突变体肺炎链球菌溶血素蛋白质的制作方法

专利名称：突变体肺炎链球菌溶血素蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括突变体肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本发明进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。
背景技术：
肺炎链球菌为引起侵袭性疾病如肺炎、脑膜炎和菌血症的重要病原体。甚至在可自由获得有效抗生素疗法的地区，住院患者中肺炎球菌性肺炎的死亡率可高达19％。发展中国家中，每年超过3百万5岁以下的儿童死于肺炎，其中肺炎链球菌为最常见的病原体。肺炎链球菌还引起不太严重，但非常普遍的感染如中耳炎和鼻旁窦炎，其对发达国家中的健康-护理费用具有显著的影响。中耳炎在幼童中尤其重要，而鼻旁窦炎感染儿童和成人。
来自Wyeth的七价多糖缀合物疫苗，在美国作为Prevnar销售而在世界上其他国家作为Prevenar销售，为目前有效预防肺炎链球菌感染的唯一有效的缀合物疫苗(Kyaw等.，2002；Hausdorff等.，2000)。该疫苗包括可能的90种中七种纯化的链球菌荚膜多糖(血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F)(Kalin，1998)，每种都缀合至载体蛋白。所述疫苗的制备在美国专利4,673,574中描述(Anderson)。用于缀合荚膜多糖的蛋白质为白喉类毒素CRM197，它提供婴儿中该疫苗免疫原性的增强(Blum等.，2000；Katkocin，2000)。然而，每种肺炎链球菌血清型具有结构不同的荚膜多糖，使得用一种血清型进行的免疫趋向于不提供对大部分其他血清型的预防，虽然对疫苗相关的血清型存在一些交叉预防(Whitney等.，2003)。
血清型-特异性免疫的补充方法正在研究中。一种可能性为还利用物种共有的毒力因子如肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin，PLY)，这是由所有肺炎链球菌的侵袭性株产生的53kD毒素(Paton等.，1993)。PLY可单独使用或作为缀合至Prevnar中多糖的载体蛋白使用，提供增强的效力。Alexander等(1994)证实小鼠用PLY类毒素的免疫赋予对用9种不同肺炎链球菌血清型攻击的免疫保护。已显示PLY通过激活经典的补体途径(Paton等.，1984)以及诱导嗜中性粒细胞和巨噬细胞凋亡(Cockeran等.，2002；Kadioglu等.，2000)而刺激类似于肺炎链球菌感染的免疫应答。
PLY属于胆固醇结合性溶细胞素(CBC)组，其在形成产生溶解孔的大的30-50mer环状结构之前结合至宿主细胞膜的胆固醇(Palmer，2001；Jedrzejas，2001)。孔形成的机制不完全了解并且对事件的顺序存在许多争论(Boney等.，2000；Shepard等.，1998)。然而，形成孔的能力意味着天然的PLY为高毒性的，这对免疫原性组合物开发是一个问题。
虽然生产中所用的缀合方法使得PLY无毒，更好的是以无毒形式开始。此外，有毒形式将难以用于非缀合免疫原性组合物的制备。PLY的毒性可通过定点诱变显著降低以产生PLY类毒素，称为Pneumolysoids(Paton，1996)。
存在各种这类类毒素并且已显示其独立或在缀合至多糖时给小鼠对有毒力的2型D39肺炎链球菌攻击提供免疫保护(Paton等.，1991；Alexander等.，1994)。之前大多数突变在接近C′末端的高度保守的11个氨基酸区域中产生(Mitchell等.，1992；Berry等.，1995)。已显示该位点参与结合宿主细胞(de los Toyos等.，1996)。国际专利申请WO 90/06951中描述了PLY许多这类突变形式；该出版物中描述的每一突变接近蛋白质的C′末端。
PLY另外的问题为其在大规模生产时聚集，这是PLY用于免疫原性组合物中必须解决的问题。据信PLY的聚集与参与孔形成的PLY的寡聚化有关。本发明因此试图降低或消除PLY-PLY的相互作用(寡聚化)，使得降低大规模生产期间的聚集可能性，由此产生PLY很容易纯化的形式。
Toyos等(1996)描述了PLY不同区域单克隆抗体(mAb)的形成以及完整毒素和‘蛋白酶K切口’形式的探测。蛋白酶K切割PLY成37kD和15kD的片段。抗体mAb PLY 4仅识别完整的PLY，而不识别这些片段，表明针对该mAb的PLY上的表位位于切口区域内。当PLY与mAb PLY 4预温育，随后添加至脂质体中时，该毒素不再在脂质体膜上形成孔。这暗示mAb PLY 4封闭的位点(认为为天冬酰胺N143区域)为负责与其他PLY单体相互作用以形成寡聚体孔的位点。如Hugo等1986证实的，链球菌属的链球菌溶血素O的寡聚化也可由mAb阻断。是否抗体通过结合至寡聚化位点而直接阻止寡聚化或是否存在空间阻碍毒素单体相互作用的关联是未知的。
单克隆抗体PLY 4已由Suarez-Alvarez等(2003)进一步表征并且提示mAb PLY 4的表位比最初Toyos等在1996提议的N143区域更下游。目前看来识别位点是构象依赖性的并且在氨基酸E151-Y247内而非N143区域内。
之前本发明人建立了PLY内的N142N143缺失和N143D替代作为了解该区域以及其在寡聚化中的作用的第一步。两种突变体在溶血作用和孔形成(Search，2002)方面显示与天然PLY相同的行为，提示未阻断寡聚化，以及突变体的毒性维持不变。因此，之前产生的突变体PLY形式不显示降低的毒性或降低的寡聚化，提示这些突变无助于免疫原性组合物的生产。
发明概要本发明广泛涉及包括突变体肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本发明进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。
因此在一个方面，本发明涉及分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低。该突变可位于野生型序列的氨基酸144至151的区域内。
该突变可以是在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代。
该突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
例如，该突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质，例如氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的缺失。
任何上述突变体PLY蛋白质可进一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
分离的突变体PLY蛋白质具有对哺乳动物降低的毒性。此典型地为与野生型PLY蛋白质相比具有降低的成孔活性的结果，其可与降低的溶血活性和/或降低的寡聚化活性有关。希望的但不是必须的是，该突变体PLY蛋白质具有降低的寡聚化活性以利于纯化和随后的操作。
在另外的方面，本发明涉及免疫原性缀合物(conjugate)，其包括(a)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(b)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低。该突变可位于野生型序列的氨基酸144至151的区域内。
该突变可以是野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失。
该免疫原性缀合物的突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
例如，该免疫原性缀合物的突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质，例如氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的缺失。
任何上述免疫原性缀合物的前述突变体PLY蛋白质可进一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
免疫原性缀合物的糖、低聚糖或多糖可源于肺炎链球菌。
在另外的方面，本发明提供分离和纯化的核酸序列，它包括核酸序列，该核酸序列a)编码突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低；或b)与a)中定义的核酸序列互补。
该突变可位于野生型序列的氨基酸144至151的区域内。
该突变可以是野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失。
该核酸序列可编码突变体PLY蛋白质，其通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
例如，该核酸序列可编码突变体PLY蛋白质，其通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质，例如氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失。
由该核酸序列编码的突变体PLY蛋白质可以是上述任何蛋白质，并且可进一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
在更进一步的方面，本发明提供重组表达载体，其包括任何上述编码突变体PLY蛋白质的分离和纯化的核酸序列，以及用所述重组表达载体转化、转染或感染的重组宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供产生本发明分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质的方法，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低，该方法包括a)用如上所述的重组表达载体转化、转染或感染宿主细胞并且在允许所述突变体PLY蛋白质被该宿主细胞表达的条件下培养该宿主细胞；和b)从培养物回收突变体PLY蛋白质。
仍然在另一个方面，提供免疫原性组合物，其包括a)未缀合形式或作为如上所述免疫原性缀合物一部分的分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
该突变可位于野生型序列的氨基酸144至151的区域内。
该突变可以是野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失。
该组合物的分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型PLY蛋白质。
例如，该突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型PLY蛋白质，例如氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失。
该免疫原性组合物可包含未缀合形式或作为如上所述免疫原性缀合物一部分的任何上述突变体PLY蛋白质，其进一步包括野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸的替代或缺失。
因此，该免疫原性组合物可包括a)免疫原性缀合物，它包括(i)源于链球菌属，例如肺炎链球菌的糖、低聚糖或多糖；和(ii)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。该组合物可包括多个肺炎链球菌亚型的糖、低聚糖或多糖。
在另外的方面，本发明涉及用于哺乳动物的预防方法，该方法包括给予受治疗者哺乳动物免疫原性组合物的步骤，该组合物包括a)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
该免疫原性组合物可包括a)免疫原性缀合物，它包括(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(ii)如本文所述的分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质。
在另一个方面，本发明涉及本发明分离的突变体PLY蛋白质或免疫原性缀合物在制备免疫原性组合物中的用途。本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，包括将本发明的突变体蛋白质或免疫原性缀合物与药学可接受载体混合的步骤。
本发明的免疫原性组合物可用于细菌感染的预防或治疗。尤其其可用于具有与PLY免疫交叉反应的胆固醇结合性溶细胞素的细菌感染的预防或治疗(参见例如Palmer，2001)；即该溶细胞素能被结合PLY的抗体结合。然而优选细菌为链球菌，优选肺炎链球菌。
在另外的方面，本发明提供用于医学治疗方法中的本发明的分离突变体PLY蛋白质或免疫原性缀合物。
在更进一步的方面，本发明涉及免疫原性组合物的制备方法，该方法包括步骤提供如此处所述的分离的突变体PLY蛋白质；和将该突变体蛋白质缀合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质。上述方法中的突变体蛋白质可缀合至肺炎链球菌多糖。该方法可包括另外的将由此获得的缀合物与药学可接受载体混合的步骤。
在另外的方面，本发明涉及筛选适合用于免疫原性组合物中的候选突变体PLY蛋白质的方法，该方法包括步骤提供突变体PLY蛋白质；测试该突变体蛋白质的溶血活性；测试该突变体PLY蛋白质的寡聚化活性；和将该突变体PLY蛋白质的溶血和寡聚化活性与非突变体蛋白质的相比较。
附图简述

图1显示野生型肺炎链球菌溶血素的氨基酸序列；图2显示通过mAb PLY4检测的PLY缺失突变体蛋白质印迹；图3显示将WT PLY比较Δ6 PLY突变体的定量溶血测定的结果；图4显示将WT PLY比较Δ6 PLY突变体的细胞毒性测定的结果；图5显示WT PLY处理的红细胞膜的电子显微照片；图6显示用WT PLY或Δ6 PLY处理后肺组织中的IL-6水平；图7显示用WT PLY或Δ6 PLY处理后肺灌洗物中的IL-6水平；图8显示用WT PLY或Δ6 PLY处理后支气管肺泡灌洗物中的总蛋白水平；图9显示响应小鼠用WT PLY或Δ 6 PLY免疫的抗-PLY抗体水平；图10显示用WT PLY或缺失突变体ΔA146 PLY处理的SRBC(绵羊红细胞)中与毒素浓度有关的溶血作用的程度。
图11比较了WT PLY和突变体PLY W433F、Δ6 PLY、Δ7 PLY、Δ8 PLY和ΔA146 PLY的溶血活性；图12显示WT PLY和突变体PLY W433F、Δ6 PLY、Δ7 PLY、Δ8 PLY和ΔA 146 PLY对鼠L929成纤维细胞的细胞毒性；图1 3表明ΔA146 PLY不引起RBL-2H3肥大细胞的脱粒，而WT PLY引起脱粒；图14显示用野生型PLY或ΔA146 PLY处理后的中心体温分析。
发明详述
PLY为胆固醇结合性溶细胞素(CBC)组的成员。图1中给出了野生型肺炎链球菌溶血素的氨基酸序列。图1还显示了该序列的GenBank标识号，源于NCBI-GenBank Flat File Release 141.0，2004年4月15日。
本发明依赖许多PLY形式的鉴定，其在野生型PLY蛋白质的氨基酸144至161区域内具有突变，且如通过溶血活性和/或寡聚化的降低所反映的，其具有降低的毒性。该区域的共有序列如下VPARMQYEKITAHSMEQL(参见图1)。
在一个方面，本发明涉及突变体PLY蛋白质，其通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内的突变而不同于野生型蛋白质。该区域的共有序列如下VPARMQYE(参见图1)。
该突变体可在氨基酸144至161的区域内，例如氨基酸144至151内具有一个或多个氨基酸的替代或缺失。
因此在本发明的所有方面中，该突变体肺炎链球菌溶血素可在野生型序列氨基酸144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或161中的一个或多个氨基酸处具有突变，例如替代或缺失。
本发明进一步涉及突变体PLY蛋白质，其通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。所述双突变体的实例为包含氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失的那些。
这些突变体PLY蛋白质自身与一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体一起用于免疫原性组合物中。
或者，这些突变体PLY蛋白质缀合至来自相同或异种生物的糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质，以形成与一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体一起用于免疫原性组合物中的缀合物。因此，突变体PLY缀合的糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质可来自链球菌属，例如肺炎链球菌。其可源于细菌荚膜。
以未缀合或缀合形式，包含在免疫原性组合物中的突变体PLY蛋白质可用于预防或治疗。
以未缀合或缀合的形式，该突变体PLY蛋白质可进一步包含野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。这些进一步的替代或缺失在Paton等的公开的国际专利申请WO 90/06951中描述。
根据本发明的另外方面，提供包括如此处所述分离的突变体PLY蛋白质的免疫原性组合物。在一实施方案中，该免疫原性组合物为肺炎链球菌免疫原性组合物。
该突变体PLY蛋白质可保留在哺乳动物中的免疫原性活性。“哺乳动物中免疫原性的”指哺乳动物免疫系统将产生该突变体PLY蛋白质的抗体，并且这些抗体将也识别野生型PLY蛋白质。类似地，野生型PLY蛋白质的哺乳动物抗体将也识别突变体PLY蛋白质。优选该突变体蛋白质在人中为免疫原性的。优选突变体PLY蛋白质将刺激哺乳动物免疫系统产生可结合野生型VPARMQYEKITAHSMEQL或VPARMQYE序列的抗体。
在一实施方案中，该突变位于参与野生型蛋白质寡聚化的PLY蛋白质的区域中。
不受理论的束缚，认为该突变体PLY蛋白质具有降低的毒性，这是和野生型PLY蛋白质相比降低的孔形成活性的结果。据认为这与降低的寡聚化活性和/或降低的溶血活性有关。可直接测量毒性。或者，可测量孔形成、寡聚化和溶血作用中的一种或多种以提供可能毒性的指示。
缺失和替代是可用于提供具有降低毒性的PLY突变体蛋白质的突变的实例。非保守替代可能尤其适于降低PLY突变体的毒性，因为具有非保守突变的突变体比具有保守替代的突变体保留野生型功能水平的可能性更低。
保守替代可定义为氨基酸类别内的替代和/或在如下所示的BLOSUM62矩阵中得正分的替代，因此非保守替代可定义为氨基酸类别之间的替代，或在BLOSUM62矩阵中不得正分的替代。
根据一种分类，氨基酸类别为酸性、碱性、不带电荷极性的和非极性的，其中酸性的氨基酸为Asp和Glu；碱性氨基酸为Arg、Lys和His；不带电荷的极性氨基酸为Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr；以及非极性氨基酸为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys。
根据另一种分类，氨基酸类别为小亲水的、酸性的/酰胺/亲水的、碱性的、小疏水的和芳香族的，其中小亲水的氨基酸为Ser、Thr、Pro、Ala和Gly；酸性的/酰胺/亲水的氨基酸为Asn、Asp、Glu和Gln；碱性的氨基酸为His、Arg和Lys；小疏水的氨基酸为Met、Ile、Leu和Val；以及芳香族氨基酸为Phe、Tyr和Trp。
在BLOSUM62矩阵中得正分的保守替代如下
本发明的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白质优选具有与图1中所示野生型序列至少80％的氨基酸同一性。该突变体可具有与该野生型序列至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。
相对于参照序列的氨基酸序列百分比(％)同一性定义为，在比对序列和引入缺口(如果需要的话)以获得最大百分比序列同一性后候选序列中与参照序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，而不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分。％同一性值可通过WU-BLAST-2(Altschul等.，Methods in Enzymology，266460-480(1996))确定。WU-BLAST-2利用若干搜索参数，大多数设为缺省值。可调参数设为下列值重叠跨度(overlap span)＝1、重叠分数(overlapfraction)＝0.125、字阀值(word threshold)(T)＝11。％氨基酸序列同一性值通过由WU-BLAST-2确定的匹配相同残基的数目除以参照序列残基的总数(忽略由WU-BLAST-2引入参照序列中以最大化比对得分的缺口)，乘以100而确定。
氨基酸百分比(％)相似性以和同一性同样的方式定义，不同只是计数BLOSUM62矩阵中得分为正值的残基。因此，也计数了不相同但具有相似性质的残基(例如保守替代的结果)。
氨基酸144至161区域内，例如氨基酸144至151区域内的氨基酸插入也可用于降低PLY突变体的毒性。例如，可利用1、2、3、4、5、10、15、20或更多个氨基酸的插入。然而，通常缺失和替代相对于插入是更优选的，因为它们破坏野生型表位的可能性较小；这种破坏可降低突变体蛋白质的免疫原性，这在免疫原性组合物中为不想要的。
在本发明的另一方面，突变体PLY蛋白质缀合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质以形成免疫原性缀合物。在该方面，突变体PLY蛋白质可保留其免疫原性，或可消除免疫原性。无论哪种情况，突变体PLY蛋白质可用以增强缀合物中糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质的免疫原性。
这些糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质每种以任何合适的方式缀合至突变体PLY蛋白质，所述方式包括但不限于(1)通过蛋白质官能团直接偶联(例如，硫醇-硫醇键合、胺-羧基键合、胺-醛键合；酶直接偶联)；(2)胺的同双功能偶联(例如利用双醛)；(3)硫醇的同双功能偶联(例如利用双马来酰亚胺)；(4)通过光活化试剂的同双功能偶联；(5)胺至硫醇的异双功能偶联(例如利用马来酰亚胺)；(6)通过光活化试剂(例如β-羰基重氮(β-carbonyldiazo)家族)的异双功能偶联；(7)通过溴化氰活化或羧甲基化作用将胺反应性基团引入多糖或低聚糖中；(8)通过异双功能化合物例如Maleimido-hydrazide将硫醇反应性基团引入到多糖或低聚糖中；(9)通过将疏水基团引入蛋白质中的蛋白质-脂类缀合和(10)通过将反应性基团引入脂类中的蛋白质-脂类缀合。此外，考虑异双功能的“非共价偶联”技术如生物素-抗生物素蛋白相互作用。对于缀合技术的全面综述，参见Aslam和Dent(1998)，在下文中通过引用整体引入。
缀合肽、多肽或蛋白质至蛋白质的另外的方法在2003年12月17日提交的美国临时专利申请60/530，480和60/530，481中描述，并且两者通过引用整体引入。
另外，Kuo等的美国专利5,565,204描述了用于将这类多糖缀合至野生型PLY蛋白质的方法；该方法也适于将这类多糖缀合至本发明的突变体PLY蛋白质。
本发明的免疫原性组合物可以是缀合的免疫原性组合物。每种免疫原性组合物可包括一种或多种糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质，其可来自野生型PLY蛋白质的来源生物(肺炎链球菌)。在非限制性实例中，这类组分可源于该生物的荚膜。
在一实施方案中，糖、低聚糖或多糖源于一种以上肺炎链球菌血清型；特定的血清型将取决于免疫原性组合物的目的用途以及这些血清型在靶群体中的流行程度。
或者，糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质源于异种生物(即，不同于肺炎链球菌的生物)。就糖、低聚糖或多糖来说，多个血清型可获自但不限于脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(例如来自血清型A、C、Y和W135)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。
在本发明的某些方面，突变体PLY蛋白质缀合至肺炎链球菌的另一种肽、多肽或蛋白质。或者，突变体PLY蛋白质缀合至来自异种生物，包括人的肽、多肽或蛋白质。例如，突变体PLY蛋白质缀合至另一种肽、多肽或蛋白质，后者来自致病病毒、细菌、真菌或寄生虫，或(2)来自癌细胞或肿瘤细胞，或(3)来自过敏原以干扰IgE的产生而减轻对过敏原的变应性应答，或(4)来自淀粉样蛋白前体蛋白(APP)以预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样蛋白沉积为特征的疾病。
缀合至突变体PLY蛋白质的APP部分可以是β-淀粉样蛋白肽(也称为Aβ肽)，其为(APP)内部的39-43氨基酸片段，通过APP经β和γ分泌酶(secretase)的加工产生。所述肽的实例为Aβ1-42肽，其具有下列氨基酸序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly TyrGlu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly SerAsn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala。
Aβ组分可以另外以缀合至突变体PLY蛋白质的片段形式给予。所述片段的非限制性实例包括Aβ1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、1-10和1-12。缀合至PLY以外的蛋白质的Aβ和其片段的用途在公开的国际专利申请WO 99/27944和WO 00/72880中描述，其在此通过引用引入。
本发明另外的方面提供用于哺乳动物预防或治疗的方法，该方法包括给予受治疗者哺乳动物免疫原性组合物的步骤，该组合物包含具有如此处所述突变的分离的PLY蛋白质，其中如此处所述该突变体PLY蛋白质为未缀合的或缀合的。典型地，该方法用于一种或多种细菌物种或株系感染的预防或治疗，所述细菌具有可与野生型肺炎链球菌溶血素免疫交叉反应的胆固醇结合性溶细胞素，尤其为链球菌属，并且尤其为肺炎链球菌。其他物种，以及其溶细胞素，包括产气荚膜梭菌(产气荚膜梭菌溶血素(Perfringolysin)O)、中间链球菌(中间链球菌溶血素(Intermedilysin))、蜂房类芽胞杆菌(蜂房类芽胞杆菌溶血素(Alveolysin))、炭疽芽孢杆菌(炭疽杆菌溶血素(Anthrolysin))、蜡状芽胞杆菌(蜡状芽胞杆菌溶血素(Cereolysin))、伊氏利斯特氏菌(伊氏利斯特氏菌溶血素(Ivanolysin)O)、诺氏梭菌(诺氏梭菌溶血素(Novyilisin))、Arcanobacterium pyogenes(Pyolysin)、斯氏利斯特氏菌(斯氏利斯特氏菌溶血素(Seeligeriolysin)O)、败毒梭菌(败毒梭菌溶血素(Septicolysin))、S.pyogenes(链球菌溶血素O)、猪链球菌(猪链球菌溶血素(Suilysin))、破伤风梭菌(破伤风溶血素)、单核细胞增生利斯特氏菌(利斯特溶血素(Listeriolysin)O)、似马链球菌(链球菌溶血素O)、狗链球菌(链球菌溶血素O)、苏云金芽孢杆菌(苏云金菌溶素O)、侧胞芽胞杆菌(侧胞芽胞菌溶素(Latersporolysin)O)、肉毒梭菌(肉毒梭菌溶血素(Botulinolysin))、肖氏梭菌(肖氏梭菌溶血素(Chauveolysin))、双酶梭菌(双酶梭菌溶血素(Bifermentolysin))、索氏梭菌(索氏梭菌溶血素(Sordeliilysin))(参见例如Palmer 2001)。
本发明免疫原性组合物的给药方式，不管是给药单独的突变体PLY蛋白质或作为免疫原性缀合物一部分的该蛋白质，可以是通过任何合适的途径，其投递蛋白质的免疫保护量至受治疗者。一种所述途径为肠胃外途径，如通过肌内的或皮下给药。按照所需，也可采用其他的给药方式，如粘膜途径，如通过口服、直肠、口腔或鼻内给药，或通过其他的肠胃外途径，即真皮内或静脉内给药。
通常，免疫原性组合物一般作为药物制剂呈现，其包括适合给药至人的生理学可接受的载体或赋形剂，例如无菌水或无菌等渗盐水，以及任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等等。合适的载体对本领域技术人员来说是显而易见的并且很大部分取决于给药途径。本发明的免疫原性组合物还可包括生理学可接受的稀释剂如无菌水或无菌等渗盐水。可通过常规方法制备制剂。
然而，应理解的是用于任何具体受体哺乳动物的特定剂量水平取决于各种因素，包括年龄、常规健康情况和性别；给药时间；给药途径；与任何其他所给药物的协同效应；以及所寻求的保护程度。当然，如有必要可以以合适的时间间隔重复给药。
哺乳动物可以是人，或可以是非人哺乳动物。免疫原性组合物可以任何方便的方式例如上述那些而给予。
本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种生理学可接受的佐剂。当与免疫原或抗原一起给予时增强免疫应答的物质称为佐剂。已显示许多细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，并且因此可用作佐剂，包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如，美国专利No.5,723,127，其在此通过引用引入)、13、14、15、16、17和18(以及其突变体形式)、干扰素-α、β和γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；参见例如，美国专利No.5,078,996，其在此通过引用引入，以及ATCC登录号39900)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和肿瘤坏死因子α和β。还可用于本发明中的其他佐剂包括趋化因子，包括而不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子如选择蛋白，例如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白也可用作佐剂。再其他有效的佐剂包括而不限于，粘蛋白样分子，例如CD 34、GlyCAM-1和MadCAM-1、整联蛋白家族成员如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95、免疫球蛋白超家族成员如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3、共刺激分子如CD40和CD40L、生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮细胞生长因子、受体分子包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。其他的佐剂分子包括Caspase(ICE)。也参见国际专利公开No.W098/17799和WO99/43839，通过引用引入此处。
用于增强免疫应答的合适的佐剂进一步包括而不限于，MPLTM(3-O-去酰化单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，MT)，其在美国专利No.4,912,094中描述，在此通过引用引入。还适于用作佐剂的为合成的脂质A类似物或氨烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得(Hamilton，MT)，并且其在美国专利No.6,113,918中描述，在此通过引用引入。一种所述AGP为2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基-氨基]-β-D-吡喃葡糖苷，其亦称为529(以前称为RC529)。该529佐剂配制为水相形式或为稳定的乳剂。
其它佐剂包括矿物油和水乳剂、铝盐类(alum)，如氢氧化铝和磷酸铝等，Amphigen、Avridine、L121/角鲨烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普卢兰尼克多元醇、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)，其在美国专利No.5,057,540中描述，在此通过引用引入，以及从此产生的颗粒如ISCOMS(免疫刺激复合物)、结核分枝杆菌、细菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(美国专利No.6,207,646，其在此通过引用引入)、百日咳毒素(PT)或大肠杆不耐菌热毒素(LT)，特别是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见例如，国际专利公开No.WO 93/13302和WO 92/19265，在此通过引用引入。
还可用作佐剂的为霍乱毒素和其突变体，包括公开的国际专利申请WO 00/18434中所述的那些(其中氨基酸位置29的谷氨酸由另一种氨基酸(不同于天冬氨酸)，优选组氨酸替代)。类似的CT毒素或突变体在公开的国际专利申请WO 02/098368中描述(其中单独或与氨基酸位置68的丝氨酸由另一种氨基酸替代相结合，氨基酸位置16的异亮氨酸由另一种氨基酸替代；和/或其中氨基酸位置72的缬氨酸由另一种氨基酸替代)。其他CT毒素在公开的国际专利申请WO 02/098369中描述(其中氨基酸位置25的精氨酸由另一种氨基酸替代；和/或氨基酸在氨基酸位置49处插入；和/或两个氨基酸在氨基酸位置35和36处插入)。
可以任何合适的方式测定突变体PLY蛋白质的溶血活性。本发明中所用的一种具体方案如下。在1.5ml 1 x PBS(Oxoid)中制备系列稀释的毒素。等体积2％(vol/vol)的SRBC(绵羊红细胞)添加至每种稀释物并且37℃温育30分钟。溶液随后在3000rpm离心5分钟以沉淀SRBC膜或整个细胞。在OD540nm读取上清的血红蛋白含量并且对毒素浓度画出曲线以提供与毒素浓度有关的溶血程度。0.5的OD540nm＝50％溶解。
优选突变体蛋白质在大于1μg/ml浓度时是非溶血的；更优选在大于5μg/ml浓度；更优选在大于10μg/ml，大于25μg/ml或大于35μg/ml；并且最优选在大于50μg/ml时是非溶血的。可如上进行溶血作用的测定。
可以任何合适的方式确定成孔活性的测定；优选的方案基于SRBC膜通过电子显微镜的肉眼检查；这允许目测孔数。该方案在底下更详细地描述。
可采用一些方法以分析成孔毒素的寡聚化活性。例如，如Morgan等(1993)所述的分析性超速离心可用于研究溶液中毒素的寡聚化。蔗糖密度梯度可用于结合毒素的红细胞，其中在高分子量部分中观察到寡聚物并且与其他的红细胞膜蛋白质分离(Bhakdi等.，1985；Saunders等.，1989)比较溶液中突变体PLY与野生型PLY的寡聚化活性的一种具体方法为利用以Search(2002)所述的类似方式进行的荧光测定法。简要地，ANS(8-苯氨基-1-萘-磺酸)(KodakLtd.)作为外来荧光剂结合PLY。水溶液中，ANS在490nm具有弱的荧光(用JASCO FP-750分光荧光计读取)但在疏水环境中ANS荧光增强。该现象允许在溶液中追踪结合ANS的PLY单体的运动。脱氧胆酸钠(BDH Laboratory提供)可用于诱导肺炎链球菌溶血素的寡聚化。当野生型PLY加ANS用脱氧胆酸钠处理时观察到荧光的增强，因为毒素自缔合将ANS从亲水环境带至疏水环境。衍生的PLY，即用二硫代(双)硝基苯甲酸盐化学修饰的PLY维持单体，当用脱氧胆酸钠处理时不引起490nm处荧光的增强。根据该实验，预计突变体PLY如果维持单体，将提供与衍生的PLY相同的结果。如果发现突变体PLY与WT PLY相同程度地发荧光则可推断突变体PLY寡聚化。
可通过将突变体给予非人试验哺乳动物，例如啮齿类而直接确定本发明的蛋白质和组合物的毒性。突变体的毒性可与野生型蛋白质的相比较。合适的毒性指标包括存活率、动物行为和炎症(其可通过测量例如在支气管肺泡灌洗物中炎性细胞因子的产生来测定)。合适的方案在实施例中描述如下。
本发明进一步提供免疫原性组合物的制备方法，该方法包括步骤提供具有本文所述突变并且与野生型PLY蛋白质相比具有降低的溶血活性的分离的突变体PLY蛋白质，该突变体蛋白质在哺乳动物中为抗原性的；和将该突变体蛋白质缀合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质。
根据本发明另外的方面，提供分离和纯化的核酸序列，它包括编码突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质的分离的核酸序列，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低，或其与这样的核酸序列互补，该突变体蛋白质在哺乳动物中为免疫原性的。本发明另外的方面提供与这样的序列互补的核酸序列。
基于遗传密码的简并性核酸序列可源于蛋白质序列。
本发明的核酸序列可包括另外的调控序列，例如启动子或阻遏子(repressors)。核酸序列可包括在表达载体，例如质粒、人工染色体、表达盒等等内。
根据本发明更进一步的方面，提供用包括表达如此处所述突变体PLY蛋白质的分离和纯化的核酸序列的重组表达载体转化、转染或感染的重组宿主细胞。在一实施方案中，细胞为原核细胞。
根据本发明更进一步的方面，提供筛选适合用于免疫原性组合物中的候选突变体PLY蛋白质的方法，该方法包括步骤提供突变体PLY蛋白质；测定该突变体蛋白质的溶血活性；测定该突变体PLY蛋白质的寡聚化活性；和将该突变体PLY蛋白质的溶血和寡聚化活性与非突变体蛋白质的相比较。
和该蛋白质的非突变体形式相比具有降低的溶血和寡聚化活性的那些突变体蛋白质很可能是用于制备免疫原性组合物的优良候选者。
该方法可进一步包括测试突变体蛋白质在目的哺乳动物中免疫原性活性的步骤。此包括将突变体蛋白质与非突变体蛋白质的抗体接触的步骤。此可在体内或体外进行。
此处所述的本发明涉及肺炎链球菌溶血素的缺失突变体，其呈现降低的毒性、溶血作用和孔形成。数据证实，和2μg/剂WT PLY相比，7μg/剂的Δ6 PLY对小鼠无害。
然而，本发明人围绕N143残基建立和此处所述的各种突变仍然可被用mAb PLY 4进行的Western印迹法识别，表明PLY上的该高抗原性位点未改变。通过表位扫描已显示该突变位点为高抗原性的并且该位点被人血清和兔超免疫血清识别(Salo等.，1993)。
已证实产生的所有突变体为肺炎链球菌溶血素的形式。mAb PLY4识别突变体的事实表明该表位没有改变至其对该抗体不再特异的程度。该区域内的更大缺失产生不被mAb PLY4识别的突变体。由于该区域已鉴定为高免疫原性的(Salo等.，1993)，在已产生用于免疫原性组合物中的缺失中该位点保留完整是有用的。
此处所述的无毒突变体在提议参与寡聚化的位点之内(de losToyos等.，1996)。一种纯化的类毒素Δ6 PLY进一步的体外表征显示其对鼠成纤维细胞或红细胞无细胞毒性。这提示由于已阻止了寡聚化(孔形成)，宿主细胞膜不被Δ6 PLY裂解。很容易看见用WT PLY处理的SRBC膜上的孔，但在用Δ6 PLY处理的膜上没有观察到孔。将Δ6 PLY处理的膜固定至网格用于EM的显像比较困难。此可能归因于用Δ6 PLY的溶血测定法中所见的膜凝集。Δ6 PLY和SRBC的溶血测定法中观察到的血细胞凝集作用提示Δ6 PLY单体仍结合宿主细胞膜。产生了Δ6 PLY的标记形式，其允许结合宿主细胞膜的可视化。根据结合测定法(数据没有显示)证实Δ6 PLY的确结合宿主细胞膜。Δ6PLY单体之间可能存在弱的亲和力，允许单体的交联但不是真正寡聚物的形成。除单体结合至红细胞外，Δ6 PLY单体的交联可产生96-孔平皿中观察到的矩阵。认为通过产生Δ6 PLY突变体，阻断了寡聚化阶段，但没有消除宿主细胞的结合/识别。
该假设得到如下发现的支持如利用突变体和野生型蛋白质的eGFP-标记型所确定的，Δ146 PLY仍然能与细胞膜结合，而Δ146 PLY不在细胞膜中形成孔。反之，在细胞表面看到蛋白质长链，其可能是不能正确寡聚化形成孔的自缔合蛋白质。
用Δ6 PLY的体内处理在处理后24小时不引起炎性细胞因子IL-6的增加。发现小鼠用WT PLY处理产生比盐水对照和Δ6 PLY处理高10倍的IL-6。所述数据确定用Δ6 PLY的处理不诱导与天然PLY有关的炎性副作用。WT PLY处理在给药部位产生局部的炎性反应。支气管肺泡灌洗物中该局部化IL-6的产生很可能来自募集的嗜中性粒细胞(Kadioglu，2000)和肺泡巨噬细胞，其比肺组织的上皮细胞产生更多的IL-6(Kerr，personal communication 2003)。
野生型PLY严重损伤肺完整性，但用Δ6 PLY处理的肺维持健康。WT PLY处理的小鼠导气管中观察到的大量总蛋白已表征为宿主蛋白质的流入(Rubins & Janoff，1998)。之前PLY已参与紧密联结的破坏(Rayner等.，1995)，允许宿主蛋白质通过毛细管/导气管屏障的破坏而‘渗漏’进入导气管。Δ6 PLY的低炎性应答和对肺无破坏与Δ6PLY没能力在宿主细胞膜中产生成孔性寡聚物相关联。
还证实小鼠用WT PLY的处理引起持续的低体温应答，其在用Δ146PLY处理的动物中未见到。
本发明的这些和其他方面将通过下列非限制性实施例以及参考附图描述。
实施例实施例1肺类链球菌溶血素的定点诱变利用Quikchange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)产生野生型肺炎链球菌溶血素的八种双氨基酸缺失。模板质粒为高表达载体pKK233-3(Clontech Laboratories)，其中之前已插入PLY。用来缺失相关氨基酸(参见下面表1)的引物从Sigma-Genosys定购。产生下列缺失以跨跃PLY的N143区域W134H135Q136D137Y138G139Q140U141N142N143V144P145A146R147M148Q149Y150E151；其中(Δ1)W134H135、(Δ2)Q136D137、(Δ3)Y138G139、(Δ 4)Q140V141、(Δ5)V144P145、(Δ6)A146R147、(Δ7)M148Q149(Δ8)Y150E151(参见表2)。N142N143为之前产生的缺失(Search(2000))，其中蛋白酶K将PLY切成两个片段。
表1用于在PLY基因内产生双氨基酸缺失的引物
注意-反向引物[rev]为正向[fwd]引物的精确反向互补物，所要缺失的碱基从所述引物除去。
表2PLY基因内每种突变缺失的碱基和缺失的氨基酸。
实施例2蛋白质表达和纯化野生型(WT)和突变体PLY如之前所述在大肠杆菌中表达并且收集(Mitchell等.，1989)。利用台式(benchtop)细胞破坏器(ConstantSystems Ltd)破碎细胞并且通过在13,000rpm离心30分钟获得胞质蛋白质。用BioCAD(RTM)700E Perfusion Chromatography工作站(Applied Biosystems)，用苯基醚基质(PE20，Applied Biosystems)以疏水作用层析纯化PLY。洗脱组分在SDS-PAGE上电泳并且利用标准的方案考马斯染色并且合并包含纯PLY的级分。
实施例3定量溶血测定法采用基于Walker等(1987)报道的测定法利用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Oxoid)中2％(vol/vol)绵羊红细胞(SRBC)(E&O实验室)溶液评估纯化的蛋白质的溶血活性。利用minicon B15临床样品浓缩器(Millipore)浓缩合并的级分。在1.5ml 1x PBS(Oxoid)中制备连续稀释的毒素。等体积2％(vol/vol)的SRBC添加至每种稀释物中并且37℃温育30分钟。溶液随后在3000rpm离心5分钟以沉淀SRBC膜或整个细胞。在OD540nm读取上清的血红蛋白含量并且对毒素浓度画出曲线以提供与毒素浓度有关的溶血作用程度。0.5的OD540nm＝50％溶解。
粗略的溶血分析揭示这些突变体的四种，缺失体5-8，为非溶血的。在定量溶血测定法中纯化的Δ6 PLY(A146R147)的进一步分析(图3)揭示其在50μg/ml浓度时为非溶解性的而＜1μg/ml的WT PLY对SRBC为溶血的。观察到纯化的Δ5 PLY和Δ6 PLY的制剂在96-孔微量滴定平皿中凝集红细胞而不裂解所述细胞；该作用为浓度依赖性的。
实施例4
电子显微镜检查200μl 2％(v/v)sRBC溶液与等体积0.2mg/ml WT PLY或Δ6 PLY在37℃温育20分钟随后用台式离心机离心以沉淀SRBC膜。膜用dH2O洗涤3次并且重悬于100μl dH2O中。5μl悬浮液置于碳涂布的网格上并且用pH6.8的1％磷钨酸负染。放大倍数为x25000，利用LEO 912Energy Filter Transmission电子显微镜。
在用0.2mg/ml WT PLY处理的红细胞膜上显现30-40μm的孔(图5)。相反，用0.2mg/mlΔ6 PLY处理的膜上未显现孔。
实施例5Western印迹法利用标准技术用蛋白质印迹检测通过定点诱变产生的PLY突变体。斑点与来自兔的多克隆抗-PLY血清或来自小鼠的单克隆PLY 4抗-PLY血清温育(de los Toyos等.，1996)并且随后与相关的HRP-连接的抗体(Amersham Life sciences)温育和显影。
在八种产生的双氨基酸缺失物中，所有的缺失物都通过Western印迹法被多克隆抗-PLY血清(未显示)以及由de los Toyos等(1996)制备的mAb PLY 4(图2)识别。
实施例6L929杀死测定法L929鼠成纤维细胞(ECACC，no.85011425)在RPMI 1640培养基+10％胎牛血清(FBS)(Gibco)中培养、传代并且转入96-孔平皿以及在37℃、5％CO2中温育24h。在来自0.05mg/ml贮藏浓度的RPMI 1640培养基中制备纯化的WT PLY和突变体Δ6 PLY毒素的连续稀释物并且添加至L929成纤维细胞。利用MTT(溴化3-[4，5-二甲噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)(sigma)(其通过线粒体活性降解为紫色的甲 沉淀)评估与PLY温育24h后的细胞存活力。孔中死细胞的MTT将维持黄色。用MRX平皿读数器(Dynatech Laboratories)在540nm读取光密度。
进行用L929鼠成纤维细胞的细胞毒性测定法以评估突变体Δ6PLY相比于WT PLY的毒性(图4)。Δ6 PLY在30μg/ml浓度对成纤维细胞无毒，而＜500pg/ml的WT PLY为细胞毒性的。
实施例7体内细胞因子分析八周大小的MF-1小鼠(Harlan)用2％氟烷/1.5％氧(1.5升/min)(Zeneca)稍微麻醉。纯化的无LPS的WT PLY以2μg/剂经鼻给予并且Δ6 PLY以50μl体积的7μg/剂(9.928ng LPS/剂)给予，盐水组作为对照(每种处理n＝4)。利用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)Kinetic-QCL Kit(BioWhittaker)并且根据制造商的说明书进行而确定纯化的毒素的脂多糖(LPS)含量。小鼠监视至24h终点。回收血清、支气管肺泡灌洗物和肺组织样品并且如之前所述处理(Kerr等.，2002)。用商品化的细胞因子ELISA试剂盒测量白介素(IL)-6、干扰素(IFN)-γ(Pharmigen)和肿瘤坏死因子(TNF)-α(R&D systems，UK)的细胞因子水平。利用标准的Bradford测定法测量灌洗物中的总蛋白水平。
使用Mann-Whitney U检验的非参数分析测量细胞因子和总蛋白水平，其中p＜0.05认为是统计上显著的。值利用Statview(AbacusConcepts)表示为中位值±1中位值绝对偏差(MAD)。
作为体内毒性研究的一部分，确定总体症状。除了一只来自WT PLY组的小鼠外所有小鼠在处理后24小时存活。用Δ6 PLY和盐水处理的小鼠比给予WT PLY的小鼠从麻醉状态恢复得更快。Δ6 PLY处理小鼠的行为类似于盐水对照的，但WT PLY处理的小鼠在6-小时期间呈现竖毛、呼吸困难和弓背姿势，在24-小时时间范围内恢复。
然后，进行炎性细胞因子的分析。IL-6的产生作为PLY对宿主毒性的标记物而测量。相比Δ6 PLY处理(p＜0.05)和盐水对照(p＜0.05)，WT PLY处理的小鼠支气管肺泡灌洗物中存在超过10倍的IL-6水平提高(图7)。用WT PLY的处理诱导宿主导气管中的炎症而用Δ6 PLY的处理没有。WT处理的支气管肺泡灌洗物中中位值IL-6水平为416pg/ml(335-2225pg/ml的范围)而本底IL-6水平很低(59pg/ml)，用Δ6 PLY处理的小鼠中没有提高(36pg/ml)(参见下面表3)。相比盐水对照，WT处理的小鼠肺组织中观察到IL-6水平的提高(p＜0.05)(图6)。相比盐水处理，Δ6处理的小鼠肺组织中没有显著的IL-6提高。给药后24h各处理之间IFN-γ和TNF-α的测量不显著(数据没有显示)。
表3处理后24h支气管肺泡灌洗物中IL-6的中位值(最小值-最大值)水平
测量支气管肺泡灌洗物中的总蛋白水平(图8)以评估肺完整性。相比健康的灌洗样品，Δ6 PLY处理的小鼠未观察到蛋白水平的提高。相比盐水对照组0.23mg/ml的本底总蛋白水平，WT PLY处理的小鼠导气管具有大量的蛋白质(3.57mg/ml)(图8)。
实施例8小鼠免疫原性研究进行小鼠免疫原性研究以比较野生型PLY蛋白质与Δ5、6和7突变体蛋白质的应答。所有免疫原性组合物在佐剂AlPO4(0.2mg)和MPL-SE(50μg)的组合存在下制备为5μg rPLY/剂。磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的AlPO4(0.2mg)和MPL-SE(50μg)用作阴性对照。
每组5只的几组雌性CD-1小鼠(6-8周大)经腹膜免疫并且以2周时间间隔接受2次加强剂量。在第0、2、4和6周眶后收集血液。分析各个血清并且GMTs代表0.3的终点。第0周的抗体全部＜50。如表4所示，三种PLY突变体在小鼠中产生抗体，其可与野生型PLY产生的那些相比。
表4小鼠中对突变体重组肺炎链球菌溶血素(rPLY)的血清IgG抗体应答
实施例9抗-PLY抗体的产生用野生型PLY或Δ6 PLY免疫的小鼠中产生的抗-PLY抗体的水平通过用20μg WT PLY或Δ6 PLY，每种和100μg Alum/100μl剂量一起最初的皮下注射来免疫MF-1小、鼠而确定。小鼠随后用相同的剂量加强两次。在所述免疫方案的第47天收集血清并且分析抗-PLY IgG抗体。抗体稀释曲线作为针对血清系列稀释的组平均值0D490nm±SEM而在图9中显示。血清最初稀释至1/1000，因为更浓缩的样品导致所述底物完全饱和。图9证实了响应Δ6 PLY+Alum以及WT PLY+Alum产生了高水平的抗体，但仅Alum的对照组则没有。
然后，评估抗-PLY抗体中和溶血活性的能力。观察到Δ6 PLY和野生型PLY处理组中抗-PLY抗体完全中和2.5溶血单位(HU)PLY至溶血分析中1000-2400的滴度(其中中和能力表示为完全中和2.5HUPLY的抗体稀释度的倒数)(数据没有显示)。此证实PLY上的中和位点被响应用Δ6 PLY+Alum和WT PLY+Alum免疫而产生的抗体所识别并且结合。由于Δ6 PLY为无毒的并且不诱导用野生型PLY处理观察到的体内水平细胞因子产生，因此用作免疫原性载体蛋白时，Δ6 PLY为比野生型PLY更有利的蛋白质。
实施例10单个氨基酸缺失的影响产生突变体PLY，其具有单氨基酸缺失氨基酸146的丙氨酸缺失(ΔA146 PLY)。如图10所示，该单缺失(ΔA146)也产生PLY的非溶血形式。ΔA146 PLY在到达浓度＞100μg/ml时对SRBC为不溶血的，而野生型PLY在浓度＜1μg/ml为溶血的。该突变体的产生通过测序以及通过表达的蛋白质用多克隆抗-PLY血清的Western印迹得到证实(数据没有显示)。
实施例11PLY突变体与PLY W433F相比的溶血活性将缺失突变体Δ6、Δ7、Δ8 PLY和ΔA146 PLY对人红细胞的溶血活性与WT PLY以及带有替代W433F的PLY突变体相比，PLY W433F之前描述具有WT PLY仅1％的溶血活性(参见WO 90/06951)。
图11表明，正如所料，W433F突变体显示野生型PLY约1％的溶血活性。然而该缺失突变体完全不引起人红细胞的裂解。
实施例12GFP-标记的PLY结合红细胞膜使用荧光显微镜检查显现用WT PLY和Δ6 PLY的eGFP-标记形式处理的红细胞。
通过用蒸馏水反复洗涤从人血液制备血影。从0.1ml人血液产生的血影与1ml 1x PBS中的50μg EGFP-PLY或50μg Δ6EGFP-PLY在37℃温育30分钟。沉淀影膜，在PBS中洗涤3次并且利用ZeissAxioscop20通过荧光显微镜检查法显象。
结果(未显示)证实Δ6 PLY和膜的结合基本上与WT PLY和膜的结合相同。
实施例13利用透射电子显微镜检术分析孔形成对负染的用0.2mg/ml野生型肺炎链球菌溶血素、0.2mg/ml W433FPLY和0.2mg/ml ΔA146 PLY处理的马红细胞膜如上进行电子显微镜检查(实施例4)。
在用wt PLY和W433F处理的膜上观察到孔，但在用ΔA146 PLY处理的膜上没有观察到孔。反之，ΔA146 PLY的处理导致长链的形成，认为包含不能寡聚化形成孔的自缔合的毒素(数据没有显示)。
因此Δ6 PLY保留野生型PLY的膜结合性质但不在细胞膜中形成孔。
实施例14肺炎链球菌溶血素突变体对鼠L929成纤维细胞的细胞毒性如实施例6中所述确定WT PLY、PLY W433F和缺失突变体Δ6、Δ7、Δ8 PLY和ΔA146 PLY对鼠L929成纤维细胞的细胞毒性。人红细胞与WT PLY的比较。
发现该分析中W433F PLY突变体在10μg/ml和以上时为细胞毒性的，而缺失突变体为无毒的(图12)。
实施例15
肺炎链球菌溶血素突变体ΔA146 PLY对RBL-2H3肥大细胞的细胞毒性利用脱粒分析评估ΔA146 PLY对大鼠RBL-2H3肥大细胞的细胞毒性。
如Stassen等(2003)所述，利用104细胞/孔，与野生型PLY或ΔA146 PLY温育90分钟进行该分析。
测量β-氨基己糖苷酶从肥大细胞颗粒的释放，其给出该细胞响应毒素的脱粒的直接测量。ΔA146 PLY不引起肥大细胞的脱粒(图13)。
实施例16用wt PLY或ΔA146 PLY处理后的鼠中心体温分析在Balb/c小鼠中植入遥测芯片，这使得可以获得中心体温(Tc)。小鼠用1μg wt PLY、1μgΔA 146 PLY或仅盐溶液处理。如图14所示，用WT PLY的处理导致严重的低体温应答，Tc降至28℃。该Tc维持6小时，其后Tc以约0.6℃/小时提高并且24小时后与对照组的Tc相似，尽管仍然是统计上显著的。用ΔA146 PLY的处理不导致低体温并且中位值Tc与盐水对照组相当。
因此，小鼠用WT PLY处理导致持续的低体温应答，这种应答在用相同量的ΔA146 PLY处理后未观察到。
虽然已结合上述例证性的实施方案描述本发明，当给予本说明书时许多同等的改进和改变对于本领域技术人员为显而易见的。因此，认为本发明的例证性实施方案为说明性的和非限制性的。可在不背离本发明的精神和范围的条件下产生对所述实施方案的各种改变。此处引用的所有参考文献通过引用明确地引入。
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1.分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。
2.权利要求1的蛋白质，其中该突变 体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个 或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白质。
3.权利要求1的蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质。
4.权利要求3的蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
5.权利要求4的蛋白质，其中丙氨酸146被替代或缺失。
6.权利要求4的蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白质。
7.权利要求6的蛋白质，其中氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145被缺失。
8.权利要求6的蛋白质，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
9.权利要求6的蛋白质，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
10.权利要求6的蛋白质，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
11.权利要求1至10任何一项的蛋白质，其中该蛋白质进一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
12.免疫原性缀合物，其包含(a)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(b)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。
13.权利要求12的免疫原性缀合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白质。
14.权利要求12的免疫原性缀合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质。
15.权利要求13的免疫原性缀合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
16.权利要求15的免疫原性缀合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
17.权利要求15的免疫原性缀合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白质。
18.权利要求17的免疫原性缀合物，其中PLY蛋白质的氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145被缺失。
19.权利要求17的免疫原性缀合物，其中PLY蛋白质的氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
20.权利要求17的免疫原性缀合物，其中PLY蛋白质的氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
21.权利要求17的免疫原性缀合物，其中PLY蛋白质的氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
22.权利要求12至21任何一项的免疫原性缀合物，其中糖、低聚糖或多糖来自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
23.权利要求12至22任何一项的免疫原性缀合物，其中该蛋白质进一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
24.分离和纯化的核酸序列，包含核酸序列，该核酸序列a)编码突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低；或b)与a)中定义的核酸序列互补。
25.权利要求24的分离和纯化的核酸序列，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白质。
26.权利要求24的分离和纯化的核酸序列，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质。
27.权利要求26的分离和纯化的核酸序列，其中丙氨酸146被替代或缺失。
28.权利要求26的分离和纯化的核酸序列，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。
29.权利要求28的分离和纯化的核酸序列，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白质。
30.权利要求29的分离和纯化的核酸序列，其中氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145被缺失。
31.权利要求29的分离和纯化的核酸序列，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
32.权利要求29的分离和纯化的核酸序列，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
33.权利要求29的分离和纯化的核酸序列，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
34.权利要求24至33任何一项的分离和纯化的核酸序列，其中该蛋白质进一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
35.重组表达载体，包含权利要求24至34任何一项的包含核酸序列的分离和纯化的核酸序列。
36.用权利要求35的重组表达载体转化、转染或感染的重组宿主细胞。
37.产生分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质的方法，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低，该方法包括a)用权利要求35的重组表达载体转化、转染或感染宿主细胞并且在允许所述突变体PLY蛋白质被该宿主细胞表达的条件下培养该宿主细胞；和b)从培养物回收突变体PLY蛋白质。
38.免疫原性组合物，其包含a)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
39.权利要求38的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白质。
40.权利要求38的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质。
41.权利要求40的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型蛋白质。
42.权利要求41的免疫原性组合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
43.权利要求41的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白质。
44.权利要求43的免疫原性组合物，其中氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145被缺失。
45.权利要求43的免疫原性组合物，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
46.权利要求43的免疫原性组合物，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
47.权利要求43的免疫原性组合物，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
48.权利要求38至47任何一项的免疫原性组合物，其中该蛋白质进一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
49.免疫原性组合物，其包含a)免疫原性缀合物，包含(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(ii)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
50.权利要求49的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白质。
51.权利要求49的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质。
52.权利要求51的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代而不同于野生型蛋白质。
53.权利要求52的免疫原性组合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
54.权利要求52的免疫原性组合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白质。
55.权利要求54的免疫原性组合物，其中该PLY蛋白质的氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145被缺失。
56.权利要求54的免疫原性组合物，其中该PLY蛋白质的氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
57.权利要求54的免疫原性组合物，其中该PLY蛋白质的氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
58.权利要求54的免疫原性组合物，其中该PLY蛋白质的氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
59.权利要求49至58任何一项的免疫原性组合物，其中糖、低聚糖或多糖来自于肺炎链球菌。
60.权利要求59的免疫原性组合物，其中存在多种肺炎链球菌血清型。
61.权利要求49至60任何一项的免疫原性组合物，其中该蛋白质进一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。
62.用于哺乳动物的预防方法，该方法包括给予受治疗者哺乳动物免疫原性组合物的步骤，所述组合物包含a)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失而不同于野生型PLY蛋白质；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
63.用于哺乳动物的预防方法，该方法包括给予受治疗者哺乳动物免疫原性组合物的步骤，所述组合物包含a)免疫原性缀合物，包含(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(ii)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低；和b)一种或多种生理学可接受的佐剂、稀释剂或载体。
64.突变体PLY蛋白质或其免疫原性缀合物在制备用于预防或治疗细菌感染的免疫原性组合物中的用途，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。
65.用于医学治疗方法中的分离的突变体PLY蛋白质或其免疫原性缀合物，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。
66.免疫原性组合物的制备方法，该方法包括步骤提供分离的突变体PLY蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低；和将该突变体蛋白质缀合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质。
67.权利要求66的方法，其中该突变体蛋白质缀合至肺炎链球菌多糖。
68.筛选适合用于免疫原性组合物中的候选突变体PLY蛋白质的方法，该方法包括步骤提供突变体PLY蛋白质；测定该突变体蛋白质的溶血活性；测定该突变体PLY蛋白质的寡聚化活性；和将该突变体PLY蛋白质的溶血和寡聚化活性与非突变体蛋白质的那些活性相比较。
全文摘要
本发明涉及包含突变体肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本发明进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。在具体的实施方案中，本发明涉及分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。在具体的实施方案中，该突变体PLY蛋白质通过在该区域内氨基酸的替代或缺失，包括野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的缺失，而不同于野生型蛋白质。
文档编号A61K39/00GK101018863SQ200580022076
公开日2007年8月15日 申请日期2005年5月9日 优先权日2004年5月7日
发明者利-安·柯卡姆, 蒂莫西·约翰·米切尔 申请人:利-安·柯卡姆, 蒂莫西·约翰·米切尔