专利名称：通过花色素苷和花色素分泌胰岛素的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求于2004年7月29日提交的序列号为60/591,806的临时专利申请的优先权。
政府权益本发明受到USDA基金No.2003-35504-13618的资助。美国政府对本发明有一定权利。
背景技术：
(1)发明领域本发明涉及使用花色素苷、花色素或其混合物增加细胞中胰岛素产生的方法。本发明还涉及用于该方法中增加胰岛素产生的组合物。所述方法和组合物可以为体内或体外。
(2)相关领域的描述胰岛素的功能是保持正常血液葡萄糖水平，这或是通过抑制葡萄糖从肝中的输出或通过刺激葡萄糖吸收和代谢(Ross，S.A.，等，Chemistry and Biochemistry of diabetes.Chem.Rev.104 1255-1282(2004))而实现的。在靶标组织中胰岛素释放的不充足或胰岛素作用的丧失导致异常葡萄糖和脂肪代谢。这就导致血中葡萄糖水平的升高，即糖尿病的特点(Jovanovic，L.，等2-type diabetesThe epidemicof new millennium.Ann.Clin.Lab.Sci.29 33-42(1999))。存在两种类型的糖尿病，1-型(胰岛素-依赖型糖尿病)和2-型糖尿病(非胰岛素-依赖型糖尿病)。1-型糖尿病由胰腺β-细胞被自身免疫破坏导致，胰腺β-细胞是分泌胰岛素的细胞，从而导致胰岛素缺乏。2-型糖尿病更普遍，其是由β-细胞不能分泌足够量胰岛素以克服由遗传和环境因素建立的胰岛素抗性导致的(Henquin，J.C，Diabetes 49 1751-1760(2000))。胰岛素抗性是一种病症，其中在骨骼肌肉和脂肪中胰岛素不能充分刺激葡萄糖转运，不能充分抑制肝脏葡萄糖产生。发病机制包括阻止β-细胞分泌足够量的胰岛素以克服就要建立的外周胰岛素抗性。口服降血糖药直接刺激胰岛素从β-细胞的释放(例如基于磺酰脲的药物)，但是，已经表明从2-型糖尿病患者胰岛分泌的胰岛素可以充分升高以克服外周胰岛素抗性和使血液葡萄糖水平正常。使用基于磺酰脲的药物的缺点之一是不能控制正常血液葡萄糖水平(Pfeiffer，A.F.H.，Oral hypoglycemic agentsSulfonylureas and meglitinides.InB.J.Goldstein，等，(Eds.)、Test book of Type-2 Diabetes.MartinDunitz Ltd.，London第77-85页(2003))。这些药物对β-细胞分泌胰岛素能力也有不利的影响，并导致重量增加((Pfeiffer，A.F.H.，Oralhypoglycemic agentsSulfonylureas and meglitinides.In B.J.Goldstein，等，(Eds.)、Test book of Type-2 Diabetes.Martin DunitzLtd.，London第77-85页(2003))。因此，对饮食成分的控制具有调节血液葡萄糖水平或诱导胰腺β-细胞产生胰岛素的作用。
饮食消费量中脂肪量少和抗氧化剂丰富可减少肥胖症和胰岛素抗性的危险(Blakely，S.，等，J.Nutr.133 2838-2844(2003))。花色素苷属于抗氧化性的多元酚，存在于各种食物和饮料中。花色素苷的消费量与几种退行性疾病例如动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症和糖尿病危险的减小相关(Jayaprakasam，B.，等，Potent lipid peroxidationinhibitors from Withania somnifera.″Tetrahedron 60 3109-3121(2004))。这些化合物是众所周知的游离基清除剂，被报导为有效的化学预防物质(Duthie，G.G.，等，Nutr.Res.Rev.13 719-106(2000))。例如通过食用草莓、樱桃和红酒增加血清的抗氧化能力(Kang，S.Y.，等，Cane.Lett.194 13-19(2003)；Van Velden，D.P.，等，Ann.New YorkAcad.Sci.957 337-340(2002)；和Wang，H.，等，J.Nat.Prod.62294-296(1999))。最近的研究表明花色素苷、花青素3-糖苷减少高脂肪饮食诱导的小鼠肥胖症(Tsuda，T.，等，J.Nut.133 2125-2130(2003))。因此，存在于食物中的天然色素由于它们的安全、营养和治疗价值而吸引消费者(Espin，J.C，等，J.Agri.Food Chem.481588-1592(2000))。由于花色素苷被广泛消费，这些化合物另外的生物学活性将引起极大的兴趣。
山茱萸种属果实是花色素苷的丰富来源。欧亚山茱萸(Cornus masL.)的果实还被称作欧亚山茱萸(European and Asiatic corneliancherry)，在欧洲用于饮料的制备(Millspaugh，CF.，In AmericanMedicinal plants；Dover PublicationsNew York，282(1974))。在传统药物学中，已知山茱萸果实的镇痛和利尿活性(Kim，D.K.，等，Arch.Pharm.Res.21 787-789(1998))。在亚洲国家中山茱萸果实还是几种抗糖尿病草药制剂的主要成分之一(Yamahara，J.，等，Yakugaku Zasshi 101 86-90(1981))。我们对欧亚山茱萸和山茱萸果实的早期研究表明两者均含有高水平的花色素苷(Seeram，N.P.，等，J.Agri.Food chem..50 2519-2523(2002))。
目的因此本发明的目的是提供增加体外或体内胰岛素产生的方法和组合物。从下列描述和附图中进一步的目的将变得更清楚。
发明概述本发明涉及使分泌胰岛素的胰腺细胞增加胰岛素分泌的方法，包含提供用于胰腺β细胞的花色素苷或花色素或其混合物，用来使胰岛素的分泌比没有花色素苷时增加。花色素苷优选从果实、蔬菜和花中分离。优选在该方法中，花色素苷选自以下组花青素-3-糖苷(Cyanidin-3-glycoside)、飞燕草素-3-糖苷(delphinidin-3-glycoside)、花葵素-3-糖苷(pelargonidin-3-glycoside)及其混合物。胰腺细胞可以为体内的。胰腺细胞可以为体外的。优选在该方法中将花色素或花色素苷或其混合物分离和纯化。
本发明还涉及花色素苷或花色素或其混合物作为剂量单位用于增加体内胰岛素从胰腺细胞的产生。
优选在组合物中花色素苷是从果实、蔬菜和花中分离的。优选在组合物中花色素苷选自下组花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。优选在组合物中花色素或花色素苷或其混合物是被分离和纯化的。“糖苷”是指任何含有碳水化合物分子(糖)的化合物，特别是指在植物中任何这样的天然产物，通过水解裂解可转化为糖和非糖成分(糖苷配基)，并且根据含的糖特别命名为糖苷(葡萄糖)、戊糖苷(戊糖)、果糖苷(果糖)等。
花色素苷引起果实、蔬菜和花多种的明亮的颜色包括红色、蓝色和紫色，作为饮食多元酚被消费。含有花色素苷的果实与减少冠心病有关联，且用于抗糖尿病制剂。本发明显示在体外啮齿动物胰腺β细胞(INS-I 813/32)中花色素苷、花青素-3-糖苷(1)、飞燕草素-3-糖苷(2)、花青素-3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)；和花色素、花青素(5)、飞燕草素(delphinidin)(6)、花葵素(7)、锦葵色素(8)，和矮牵牛素(petunidin)(9)刺激胰岛素分泌的能力。所述化合物在4和10mM葡萄糖浓度存在下进行实验。在4和10mM葡萄糖浓度下花色素苷和花色素实验中，花青素-3-糖苷(1)和飞燕草素-3-糖苷(2)是最有效的胰岛素促分泌剂。花葵素-3-半乳糖苷是主要花色素苷之一，它的糖苷配基花葵素，在4mM葡萄糖浓度下导致胰岛素分泌增加1.4倍。所测试的其余的花色素苷和花色素在4和10mM葡萄糖浓度下对胰岛素仅仅有边际影响。
图1是显示花色素苷1-4和花色素5-9结构的图。
图2A显示在4和10mM葡萄糖存在下，被化合物1和2引起的每毫克蛋白胰岛素分泌的量，图2B显示在4和10mM葡萄糖存在下，被化合物5和6引起的每毫克蛋白胰岛素分泌的量。在分析孔中最终DMSO浓度为0.1％。结果被表示为三次或五次独立试验的平均值，对每个样品进行重复分析。使用t-检验通过LSD确定由化合物1、2、5和6引起的胰岛素分泌显著性*(95％或p≤0.05)或**(99％或p≤0.01)。
图3显示在4和10mM葡萄糖浓度下由化合物3、7-9引起胰岛素分泌的图。胰岛素分泌的量对毫克蛋白标准化。在分析孔中最终DMSO浓度为0.1％。结果被表示为三次独立试验的平均值，对每个样品进行重复分析。使用t-检验通过LSD确定由化合物3、7-9引起的胰岛素分泌显著性*(95％或p≤0.05)。
优选实施方案的描述实施例材料和方法化学品。从Invitrogen(Grand Island，NY)获得胎牛血清(FBS)和RPMI-1640介质。使用的所有有机溶剂为ACS试剂级的。用于制备缓冲液的HEPES、青霉素-链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、胰岛素-EDTA、BSA(牛白蛋白；RIA级)、Folin-Ciolatues试剂和化学品从Sigma-Aldrich化学品公司(St.Louis，MO)购买。用于分析的花色素、花青素、飞燕草素、花葵素、锦葵色素和矮牵牛素从Chromadex(Laguna Hills，CA)购买。
花色素苷。飞燕草素-3-糖苷(2)从山茱萸果实中纯化。花青素-3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)从欧亚山茱萸果实中分离。用于该研究的纯的花青素-3-糖苷(1)来自我们在-20℃的储藏品。
花色素苷的分离和纯化。将山茱萸果实与水(pH＝3)混合并过滤。将滤液在柱中通过XAD-16琥珀色树脂，吸收花色素苷的树脂用水(17)反复洗涤。然后用酸性MeOH(pH＝3)洗脱XAD-16树脂，将得到的溶液在减压下浓缩得到粗品花色素苷部分。将该部分通过MPLC柱(C18硅胶)使用MeOH∶H2O(pH＝3)在梯度条件下纯化。用MeOH∶H2O(65∶35，v/v)溶剂系统洗脱花色素苷。化合物的纯度通过HPLC(Waters Corp.)使用Capcell C18分析柱在梯度条件下检验。使用的溶剂为ATFA∶H2O(99.9∶0.1；v/v)和BH2O∶CH3CN∶CH3COOH∶TFA(50.4∶48.5∶1.0∶0.1；v/v/v/v)。梯度在流速0.8ml/min下在26分钟20％B至60％B，在30分钟至20％B。在520nm使用PDA检测峰。
胰岛素分泌研究。将INS-1 832/13细胞(由NC Duke大学的Christopher Newgard博士友好提供)(18)在含有11.1mM葡萄糖和补充有10％FBS(胎牛血清)、10mM HEPES、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640介质中在5％CO2/空气中37℃下常规培养。在分开胰岛素-EDTA后每周传递细胞。为进行静止分泌研究，将细胞以每孔0.64×106细胞的密度放入24孔板中，培养24小时。然后将细胞在含有4mM葡萄糖和上述补充剂的RPMI-1640中再培养24小时。然后将细胞在含有4mM葡萄糖和0.1％BSA的Krebs Ringer Bicarbonate缓冲液(KRBB)中培养两次30分钟。将细胞用KRBB快速洗涤，在含有4或10mM葡萄糖含有或没有指定的花色素苷或花色素中培养60分钟。为确定胰岛素释放然后除去介质。然后将细胞用PBS洗涤两次，溶解在1M NaOH中。然后通过Lowry分析测定细胞内蛋白浓度。将花色素苷和花色素溶解在DMSO中获得所需的浓度。DMSO最终浓度为0.1％。由细胞分泌到介质中的胰岛素通过放射免疫分析测定，对总细胞蛋白标准化。
放射免疫分析(RIA)。RIA试剂盒从LINCO Research Inc.(StCharles，MO)购买，根据生产者的指导进行分析。简要地说，将0.1-10ng胰岛素标准品(100μl)加入12×75mm实验管中。类似地，将来自胰岛素分泌研究的样品(25μl)也加入到实验管中。向其中加入等份(75μl)的分析缓冲液。然后向每个实验管中加入125I标记的胰岛素(100μl)。将100μL等份的抗大鼠胰岛素抗体加入到管中，混合并在4℃培养24小时，进一步用1ml等份的沉淀试剂在4℃培养20分钟以沉淀与抗体结合的胰岛素。然后离心试管，使用γ计数器测定放射活性。
Lowry蛋白分析。在分析孔中蛋白的量通过Lowry方法测定(Francis，J.A.，等，Helv.Chim.Acta 87 317-326(2004))。通过将Lowry溶液、CuSO4.5H2O(1％)和酒石酸钠(1％)混合制备Lowry分析溶液。简要地说，将蛋白样品(100μl)和Lowry混合物(1mL)在实验管(12×75)中混合。向这些管中加入Folin-Ciolatues试剂(100μl)、混合并在室温下培养30分钟。所得到溶液的光密度使用紫外可见分光光度计在700nm读数。
结果和讨论山茱萸果实被用于抗糖尿病中药处方药例如“HachimiGan”(Yamahara，J.，等，Yakugaku Zasshi，101 86-90(1981))中。最近报导了花色素苷在山茱萸果实中的定量(Seeram，N.P.，等，J.Agri.Food Chem.50 2519-2523(2002))。山茱萸果实研究表明它们中的主要生物活性成分是花青素、飞燕草素和花葵素糖苷。因此，我们使用胰腺β细胞集中关注这些花色素苷和它们的糖苷配基的胰岛素分泌能力，以证实在传闻抗糖尿病制剂中山茱萸果实的用途。矮牵牛素、锦葵色素和芍药素糖苷配基也包括在该分析中，因为它们在其它果实中是含量丰富的。
花色素苷为水溶的化合物。欧亚山茱萸果实水溶液萃取物中含有糖、生物类黄酮和花色素苷，因此通过XAD-16树脂分离。从树脂中洗脱得到的花色素苷部分通过MPLC纯化得到纯的花色素苷。在4、10和16mM葡萄糖浓度下，测定由INS-1 832/13细胞葡萄糖-诱导胰岛素的产生，发现在10mM葡萄糖浓度下胰岛素分泌达到停滞期(数据没有给出)。在4mM水平的葡萄糖浓度是人正常葡萄糖水平的代表值(Christison，G.B.，等，Med.Boil.Eng.Comp 31 284-290(1993))。在10mM葡萄糖下细胞每mg蛋白的胰岛素分泌经比较是在4mM葡萄糖浓度下胰岛素分泌的3倍多。
还将花色素苷和花色素在细胞生长介质中在4和10mM葡萄糖负载下测试。花色素苷和花色素最初在50μg/mL浓度下分析。在4mM葡萄糖下花色素苷、花青素3-糖苷(1)显示增加胰岛素分泌达到9ng/mg蛋白(1.3倍)，然而在10mM葡萄糖浓度下其增强胰岛素分泌1.43倍(119ng/mg蛋白)(图2A)。飞燕草素-3-糖苷(2)是活性最强的受试花色素苷，在4mM葡萄糖浓度下显示胰岛素分泌1.8-倍的增加(49ng/mg蛋白)。但是，在10mM葡萄糖下它仅显示出胰岛素产生的1.4-倍(113ng)的增加(图2A)。在该分析中在4和10mM葡萄糖浓度下细胞分泌的胰岛素分别为每mg蛋白27和83ng胰岛素。花色素苷、花青素-3-半乳糖苷(3)和花葵素-3-半乳糖苷(4)在4mM葡萄糖浓度下不增加胰岛素分泌。但是花青素-3-半乳糖苷显示在10mM葡萄糖浓度下17ng胰岛素/mg蛋白(1.2倍)的增加(图3)。由于样品限制，花葵素-3-半乳糖苷(4)仅仅被实验一次。
花色素苷花青素-3-糖苷(1)被评价了在5、10、50、100和250μg/mL浓度下的剂量依赖性胰岛素分泌。用于该分析中的葡萄糖浓度为4mM水平，其是人正常葡萄糖水平的代表值(Christison，G.B.，等，Med.Boil.Eng.Comp.31 284-290(1993))。在该浓度下，未处理的细胞分泌33ng胰岛素/mg蛋白。被花青素-3-糖苷(1)在5μg/mL下处理的细胞分泌胰岛素为46ng胰岛素/mg蛋白。但是，在化合物1浓度10、50、100和250μg/mL下胰岛素分泌没有显著的差异。我们没有足够量的飞燕草素-3-糖苷完成剂量依赖分析。
花色素在50μg/mL浓度下分析。花青素-3-糖苷的糖苷配基，花青素(5)在4mM葡萄糖下增强胰岛素分泌达到1.5倍(29ng/mg蛋白)，然而在10mM葡萄糖下它分泌88ng/mg蛋白(图2B)。在该组分析中，未处理的细胞在4和10mM葡萄糖下分别分泌19和83ng胰岛素/mg蛋白。糖苷配基飞燕草素(6)显示在4mM葡萄糖浓度下增加胰岛素分泌6ng/mg蛋白，不是显著的。飞燕草素在10mM葡萄糖下不显示葡萄糖-诱导的胰岛素分泌(图2B)。花葵素是活性最强的花色素，其在4和10mM葡萄糖下分别分泌49(1.4倍)和91(1.2倍)ng胰岛素/mg蛋白(图3)。糖苷配基矮牵牛素(9)在4mM葡萄糖浓度下增加胰岛素分泌4ng胰岛素/mg蛋白。但是对于未处理的细胞，锦葵色素(8)没有显示增加出胰岛素分泌作用。
报导显示果实和蔬菜尤其是富含多元酚的果实和蔬菜的消费降低2-型糖尿病的发病率(Anderson，R.A.，等，J.Agric.Food Chem.507182-7186(2002)；Anderson，R.A.，等，J.Agric.Food Chem.52 65-70(2004)；和Landrault，N.，等，J.Agric.Food Chem.51 311-3188(2003))。而且，还已知饮食中的抗氧化剂保护胰腺β-细胞免受葡萄糖诱导的氧化应力。花色素苷在果实、蔬菜和加工的产品例如葡萄酒、苹果酒和茶中是含量丰富的；但是，对其降低或预防糖尿病的能力还知之甚少。我们的结果提示花色素苷和花色素都是胰岛素促分泌剂。在它们中最有效的是飞燕草素-3-糖苷，与未处理的细胞比较其在4和10mM葡萄糖浓度下显著诱导胰岛素分泌。尽管花青素-3-糖苷在较低的葡萄糖浓度下比飞燕草素-3-糖苷活性较小，在较高的葡萄糖浓度下它活性更高。在半乳糖苷中，花葵素-3-半乳糖苷在4和10mM葡萄糖浓度下不诱导胰岛素分泌，然而花青素-3-半乳糖苷显示显著的增加胰岛素分泌作用。花色素苷分泌胰岛素能力研究表明按增加的次序是飞燕草素-3-糖苷＞花青素-3-糖苷＞花葵素-3-半乳糖苷。这表明在花色素苷B-环中的羟基数在它们的分泌胰岛素能力中发挥着重要的作用。在受试的花色素中，在4mM葡萄糖下花葵素活性是最高的。其它糖苷配基在4或10mM葡萄糖浓度下不显著增加胰岛素分泌。
本文是通过花色素苷和花色素暴露给胰腺β细胞引起胰岛素分泌的第一个报导。我们的结果提示含有这些花色素苷的山茱萸果实、樱桃和浆果用于预防2-型糖尿病。而且从果实和蔬菜中分离和纯化的花色素苷和花色素可以用于治疗2-型糖尿病。
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花色素苷和花色素的分离和生产方法在美国专利6,194,469；6,423,365；6,623,743；6,676,978和6,656,914；以及2002年2月27日提交的美国专利申请S.N.10/084,575中描述，本文将其全部内容引入作为参考。
前面描述的目的仅仅在于举例说明本发明，本发明只受下文所附的权利要求限制。
权利要求
1.增加分泌胰岛素的胰腺细胞的胰岛素分泌的方法，其包含提供花色素苷或花色素或其混合物给胰腺β细胞以使胰岛素分泌比没有花色素苷时的胰岛素分泌增加。
2.权利要求1的方法，其中花色素苷是从果实、蔬菜和花中分离的。
3.权利要求1的方法，其中花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。
4.权利要求1、2或3任何一项的方法，其中胰腺细胞是在体内的。
5.权利要求1、2或3任何一项的方法，其中胰腺细胞是在体外的。
6.作为剂量单位的花色素苷或花色素或其混合物，用于在体内增加胰岛素从胰腺细胞产生。
7.权利要求6的组合物，其中花色素苷从果实、蔬菜和花中分离。
8.权利要求6的组合物，其中花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷及其混合物。
9.权利要求1的方法，其中花色素或花色素苷或其混合物是被分离和纯化的。
10.权利要求6的组合物，其中花色素或花色素苷或其混合物是被分离和纯化的。
11.权利要求1的方法，其中花色素苷或花色素或其混合物是在果实或蔬菜的汁液中的。
全文摘要
通过花色素和花色素苷刺激胰岛素分泌的方法。所述分泌可以为在哺乳动物包括人的体内，或体外。
文档编号A61K31/70GK1993135SQ200580025636
公开日2007年7月4日 申请日期2005年6月21日 优先权日2004年7月29日
发明者M·G·奈尔, B·亚亚普拉卡萨姆, L·K·奥尔森, S·K·瓦里德 申请人:密执安州大学