的另一方面，提供了用本发明的杂交瘤细胞系制备本发明的单克隆抗体的方法。
在本发明的另一方面，提供了制备本发明的人源化或嵌合抗体的方法，包括(i)提供用包含编码本发明的人源化或嵌合抗体的核酸分子的载体转化或转染的细胞；(ii)在适于产生所述抗体的条件下使所述细胞生长；和(iii)从所述细胞或其生长环境纯化所述抗体。
在本发明的另一方面，提供了制备本发明的杂交瘤细胞系的方法，包括以下步骤
i)用包括至少一种具有图1或图3所示氨基酸序列的多肽或其片段的免疫原对免疫活性哺乳动物进行免疫；ii)将被免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；iii)根据对(i)的氨基酸序列的结合活性筛选步骤(ii)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；iv)培养杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；和v)从培养物上清液回收单克隆抗体。
免疫活性哺乳动物可以是小鼠、大鼠或兔。
用杂交瘤细胞制备单克隆抗体是本领域公知的。用于制备单克隆抗体的方法公开于Kohler and Milstein，Nature 256，495-497(1975)和Donillard and Hoffinan，″Basic Facts about Hybridomas″，Compendiumof Immunology V.II ed.Schwartz，1981，在此引入作为参考。
在本发明的另一方面，提供了本发明第一方面的抗原性多肽在制备用于治疗或预防金黄色葡萄球菌相关病症的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了本发明的抗体在制备用于治疗金黄色葡萄球菌相关病症的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了治疗患者的方法，包括给患者施用本发明第一方面的抗原性多肽，或本发明第五方面的疫苗，或本发明的抗体。优选地，该方法用于治疗金黄色葡萄球菌相关病症。
金黄色葡萄球菌相关病症可以包括，例如，败血症；结核；细菌相关的食物中毒；血液感染；腹膜炎；心内膜炎；骨髓炎；脓毒症；皮肤病症；脑膜炎；肺炎；胃溃疡；淋病；链球菌咽喉炎(strep throat)；链球菌相关的毒性休克；坏死性筋膜炎；脓疱病；组织胞浆菌病；莱姆病；胃肠炎；痢疾；志贺氏菌病。
下面将通过举例并且参照下文材料、方法和附图描述本发明的实施方案。
图1显示了编码推定的金黄色葡萄球菌PheP的细胞质外环的DNA序列(a，b和c)和相应的氨基酸序列；图2显示了金黄色葡萄球菌PheP的DNA序列。
图3显示了相应于图2所示DNA序列的氨基酸序列。
图4是pheP-katA基因座的示意图。pheP和katA转录的方向用大箭头表示，推定的转录终止子结构用圆球和棒表示。(A)8325-4(野生型)。(B)突变的ST1，显示了Tn917的插入，以及相应的phep基因的1542bp编码区的380bp缺失和katA基因的1419bp编码区的1329bp缺失。(C)MJH600(pheP)，示出了等位基因替代。
图5.鼠皮肤感染脓肿模型中金黄色葡萄球菌菌株的致病性。将大约108cfu的每种菌株皮下接种到6-8周龄BALB/C小鼠中8325-4(野生型)(n＝10)，ST1(pheP katA)(n＝10)，MJH600(pheP)(n＝10)和PC1839(sarA)(n＝10)。感染后7天，麻醉小鼠，取出病变，匀浆，在稀释和在BH1琼脂板上生长后对活细菌进行计数(3，7)。对ST1(pheP katA)(0.15％)(P＜0.003)，MJH600(pheP)(1.9％)(P＜0.003)和PC1839(sarA)(0.04％)(P＜0.003)观察到了显著减少的回收。虚线表示回收的限度。柱表示回收值。用斯氏t检验评估菌株回收的统计学显著性，采用5％的置信区间。
图6.在葡萄糖限制CDM(22)中延长的需氧温育后8325-4(野生型)(■)，ST1(●)，ST16(katA)(○)和MJH600(pheP)(△)MJH621(phePPmal43R)(□)的饥饿存活能力。在指出的时间无菌取样，通过在BHI琼脂上14小时温育后稀释和对菌落计数，评估存活力。重复实验3次，产生非常相似的结果；示出了代表性实验的结果。
图7.MJH600(pheP)的生长表型和补充。在猪血清琼脂上的微需氧环境中温育菌株过夜，所述琼脂不添加(A)或添加(B)苯丙氨酸(终浓度为1mM)。MJH620(8325-4 pMAL43R)和MJH621(pheP Pmal43R)在猪血清琼脂上的生长(C)。对于补充研究，将pMAL43和Pmal43R电穿孔到8325-4(野生型)和MJH600(pheP)。由于大肠杆菌中基因的毒性，pheP基因直接克隆到金黄色葡萄球菌中，这防止了大肠杆菌转运突变体的补充。
实施例Tn917文库筛选对在碳饥饿中存活的能力改变的金黄色葡萄球菌Tn917文库转座物进行的筛选鉴定了菌株ST1。测序确定了转座子插入产生了编码过氧化氢酶的KatA基因的大缺失和编码推定的氨基酸通透酶的趋异转录的pheP基因的较小缺失(图4A，B)。
pheP基因的分析pheP序列的分析发现它具有12个非连续的疏水区，表明跨膜结构域。该蛋白与转运蛋白的氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)超家族(Jack etal. Microbiology.1461797-814(2000)和Saier，M.H.Microbiology.1461775-1795(2000))具有显著同源性。金黄色葡萄球菌PheP表现出与作为赖氨酸通透酶的大肠杆菌LysP(44.6％)，和作为精氨酸和鸟氨酸通透酶的枯草芽孢杆菌RocE(34.9％)最高的序列同一性。
当在鼠感染的脓肿模型中检验ST1(pheP katA)的毒力时，它与同基因亲本菌株8325-4相比具有显著减少的回收(0.15％)(P＜0.003)。ST1(pheP katA)的回收水平与独毒力调节物突变体sarA相似(0.04％)，(P＜9,993)(图5)。相反，以前描述(Horsburgh，et al.Infect.Immun.693744-3754(2001))的ST16(katA)的回收没有显著不同于8325-4(野生型)，表明ST1(pheP katA)的毒力降低是由于pheP基因的灭活。
构建了等位基因替代突变体MJH600(pheP)(图4C)来确定pheP的灭活是否是ST1毒力降低的导致因素。通过用引物CCAGAATTCTGCCAATGATTAACTCTAATCG 与ATGATGGTACCAGTAGCTACAAATAGACCAGTCC 和AGAGGATCCGCATGTCGCAATCGTATTTGTGACC 与GGACTGGTCTATTTCTAGCTACTGGTACCATCAT扩增上游和下游片段中的pheP基因，完成等位基因替代。用引物CCGGTACCCGGATTTTATGACCGATGATGAAG与CCGGTACCTTAGAAATCCCTTTGAGAATGTTT扩增来自pDG1513(Guerot-Fleury，et al. Gene 167335-336(1995))的四环素抗性基因(tet)。纯化后，分别用BamHI/KpnI，EcoRI/KpnI和KpnI消化三个独立的PCR产物，同时连接到BamHI/EcoRI消化的pAZ106中(Kemp etal，J Bacteriol. 1734646-4652(1991)，Sambrook et al。用一种四环素抗性克隆Pmal32转化电感受态金黄色葡萄球菌RN4220(Schenk，S.andR.A.Ladagga.Lett.94133-138(1992))，通过用φ11转导金黄色葡萄球菌8325-4，通过远交分辨。
PheP突变体研究当在鼠脓肿模型中检测时，与8325-4(野生型)相比，MJH600(pheP)的毒力降低(图5)。这证明了毒力降低与pheP的突变相关，并且证实灭活的通透酶基因是负责ST1的毒力降低的决定因子。相对于MJH600(pheP)，ST1(katA pheP)的毒力显著降低(P＜0.02)，表明katA可能导致pheP突变体的存活。排除突变对公知的细胞外毒力因子表达的主要影响，MJH600(pheP)表现出与8325-4(野生型)相似的外来蛋白曲线(数据未示出)。在感染的黑翅果蝇模型中相似地观察到了MJH600(pheP)的毒力降低(A.Needham and S.J.Foster，数据未公开)。
突变体补充研究ST16(katA)在葡萄糖饥饿条件下存活的能力降低(Horsburgh et al.Infect.Immun.693744-3754(2001)和Watson et al，J.Bacteriol.1801750-1758(1998))。由于ST1(katA pheP)在葡萄糖限制的CDM中长期需氧温育中与ST16(katA)相比存活减少，检验了MJH600(pheP)的饥饿存活。MJH600(pheP)比亲本菌株丧失存活力更快，因此在5天后，存活力比8325-4(野生型)低10倍(图6)。由于pMAL43R的存在，存活力得到恢复，所述pMAL43R在补充载体pMK4(Sullivan et al，Gene 2921-26(1984))上含有pheP基因的全长拷贝。采用引物GAGAGGATCCTAGATGGGAGACTAAATATGG 与CACAGAATTCGAATGGTAACATGGTAATAAT对pheP进行PCR扩增，以构建质粒pMAL43R；用BamHI/EcoRI消化产物，连接到pMK4，直接克隆到金黄色葡萄球菌RN4220中。
在所有测试条件下，MJH600(pheP)在营养和化学确定的培养基(CDM)上与亲本菌株8325-4的生长相似(数据未示出)。相反，在微需氧(5％CO2，87％N2，8％O2)(图7A)和厌氧条件下(数据未示出)，对于MJH600(pheP)观察到了在猪血清琼脂(Wiltshire et al，Infect.Immun.695198-5202(2001))上的强生长缺陷；对于猪血清琼脂上的需氧生长观察到了正常生长。添加微摩尔浓度的来自CDM的成分，鉴定出苯丙氨酸完全恢复了MJH600(pheP)的正常生长(图7B)，表明通透酶突变体很可能在苯丙氨酸摄取中具有缺陷。通过用Pmal43R补充，挽救了生长缺陷，表明仅有pheP突变导致观察到的表型(图7C)。
结论金黄色葡萄球菌在感染过程中从宿主清除氨基酸的能力似乎是对在体内生长的重要适应。金黄色葡萄球菌8325-4对于苯丙氨酸不是营养缺陷的(Taylor，D.and K.T.Holland.J.Appl.Bacteriol.66319-329(1989))。但是，生物合成不一定是足够满足诸如脓肿的环境中细胞生长要求的，从而建立感染过程中对苯丙氨酸摄取的要求。
权利要求
1.由选自下组的分离的核酸序列编码的抗原性多肽，或其部分i)图1所示的核酸序列；ii)如(i)的核酸序列，其编码由致病生物表达的多肽；iii)与上述(i)或(ii)的序列杂交的核酸序列；和iv)(i)、(ii)或(ii)中定义的核酸序列的遗传密码简并得到的核酸序列，所述抗原性多肽或其部分用作药物。
2.权利要求1的抗原性多肽，其中所述药物是疫苗。
3.权利要求1的抗原性多肽，其中所述核酸序列选自i)图2所示的核酸序列；ii)如(i)的核酸序列，其编码由致病生物表达的多肽；iii)与上述(i)或(ii)的序列杂交的核酸序列；和iv)(i)、(ii)或(ii)中定义的核酸序列的遗传密码简并得到的核酸序列。
4.权利要求1的抗原性多肽，其中所述核酸序列在严格杂交条件下与图1或图2所示的核酸序列或其互补链退火。
5.权利要求1的抗原性多肽，其中所述多肽具有作为通透酶的活性。
6.权利要求5的抗原性多肽，其中所述多肽具有苯丙氨酸通透酶活性。
7.权利要求1的抗原性多肽，其中所述多肽由致病生物表达。
8.权利要求7的抗原性多肽，其中所述致病生物是细菌。
9.权利要求8的抗原性多肽，其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、结核分枝杆菌、B族链球菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏球菌；A族链球菌；布氏疏螺旋体；Coccidiodes immitis；Histoplasma sapsulatum；B型脑膜炎奈瑟氏球菌；弗氏志贺氏菌；大肠杆菌；流感嗜血杆菌。
10.权利要求8的抗原性多肽，其中所述细菌是葡萄球菌属的菌种。
11.权利要求8的抗原性多肽，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌。
12.权利要求1的抗原性多肽，其中所述多肽与致病生物的传染性致病性相关。
13.权利要求1的抗原性多肽，其中所述多肽包含图1或3所示氨基酸序列的全部或部分。
14.包含编码权利要求1的抗原性多肽的核酸序列的载体。
15.制备本发明任何前述方面的重组抗原性多肽的方法，包括(i)提供用权利要求14的载体转化/转染的细胞；(ii)在适于产生所述多肽的条件下生长所述细胞；和(iii)从所述细胞或其生长环境纯化所述多肽。
16.权利要求15的方法，其中所述载体编码促进所述多肽纯化的分泌信号。
17.用权利要求14的载体转化或转染的细胞或细胞系。
18.包含权利要求1的至少一种抗原性多肽或其部分的疫苗。
19.权利要求18的疫苗，其中所述疫苗包含载体和/或佐剂。
20.权利要求18的疫苗，其中所述疫苗是亚单位疫苗，其中疫苗的免疫原性部分是权利要求1的抗原性多肽的片段或亚单位。
21.对动物进行抗致病微生物免疫的方法，包括给所述动物施用至少一种权利要求1的多肽或其部分。
22.权利要求21的方法，其中所述多肽是疫苗形式。
23.权利要求21的方法，其中所述动物是人。
25.抗体或至少其有效结合部分，其结合权利要求1的至少一种抗原性多肽或其部分。
25.权利要求24的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
26.权利要求24的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
27.权利要求24的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
28.权利要求24的抗体，其中所述抗体是调理抗体。
29.包含编码权利要求26、27或28的抗体的核酸序列的载体。
30.用权利要求29的载体转化或转染的细胞或细胞系。
31.产生权利要求25的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
32.制备权利要求26或27的人源化或嵌合抗体的方法，该方法包括(i)提供用权利要求27、28或29的载体转化或转染的细胞；(ii)在适于产生所述抗体的条件下使所述细胞生长；和(iii)从所述细胞或其生长环境纯化所述抗体。
33.制备权利要求31的杂交瘤细胞系的方法，包括以下步骤i)用包括至少一种具有图1或图3所示氨基酸序列的多肽或其片段的免疫原对免疫活性哺乳动物进行免疫；ii)将被免疫的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；iii)根据对(i)的氨基酸序列的结合活性筛选步骤(ii)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；iv)培养杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；和v)从培养物上清液回收单克隆抗体。
34.权利要求1的抗原性多肽在制备用于治疗或预防金黄色葡萄球菌相关病症的药物中的用途。
35.权利要求24的抗体在制备用于治疗金黄色葡萄球菌相关病症的药物中的用途。
36.权利要求34或35的用途，其中所述金黄色葡萄球菌相关病症包括败血症；结核；细菌相关的食物中毒；血液感染；腹膜炎；心内膜炎；骨髓炎；脓毒症；皮肤病症；脑膜炎；肺炎；胃溃疡；淋病；链球菌咽喉炎；链球菌相关的毒性休克；坏死性筋膜炎；脓疱病；组织胞浆菌病；莱姆病；胃肠炎；痢疾和志贺氏菌病。
全文摘要
本发明涉及由致病微生物表达的抗原性多肽，包括由图1的核酸序列编码的抗原性多肽，包含抗原性多肽的疫苗，和针对抗原性多肽的治疗性抗体。
文档编号A61P31/00GK1988917SQ200580021665
公开日2007年6月27日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月29日
发明者S·J·福斯特 申请人:谢菲尔德大学