作为hiv进入抑制剂和局部杀微生物剂的淀粉－石榴汁复合物的制作方法

专利名称：：作为hiv进入抑制剂和局部杀微生物剂的淀粉－石榴汁复合物的制作方法政府权利本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)GrantPO1HD41761下的美国政府支持下产生的。美国政府可拥有本发明的某些权利。相关申请的交叉引用本申请根据35USC119(e)要求2004年9月21日提交的美国临时申请系列号60/611,778的优先权，该临时申请的全部内容通过引用结合到本文中。
背景技术：
：发明领域本发明涉及可用作HIV-1或HIV-2进入抑制剂和作为局部杀微生物剂的淀粉-石榴汁复合物，以及通过将所述复合物经阴道给予妇女来预防HIV-1或HIV-2感染的方法。
背景技术：
：大约24年来，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)这一大疫病已经夺去大约3千万人生命，在2003年每天造成约14,000例新的人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染病例。约有80％的感染是经异性传播发生的。在没有疫苗的情况下，预期可阻断病毒传播的局部杀微生物剂给控制该疫病提供了希望。抗逆转录病毒化疗药物在工业化国家中已降低了AIDS死亡率，但在发展中国家中只有极微的降低。为防止出现类似的两极分化现象，杀微生物剂应该是可接受的、可取得的、负担得起的和加速从开发到上市的转变。具有确定的安全记录和足够的抗HIV-1活性的已上市药物赋形剂或者食物可提供这一选择。全球AIDS流行病已经无情地持续发生了大约24年，且还看不到有希望的预防性干预措施。2003年有5百万例新HIV感染病例和3百万例AIDS死亡病例[UNAIDSAIDSEpidemicUpdate(December2003)2004[http://www.unaids.org/en/other/functionalities/ViewDocument.asp？href＝http％3a％2f％2fgva-doc-owl％2fWEBcontent％2fDocuments％2fpub％2fPublications％2fIRC-pub06％2fJC943-EpiUpdate2003_en％26％2346％3bpdf]]。到目前为止，伴随HIV-1感染/AIDS而生活的人数已达到4千万人，且如上所述，自从AIDS开始以来已经有大约3千万人死于该疫病[UNAIDSAIDSEpidemicUpdate(December2003)，2004；WHO/SEAROCDSHIV/AIDSEnd-2000globalestimates(Childrenandadults)，2001[http://w3.whosea.org/hivaids/fact.htm#End-2000％20global％20estimates]。大多数新感染病例是通过粘膜途径而获得的，异性传播起了主要(≈80％)的作用。虽然每次未经保护的性交行为的传播发生率估计很低(0.0001-0.004)，但如果涉及到急性感染的个人，则传播发生率显著增加[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Pilcher，C.D.，Tien，H.，Eron，J.J.，Vernazza，P.L.，Leu，S-Y，Stewart，P.W.，Goh，L-E，Cohen，M.S.BriefbutefficientAcuteHIVinfectionandthesexualtransmissionofHIV，J.Infect.Dis.，(2004)，1891785-1792]，其累积效应是势不可挡的。适用于全球免疫计划的抗HIV-1疫苗预期许多年后都不可能获得。因此，急需其它的预防策略。这包括进行教育工作和实施机械和/或化学屏障方法。后一方法对应于杀微生物剂，即设计来在性交前经阴道(也许还可经直肠)施用以阻断HIV-1感染(也许还有其它性传播疾病的传播)的局部制剂[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Stone，A.MicrobicidesAnewapproachtopreventingHIVandothersexuallytransmittedinfections，Nat.Rev.DrugDiscov.，(2002)，1977-985；Shattock，R.，Solomon，S.Microbicides-aidstosafersex，Lancet，(2004)，3631002-1003；Brown，H.Marvellousmicrobicides.Intravaginalgelscouldsavemillionsoflives，butfirstsomeonehastoprovethattheywork，Lancet，(2004)，3631042-1043]。在概念上，优选杀微生物剂制剂的活性成分(1)通过分别防止HIV-1与细胞受体CD4、共同受体CXCR4/CCR5和与树突细胞/游走细胞上的受体(捕捉病毒并将其传播到与病毒复制有直接关系的细胞)的结合，阻断病毒进入易感细胞中[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Moore，J.P.，Doms，R.W.Theentryofentryinhibitorsafusionofscienceandmedicine，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(2003)，10010598-10602；Pierson，T.C.，Doms，R.W.HIV-1entryinhibitorsnewtargets，noveltherapies，Immunol.Lett.，(2003)，85113-118；Davis，C.W.，Doms，R.W.HIVTransmissionClosingalltheDoors，J.Exp.Med.，(2004)，1991037-1040；Hu，Q.，Frank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]，和/或(2)具有杀病毒作用。所述制剂必须不会对靶组织造成不利影响，且在杀微生物剂去除后不应使靶组织变得更易受感染[Fichorova，R.N.，Tucker，L.D.，Anderson，D.J.Themolecularbasisofnonoxynol-9-inducedvaginalinflammationanditspossiblerelevancetohumanimmunodeficiencyvirustype1transmission，J.Infect.Dis.，(2001)，184418-428；Fichorova，R.N.，Bajpai，M.，Chandra，N.，Hsiu，J.G.，Spangler，M.，Ratnam，V.，Doncel，G.F.Interleukins(IL)-1，IL-6andIL-8predictmucosaltoxicityofvaginalmicrobicidalcontraceptives，Biol.Reprod.EpubaheadofprintMay52004[http://www.biolreprod.org/cgi/rapidpdf/biolreprod.104.029603v1]]。用抗逆转录病毒药物进行治疗在工业化国家已经降低了AIDS死亡率，但迄今为止在发展中国家作用甚微[Weiss，R.AIDSunbeatable20yearson，Lancet，(2001)，3572073-2074]。为避免在杀微生物剂上出现类似的两极分化现象，应对杀微生物剂加以设计和选择，使其变得负担得起和可广泛获得，同时使得其研究开发和上市销售之间的时间尽可能缩短。如果具有确立的安全记录的大规模生产产品被发现具有抗HIV-1活性，就会促进这一点。通过分别筛选药物赋形剂(药物剂型的“非活性”成分)和食物的抗病毒性能，也许可以发现有资格被考虑用于杀微生物剂开发的候选者。这个方法已经导致发现1，2-苯二甲酸醋酸纤维素(用于肠溶片剂和胶囊剂的包衣)可作为有希望的候选杀微生物剂[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Lin，K.，Jiang，S.Designofa″microbicide″forpreventionofsexuallytransmitteddiseasesusing″inactive″pharmaceuticalexcipients，Biologicals，(1999)，2711-21；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117；Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Anti-HIV-1activityofcelluloseacetatephthalateSynergywithsolubleCD4andinductionof″dead-end″gp41six-helixbundles，BMCInfect.Dis.，(2002)，26；Neurath，A.R.，Strick，N.，LiY-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.，(2003)，327]。在本文中描述中和至pH≈7以减少酸性引起的非特异性作用的果汁的筛选结果。石榴因其药用性能数千年来一直受到人们的崇拜，且被世界上许多主要宗教认为是神圣的。出于对石榴的崇敬，英国医学会(BritishMedicalAssociation)和几个英国皇家学院(BritishRoyalCollege)在它们的盾徽中描绘了石榴。伦敦皇家医学院(RoyalCollegeofPhysiciansofLondon)早在16世纪中叶就将石榴采用到它们的盾徽中[Langley，P.，WhyaPomegranate？，BMJ，2000，3211153-1154]。文学上对石榴种子的避孕威力的提及，最著名的是希腊经典神话。普西芬尼(Persephone，宙斯之女，被冥王劫持娶作冥后)在冥界时吃了六颗石榴果仁(石榴果仁可制石榴汁)，为此秋冬两季的数月时间里大地万物荒芜。具有讽刺意味的是，本申请证实，石榴汁含有的HIV-1或HIV-2进入抑制剂就对应于一类仍有待开发的抗逆转录病毒药物[Greene，W.C.，ThebrighteningfutureofHIVtherapeutics，Nat.Immunol.，2004，5867-871]。发明概述本发明的目的是提供可用作HIV-1或HIV-2进入抑制剂的淀粉-石榴汁复合物。本发明的又一个目标是预防HIV-1或HIV-2感染。这些目标以及其它目标和优点由本发明来提供。本发明提供包含石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的复合物，活性成分在淀粉为水不溶性形式时吸附到淀粉上。所述复合物能抑制HIV-1或HIV-2感染。所述复合物能阻断HIV-1或HIV-2与CD4受体及CCR5和CXCR4共同受体的结合。本发明还涉及预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括给予人的粘膜药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述包含吸附到淀粉上的石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的复合物。本发明还涉及包含药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述复合物与药物可接受载体的组合的药物组合物。本发明还涉及预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括给予人的粘膜药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的上述药物组合物。附图简述出于说明本发明的目的，提供了附图。但是应认识到，本发明并不受限于附图中图示的明确主题。图1是显示石榴汁(PJ)分别对HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞和U373-MAGI-CCR5E细胞的HIV-1感染的抑制作用的图。阴影区域＝HIV-1IIIB；非阴影区域＝HIV-1BaL。试验了四种不同的石榴汁(PJ1-PJ4)。感染情况通过测量β-半乳糖苷酶来监测。图2是显示石榴汁(PJ)分别对CD4与重组gp120IIIB的结合和与BaL的结合的抑制作用的图。各孔与石榴汁的各稀释液一起37℃下温育1小时。各孔除去石榴汁后进行洗涤，加入生物素基-CD4并用ELISA测量其与各孔的结合情况。图3是显示石榴汁(PJ)对衍自gp120序列的合成肽的抗体与gp120的结合的抑制作用的图。将包被gp120IIIB的聚苯乙烯板的各孔与4倍稀释的石榴汁一起37℃下温育1小时。各孔除去石榴汁后进行洗涤，加入50倍稀释的抗肽抗血清[Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.Syntheticpeptidesandanti-peptideantibodiesasprobestostudyinterdomaininteractionsinvolvedinvirusassemblyTheenvelopeofthehumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)，Virol.，(1992)，1881-13]。用ELISA定量结合的IgG。对照孔不加入石榴汁。绘出了与各对照孔比较的吸光度下降值。图4得自X射线晶体结构，分别显示了对应于在石榴汁存在下与gp120结合被抑制≥50％的抗肽抗体的区段在gp120结构上的位置(阴影区域)，及参与CD4和CXCR4/CCR5共同受体结合的氨基酸残基在gp120结构上的位置。gp120结构的非阴影部分对应于与gp120的附着不被石榴汁显著抑制的抗肽抗体。将中和抗体的CD4结构域和抗原结合片断从gp120-CD4抗体复合物的结构上切除掉[Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.，Hendrickson，W.A.StructureofanHIVgp120envelopeglycoproteinincomplexwiththeCD4receptorandaneutralizinghumanantibody，Nature，(1998)，393648-659](1gc1从蛋白质数据库(pdb)检索到[http://www.rcsb.org/pdb/)]。按文献描述[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-Y，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117]，将通过同源模建产生的V3环添加到结构gp120中。图形由Molscript[Kraulis，P.J.，MOLSCRIPTaprogramtoproducebothdetailedandschematicplotsofproteinstructures，J.Appl.Cryst.，(1991)，24946-950]和Raster3D[Bacon，D.J.，Anderson，W.F.Afastalgorithmforrenderingspace-fillingmoleculepictures，J.Mol.Graphics，(1988)，6219-220；Merritt，E.A.，Bacon，D.J.Raster3DPhotorealisticmoleculargraphics，MethodsEnzymol.，(1997)，277505-524]产生。指示出了gp120可变环(V1-V5)的位置和序列的N末端和C末端的位置。图5是显示来自石榴汁(PJ)的gp120-CD4结合抑制剂在玉米淀粉上的吸附的图。将玉米淀粉(PURITY21，NF级(S21)；200mg/ml)加入到经预过滤除去颗粒物的石榴汁中。在≈20℃下混合1小时后，让淀粉沉淀下来，抽吸除去上清液。将沉淀物重悬(200mg/ml)于磷酸缓冲盐水中。按对图2的描述试验上清液的系列稀释液对CD4与gp120IIIB的结合的抑制作用。然后确认重悬的沉淀物对gp120BaL-CD4结合的抑制活性。对照淀粉不抑制gp120-CD4结合。图6是显示石榴汁(PJ)和PJ-S21分别对gp120IIIB-CD4复合体与表达CXCR4共同受体的细胞的结合的抑制作用的图。将HIV-1IIIBgp120(5μg)和生物素基-CD4(2.5μg)加入到含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)(PBS-BSA)和石榴汁(PJ)(最终3倍稀释)或PJ-S21(67mg)的100μl磷酸缓冲盐水(PBS)中。在20℃下1小时后，将各混合物加入到106MT-2细胞中。30分钟后，用PBS-BSA将细胞洗涤3次，加入PE-链霉亲和素(一种对生物素特异的荧光标记；0.1μg)。20分钟后，将细胞洗涤并用1％甲醛-PBS溶液固定。在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinsonImmunocytometricSystems，SanJose，CA)中进行流式细胞术分析。暴露于gp120-CD4、gp120-CD4+PJ、gp120-CD4+PJ-S21的各细胞和对照细胞的相对荧光值中值分别是13.7、4.0、4.3和2.1。图7显示石榴汁和PJ-S21分别对FLSC与表达CCR5的Cf2Th/synCCR5细胞的结合的抑制作用。FLSC是gp120BaL与CD4的D1D2结构域连接组成的嵌合重组蛋白。用基于细胞的ELISA[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]对抑制作用进行定量。PJ-S21的起始浓度是200mg/ml。图8A和8B是显示PJ-S21对生物素基-gp120IIIB与外周血单核细胞(PBMC)的结合的抑制作用的图。将HIV-1IIIB生物素基-gp120(5μg)加入到含有等级量的(gradedquantitiesof)PJ-S21的100μlPBS-BSA中。在20℃下1小时后，将各混合物加入到106PBMC中。30分钟后，用PBS-BSA将细胞洗涤3次，加入PE-链霉亲和素(0.1μg)。之后采用上文对图6描述的程序。对照细胞和在不存在或存在PJ-S21(100，6.25和3.12mg/ml)下暴露于生物素基-gp120的细胞的相对荧光值中值分别是4.1、81.31、12.2、35.2和50.0。100mg的PJ-S21相当于大约320μg从石榴汁吸附到淀粉上的固形物。图9显示HIV-1IIIB或BaL复制的抑制情况取决于感染前或感染后PJ-S21的加入时间。为进行比较，测定了在HIV-1之后在不同时间间隔加入到细胞中的非核苷类逆转录酶抑制剂TMC-120对感染的抑制作用。病毒感染情况通过对β-半乳糖苷酶的定量来测量。图10是显示PJ-S21及其制剂的HIV-1抑制和杀病毒活性的图。对HIV-1IIIB和BaL感染的抑制情况分别按对图1的描述进行测定。为测量杀病毒活性，将各病毒与等级量的PJ-S21在37℃下混合5分钟。低速离心后，用PEG8000沉淀并离心，来分离病毒。将重悬的沉淀病毒和未处理的对照病毒进行系列稀释，并测定各稀释液的传染性。横坐标上给出的浓度范围相当于0.31-1,268μg从石榴汁吸附到淀粉上的固形物。发明详述本发明的复合物包含淀粉和石榴汁的抗HIV-1或抗HIV-2活性成分，所述成分吸附到水不溶性形式的淀粉上。所述淀粉是能选择性吸附石榴汁的抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的淀粉。本发明的复合物能抑制HIV-1或HIV-2感染。所述复合物因此可充当阻断HIV-1或HIV-2感染的局部杀微生物剂。所述复合物是HIV-1或HIV-2进入抑制剂(即能防止HIV-1或HIV-2进入细胞中)，因为它能阻断HIV-1或HIV-2与CD4受体及CCR5和CXCR4共同受体的结合。通过将100-250mg的淀粉与1ml的石榴汁组合，优选将150-225mg的淀粉与1ml的石榴汁组合，产生所述复合物。可将本发明的淀粉-石榴汁复合物给予男人或女人的粘膜，以预防HIV-1或HIV-2感染。因此，可将所述淀粉-石榴汁复合物应用到身体内表面，如阴道或直肠。给予方式包括局部给予、阴道给予或直肠给予。本发明对于预防性接触如性交过程中的HIV-1或HIV-2感染特别有效。为将本发明复合物给予人，优选它为包含药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的所述复合物和药物可接受载体的药物组合物形式。所述药物可接受载体应优选为这样的载体，它使得本发明的淀粉-石榴汁复合物能以栓剂、水可分散膜剂、水可分散片剂、海绵剂或凝胶剂的形式给予。其中载体是固体的适合直肠或阴道给予的药物制剂，最优选体现为单位剂量栓剂。合适的载体包括名为“FATTIBASE”的脂肪酸栓剂基料(或氢化植物油栓剂基料)、可可脂及本领域常用的其它材料，所述栓剂可方便地通过将本发明的复合物与软化或熔化的载体混合，然后在模子中冷却并成型来形成。通过将冻干的石榴/淀粉复合物与羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)、“PHARMABURST”(一种快速溶解的递送平台，堆积密度为0.450，振实密度为0.536，Carr指数为16.0％，SPIPharma制造)、“CARBOPOL947P”聚合物(Cleveland，OH的Noreon，Inc.制造)和“CARBOPHIL”(美国俄亥俄州Cleveland，OH的Noreon，Inc.制造)组合，可制备粘膜粘附性立即可分散(水可分散)片剂。本发明的复合物可掺入到水可分散膜剂(类似于广泛使用的“breathcontrol”条)中。本发明的复合物也可掺入到在局部施用后会转化成凝胶的水可分散海绵剂中(参见Neurath等，BMCInfect.Dis.，2003，327；美国专利第6,572,875号和美国专利第6,596,297号，这两份专利的全部内容通过引用结合到本文中)。根据本发明使用的药物组合物也可含有其它活性成分，如杀精子剂、抗微生物剂、防腐剂或其它抗病毒剂。本发明的药物组合物也可含有含有添加剂如防腐剂、调味剂(flavor)和香料(fragrance)。这些添加剂可以以任何需要的浓度存在。这些添加剂的浓度将决定于所需的性能、所要释放的药物、功效、所需的剂量、溶解时间等。每一种上述制剂都应符合以下要求(1)使用为递送杀微生物凝胶剂/霜剂所需要的施用器时伴随产生的废物处理问题最小化；(2)简便；(3)小包装，购买、携带和储存时易辨别；(4)低生产成本；(5)易于在全球多个地方进行工业大规模生产；和(6)具有作为直肠杀微生物剂的应用潜力。所述复合物可以以0.5-3g，优选1-1.5g的浓度给予。此外，仍有可能生产出货架期短的基于PJ-S21的凝胶制剂供局部使用，以避免通过适当的低温干燥方法生产PJ-S21干粉的成本。这些制剂无论选择哪一种，都需要有足够的质量控制，以确保成品的抗HIV-1或抗HIV-2活性一致和建立可再现的制造条件。在得出本发明的过程中，用CD4和CXCR4作为细胞受体筛选了各种果汁对HIV-1IIIB的抑制活性。最佳的果汁在以下抑制作用方面经过了试验(1)对HIV-1BaL感染的抑制作用，试验用CCR5作为细胞受体；和(2)对gp120IIIB和gp120BaL分别与CXCR4和CCR5的结合的抑制作用。为除去大部分的果汁有色成分，研究了有效成分与可分散赋形剂和其它食物的吸附作用。对选出的复合物试验了其对原代HIV-1分离物感染的抑制作用。发现来自石榴汁的HIV-1进入抑制剂能吸附到玉米淀粉上。所得的复合物能阻断病毒与CD4和CXCR4/CCR5的结合，抑制原始病毒分化体A-G和O群的感染。本文的结果证明了从安全性经过多个世纪得到证实的、廉价、可广泛获得的来源生产抗HIV-1杀微生物剂的可行性，条件是它的质量得到足够的标准化和监测。石榴汁含有的几种成分[Poyrazoglu，E.，Goekmen，V.，Artik，N.Organicacidsandphenoliccompoundsinpomegranates(PunicagranatumL.)GrowninTurkey，J.FoodCompositionandAnalysis，(2002，15567-575；Module2Phytochemicals(minerals，phytamins，andvitamins)]，其从石榴汁以外的天然产物分离出来，据报告具有抗HIV活性，这些成分例如咖啡酸[Mahmood，N.，Moore，P.S.，Detomassi，N.，Desimone，F.，Colman，S.，Hay，A.J.P.C.InhibitionofHIV-infectionbycaffeoylquinicacid-derivatives.Antivir.Chem.Chemother.，(1993)，4235-240]、熊果酸[Ma，C.，Nakamura，N.，Miyashiro，H.，Hattori，M.，Shimotohno，K.Inhibitoryeffectsofursolicacidderivativesfromcynomoriumsongaricum，andrelatedtriterpenesonhumanimmunodeficiencyviralprotease，PhytotherapyResearch，(1998)，12s138-142]、儿茶酚和槲皮黄酮[Mahmood，N.，Piacente，S.，Pizza，C.，Burke，A.，Khan，A.I.，Hay，A.J.Theanti-HIVactivityandmechanismsofactionofpurecompoundsisolatedfromRosadamascena，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1996)，22973-79；DeTommasi，N.，Piacente，S.，Rastrelli，L.，Mahmood，N.，Pizza，C.Anti-HIVactivitydirectedfractionationoftheextractsofMargyricarpussetosus，PharmaceuticalBiology，(1998)，3629-32]。但是，与来自石榴汁的进入抑制剂不同的是，这些化合物市售获得的纯化形式经本文描述的ELISA测量发现并不能阻断(200μg/ml下)gp120-CD4结合，并且不能吸附到玉米淀粉上。实际上，用淀粉处理石榴汁除去进入抑制剂后的上清液保留有抗HIV-1活性，且与吸附到淀粉上的HIV-1进入抑制剂不同的是，它还能抑制疱疹病毒1型的感染。因此，上清液中的抗病毒活性似乎是非特异性的，可能类似于石榴皮提取物的活性[ReutersNewMedia，IncPomegranatescouldhelpinbattleagainstAIDS，1996Mar10.http://www.aegis.com/news/re/1996/RE960310.html；BritishMuslimsMonthlySurveyMedicalbreakthrough.1996March；IV6[http://artsweb.bham.ac.uk/bmms/1996/03March96.html#Medical％20breakthrough]，但没有作进一步的表征。另外的信息[Jassim，S.A.A.，Denyer，S.P.，andStewart，G.S.A.B.Antiviralorantifungalcompositioncomprisinganextractofpomegranaterindorotherplantsandmethodofuse，美国专利第5,840,308号(1998年11月24日授予)；Shehadeh，A.A.Herbalextractcompositionandmethodwithimmune-boostingcapability，美国专利第6,030,622号(2000年2月29日授予)；Jassim，S.A.A.，Denyer，S.P.，andStewart，G.S.A.B.Antiviralorantifungalcompositionandmethod，美国专利第6,187,316号(2001年2月2日授予)；Jassim，S.A.A.andDenyer，S.P.Antiviralorantifungalcompositionandmethod，美国专利申请2002/0064567(2002年5月30日公布)]揭示，上述发现适用于在可破坏本文所述HIV-1进入抑制剂的条件下高温制备的石榴皮粗提取物。干扰gp120与CD4的结合的抑制剂(图2和5)阻断了gp120上参与和CXCR4/CCR5共同受体(图4、6和7)相互作用的另外位点(图3)。这完全没有预料到，不过可以有这样两种解释，PJ-S21中存在多种具有独特或重叠的特异性的抑制剂，或者诱导了gp120构象变化[Hsu，S-T，Bonvin，A.M.J.J.AtomicinsightintotheCD4binding-inducedconformationalchangesinHIV-1gp120，Proteins，(2004)，55582-593]而导致gp120上的CD4和CXCR4/CCR5结合位点被封锁。对于其它小分子抑制剂也注意到类似的作用[Neurath，A.R.，Strick，N.，Lin，K.，Debnath，A.K.，Jiang，S.TinprotoporphyrinIXusedincontrolofhememetabolisminhumanseffectivelyinhibitsHIV-1infection，AntiviralChem.Chemother.，(1994)，5322-330]。期望候选杀微生物剂同时封闭HIV-1上一个以上的参与病毒进入的位点，以提高其有效性[Hu，Q.，Frank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]。抑制剂的靶位点很可能位于gp120的蛋白质部分当中，因为标记的雪滴花(Galanthusnivalis)凝集素(对末端甘露糖残基特异)[Hammar，L.，Hirsch，I.，Machado，A.A.，deMareuil，J.，Baillon，J.G.，Bolmont，C.，Chermann，J-CLectin-mediatedeffectsofHIVtype1infectioninvitro，AIDSRes.Hum.Retroviruses，(1995)，1187-95]和其它凝集素与gp120寡糖的结合在石榴汁或PJ-S21存在下并没有减少(数据未给出)。已证实通过单克隆抗体或CD4-IgG2重组蛋白封闭HIV-1gp120上的CD4结合位点，足以体外(exvivo)抑制人宫颈组织的HIV-1感染[Hu，Q.，Frank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E.，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，2004，1991065-1075]，阴道施用时防止病毒传播给猕猴[Veazey，R.S.，Shattock，R.J.，Pope，M.，Kirijan，J.C.，Jones，J.，Hu，Q.，Ketas，T.，Marx，P.A.，Klasse，P.J.，Burton，D.R.，Moore，J.P.PreventionofvirustransmissiontomacaquemoneysbyavaginallyappliedmonoclonalantibodytoHIV-1gp120，Nat.Med.，2003，9343-346]。因此，预期PJ-S21将会同样有效。PJ-S21作为局部抗HIV-1杀微生物剂的应用，要求在不同时间和地点生产的各批次之间有合理的一致性。不同的新鲜制备石榴汁和贮藏时间不明的市售石榴汁的gp120-CD4结合抑制活性相似，这提示以上要求是切实可行的。石榴汁在85℃下巴氏灭菌30秒，导致了抑制活性完全丧失。一种市售石榴汁浓缩物暴露于61℃，还有其它两种大概是高温蒸发制备得到的浓缩物，它们的活性都消失或急剧减少。PJ3(添加了果糖和柠檬酸的石榴汁)的gp120-CD4抑制活性未能结合到淀粉上。另外的实验揭示，这些化合物会干扰抑制剂与玉米淀粉的结合。因此，打算用来生产PJ-S21复合物的石榴汁必须通过过滤法灭菌，且不含添加剂。必须特别注意淀粉的选择，以便石榴汁的病毒进入抑制剂的有效结合，而淀粉是阴道制剂中常用的药物赋形剂[Garg，S.，Tambweker，K.R.，Vermani，K.，Garg，A.，Kaul，C.L.，Zaneveld，L.J.D.Compendiumofpharmaceuticalexcipientsforvaginalformulations，PharmaceuticalTechnologyDrugDelivery，(2001)，Sept.14-24.[http://ptech.adv100.com/pharmtech/data/articlestandard/pharmtech/512001/5133/article.pdf]]。在试验过的多种淀粉中，最好的结果是用PURITY21玉米淀粉NF等级(S21)获得的。但是认为不同品牌的淀粉都可能是有效的，所以本发明并不限于S21。对于试验过的其它品牌的淀粉，要么抑制剂的吸附不完全，要么抑制剂的结合并没有导致产生在测量gp120-CD4结合抑制情况的ELISA中具有活性的复合物(ARGO玉米淀粉)，大概是因为石榴汁抑制剂发生了不可逆结合。有趣的是，只有少数参考文献涉及到淀粉作为不同化合物的吸附剂的用途，这些化合物如香料[Yao，W.，Yao，H.Adsorbentcharacteristicsofporousstarch，Starch/Starke，2002，54260-263；Whistler，R.L.Microporousgranularstarchmatrixcompositions，U.S.Patent4,985,082issuedJanuary15，1991]、染料[Berset，C.，Clermont，H.，Cheval，S.Naturalredcoloranteffectivenessasinfluencedbyabsorptivesupports，J.FoodSci.，1995，60858-861，879；Stute，R.，Woelk，H.U.Interactionbetweenstarchandreactivedyes，Newtechniquefortheinvestigationofstarch.II.Influenceoffixationreactionofstarch，Starch/Starke，1974，261-9；Seguchi，M.Dyebindingtothesurfaceofwheatstarchgranules，CerealChemistry，1986，63518-520]、低分子量糖类[Tomasik，P.，Wang，Y-J，Jane，J.L.Complexesofstarchwithlow-molecularsaccharides，Starch/Starke，1995，47185-191]、脂类[Zhang，G.，Maladen，M.D.，Hamaker，B.R.Detectionofnovelthreecomponentcomplexconsistingofstarch，protein，andfreefattyacids，J.Agric.FoodChem.，2003，512801-2805；Johnson，J.M.，Davis，E.A.，Gordon，J.Lipidbindingofmodifiedcornstarchesstudiesbyelectronspinresonance，CerealChemistry，1990，67236-240]、蛋白质[Tomazic-Jezic，V.J.，Lucas，A.D.，Sanchez，B.A.Bindingandmeasuringnaturalrubberlatexproteinsonglovepowder，J.ImmunoassayImmunochem.，2004，25109-123]和碘[Conde-Petit，B.，Nuessli，J.，Handshin，S.，Escher，F.Comparativecharacterizationofaqueousstarchdispersionsbylightmicroscopy，rheometry，andiodinebindingbehavior，Starch/Starke，1998，50184-192]。本发明复合物的预定剂量(例如供阴道施用的PJ-S21)是1.0-1.5g(＝3.17-4.76mg从石榴汁吸附到淀粉上的固形物)，即比在体外阻断HIV-1感染所需的剂量高≥100倍(图10，表1)，因此预期可符合有希望在体内保护免受病毒阴道攻击的要求[Moore，J.，Wainberg，M.，Amman，A.，Veazey，R.，Pope，M.，Shattock，R.J.，Doms，R.W.Developmentoffusion/entryinhibitorsastopicalmicrobicides，InProceedingoftheMicrobicides，(2004)28-31March2004；London[http://www.microbicides2004.org.uk/progtue.html]]。这一PJ-S21量从5-7.5ml的石榴汁，即单份石榴汁(150ml)的≤5％得到，证实了这一建议的候选局部杀微生物剂的安全性、可行性和经济性。实施例现将参考以下非限制性实施例对本发明进行描述。试剂石榴汁(PJ)购自美国纽约州纽约市当地商店；它们的来源在括号中给出PJ1(MadeiraEnterprisesInc.，Madeira，CA)；PJ2在本发明人的实验室中从新鲜成熟的石榴制备得到；PJ3(Sadaf7；Sadaf7Foods，LosAngeles，CA；附加成分果糖、柠檬酸)；PJ4(CortasCanning&RefrigerationCo.S.A.L.，Beirut，Lebanon)；PJ5(Kradjian，Import&WholesaleDistribution，Glendale，CA.，伊朗产品)；PJ6(R.W.Knudson；JustPomegranate；Knudsen&Sons，Inc.，Chico，CA)；PJ7(AromaproductLtd.，美国佐治亚州产品；Tamani，Inc.，NewYork，NY经销)。所用的淀粉如下PURE-DENTB815玉米淀粉NF、PURE-DENTB816玉米淀粉USP、SpressB825预糊化玉米淀粉NF、SpressB820预糊化玉米淀粉NF、INSTANTPURE-COTETMB792食用淀粉-改性、INSCOSITYTMB656食用淀粉-改性(GrainProcessingCorporation，Muscatine，IN)；PURITY21玉米淀粉NF和PURITY826玉米淀粉NF(NationalStarchandChemicalCompany，Bridgewater，NJ)；RemylineAX-DR糯米淀粉和RemyDR稻米淀粉，中级压碎(A&BIngredients，Fairfield，NJ)；ARGO玉米淀粉(BestFoodsDivision，CPCIntemationalInc.，EngelwoodCliffs，NJ)；STALEY食用纯粉状淀粉(Tate&Lyle，Decatur，IL)；STARCH1500预糊化淀粉NF(Colorcon，WestPoint，PA)。使用了以下聚合物聚乙二醇(PEG)1000NF，1500NF和8000NF；羟丙基甲基纤维素(HPMC)，50cps，USP(Spectrum，NewBrunswick，NJ)；Carbopol974P-NF(B.F.GoodrichCo.，Cleveland，OH)；Carbophil，NoveonAA1(Noveon，Inc.，Clevelan，OH)；和PharmaburstB2(SPIPharma，NewCastle，DE)。Fattibase获自PaddockLaboratories，Inc.，Minneapolis，MN。采用了以下重组蛋白HIV-1IIIBgp120，生物素基-HIV-1IIIBgp120，CD4和生物素基-CD4(ImmunoDiagnostics，Inc.，Woburn，MA)；HIV-1IIIBBaLgp120和FLSC(由BaLgp120通过20氨基酸接头与CD4的D1D2结构域连接而组成的全长单链蛋白)(在被转染的293T细胞中产生[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]。藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素获自R&DSystems，Minneapolis，MN。生物素化的雪滴花凝集素获自EYLaboratories，Inc.，SanMateo，CA。抗衍生自gp120的合成肽(残基编号按Neurath，A.R.，Strick，N.，Jiang，S.Syntheticpeptidesandanti-peptideantibodiesasprobestostudyinterdomaininteractionsinvolvedinvirusassemblyTheenvelopeofthehumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)，Virol.(1992)，1881-13)的兔抗体按Neurath等，Virol.，(1992)，1881-13的描述制备。对CD4结合位点特异的单克隆抗体(mAb)588D和对gp120V3环特异的单克隆抗体9284分别获自S.Zolla-Pazner博士和NENResearchProducts，DuPont，Boston，MA。“一般”形式的非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂TMC-120[VanHerrewege，Y.，Michiels，J.，VanRoey，J.，Fransen，K.，Kestens，L.，Balzarini，J.，Lewi，P.，Vanham，G.，Janssen，P.InvitroevaluationofnonnucleosidereversetranscriptaseinhibitorsUC-781andTMC120-R147681ashumanimmunodeficiencyvirusmicrobicides，Antimicrob.AgentsChemother.，(2004)，48337-339]由AlbanyMolecularResearch，Inc.，Albany，NY合成，在对照实验中以5μM终浓度使用。HIV-1IIIB和BaL的1000倍沉淀浓缩物(分别为6.8×1010个病毒颗粒/ml和2.47×1010个病毒颗粒/ml)获自AdvancedBiotechnologies，Inc.，Columbia，MD。原代HIV-1分离物、MT-2细胞、HeLa-CD4-LTR-β-gal和U373-MAGI-CCR5E细胞及Cf2Th/synCCR5细胞获自McKessonBioServicesCorporation，Rockville，MD管理的AIDSResearchandReferenceReagentProgram。用HIV-1长末端重复序列(LTR)-绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因构建物转导、表达CD4受体及CXCR4和CCR5共同受体的CEMx1745.25M7细胞[Hsu，M.，Harouse，J.M.，Gettie，A.，Buckner，C.，Blanchard，J.，Cheng-Mayer，C.IncreasedmucosaltransmissionbutnotenhancedpathogenicityoftheCCR5-tropic，simianAIDS-inducingsimian/humanimmunodeficiencyvirusSHIVSF162P3mapstoenvelopegp120，J.Virol.，(2003)，77989-998]获自CeciliaCheng-Mayer博士。该细胞维持在补加10％胎牛血清(FBS)、1μg/ml嘌呤霉素和200μg/mlG418的RPMI-1640培养基中。这些细胞适合用于滴定X4和R5HIV-1分离物和以可靠的再现性测定抗HIV-1药物的有效性。这用外周血单核细胞(PBMC)是不可能实现的，因为衍自不同个体的外周血单核细胞在对HIV-1感染的易感性方面存在差异[Schwartz，D.H.，Castillo，R.C.，Arango-Jaramillo，S.，Sharma，U.K.，Song，H.F.，Sridharan，G.Chemokine-independentinvitroresistancetohumanimmunodeficiencyvirus(HIV-1)correlatingwithlowviremiainlong-termandrecentlyinfectedHIV-1-positivepersons，J.Infect.Dis.，1997，1761168-1174；Wu，L.，Paxton，W.A.，Kassam，N.，Ruffing，N.，Rottman，J.B.，Sullivan，N.，Choe，H.，Sodroski，J.，Newman，W.，Koup，R.A.，Mackay，C.R.CCR5levelsandexpressionpatterncorrelatewithinfectabilitybymacrophage-tropicHIV-1，invitro，J.Exp.Med.，1997，1851681-1691；Blaak，H.，Ran，L.J.，Rientsma，R.，Schuitmaker，H.SusceptibilityofinvitrostimulatedPBMCtoinfectionswithNS1HIV-1isassociatedwithlevelsofCCR5expressionandbeta-chemokineproduction，Virol.，2000，167237-246]。PBMC按文献描述[Gartner，S.，Popovic，M.Virusisolationandproduction，InTechniquesinHIVResearch，EditedbyAldovini，A.，Walker，B.D.，NewYork；M.，StocktonPress；199053-70]从HIV-1阴性供体分离得到。制剂为尝试将gp120-CD4结合活性与石榴汁的大多数其它成分分离，向每ml石榴汁各加入200mg不同的淀粉制品。在20℃下混合1小时后，倾析掉过量的石榴汁，将沉淀物重悬于1ml蒸馏水中。根据酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，选出PURITY21玉米淀粉，NF等级(S21)作进一步研究，相应的石榴汁复合物标号为PJ-S21。将PJ-S21冻干，用来制备以下制剂PEG栓剂(50％PJ-S21，45％PEG1000，5％PEG1500)；Fattibase栓剂(50％石榴汁-S21，50％Fattibase)；和粘膜粘附性立即可分散片剂(50％PJ-S21，20％HPMC，20％Pharmaburst，7.5％Carbopol974P和2.5％Carbophil)。酶联免疫吸附测定(ELISA)依靠β-半乳糖苷酶读取系统测定分别对HIV-1IIIB和BaL感染的抑制作用[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227]。用MicrolightML2250发光计(DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)，按Galacto-LightPlusSystem化学发光报告基因测定法(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)对酶进行定量。为测量杀病毒活性，通过离心和/或用PEG8000沉淀使病毒与过量的灭活剂分离[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.(2002)，227；Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.(2003)，327]。如上所述试验处理病毒的系列稀释液的传染性。获得了处理病毒和对照病毒的剂量反应曲线(即发光度对稀释度)，并计算出病毒灭活百分比[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YWaterdispersiblemicrobicidalcelluloseacetatephthalatefilm，BMCInfect.Dis.，(2003)，327]。为测定对原代HIV-1毒株感染的抑制情况，将CEMx1745.25M7细胞与100×TCID50的原代HIV-1毒株在不存在或存在等级(graded)浓度的PJ-S21时37℃下温育3天。实验重复进行三次。感染情况通过使用Promega(Madison，WI)的试剂盒在Ultra384发光计(Tecan，ResearchTrianglePark，NC)中测量荧光素酶活性来定量[Hsu，M.，Harouse，J.M.，Gettie，A.，Buckner，C.，Blanchard，J.，Cheng-Mayer，C.IncreasedmucosaltransmissionbutnotenhancedpathogenicityoftheCCR5-tropic，simianAIDS-inducingsimian/hnmanimmunodeficiencyvirusSHIVSF162P3mapstoenvelopegp120，J.Virol.，(2003)，77989-998]。通过ELISA测量CD4-HIV-1gp120结合及其抑制情况。将96孔聚苯乙烯板(ImmulonII，DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)的各孔用100ng/孔的gp120IIIB或gp120BaL包被，并按文献描述[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y.Y.，Debnath，A.K.Celluloseacetatephthalate，acommonpharmaceuticalexcipient，inactivatesHIV-1andblocksthecoreceptorbindingsiteonthevirusenvelopeglycoproteingp120，BMCInfect.Dis.，(2001)，117]进行后包被。将石榴汁和PJ-S21在含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的0.14MNaCl，0.01MTris，0.02％硫柳汞钠，pH7.0(TS)中的稀释液分别加入到各孔中，37℃下保持1小时。将各孔用TS洗涤5x。将生物素基-CD4(1μg/ml)(TS-1％明胶中)加入到各孔中，37℃下保持5小时。用TS-0.1％Tween20洗涤1x和用TS洗涤5x后，加入辣根过氧化物酶(HRP)-链霉亲和素(0.625μg/ml；Amersham，ArlingtonHeights，IL)(TS-2％明胶-0.05％Tween20中)。37℃下30分钟后，将各孔用TS-0.1％Tween20洗涤4x，用TS洗涤2x。用KirkegaardandPerryLaboratoriesInc.(Gaithersburg，MD)的试剂盒检测结合的HRP，在450nm处读取吸光度(A)。吸光度在不存在抑制剂下是1.0-1.5，在不存在生物素基-CD4下是0-0.005。在另一测定中，将CD4(500ng/ml)与生物素基-gp120(1μg/ml)在存在或不存在抑制剂时20℃下混合30分钟。将混合物的系列稀释液加入到用抗CD4mAbOKT4(Ortho-ClinicalDiagnostics，Rochester，NY)包被的各孔中，如上所述用HRP-链霉亲和素检测被捕获的生物素基-gp120。为测量抗gp120肽抗体与gp120的结合情况，将各兔抗血清在含有0.1％Tween20(pH8.0)的FBS和山羊血清混合物(9∶1)中稀释50倍，加入到gp120孔中。用HRP标记的抗兔IgG(Sigma，St.Louis，MO；1μg/ml于TS-10％山羊血清-0.1％Tween20中)检测结合的IgG。用基于细胞的ELISA测量PJ和PJ-S21分别对HIV-1BaLgp120上的CCR5结合位点的封闭情况[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]。简单的说，将FLSC(125ng/ml)在不存在或存在等级量的抑制剂时加入到96孔板各孔中用5％甲醛固定的Cf2Th/synCCR5细胞中。37℃下1小时后，用对CD4D2结构域特异的mAbM-T441(125ng/ml；Ancell，Bayport，MN)检测结合的FLSC，然后依次用生物素化的抗小鼠IgG和HRP-链霉亲和素进行检测。结果石榴汁的抗HIV-1活性试验了各果汁[苹果、黑樱桃、蓝莓、椰子汁、蔓越桔、接骨木、葡萄(红)、葡萄柚、蜂蜜、柠檬、莱母酸橙、菠萝、石榴和甜菜(10％复水干粉)]的系列两倍稀释液对表达CD4和CXCR4受体和共同受体的细胞的HIV-1IIIB感染的抑制作用。除蓝莓汁、蔓越桔汁、葡萄汁和莱母酸橙汁外，大多数果汁(4倍稀释)都没有抑制活性[50％感染抑制(ED50)的终点在1/16-1/64之间]。来自不同地理区域的石榴汁一致地具有最高的抑制活性(图1；阴影区域)。由于利用CCR5作为共同受体的HIV-1病毒(＝R5病毒)以性传播为主[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Shattock，R.J.，Doms，R.W.AIDSmodelsMicrobicidescouldlearnfromvaccines，Nat.Med.，(2002)，8425]，因此重要的是要验证石榴汁是否不但能抑制利用CXCR4作为共同受体的HIV-1IIIB病毒(＝X4病毒)的感染，而且还能抑制HIV-1BaL这种R5病毒的感染。图1中的结果(非阴影区域)显示，后一病毒的感染也被抑制，尽管抑制得不如HIV-1IIIB那么有效。阻断病毒进入是杀微生物剂开发的主要目标[Shattock，R.J.，Moore，J.P.InhibitingsexualtransmissionofHIV-1infection，Nat.Rev.Microbiol.，(2003)，125-34；Moore，J.P.，Doms，R.W.Theentryofentryinhibitorsafusionofscienceandmedicine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2003)，10010598-10602；Pierson，T.C.，Doms，R.W.HIV-1entryinhibitorsnewtargets，noveltherapies，Immunol.Lett.，(2003)，85113-118；Davis，C.W.，Doms，R.W.HIVTransmissionClosingalltheDoors，J.Exp.Med.，(2004)，1991037-1040；Hu，Q.，Frank，I.，Williams，V.，Santos，J.J.，Watts，P.，Griffin，G.E，Moore，J.P.，Pope，M.，Shattock，R.J.BlockadeofattachmentandfusionreceptorsinhibitsHIV-1infectionofhumancervicaltissue，J.Exp.Med.，(2004)，1991065-1075]。因此，有意义的是要测定石榴汁是否抑制HIV-1包膜糖蛋白gp120与CD4(X4病毒和R5病毒的共同受体)的结合。用石榴汁对gp120IIIB和BaL进行预处理，抑制了随后可溶性标记CD4的结合(图2)。这提示一种或多种石榴汁成分与gp120上的CD4结合位点发生强烈或不可逆的结合。在使用固定化在聚苯乙烯板上的gp120的ELISA中获得的这些结果，在其中gp120和CD4均为可溶性形式的另一个试验中得到确认(数据未给出)。在反向实验(reverseexperiment)中，用石榴汁预处理CD4未能阻断随后的gp120结合。其它具有抗HIV-1活性的果汁(蓝莓汁、蔓越桔汁、葡萄汁和莱母酸橙汁)未能阻断gp120-CD4结合。为描绘出gp120上被石榴汁抑制剂封闭的位点，研究了石榴汁对衍生自gp120氨基酸序列的肽的抗体与gp120IIIB结合的抑制作用。抗体与肽的结合(102-126)、(303-338)、(306-338)、(361-392)、(386-417)、(391-425)、(411-445)和(477-508)受到显著(≈50％)抑制(图3)。分别对gp120V3环(残基303-338)和CD4结合位点特异的单克隆抗体9284和588D[Skinner，M.A.，Ting，R.，Langlois，A.J.，Weinhold，K.J.，Lyerly，H.K.，Javaherian，K.，Matthews，T.J.CharacteristicsofaneutralizingmonoclonalantibodytotheHIVenvelopeglycoprotein.AIDSRes.Hum.Retroviruses，(1988)，4187-197；Laal，S.，Zolla-Pazner，S.EpitopesofHIV-1glycoproteinsrecognizedbythehumanimmunesystem，InImmunochemistryofAIDS，ChemicalImmunology，Volume56，EditedbyNorrbyE.BaselKarger；199391-111]与gp120的结合各自被抑制97％。一些相关的肽含有参与CD4结合的残基[Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.，Hendrickson，W.A.StructureofanHIVgp120envelopeglycoproteinincomplexwiththeCD4receptorandaneutralizinghumanantibody，Nature，(1998)，393648-659；Xiang，S.H.，Kwong，P.D.，Gupta，R.，Rizzuto，C.D.，Casper，D.J.，Wyatt，R.，Wang，L.，Hendrickson，W.A.，Doyle，M.L.，Sodroski，J.Mutagenicstabilizationand/ordisruptionofaCD4-boundstaterevealsdistinctconformationsofthehumanimmunodeficiencyvirustype1gp120envelopeglycoprotein，J.Virol.，(2002)，769888-9899；Pantophlet，R.，OllmannSaphire，E.，Poignard，P.，Parren，P.W.I.，Wilson，I.A.，Burton，D.R.FinemappingoftheinteractionofneutralizingandnonneutralizingmonoclonalantibodieswiththeCD4bindingsiteofhumanimmunodeficiencyvirustype1gp120，J.Virol.，(2003)，77642-658]，而所有辨别的肽都包括参与共同受体结合的残基[Westervelt，P.，Gendelman，H.E.，Ratner，L.Identificationofadeterminantwithinthehumanimmunodeficiencyvirus1surfaceenvelopeglycoproteincriticalforproductiveinfectionofprimarymonocytes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1991)，883097-3101；Westervelt，P.，Trowbridge，D.B.，Epstein，L.G.，Blumberg，B.M.，Li，Y.，Hahn，B.H.，Shaw，G.M.，Price，R.W.，Ratner，L.Macrophagetropismdeterminantsofhumanimmunodeficiencyvirustype1invivo，J.Virol.，(1992)，662577-2582；Rizzuto，C.D.，Wyatt，R.，Hernandez-Ramos，N.，Sun，Y.，Kwong，P.D.，Hendrickson，W.A.，Sodroski，J.AconservedHIVgp120glycoproteinstructureinvolvedinchemokinereceptorbinding，Science，(1998)，801949-1953；Cormier，E.G.，Dragic，T.ThecrownandstemoftheV3loopplaydistinctrolesinhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteininteractionswiththeCCR5coreceptor，J.Virol.，(2002)，768953-8957；Suphaphiphat，P.，Thitithanyanont，A.，Paca-Uccaralertkun，S.，Essex，M.，Lee，T-HEffectofaminoacidsubstitutionoftheV3andbridgingsheetresiduesinhumanimmunodeficiencyvirustype1subtypeCgp120onCCR5utilization，J.Virol.，(2003)，773832-3837；Liu，S.，Fan，S.，Sun，Z.StructuralandfunctionalcharacterizationofthehumanCCR5receptorincomplexwithHIVgp120envelopeglycoproteinandCD4receptorbymolecularmodelingstudies，J.Mol.Model(Online)(2003)，9329-336]。图4显示gp120的X射线晶体结构上参与受体/共同受体结合的肽和残基的位置。这些结果提示石榴汁抑制剂也可阻断gp120-共同受体结合。抗HIV-1抑制剂从石榴汁的分离石榴汁着色很深。因此它不能直接配制成杀微生物剂，因为它会沾污衣物，这是不可接受的。尝试了从石榴汁中分离或离析出活性成分。为此断续努力了四年后，发现gp120-CD4结合抑制剂能有效地(≥99％)吸附到选定品牌的玉米淀粉上(图5)，导致产生近乎无色的产物，标号为PJ-S21。PJ-S21悬浮在水或未缓冲的0.14MNaCl中pH为3.2，与阴道的酸性环境相容，在阴道中施用后仍会保持稳定(参见本文)。gp120-CD4结合抑制剂可用乙醇/丙酮5∶4提取而从PJ-S21洗脱出来。提取物干燥后进行重量测定表明，该提取物含有3.17mg固形物/克PJ-S21。由流式细胞术测出，PJ-S21对gp120IIIB-CD4复合物与表达CXCR4细胞的结合的抑制程度和原始石榴汁一样(图6)。类似地，由基于细胞的ELISA测出，gp120BaL-CD4融和蛋白与表达CCR5细胞的结合被石榴汁和PJ-S21抑制[Zhao，Q.，Alespeiti，G.，Debnath，A.K.AnovelassaytoidentifyentryinhibitorsthatblockbindingofHIV-1gp120toCCR5，Virol.，326299-309]；(图7)。因此，PJ-S21是结合细胞受体CD4和共同受体CXCR4/CCR5的X4病毒和R5病毒两者的抑制剂。由流式细胞术测出，PJ-S21还抑制gp120与PBMC的结合(图8A和8B)。为确认PJ-S21起到病毒进入抑制剂的作用，将本发明复合物在HIV-1IIIB和BaL分别感染细胞之前和之后以不同时间间隔加入到细胞中。图9所示的结果证明PJ-S21能干扰病毒复制周期的早期步骤。要考虑PJ-S21作为局部杀微生物剂，则必须将其配制成能经得起在热带环境中贮藏。加速热稳定性研究揭示，PJ-S21的水悬浮液当在60℃下贮藏30分钟和在50℃或40℃下贮藏一个星期时，只分别保持其原始活性的4％、11％和33％(由gp120-CD4结合的抑制情况测量出)。另一方面，PJ-S21干粉在50℃下贮藏12个星期(评估中所用的最长时间)后仍完全保持活性。因此，无水制剂是理想的。制备了三种这样的制剂两种是栓剂(在37℃下熔化)，一种是片剂(其组成在本文中描述)。片剂中在50℃下、栓剂中在30℃下(被认为是能防止发生熔化的最高温度)贮藏12个星期后，PJ-S21抑制活性仍完全得到保持。图10总结的数据显示了PJ-S21及其制剂(除还含有PJ-S21以外的抗HIV-1抑制剂即Carbopol974P[Neurath，A.R.，Strick，N.，Li，Y-YAnti-HIV-1activityofanionicpolymersAcomparativestudyofcandidatemicrobicides，BMCInfect.Dis.，(2002)，227]的片剂外)分别对HIV-1IIIB和BaL感染的抑制作用。与原始石榴汁的抑制活性不同的是，它们对HIV-1IIIB和BaL的抑制活性相似(图1)。这些制剂也能杀病毒，尽管所需浓度比足以抑制感染的浓度要高。这些实验还揭示，PJ-S21在所用的实验条件下没有细胞毒性。PJ-S21在精液(SF)存在下(SF与PJ-S21之比1∶1(w/w))保持抑制/杀病毒活性。杀微生物剂只有具有对抗属于不同病毒分化体和表型的原代病毒分离物的抗病毒活性，才能被认为是潜在成功的。PJ-S21符合这个要求，因为它抑制了具有R5和X4R5(＝双嗜)表型的所有受试分化体的原代HIV-1毒株的感染(表1)。PJ-S21可归类为“AAAAA”候选杀微生物剂，即是可接受的、可取得的、负担得起的和从开发到上市的转变加速的。因此，可以预期PJ-S21能避开与逆转录病毒药物或许还有一些其它候选杀微生物剂有关的一些问题，即与潜在副作用有关的不确定性、为建立廉价的大规模生产所需的投资和时间以及供应的垄断。表1-PJ-S21对原代HIV-1毒株感染的抑制活性原始毒株亚型，所用共同受体ED50*mg/mlED90*mg/ml92RW008A，R50.50±0.052.76±0.2894UG103A，X4R51.42±0.543.42±0.9892US657B，R50.62±0.112.86±0.3393IN101C，R53.56±1.108.87±2.5593MW959C，R51.02±0.193.54±0.9092UG001D，X4R50.62±0.172.94±0.8593THA051E，X4R50.86±0.014.09±0.0893BR020F，X4R54.25±0.788.31±1.04RU570G，R50.42±0.091.54±0.16BCF02O群，R50.59±0.293.92±0.27*ED50(90)＝达到50％(90％)感染抑制的有效剂量一克PJ-S21大约含有3.2mg从石榴汁吸附到淀粉上的抑制剂。应认识到，本说明书是通过举例说明而不是限制的方式阐明的，并且可作出各种修改和变化而不背离本发明的精神和范围。权利要求1.一种包含淀粉和在所述淀粉为水不溶性形式时吸附到所述淀粉上的石榴汁抗HIV-1或抗HIV-2活性成分的复合物，所述复合物抑制HIV-1或HIV-2感染，所述复合物阻断HIV-1或HIV-2与CD4受体及CCR5和CXCR4共同受体的结合。2.权利要求1的复合物，其中所述复合物抑制HIV-1感染。3.权利要求1的复合物，其中所述复合物抑制HIV-2感染。4.权利要求1的复合物，其中所述复合物通过将100-250mg的所述淀粉与1ml的石榴汁组合来产生。5.一种药物组合物，所述组合物包含药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的权利要求1的复合物与药物可接受载体。6.一种在人中预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括给予人粘膜药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的权利要求1的复合物。7.权利要求6的方法，其中所述方法用于预防HIV-1感染。8.权利要求6的方法，其中所述方法用于预防HIV-2感染。9.权利要求6的方法，其中所述给予通过阴道给予来进行。10.权利要求6的方法，其中所述给予通过直肠给予来进行。11.一种在人中预防HIV-1或HIV-2感染的方法，所述方法包括给予人粘膜药物有效抗HIV-1或抗HIV-2量的权利要求5的药物组合物。12.权利要求11的方法，其中所述方法用于预防HIV-1感染。13.权利要求11的方法，其中所述方法用于预防HIV-2感染。14.权利要求11的方法，其中给予0.5-3g的所述复合物。15.权利要求11的方法，其中所述给予通过阴道给予来进行。16.权利要求11的方法，其中所述给予通过直肠给予来进行。全文摘要一种包含淀粉和在淀粉为水不溶性形式时吸附到淀粉上的石榴汁抗HIV－1或抗HIV－2活性成分的复合物。所述复合物抑制HIV－1或HIV－2感染，阻断HIV－1或HIV－2与CD4受体及CCR5和CXCR4共同受体的结合。所述复合物可用于预防HIV－1或HIV－2感染的方法，该方法包括给予人粘膜药物有效抗HIV－1或抗HIV－2量的复合物。文档编号A61K36/185GK101031205SQ200580031371公开日2007年9月5日申请日期2005年9月15日优先权日2004年9月21日发明者A·R·纽拉思,N·斯特里克,李远遥申请人:纽约血液中心有限公司