改善重组蛋白制备的方法和组合物的制作方法

专利名称：改善重组蛋白制备的方法和组合物的制作方法
改善重组蛋白制备的方法和组合物 相关申请的交叉引用本申请要求递交日为2004年10月5日的美国专利申请第 60/616,474号的优先权，在此将其全文引用作为参考。发明背景至少从1980年代的中期就已存在制备重组蛋白的表达载体。通 常，用于重组蛋白表达的基于载体的策略大量地被应用于蛋白制剂绝 对纯度并不重要的基础研究和小规模实验中。相反，当重组蛋白被用 于治疗应用时，即使是少量的污染，例如错误剪接或内含子连读副产 物的存在都会降低所得治疗性蛋白的活性和产量。向患者给药具有错 误剪接或连读蛋白序列的治疗性蛋白会增加不希望的副作用的可能 性。这样的副产物同样也会给生产造成了麻烦。副产物的存在会对纯 化过程造成危害，因为这样的副产物通常在大小，亲合力，或生物活 性方面都与所希望的蛋白非常相似。而且，现已观察到，与所希望的 产物相比较，使用重组宿主细胞按比例放大蛋白表达通常都会导致副 产物量的增加，尤其是如果细胞是在略差于最适细胞培养条件下进行 培养的。这样的非最适细胞培养条件常常出现在大规模蛋白制备中， 例如，在生物发酵罐运行的后期，或者，出于其他的原因，当所述大 规模培养物的健康情况恶化时。因此，需要改进重组蛋白制备，尤其是大规模治疗性蛋白制备的 方法。发明概述本发明提供了改善重组蛋白或肽表达和/或制备的方法和组合物。 在一个实施方案中，提供了经过修饰从而降低或消除错误剪接和/或内 含子连读副产物，和/或增强重组蛋白表达的核酸分子。在某些实施方 案中，所述核酸编码重组抗体(在本文中也可称为免疫球蛋白)，或其片 段。本发明还包括经过修饰从而降低或消除错误剪接和/或内含子连 读副产物和/或从而增强重组蛋白表达的载体(例如，表达载体)；包括 这些核酸分子和载体的宿主细胞，例如，哺乳动物细胞；以及培养这 些细胞从而制备，例如，以大规模制备所述重组蛋白或肽的方法。本 发明还公开了基本上不含有错误剪接和/或内含子连读产物的重组蛋白 或肽，例如抗体的组合物，'例如药物组合物。这些组合物适用于治疗 性用途，包括，例如，神经变性和恶性疾病。特别地，本发明提供了表达用于治疗神经变性疾病的治疗性抗体 的组合物和方法。这些抗体的完整性尤其重要，因此，例如，每单位 剂量的分子治疗活性得以保持且其纯化得以改善。亟待改善这些旨在 具有特化功能蛋白的纯度，从而在治疗某些生物学适应症，例如神经 变性疾病中得以传递和使用，在该疾病中治疗性多肽能透过血脑屏障 (BBB)并结合于大脑中的耙抗原。如本发明所述的示例性抗体是高纯度 制备的，其结合于神经变性疾病靶位，例如，阿耳茨海默氏病的淀粉 样蛋白，即淀粉样-Z3肽(AP)的抗体。因此，在一方面，本发明的特征在于核酸分子(例如，修饰的或重 组核酸分子)，所述核酸分子包括了这样的核苷酸序列，该核苷酸序列 具有一种或多种内含子和外显子序列，与天然存在的基因组序列相比 较，其中至少一种内含子序列被修饰从而增强了蛋白表达和/或降低或 消除了错误剪接或内含子连读(IRT)副产物。在一个实施方案中，所述 核酸分子旨在相对于天然存在序列(例如，基因组序列)，增强所希望的 蛋白或肽，例如，抗体或其片段(例如，免疫球蛋白重链)的表达和/或降低或消除其内含子连读(IRT)副产物。所述蛋白或肽可以是哺乳动物， 例如人或鼠类来源的，通常是人源的。在本说明书中所述的核酸分子 也可理解为来自天然存在的序列的修饰形式。在某些实施方案中，所 述核酸分子是分离或纯化的。在其他实施方案中，所述核酸分子是重 组分子。在一个实施方案中，与天然存在序列(例如，基因组序列)相比，所 述核酸分子具有至少一个，两个，三个内含子或直至除了一个之外的 全部内含子缺失。例如，可从所述天然存在序列中缺失一个能够协助内含子连读(IRT)的内含子。在其他实施方案中，可通过内含子/外显子构型重排(例如，内含子/外显子5'到3'顺序)； 一个或多个内含子部分 的缺失；或用异源内含子序列替换内含子或其部分的方式中的一种多 种对核酸分子进行修饰，由此产生了蛋白表达的增强和/或错误剪接或内含子连读(IRT)副产物的降低或消除。在相关实施方案中，所述核酸分子包括编码抗体重链或其片段的 核苷酸序列(例如，人基因组序列)。例如，所述核苷酸序列可包括编码免疫球蛋白亚型，例如免疫球蛋白G亚型(例如，IgGl， IgG2， IgG3 或lgG4抗体亚型)重链可变区，铰链区，以及第一，第二和第三恒定区 (例如，CH1， Ch2， CH3)的一种或多种核苷酸(例如，外显子)序列。通 常，所述免疫球蛋白亚型来自于哺乳动物来源，例如鼠类或人。在一 个实施方案中，选择的是人IgGl或lgG4，或其突变的形式。例如，免疫球蛋白的恒定区可被突变从而导致以下情况中的一种或多种稳定 性增加，效应器功能降低，或补体结合降低。在一个实施方案中，人 IgG4突变，从而增加了稳定性，例如，在241位残基从丝氨酸替换为 脯氨酸从而增加了铰链区的稳定性。在其他实施方案中，恒定区突变 从而降低了糖基化。在一个实施方案中，对核酸分子进行修饰从而缺失了至少一个协 助内含子连读该序列的内含子。例如，在免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3之间的内含子可被缺失。其他可单独或组合缺失的重链免疫球 蛋白内含子的例子包括重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区CH1之间 的内含子，CH1和铰链区之间的内含子，以及铰链区和免疫球蛋白重链
恒定区CH2之间的内含子。前述内含子的任意组合均可被缺失，包括
上述内含子的两个，三个内含子的组合，或直至除了一个内含子的全 部内含子的组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区的三个内含子，
例如CH1和铰链区之间的内含子，铰链区和CH2之间的内含子，以及 CH2和CH3之间的内含子缺失。以下重链免疫球蛋白内含子缺失的示 例性组合也在本发明的范围之内免疫球蛋白重链恒定区CH1和铰链 区之间的内含子，以及CH2和CH3之间的内含子；CH1和铰链区之间 的内含子，以及铰链区和CH2之间的内含子；铰链区和CH2之间的内 含子，以及Ch2和Ch3之向的内含子。
在一些实施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-Int2-铰链誦Int3-CH2-CH3，
其中VH是编码重链可变区的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是编码对应重链恒定区，例如人IgGl或IgG4 重链基因的天然存在或突变形式的核苷酸序列；
铰链是编码重链恒定区，例如人IgGl或IgG4重链基因的天然存 在或突变形式的铰链区的核苷酸序列；且
Intl， Int2， Int3和Int4是来自重链基因组序列的内含子。在一个 实施方案中，在CH2和CH3之间，在本说明书中以Int4代表的内含子 缺失。在其他实施方案中，在CHl和铰链区之间，在铰链区和CH2之 间，和/或在CH2和CH3之间，在本说明书中以Int2， Int3和Int4代表 的内含子中的一种，两种或通常是三种缺失。其他重链基因组序列的 内含子/外显子排列示意图可见于图1，图5和图7。
通常，在核酸分子中存在有至少一种内含子，例如，在重链可变 区和CHl之间的内含子，在本说明书中以Intl代表。其他可单独或组合存在的重链免疫球蛋白内含子示例包括免疫球蛋白重链恒定区CH1 和铰链区之间的内含子；铰链区和CH2之间的内含子；以及Ch2和CH3
之间的内含子。通常希望的是在所修饰的核酸分子中包括至少一个内 含子。抛开理论的束缚，可认为内含子能够影响蛋白制备过程中的众
多事件，包括转录速率，聚腺苷酸化，mRNA输出，翻译效率以及mRNA 衰亡。
在一个实施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-Int2-铰链-Int3-CH2-CH3，
其中VH是编码重链可变区的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是编码对应重链恒定区，例如人IgGl或IgG4 重链基因的天然存在或突变形式的核苷酸序列；
铰链是编码重链恒定区，例如例如人IgGl或IgG4重链基因的天 然存在或突变形式的铰链区的核苷酸序列；且
Intl， Int2和Int3是来自重链基因组序列的内含子。在一个实施方 案中，所述核苷酸序列基本上由上述的成分组成，例如，没有改变结 构或功能的插入序列。
在其他实施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序
列
VH-Intl-CHl-铰链-CH2-CH3，
其中VH是编码重链可变区的核苷酸序列；
CH1， CH2和CH3是编码对应重链恒定区，例如人IgGl或IgG4 重链基因的天然存在或突变形式的核苷酸序列；
铰链是编码重链恒定区，例如人IgGl或IgG4重链基因的天然存 在或突变形式的铰链区的核苷酸序列；以及
Intl是来自重链基因组序列的内含子。在一个实施方案中，所述 核苷酸序列基本上由上述的成分组成，例如，没有改变其结构或功能 的插入序列。人IgGl的基因组核苷酸序列和对应的氨基酸序列如图8所示(分
别为SEQIDNO: l和2)。编码CHl，铰链区，CH2和CH3的外显子分 别位于图8(SEQ ID NO: l)的约231-524， 916-960， 1079-1408，以及 1506-1829位核苷酸。对应于来自人IgGl重链基因组序列内含子的 Intl， Int2, Int3和Int4分别位于图8(SEQ ID NO: l)的约1-230，约 525-915，约961-1078，和约1409-1505位核苷酸。
突变的人IgG4的基因组核苷酸序列和对应的氨基酸序列如图9所 示(分别为SEQ ID NO: 3和4)。编码CH1，铰链区，CH2和CH3的外 显子分别位于图9(SEQIDNO: 3)的约231-524， 916-952， 1071-1400， 以及1498-1820位核苷酸。对应于来自人IgG4重链基因组序列内含子 的Intl， Int2， Int3和Int4分别位于图9(SEQ ID NO: 3)的约1-230，约 525-916，约953-1070，和约1401-1497位核苷酸。
本发明中修饰的核酸分子的示例包括缺失了人IgGl的CH2和 CH3之间内含子，对应于图S(SEQ ID NO: l)的约1409-1505位核苷酸； 或突变的人IgG4，对应于图9(SEQIDNO: 3)的约1401-1497位核苷酸 的人基因组重链恒定区序列。其他可单独或组合缺失的重链免疫球蛋 白内含子示例包括人IgGl重链可变区和CH1之间的内含子，对应于图 8(SEQ ID NO: l)的约1-230位核苷酸，或突变的IgG4，对应于图9(SEQ ID NO: 3)的约1-230位核苷酸；人IgGl的CH1和铰链区之间的内含 子，对应于图8(SEQIDNO: l)的约525-915位核苷酸；或突变的IgG4， 对应于图9(SEQ ID NO: 3)的约525-916位核苷酸；以及人IgGl铰链 区和CH2之间的内含子，对应于图8(SEQIDNO: l)的约961-1078位 核苷酸；或突变的IgG4，对应于图9(SEQIDNO: 3)的约953-1070位 核苷酸。前述内含子的任意组合均可被缺失，包括上述内含子的两个， 三个内含子的组合，或直至除了一个内含子的全部内含子的组合亦可 被缺失。在一些实施方案中，所述重链恒定区的三个内含子，例如CH1 和铰链区之间的内含子，铰链区和CH2之间的内含子，以及CH2和CH3之间的内含子缺失。在一些实施方案中，所述核酸分子包括在本发明 中公开的人IgGl或IgG4，或基本上与其一致序列的一种或多种外显子 核苷酸序列，以及一种或多种(但不是全部)内含子核苷酸序列。在相关
实施方案中，所述核酸序列具有在本发明中公开的人IgGl或lgG4，或
基本上与其一致序列的一种或多种(但不是全部)内含子核苷酸序列缺 失。
在一个实施方案中，修饰的核酸分子包括编码如图IO(SEQ ID NO: 5)所示的人IgGl或基本上与其一致序列(例如，与SEQIDNO: 5 同一性至少为85%, 90%， 95%或99%的序列，或与SEQIDNO: 5的 核苷酸序列相比，具有l， 5， 10， 50或更多核苷酸改变的序列)的核苷 酸序列。
在另一个实施方案中，修饰的核酸分子包括编码如图ll(SEQ ID NO: 6)所示的人IgG4或基本上与其一致序列(例如，与SEQIDNO: 6 同一性至少为85%， 90%， 95%或99%的序列，或与SEQIDNO: 6的 核苷酸序列相比，具有l, 5， 10, 50或更多核苷酸改变的序列)的核苷 酸序列。
修饰的核酸分子可包括编码轻链和重链抗体或免疫球蛋白序列的 核苷酸序列。这些序列可存在于同一核酸分子(例如，同一表达载体) 中，或者，可在分别的核酸分子(例如，分别的表达载体)中得以表达。 通常，编码的抗体或免疫球蛋白或其片段可包括至少一条，且优选为 两条全长重链，以及至少一条，且优选为两条轻链。或者，编码的免 疫球蛋白或其片段可仅包括抗原结合片段(例如，Fab， F(ab')2， Fv或 单链Fv片段)。抗体或其片段可以是单克隆或单独特异性抗体。抗体或 其片段还可以是人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，CDR-接枝抗体，或 体外生成的抗体。在又一个实施方案中，所述抗体具有选自，例如， IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgM, IgAl， IgA2， IgD和IgE的重链恒定 区；更特别地，选自，例如IgGl， IgG2， IgG3和IgG4的重链恒定区。在其他实施方案中，所述抗体具有选自，例如，K或入的轻链。
在其他实施方案中，所述核酸分子包括可变区，例如，人源化的， 嵌合的，CDR-接枝的或体外生成的可变区。通常，可变区特异性的结 合于预定的抗原，例如，与疾病，例如神经变性或恶性疾病关联的抗 原。
在一个实施方案中，所述疾病是神经变性疾病，且所述抗体结合
于淀粉样蛋白，例如A0肽(例如，人A/5肽)。例如，所述抗体可以是 针对于A/3肽的人源化抗体，其含有来自鼠类抗体一个或多个互补决定 区(CDR)的重链和轻链区，所述鼠类抗体例如鼠抗A/5 3D6抗体，或鼠 抗A/3 12A11抗体，或鼠抗A/3 10D5抗体，或鼠抗A/3 12B4抗体。人 源化抗体的可变区通常包括人或基本上是人的框架区。在一个实施方 案中，所述核酸分子包括人源化抗A/3-肽抗体的重链和轻链可变区。
在另一方面，本发明的特征在于载体(例如，表达载体)，所述载体 包括一种或多种前述的修饰核酸分子。所述载体可额外地包括能够增 强宿主细胞中复制，选择，mRNA转录，mRNA稳定性，蛋白表达 或蛋白分泌的一种或多种情况的核苷酸序列。例如，所述载体可包括 负责复制或增强子表达，增强子启动子元件的核苷酸序列，编码引导 序列的核苷酸序列，编码选择性标记(例如，DHFR)的基因，内部核糖 体进入位点序列(IRES)，和聚腺苷酸化序列。
在另一方面，本发明提供了包括一种前述核酸分子和/或载体，例 如表达载体的细胞，例如，真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞(例如， 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
在另一方面，本发明提供了增强重组蛋白或肽，例如，抗体的表 达的方法，或与参考序列，例如天然存在基因组序列相比，具有降低 水平(例如，基本上没有)的错误剪接和/或内含子连读产物的重组蛋白或肽的表达，例如抗体的表达的方法。本方法包括如本申请所述的向 宿主细胞，例如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)引入核酸分子；在允 许表达重组蛋白或肽的条件下培养所述宿主细胞，由此制备了宿主细 胞的培养物；且任选，从宿主细胞的培养物(例如，宿主细胞上清液) 中获得，例如，纯化处所述重组蛋白或肽。
所述方法还包括在核酸样品，例如来自宿主细胞的mRNA样品中， 鉴定IRT或IRT产物(例如，检测和/或测定其水平)的步骤，在允许所 述核酸样品和探针杂交的条件下，将所述核酸样品与互补于内含子和 邻近的外显子序列，或者与互补于邻近外显子序列的核酸探针接触； 检测所得复合物，例如，通过PCR扩增所述探针序列。在含有互补于 内含子序列核酸探针的样品中，复合物，例如，PCR扩增产物的检出 说明了 IRT或IRT产物的存在。IRT产物的水平可根据，例如，实施 例1中的描述来定量。
在另一方面，本发明提供了制备与标准参考，例如天然存在基因. 组序列相比，具有降低(例如，基本上没有)的内含子连读(IRT)重链副 产物的抗体或其片段的方法。本方法包括在允许重链和轻链表达，以 及，任选，可操作连接的条件下，培养含有如本申请所述核酸分子， 以及，任选，编码抗体轻链核酸的细胞，例如哺乳动物细胞(例如，CHO 细胞)。任选，可从细胞培养物中纯化抗体或其片段。通常，所述抗体， 或其片段，具有降低的错误剪接或内含子连读(IRT)重链副产物。
本方法还包括在样品，例如，来自宿主细胞的mRNA样品中检测 和/或测定IRT或IRT产物水平的步骤；在允许所述核酸样品和探针杂 交的条件下，将所述核酸样品品与互补于内含子和邻近外显子序列， 或者与互补于邻近外显子序列的核酸探针接触；检测所得复合物，例 如，通过PCR扩增所述探针序列。在含有互补于内含子序列核酸探针 的样品中，复合物，例如，PCR扩增产物的检出说明了 IRT或IRT产 物的存在。IRT产物的水平可根据，例如，实施例l中的描述来定量。在另一方面，本发明提供了通过从所述序列缺失一个协助IRT的
内含子，来降低从基因组重链序列表达的内含子连读(IRT)重链副产物
的方法。
在又一方面，本发明的特征在于在样品，例如核酸样品中鉴定IRT
或IRT产物(例如，检测和/或测定其水平)的方法。该方法包括从细
胞，例如重组细胞(例如，如本发明所述的宿主细胞)获得核酸样品，例
如，mRNA样品；在允许所述核酸样品和探针杂交的条件下，将所述 核酸样品与互补于内含子和邻近外显子序列，或者与互补于邻近外显 子序列的核酸探针接触；检测所得复合物，例如，通过PCR扩增所述 探针序列。在含有互补于内含子序列核酸探针的样品中，复合物，例 如，PCR扩增产物的检出说明了 IRT或IRT产物的存在。IRT产物的 水平可根据，例如，实施例l中的描述来定量。
在又一方面，本发明的特征在于，与参考，例如，天然存在的基 因组序列相比，按照本发明公开方法制备的抗体(例如，重组抗体)或其 片段具有降低的(例如，基本上不含有)错误剪接和/或内含子连读产物。 在一个实施方案中，所述抗体或其片段是嵌合的，人源化的，CDR-接 枝的或体外生成的。通常，所述抗体或其片段具有特异性结合于预定 的抗原，例如，与疾病，例如神经变性或恶性疾病关联抗原的可变区。
在又一方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其含有重 组蛋白或肽，例如抗体，该抗体与参考，例如，天然存在的基因组序 列相比，具有降低的(例如，基本上没有)错误剪接和/或内含子连读产
物，的；以及药物可接受的载体。这些组合物适用于治疗性用途，包 括，例如，治疗神经变性疾病。
根据以下详细说明和权利要求可使得本发明的其他特征和优点显 而易见。


图1所示为从含有3D6 IgG基因的表达载体中转录出来的预期前
mRNA(顶部)以及正确剪接mRNA(中间)和内含子连读mRNA(底部)。
图2所示为指明了基因组5'和3'剪接接头(SEQIDNO: 7)的跨越 了 3D6重链表达载体CH2和CH3恒定区之间内含子(称为第四内含子) 的核酸序列。还示出了得自正确(SEQIDNO: 8)和不正确(SEQIDNO: 9)剪接mRNA的多肽预测的部分氨基酸序列。所述RNA剪接接头由实 心双线示出。
图3是用来评估3D6重链基因转录总水平(含有mRNA转录本的 CH2的水平)和内含子4连读转录水平的定量-聚合酶链反应(Q-PCR)探 针的示意图。
图4是说明含有含有内含子4的转录本的持续累积随培养时间和 蛋白表达诱导的变化而变化的条线图。
图5所示为3D6内含子和外显子的基因组排列以及用于开发解决 内含子连读转录表达载体中的修饰排列。
图6所示为说明在用修饰表达载体转化的细胞系中缺乏内含子连 读重链副产物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)图。
图7所示为在重链基因组构建体，缺失了最后三个内含子序列的 构建体，以及不含有内含子的cDNA构建体中的内含子和外显子的排 列。
图8所示为人IgGl的基因组核苷酸和对应的氨基酸序列(分别为 SEQIDNO:l和2)。编码(^1，铰链区，CH2禾n CH3的外显子分别位于 (SEQ ID NO: l)的约231-524， 916-960， 1079-1408，以及1506-1829 位核苷酸。对应于来自人IgGl重链基因组序列内含子的Intl，Int2，Int3 和Int4分别位于(SEQIDNO: l)的约1-230，约525-915，约961-1078， 和约1409-1505位核苷酸。
图9所示为人IgG4的基因组核苷酸序列和对应的氨基酸序列(分 别为SEQIDNO: 3和4)。编码&1，铰链区，CH2和CH3的外显子分 别位于(SEQ ID NO: 3)的约231-524， 916-952， 1071-1400，以及1498-1820位核苷酸。对应于来自人IgG4重链基因组序列内含子的 Intl， Int2， Int3和Int4分别位于(SEQ ID NO: 3)的约1-230，约525-916， 约953-1070，和约1401-1497位核苷酸。
图10所示为缺失了恒定区CH2和CH3之间内含子的人IgGl的 基因组核苷酸序列(SEQIDNO: 5)。
图11所示为具有以下内含子缺失的修饰的人IgG4基因组核苷酸 序列(SEQIDNO: 6): CH1和铰链区之间的内含子，铰链区和CH2之 间的内含子，以及CH2和CH3之间的内含子。
图12-设定了针对各种其他3D6， 10D5， 12B4和266抗体的重链 氨基酸序列。
图-设定了针对各种其他3D6， 10D5， 12B4和266抗体的重链 氨基酸序列。
发明的详细描述
已采用了多种方法对表达载体进行设计和构建，而在得到合理的 蛋白水平之前，这样的过程通常都需要相当的试错试验。在设计过程 中的一个重要的考虑就是在所述载体的构建中使用内含子序列。在一 个方法中，可将整个基因序列就如同其天然存在的-含有全部内含子和 外显子序列元件的情况进行利用。在这样的情况下，可预期在该细胞 内的转录后剪接机制会对内含子序列进行剪切，从而产生仅含有所述 基因外显子序列的成熟mRNA。另一种方法是利用仅对应于所述基因 cDNA的序列。在这种情况下，预测不会发生剪接事件，而且所述前 -mRNA序列也基本上与编码蛋白成分中的mRNA序列相同。在第三种 情况下，载体构建涉及选择和放置在正常情况下未与原始基因序列相 联的内含子。
内含子序列对载体内表达基因序列的作用尚未完全了解。有报道 认为，内含子可影响蛋白制备过程中的众多事件，包括转录速率，聚 腺苷酸化，mRNA输出，翻译效率，和mRNA衰亡(Nott等(2003) RNA 9:607-617)。在mRNA表达的环境中，在考虑到内含子对从载体产生蛋白的结果时，目前还没有明确的可预测性。例如，以前有多种报道认
为，包括有多种内含子序列可引起表达大幅度增加，对mRNA表达没 有作用，或可降低mRNA表达(Berg等人(19S8) Mol. Cell. Biol. 8:4395-4405; Bourdon等人(2001) EMBO Rep. 2:394-398)。因为绝大多 数真核基因都含有内含子，所以，在缺乏不希望连读副产物的条件下 以高水平表达含有内含子的基因并与所述外显子序列具有高度一致性 的系统的开发，可显著地帮助蛋白表达系统的可预测发展。
虽然与内含子序列关联的不可预测性阻碍了可靠的表达载体设 计，但是，当感兴趣的蛋白具有可接受遗传工程技术的模式时，还是 能够获得显著的设计益处。抗体就提供了一个这样的例子，其中所包 含的内含子序列可协助表达载体的设计。
以下对某些用于本说明书和权利要求的术语进行了定义。
在本文中，术语"内含子"包括经过转录的，但却从RNA转录本 中通过将序列(外显子)两端的任一端拼接在一起而被去除的DNA片 段。内含子被认为是基因的蛋白编码区内的干扰序列，且通常不含有 由该基因产生的蛋白所代表的信息。
术语"外显子"包括呈现在含有干扰序列的基因的成熟RNA产物 中的任意片段。外显子含有被翻译成蛋白的基因内部的信息。
术语"前-mRNA"包括通过RNA聚合酶从转录的基因中得到的 初始RNA产物。设计成前-mRNA的RNA同时含有内含子和外显子序 列，且因此未被细胞的剪接机制处理。
术语"mRNA"包括经过处理去除了内含子，且能够被翻译成多 肽的RNA转录本。术语"剪接"包括发生在真核细胞核内的细胞事件，其中内含子
被从前-mRNA类型中去除。 一般地，该过程需要剪接酶体复合物的形 成，其中5'剪接供体位点被带到3'剪接受体位点附近，同时从所述转 录本中去除干扰内含子序列。
术语"载体"包括核酸构建体，其通常含有感兴趣的基因并且还 含有在宿主细胞中复制和/或转录核酸所必需的最基本元件。这样的构 建体可作为染色体外元件存在或可整合入宿主细胞的基因组。
术语"内含子连读"("IRT")是指这样的过程，在该过程中异常 剪接的前-mRNA转录本产生了大小或氨基酸组成发生变化的蛋白或 肽。考虑到从该错误剪接转录本产生的最终蛋白，可能会产生不同的 结果。例如，可能会出现比预测蛋白更大的蛋白或具有不正确终止密 码子的蛋白，在这样的情况下，所述蛋白可能会分别比预测的蛋白更 长或更短。此外，所述蛋白还可具有不正确或额外的残基，这些残基 可协助用于糖基化，肉豆蔻酰化，磷酰化，泛素化，或其他翻译后修 饰的蛋白修饰。
术语"内含子连读副产物"是指从内含子连读所得的异常剪接 mRNA翻译而来的蛋白或肽，例如，具有不可预测大小或氨基酸组成 的蛋白质。内含子连读副产物可以比由已知氨基酸序列的基因预测的 和/或由该基因的cDNA预测的多肽更短或更长。内含子连读副产物还 可与从所述基因正确剪接mRNA所产生的已接受分子量的蛋白具有相 差甚远的分子量。而且，术语"内含子连读副产物"还包括从与感兴 趣蛋白非正常关联的蛋白水解加工事件中产生的蛋白，所述蛋白水解 加工可由于内含子-外显子-接头的连读而从阅读框移动的蛋白产物中 潜在地发生。
术语"重链副产物"是指从内含子连读产生的异常剪接免疫球蛋 白重链mRNA翻译而来的多肽，例如，具有不可预测大小或氨基酸组成的重链蛋白。重链副产物可以比由免疫球蛋白的已知氨基酸序列预
测的和/或由该基因的cDNA预测的多肽更短或更长。重链副产物还可 与从所述重链基因正确剪接mRNA所产生的已接受分子量的蛋白具有 相差甚远的分子量。而且，术语"重链副产物"还包括从与所述蛋白 非正常关联的蛋白水解加工事件中产生的多肽。
术语"天然存在序列"或"天然存在基因组序列"是指在自然或 天然状态下发现的内含子和外显子基因构造。可以在，例如，其天然 染色体位置或其克隆至载体中的位置发现天然存在序列，只要保留所 述序列的内含子和外显子构造。
术语"免疫球蛋白"或"抗体"(在本文中可交替使用)是指具有由 两条重链和两条轻链组成的4-条多肽链结构的蛋白，可通过，例如， 链间二硫键稳定所述链，其中所述免疫球蛋白或抗体具有选择性或特 异性结合于抗原的能力。
术语A^免疫球蛋白或A^-抗体是指选择性或特异性结合A/3肽的 抗体。
术语"单链免疫球蛋白"或"单链抗体"(在本文中可交替使用) 是指具有由一条重链和一条轻链组成的2条-多肽链结构的蛋白，可通
过，例如，链间肽接头稳定所述链，其中所述免疫球蛋白或抗体具有 特异性结合于抗原的能力。
术语"免疫球蛋白或抗体结构域"是指在重链或轻链多肽内的球 状区域，该区域包括通过，例如/3-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环 (例如，包括3-4肽环)。在本申请中，结构域被进一步称为"恒定的" 或"可变的"，其中术语"恒定的"是指在"恒定"结构域的情况下， 各种组件的结构域之内相对缺乏序列变异，而其中术语"可变的"是 指在"可变"结构域的情况下，各种组件的结构域之内的显著变化。在本领域中，抗体或多肽"结构域"经常可被交替地称为抗体或多肽 "区"。抗体轻链的"恒定"结构域可被交替地称为"轻链恒定区"， "轻链恒定结构域"，"CL"区或"CL"结构域。抗体重链的"恒定"
结构域可被交替地称为"重链恒定区"，"重链恒定结构域"，"CH"
区或"CH"结构域。抗体轻链的"可变"结构域可被交替地称为"轻 链可变区"，"轻链可变结构域"，"VL"区或"VL"结构域。抗体 重链的"可变"结构域可被交替地称为"重链可变区"，"重链可变 结构域"，"VH"区或"VH"结构域。
术语"区"还指抗体链或抗体链结构域的零件或部分(例如，如本 说明书中所定义的，重链或轻链的零件或部分，或恒定或可变结构域 的零件或部分)，以及所述链或结构域的更分散的零件或部分。例如， 如本说明书所定义的，轻链和重链或轻链和重链可变结构域包括散落 在"结构区"或"FRs"之间的"互补决定区"或"CDRs"。
免疫球蛋白或抗体可以与单体或多聚体形式存在，例如，以五聚 体形式存在的IgM抗体，和/或以单体，二聚体或多聚体形式存在的IgA 抗体。术语"片段"是指抗体或抗体链的零件或部分，其包括比完整 或全部抗体或抗体链更少的氨基酸残基。可通过对完整或全部抗体或 抗体链进行化学或酶学处理获得片段。还可通过重组的方式获得片段。 示例性的片段包括Fab， Fab'， F(ab')2， Fabc，禾d/或Fv片段。术语"抗 原结合片段"是指结合抗原或与完整抗体(即，与从所述完整抗体得到 的)竞争抗原结合(即，特异结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。
术语"构象"是指蛋白或多肽的三级结构(例如，抗体，抗体链， 及其结构域或区)。例如，短语"轻(或重)链构象"是指轻(或重)链可变 区的三级结构，而短语"抗体构象"或"抗体片段构象"则是指抗体 或其片段的三级结构。术语"构象"还可以指从一条或若干条蛋白或 肽链的三维关系所得的四级结构。与抗原决定簇相比，短语"构象表 位"是指包括以极其邻近存在的一或数个蛋白内的氨基酸特定空间排布的抗原决定簇。考虑到抗体的多功能性质(即，IgG分子能够同时结 合于不止一个蛋白分子上的若干表位的能力)，抗体被认为是具有结合 由若干氨基酸链组成的构象表位的内在性质。例如，形成斑的A口的沉 淀提供了构象表位，其中一种抗体可以结合若干邻近放置的A口肽。
可通过重组DNA技术，或通过对完整的免疫球蛋白进行酶学或化 学剪切制备结合片段。结合片段包括Fab， Fab'， F(ab，)2， Fabc， Fv， 单链和单链抗体。除了 "双特异性"或"双功能"免疫球蛋白或抗体， 免疫球蛋白或抗体可被理解为每个结合位点都是一致的。"双特异性" 或"双功能抗体"是人造杂合抗体，其具有两对不同的重/轻链配对以 及两种不同的结合位点。可通过包括杂交瘤融合或连接Fab'片段的多 种方法来制备双特异性抗体。可参见，例如，Songsivilai和Lachmann， Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny等，J. Immunol. 148， 1547-1553 (1992)。
抗体的"特异性结合"或"选择性结合"是指抗体表现出的对特 定抗原或表位的显著亲合性，而且，通常并不表现出显著的交叉反应 性。"显著的"或优选的结合包括以至少106， 107， 108， 1(^M-1或101GM—1 的亲合性结合，大于1(^M—1，优选为大于108M—i的亲合性是更优选的。 在本说明书中设定的值的中间值也包含在本发明的范围之内，同时， 优选的结合亲合性可以亲合力的范围进行表示，例如，10、10"M—1，优 选为10LlO"M—1，更优选为10S-101QM"。"未表现出显著交叉反应性" 的抗体是不能显著结合于不希望实体(例如，不希望的蛋白质样的实体) 的抗体。例如，特异性结合于的抗体可以显著地结合于A/3，但不 与非-A/3蛋白或肽(例如，包括于斑内的非-A/3蛋白或肽)显著反应。对 特定的表位具有特异性的抗体， 一般不会，例如，与在相同蛋白或肽 上的远端表位显著的交叉反应。在示例性的实施方案中，所述抗体并 未表现出交叉反应性(例如，并未与非-A^ 肽或与A/ 上的远端表位交叉 反应)。可根据任意本领域所认可的确定这种结合的方式来确定特异性 的结合。优选地，可根据Scatchard分析和/或竞争性结合分析来确定特异性结合。
术语"显著同一性"是指两条序列，例如，两条多肽序列，当进
行最佳比对时，例如通过使用默认缺口权重的GAP或BESTFIT程序时， 其享有至少50-60%的序列同一性，优选为至少60-70%的序列同一性， 更优选为至少70-80%的序列同一性，更优选为至少80-90%的同一性， 甚至更优选为至少90-95%的同一性，且甚至更优选为至少95%的序列 同一性甚至更高的同一性(例如，99%的序列同一性或更高)。术语"相 当的一致性"或"基本上一致"是指两条序列，例如，两条多肽序列， 当进行最佳比对时，例如通过使用默认缺口权重的GAP或BESTFIT 程序时，其享有至少80-90%的序列同一性，优选为至少卯-95%的序列 同一性，且更优选为至少95%的序列同一性甚至更高的同一性(例如， 99%的序列同一性或更高)。对序列比较而言，通常将一条序列作为参 考序列，将检测序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将检测 和参考序列输入计算机，如果需要的话，指定次级序列坐标，并指定 序列算法程序参数。序列比较算法随后根据所制定的程序参数，计算 出与参考序列相比，检测序列的序列同一性百分数。
可通过，例如，Smith和Waterman的本地同源性算法，Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)， Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J Mol. B';ol. 48:443 (1970)，对Pearson和Lipman的寻找类似性方法，Proc. Nat，l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)，这些算法的计算机应用(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP, BESTFIT， FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison， WI)， 或通过目 视检查(一般参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology) 来进行序列比较的最佳比对。适用于确定序列同一性百分数和序列相 似性的算法示例之一就是BLAST算法，该算法可见于Altsclml等，J. Mol. Biol. 215:403 (1990)的描述。进行BLAST分析的软件可通过国家 生物工程信息中心(科通过国立卫生院的NCBI互联网服务器公开获得) 公开获得。通常，可使用默认的程序参数实施序列比较，尽管也可以使用自定义的参数。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用了字长(W) 为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62计分矩阵的默认参数(参见， Henikoff & Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))。
优选地，不一致的残基位置会随保守氨基酸的取代而有所不同。 出于将氨基酸取代分为保守或不保守的目的，可将氨基酸进行如下分 类I类(疏水侧链)leu， met， ala， val， leu， ile; II类(中性亲水侧链) cys， ser， thr; III类(酸性侧链)asp， glu; IV类(碱性侧链)asn， gln， his， lys， arg; V类(影响链方向的残基)gly， pro;和VI类(芳香侧链) trp， tyr， phe。保守性取代涉及在相同类氨基酸之间的取代。非保守性 取代则包括将这些氨基酸种类中的氨基酸与另一种类中的氨基酸进行 交换。
抗体
本发明的方法可适用于各种抗体制备过程，其中可检测出多余或 不希望的副产物。特别地，所述方法可适用于重组抗体，例如嵌合或 人源化单克隆抗体的制备，其中所制备抗体的序列是已知的。
术语"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗体"是指包括至少一种 人源化免疫球蛋白或抗体链(g口，至少一种人源化轻链或重链)的免疫球 蛋白或抗体。术语"人源化免疫球蛋白链"或"人源化抗体链"(即， "人源化免疫球蛋白轻链"或"人源化免疫球蛋白重链")是指具有可 变区的免疫球蛋白或抗体链(即，分别为轻链或重链)，其包括基本来自 人免疫球蛋白或抗体可变框架区，以及基本来自非-人免疫球蛋白或抗 体的互补决定区(CDRs)(例如，至少一个CDR，优选为两个CDR，更 优选为三个CDR)，而且还包括恒定区(例如，在轻链的情况下，至少 一个恒定区或其部分，在重链的情况下有选为三个恒定区)。术语"人 源化可变区"(例如，"人源化轻链可变区"或"人源化重链可变区") 是指这样的可变区，其包括基本来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架 区以及基本来自非-人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDR)。短语"基本来自人免疫球蛋白或抗体"或"基本上为人的"是指， 当出于比较目的，与人免疫球蛋白或抗体氨基酸进行比对时，所述区
与人框架或恒定区序列享有至少80-90°/。， 90-95%，或95-99%同一性 (即，本地序列同一性)，从而允许，例如，保守性取代，共有序列取代， 种系取代，回复突变等。保守性取代，共有序列取代，种系取代，回 复突变等的引入，通常是指人源化抗体或链的"优化"。短语"基本 来自非人免疫球蛋白或抗体"或"基本上非人类的"是指与非人类有 机体，例如，非人类哺乳动物的免疫球蛋白或抗体序列享有至少 80-95%，优选为至少90-95%,更优选为，96%， 97%， 98%，或99% 同一性的免疫球蛋白或抗体序列。
因此，人源化免疫球蛋白或抗体，或人源化免疫球蛋白或抗体链 的全部区和残基，可能除了CDRs，都与一种或多种人免疫球蛋白序列 的对应区或残基基本上一致。术语"对应区"或"对应残基"是指当 出于比较目的对第一条和第二条序列进行最佳比对时，占据与第一条 氨基酸或核苷酸序列上的区或残基相同(即，等同)位置的位于第二条氨 基酸或核苷酸序列上的区或残基。
优选地，人源化免疫球蛋白或抗体可以对应非-人源化抗体3， 4， 或5倍的亲合力与抗体结合。例如，如果非-人源化抗体具有109M—^勺 亲合力，则人源化抗体就具有至少3x 109M"， 4x 109M—、或5 x 109M" 的亲合力。当对免疫球蛋白或抗体的结合性质进行描述时，可根据该 链产生"指导抗原(例如，A/3或5T4)结合"的能力进行描述。当使完 整的免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)具有特异性结合性质或结 合亲合力时，该链被称为"指导抗原结合的"。与含有缺乏所述突变 的等同链的抗体(或其抗原结合片段)所造成的影响相比，如果突变影响 (例如，降低)含有所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段) 的结合亲合力达到至少一个数量级，那么就认为突变(例如，回复突变) 在很大程度上影响了重链或轻链指导结合抗原的能力。与含有缺乏所述突变的等同链的抗体(或其抗原结合片段)所造成的影响相比，如果其 影响(例如，降低)含有所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合 片段)的结合亲合力仅为其两倍，三倍或四倍，那么就认为突变"未在 很大程度上影响(例如，降低)了链指导抗原结合"。
术语"嵌合免疫球蛋白"或抗体是指其可变区得自第一物种而其 恒定区得自第二物种的免疫球蛋白或抗体。可通过，例如遗传工程， 从归属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建嵌合免疫球蛋白或抗 体。术语"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗体"并未意图包括如本 说明书所定义的嵌合免疫球蛋白或抗体。尽管人源化免疫球蛋白或抗 体在其构造上是嵌合的(即，含有来自超过一种蛋白的区)，其还包括在 本发明所定义的嵌合免疫球蛋白或抗体中未被发现的其他特征(即，含 有供体CDR残基和受体框架残基的可变区)。
可通过本领域公知的重组DNA技术，例如在Robinson等人的国 际申请PCT/US86/02269; Akira等人的欧洲专利申请第184,187号； Taniguchi， M的欧洲专利申请第171,496号；Morrison等人的欧洲专利 申请第173,494号；Neuberger等人的PCT国际公开WO 86/01533; Cabilly等人的美国专利第4,816,567号；Cabilly等人的欧洲专利申请 第125,023号；Better等人的(1988) Science 240:1041-1043; Liu等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443; Liu等人(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura等人(1987) Cane. Res. 47:999-1005; Wood等人(19S5) Nature 314:446-449;以及Shaw等人(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi等人(1986) BioTechniques 4:214; Winter的美国专利第5,225,539号；Jones等人 (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan等人(1988) Science 239:1534;禾口 Beidler等人(1988) J. Immunol. 141:4053-4060所述的方法制备这样的嵌 合和人源化单克隆抗体。通过例如，缺失，加入，或取代抗体其他部分，例如恒定区的修 饰得到的单克隆、嵌合和人源化抗体也在本发明的范围之内。例如，
可对抗体进行以下修饰(i)用其他的恒定区，例如旨在增加所述抗体 半衰期，稳定性或亲合性的恒定区，或来自其他物种或抗体类型的恒 定区来替换所述恒定区；或(ii)通过对所述恒定区内的一个或多个氨基 酸进行修饰，从而改变，例如，糖基化位点的数量，效应细胞的功能， Fc受体(FcR)结合，补体结合等等。改变抗体恒定区的方法是本领域内 公知的。可通过用不同的残基替换所述抗体恒定区的至少一个氨基酸，
来制备具有改变的功能，例如，对效应配基，例如细胞上的FcR，或补 体的Cl成分的亲合性的抗体(参见，例如，欧洲专利第388,151号A1， 美国专利第5,624,821号和美国专利第5，648，260号，在此将其全文引 用作为参考)。也可对类似的改变类型进行描述，如果应用于鼠类，或 其他物种的免疫球蛋白的话，会降低或消除这些功能。
例如，通过使用在其侧链上具有适合的官能团的残基替换特定的 残基，或通过引入荷电的官能团，例如谷氨酸或天冬氨酸，或可能是 芳香非极性残基，例如，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸或丙氨酸，有可 能改变抗体(例如，IgG，例如人IgG)的Fc区，对于FcR(例如，Fc Y Rl)， 或对于Clq结合的亲合性(参见，例如美国专利第5,624,821号)。
来自转基因动物和噬菌体显示的人类抗体
可选择地，现在有可能制备这样的转基因动物(例如，小鼠)，其能 够，在免疫之后，在不产生内源性免疫球蛋白的条件下产生人类抗体 的全部组成成分(repertoire)。例如，已有描述认为，在嵌合和种系突
变小鼠中抗体重链结合区(JH)基因的纯合缺失导致了内源性抗体产生
的完全抑制。在这类种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转 移导致了在抗原刺激之后人类抗体的产生。参见，例如，美国专利第 6,150,584号；第6,114,598号和第5,770,429号。
从噬菌体显示文库中也可以得到全部的人类抗体(Hoogenboom等，J. Mol. Biol.， 227:381 (1991); Marks等，J. Mol. Biol.， 222:581- 597 (腦))。
双特异性抗体，抗体融合多肽，以及单链抗体
双特异性抗体(BsAbs)是对至少两个不同表位具有结合特异性的 抗体。这类抗体可从全长抗体或抗体片段(例如，F(ab)'2双特异性抗体) 得到。制备双特异性抗体的方法是本领域内公知的。全长双特异性抗 体的常规制备是基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中这两条 链具有不同的特异性(Millstein等，Nature, 305:537-539 (1983))。由于 免疫球蛋白重链和轻链的随机配合，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生了不 同抗体分子的潜在混合物(参见，WO 93/08829以及Traunecker等， EMBOJ.， 10:3655-3659 (1991))。
双特异性抗体还包括交联或"异源结合物(heteroconjugate)"抗 体。例如，在异源结合物抗体中的一种可与抗生物素蛋白结合，而另 一种则与生物素或其他有效载荷(payload)相结合。可使用任意方便 的交联方法制备异源结合物抗体。适合的交联剂是本领域所公知的， 并在美国专利第4，676，980号中得以公开，同时还公开了许多交联技术。
在另一个实施方案中，所述抗体可以化学或遗传地，融合到有效 载荷结构域，例如，免疫毒素从而制备出抗体融合多肽。这些有效载 荷包括，例如，免疫毒素，化疗剂，以及放射性同位素，所有这些都 是本领域内公知的。
如本发明所述，单链抗体同样也适用于稳定化。该片段包括通过 连接物连接于轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)，其允许每个可变区 相互接触并且重新构建母抗体(parent antibody)的抗原结合袋，从中 可得VL和VH区。参见Gruber等，J. Immunol.， 152:5368 (1994)。
抗-A/3抗体一般地，本发明的抗体包括通过靶向A^肽，用于治疗淀粉样变性 疾病，尤其是阿耳茨海默氏病的抗体。
术语"淀粉样变性(amyloidogenic)疾病"包括任和与不溶性淀 粉样纤维形成或沉淀相关(或由此引起)的疾病。示例性的淀粉样变性疾 病包括，但不限于，系统性淀粉样变性病，阿耳茨海默氏病，成熟糖 尿病发作，帕金森氏症，杭廷顿氏舞蹈病，额颞性痴呆，以及朊病毒-相关的传染性海绵状脑病(人类中的苦鲁病和克鲁-雅氏病以及分别在 羊和牛中的搔痒病和BSE)。根据所沉淀纤维多肽成分的性质，对不同 的淀粉样变性疾病进行了定义和表征。例如，在患有阿耳茨海默氏病 的受验者或患者中，/3-淀粉样蛋白(例如，野生型，变异的，或截短的/3-淀粉样蛋白)是淀粉样沉淀的特征性多肽成分。因此，阿耳茨海默氏病 是例如，在受验者或患者大脑中"以A/3沉淀为特征的疾病"或"与A/3 沉淀相关疾病"的示例。术语"/3-淀粉样蛋白"，"/3-淀粉样肽"，"|3-淀粉体"，"A/3"和"A/3肽"在本说明书中可交替使用。在对哺乳动 物进行给药时，可任意地与佐剂向结合，"免疫源性剂"或"免疫原" 能够诱导对该动物产生免疫反应。
在本说明书中，术语"A口抗体"，"抗A口抗体"和"抗A口" 可交替使用，且其所指为结合于APP， A口蛋白或这二者的一个或多个 表位或抗原决定簇的抗体。可以在人淀粉样前体蛋白(APP)中找到示例 性的表位或抗原决定簇，但优选地可在APP的A/3肽中找到。APP以 多种异构体形式存在，例如APP695 , APP^禾Q APP77Q。可根据APP770 同功型的序列对APP内的氨基酸分配数字号码(参见，例如，GenBank Accession No. P05067)。A/3肽(在本说明书中也可以指卩淀粉样肽和A" 是约4kDa的APP内部的39-43氨基酸片段(A/339， A/340， A/341, A/542 和A/343)。 A/340,例如，由APP的672-711残基组成，而A/342则由 APP的672-713残基组成。作为体内或原位的不同分泌酶对APP的蛋 白水解处理结果，可以同时得到"短形式"，长度为40个氨基酸，以 及"长形式"，长度为42-43氨基酸的A0肽。表位或抗原决定簇可定位于A/3肽的N-末端内，并包括A/3的1-10氨基酸残基，优选为来自 A/342的1-3， 1-4， 1-5， 1-6， 1-7， 2-7， 3-6或3-7，或在A/3的2-4， 5， 6， 7或S残基内，A/3的3-5， 6， 7， 8或9残基，或A042的4-7， 8， 9或10残基。"中间的"表位或抗原决定簇可位于肽的中间或中 间部分，并包括的16-24， 16-23， 16-22， 16-21， 19-21， 19-22， 19-23或19-24位氨基酸。"C-末端"表位或抗原决定簇位于A/3肽的 C-末端内，并包括A/3的33-40， 33-41或33-42氨基酸残基。
在多种实施方案中，A/3抗体具有末端特异性。在本说明书中，术 语"末端特异性"是指这样的抗体，其能够特异性的结合于肽的 N-末端或C-末端残基，但当存在于含有所述残基的更长A/3类型或存 在于APP中时，却不能识别相同的残基。
在多种实施方案中，A/3抗体具有"C-末端特异性"。在本说明书 中，术语"C-末端特异性"是指特异性识别A/3肽游离C-末端的抗体。 C-末端特异性抗体的示例包括这样的情况识别末端在40位残基 的A/3肽，但却不能识别末端在41， 42和/或43位残基A/3肽；识别末 端在42位残基的A/3肽，但却不能识别末端在40， 41和/或43位残基 的A^肽，等等。
在一个实施方案中，所述抗体可以是3D6抗体或其变体，或10D5 抗体或其变体，这二者都可见于美国专利公开第2003/0165496 Al号， 美国专利公开第2004/0087777 Al号，和国际专利公开第WO02/46237 A3号。3D6和10D5的描述还可见于国际专利公开第WO02/088306 A2 号以及国际专利公开第WO02/088307 A2号。3D6是单克隆抗体(mAb)， 其能够特异性地结合位于人/3-淀粉样肽内，具体地，残基1-5的N-末 端表位。相比较而言，10D5也是单克隆抗体(mAb)，其能够特异性地 结合位于人P-淀粉样肽内，具体地，残基3-6的N-末端表位。在又一 个实施方案中，所述抗体可以是12B4抗体或其变体，如美国专利公开 第2004008276 2A1号和国际专利公开第WO03/077858 A2号所述。12B4是单克隆抗体(mAb)，其能够特异性地结合位于人/3-淀粉样肽内， 具体地，残基3-7的N-末端表位。在又一个实施方案中，所述抗体可 以是12A11抗体或其变体，如美国专利申请第10/858,855号和国际专 利申请第PCT/US04/17514号所述。12A11是单克隆抗体(mAb)，其能 够特异性地结合位于人/3-淀粉样肽内，具体地，残基3-7的N-末端表 位。在又一个实施方案中，所述抗体可以是266抗体，如美国专利申 请第10/789,273号和国际专利申请第WO01/62801 A2号所述。设计成 特异性结合位于人/3-淀粉样肽内C-末端表位的适用于本发明的抗体包 括，但不限于369.2B，如美国专利第5,786,160号所述。
在示例性的实施方案中，所述抗体可选自能够选择性结合A/3肽的 人源化的抗A/5肽3D6抗体，人源化的抗A/3肽12A11抗体，人源化的 抗A/3肽10D5抗体，人源化的抗A^肽12B4抗体和人源化的抗A/3肽 266抗体。更具体地，人源化的抗A/3肽3D6抗体被设计成特异性地结 合位于人^-淀粉样1-40或1-42肽内的NH2-末端表位，所述淀粉样肽 是在脑内的斑块沉淀(例如，在罹患阿耳茨海默氏病的患者)中找到的。
Fc融合蛋白
在某些实施方案中，本发明的核酸分子编码融合或嵌合蛋白。融 合蛋白可包括靶向部分，例如，可溶性的受体片段或配体，以及免疫 球蛋白链，Fc片段，重链恒定区包括各种亚型IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgM， IgAl， IgA2， IgD和IgE。例如，融合蛋白可包括受体的 细胞外结构域，以及，例如，融合于人免疫球蛋白Fc链(例如，人IgG， 例如，人lgGl或人IgG4，或其突变形式)。在一个实施方案中，人Fc 序列可在一个或多个氨基酸上突变，例如在野生型序列的254和257 残基上突变从而降低Fc受体结合。融合蛋白还可额外地包括将第一个 部分与第二个部分，例如免疫球蛋白片段连接起来的连接物序列。例 如，融合蛋白可包括肽连接物，例如，约4-20，更优选为5-10个氨基 酸长度的肽连接物；所述长度为8个氨基酸的肽连接物。例如，融合 蛋白可包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽连接物，其中y为1，2， 3， 4， 5， 6， 7或8。在其他实施方案中，可向融合蛋白的N-或C-末端添加额外的氨基酸序列，从而促进表达，立体结构挠性，测定和/ 或分离或纯化。
可通过标准DNA重组技术制备本发明的嵌合或融合蛋白。例如， 可通过常规技术，例如，通过钝-末端或粘-末端连接，限制性酶消化提 供适当的末端，需要时进行粘末端补平，碱性磷酸酶处理以避免不希 望的连接，以及酶连接，将编码不同多肽序列的DNA片段按读框连接。 在其他实施方案中，可通过包括自动DNA合成的常规技术合成融合基 因。或者，可使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物 能够增加两条连续基因片段之间的互补突出，这两条序列可随后退火 并重新扩增从而产生嵌合的基因序列(参见，例如，Ausubel等人(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992)。 除 此之外，有许多编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区)的表达 载体是可商业获得的。免疫球蛋白融合多肽是本领域公知的，且可参 见，例如，美国专利第5,516,964号；第5,225,538号；第5,428,130号； 第5,514,582号；第5，714,147号和第5，455,165号的描述。
核酸分子，构建体和载体
本发明示例性实施方案的特征在于设计成消除不需要或不希望的 副产物，尤其是不需要或不希望的抗体(或免疫球蛋白)副产物的工程化
构建体。在某些方面，所述构建体包括天然存在的抗体基因序列的成 分，其中该成分可被遗传化改变，修饰，或工程化(例如，遗传工程化)
从而使得所得构建体能在没有不需要或不希望副产物的条件下表达感 兴趣的所希望蛋白(例如，抗体)。可使用本领域所公知的制备重组核酸 分子(例如，包括免疫球蛋白链基因的成分)的技术制备构建体，如下详 述。
抗体基因序列可编码多种亚型的抗体，包括IgG(例如，IgGl， IgG2， IgG3， IgG4)， IgM， IgAl， IgA2， IgD或IgE。优选地，所述抗体基因序列编码的抗体是IgG亚型。所编码的免疫球蛋白或抗体分子
可以包括全长(例如，IgGl或IgG4免疫球蛋白)或可以仅包括片段(例 如，Fc片段)。
本领域所属技术人员应该理解，使用遗传密码和标准分子生物学 技术，可从本申请所述的核苷酸和氨基酸序列，或从本领域公知的其 他来源的免疫球蛋白基因序列得到编码本发明抗体的核苷酸序列。可 从公知的免疫球蛋白DNA(例如，cDNA序列)得到本发明的核酸组成。 特别地，核苷酸序列可与天然的V， D， J，或恒定区cDNA序列基本 上相同或从其衍生。重链和轻链恒定区基因的序列是本领域公知的。 优选地，所述恒定区是人类的，但也可以使用来自其他物种，例如， 啮齿类(例如，小鼠或大鼠)，灵长类(短尾猿)，骆驼，或兔子的恒定区。 来自这些物种的恒定区是本领域所公知的(参见，例如，Kabat， E.A等 人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，且可通过标准PCR扩增获得含有这些区域的DNA片段。重链 恒定区可以是IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgA， IgE， IgM或IgD的恒 定区。至于重链恒定区的序列是本领域所公知的，且可以在，例如， NCBINGJ)01019中找到。在一些实施方案中，所述恒定区是IgGl或 IgG4恒定区。对Fc片段重链基因而言，编码Fc的DNA可被可操作地 连接于重链引导序列(例如，重链可变区引导序列)用于直接表达。
本发明的其他方面包括拼接的免疫球蛋白DNA盒序列。拼接的免 疫球蛋白盒序列包括由免疫球蛋白DNA盒核苷酸序列编码的核酸序列 以及氨基酸序列。
在此提供了示例性的人IgGl恒定区基因组序列
GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGC CTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCATGAGCCCA
GACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGG
GGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTC
ACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC
GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGG
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG
CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC
TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC
ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGG
AGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCT
GGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAG
GCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCC
CCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAG
GCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCT
GCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAG
CCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCA
TCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCA
AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTA
AGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGT
GCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGT
GCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCC
TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG
ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT
GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA
GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGG
TGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCT
GCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGG
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG
GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG
CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
在此还提供了示例性的IgG4恒定区基因组序列
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG
AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCAC AGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTCCGCAAGGCAGGCCCCATCTGTCTCCTCACCTGGAGGCCTCTGA
CCACCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGATTTTTC
CACCAGGCTCCGGGCAGCCACAGGCTGGATGCCCCTACCCC
AGGCCCTGCGCATACAGGGGCAGGTGCTGCGCTCAGACCTG
CCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGC
AACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC
CGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGTCAGCTCGGCCCA
ATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT
GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAAT GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA (SEQ ID NO:3)抗体制备
本发明的抗体通常是通过重组表达制备的。可将编码轻链和重链 的核酸插入到表达载体中。可将轻链和重链克隆至相同或不同的表达
载体中。可将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接于表达载体
中确保免疫球蛋白多肽的表达的控制序列。表达控制序列包括，但不 限于，启动子(例如，天然关联的或异源启动子)，信号序列，增强元件， 以及转录终止序列。优选地，表达控制序列是在能够转化或转染真核
宿主细胞(例如，COS或CHO细胞)的载体中的真核启动子系统。
根据如上所述操作分离的遗传材料从而提供本发明多肽后，通常 可将所述基因插入表达载体用于导入宿主细胞，所述载体可用来制备 所希望量的修饰抗体，这样的抗体反过来提供了权利要求所述的多肽。 术语"载体"包括了核酸构建体，其常常包括核酸，例如基因，且还 包括核酸复制，转录，稳定性和/或来自宿主细胞蛋白表达或分泌所必 需的最少元件。这样的构建体可以染色体外元件的形式存在，或可以 整合入宿主细胞的基因组。
术语"表达载体"包括特定类型的载体，其中对所述核酸构建体 进行优化从而获得所希望蛋白产物的高水平表达。表达载体常常含有 诸如启动子和增强子元件的转录调节因子，其被优化从而在特定的细 胞类型中获得高水平的转录，和/或对其进行优化从而使得在使用了特 定的诱导剂时，所述表达是组成型的。表达载体还具有提供适当和/或 增强的蛋白翻译的序列。如本领域所属技术人员所公知的，这样的载 体可方便地选自质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒。术语"表达盒" 包括含有基因和除该基因之外能够允许在宿主细胞中适当和或增强地 表达所述基因的元件。术语"可操作地连接"包括毗连(juxtaposition)，其中所述成分 以允许它们以其预期方式发挥功能(例如，功能性连接)的关系相连。例 如，可将可操作地连接于感兴趣多核苷酸的启动子/增强子连接于所述 多核苷酸，从而在能够激活由所述启动子/增强子指导表达的情况下获 得所述感兴趣多核苷酸的表达。至于本说明书所述的发明，可操作地 连接还包括在感兴趣基因的原始转录物(前-mRNA)中发现的剪接供体
和剪接受体位点的关系。 一般地，剪接受体和供体位点是可操作连接 的，其中需要两个序列，且共同发挥作用从而产生了所得成熟信使 RNA。
短语"天然可操作连接"是指在其天然或自然状态下发现的基因 的内含子和外显子的结构(organization)。克隆感兴趣基因的方法之 一涉及从所述基因中分离核酸，包括外显子和内含子，并将所述核酸 序列插入载体进而对这些核酸序列进行扩增。还可以将全部基因序列 插入用于在相同或不同物种中表达所述蛋白的表达载体中。当含有内 含子和外显子的基因，被发现正以其天然状态存在形式被克隆时，可 认为所述内含子和外显子保留了其天然可操作连接。
表达载体在宿主有机体中通常是可复制的，就像游离体(episome) 或宿主染色体DNA的整合部分一样。通常，表达载体含有选择标记(例 如，氨苄抗性，潮霉素抗性，四环素抗性，卡那霉素抗性或新霉素抗 性)从而允许用所希望的DNA序列来检测那些转化的细胞(参见，例如， Itakiira等人的美国专利第4,704,362号)。除了免疫球蛋白盒序列，插 入序列和调控序列，本发明的重组表达载体还可携带其他的序列，例 如能够在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制原点)和选择性标 记基因序列。选择性标记基因可协助选择导入了载体的宿主细胞(参见， 例如，Axel等人的美国专利第4,399,216号，第4,634,665号和第 5,179,017号)。例如，通常，选择性标记基因都会向导入了所述载体的宿主细胞赋予药物抗性，例如G418抗性，潮霉素抗性或氨甲蝶呤抗性。 优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(适用于在 dhft-宿主中进行氨甲蝶吟筛选/扩增)和neo基因(用于G418筛选)。
一旦将载体整合入适当的宿主中，就可将宿主保持在适于所述核 苷酸序列高水平表达，和收集和纯化所希望的抗体的条件下。哺乳动 物细胞本发明抗体的表达和制备所优选的。参见，例如，Winnacker， F薩Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y.， N. Y. (1987)。真核细胞 是优选的，因为已有多种能够分泌异源蛋白(例如，完整的免疫球蛋白) 的适合宿主细胞系在本领域中得到了开发，包括有CHO细胞系，各种 COS细胞系，HeLa细胞，优选地，骨髓瘤细胞系，或转化的B-细胞或 杂交瘤。优选地，所述细胞是非人类的。优选的适于表达本发明抗体 的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfTCHO细胞， 参见Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220， 与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621所述)，淋巴细胞系，例如，NSO骨髓瘤细胞和SP2 细胞，COS细胞，和得自转基因动物的细胞，例如，乳腺上皮细胞。 其他适合的宿主细胞是本领域所属技术人员公知的。
适用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制原点， 启动子，和增强子(Queen等人，Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必 要的处理信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷 酸化位点，和转录终止子序列。优选的表达控制序列是得自免疫球蛋 白基因，SV40，腺病毒，牛乳头瘤病毒，巨细胞病毒等等的启动子。 参见，例如，Co等人，(1992) J. Immunol. 148:1149。优选的适用于哺 乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物中高水平蛋白表达 的病毒元件，例如得自FF-la启动子和BGH多聚A，巨细胞病毒 (CMV)(例如CMV启动子/增强子)，猴肾病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚启动子(AdMLP))和多瘤病毒 的启动子和/或增强子。对病毒调节元件，及其序列的进一步描述，请 参见，例如Stinski等人的美国专利第5，168，062号，Bell等人的美国专 利第4，510，245号，和Schaffher等人的美国专利第4,968,615号。在示 例性的实施方案中，可将抗体重链和轻链基因可操作地连接于增强子/ 启动子调节元件(例如，得自SV40， CMV，腺病毒等，例如CMV增强 子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件) 从而驱动所述基因的高水平转录。在本发明的示例性实施方案中，所 述构建体包括了内部核糖体进入位点(IRES)从而在真核宿主细胞中提 供了相对高水平的本发明多肽。美国专利第6，193，980号公开了相容的 IRES序列，在此将其全文引用作为参考。
或者，可将抗体-编码序列整合入转基因中，从而引入到转基因动 物的基因组并在该转基因动物的乳汁中得到随后的表达(参见，例如， Deboer等人的美国专利第5,741,957号，等人的美国专利第5,304，489 号和Meade等人的美国专利第5,849,992号)。适合的转基因包括轻链 和/或重链的编码序列，其可操作地与来自乳腺特异性基因，例如酪蛋 白或/ 乳球蛋白的启动子和增强子连接。
原核宿主细胞也可适用于制备本发明的抗体。E. coli是一种特别 适用于克隆本发明多核苷酸(例如，DNA序列)的原核宿主。其他适用 于该用途的微生物宿主包括杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，肠杆菌属，例如大肠杆菌，沙门氏菌和沙雷氏菌，以及各种 假单孢菌类型。在这些原核宿主中，本领域所属技术人员同样可制备 表达载体，所述表达载体可通常含有与该宿主相容的表达控制序列(例 如，复制原点)。此外，还可存在有任意数量的各种公知的启动子，例 如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，/3-内酰胺酶启动子系统， 或来自噬菌体A的启动子系统。所述启动子通常控制表达，任选通过操纵子来进行，且具有核糖体结合位点序列等等，从而启动和完成转 录和翻译。
原核生物中的蛋白表达通常都是在E.COli中，采用含有指导融合
或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行的。融合载 体可向其中所编码的抗体，通常是重组抗体的恒定区上加入多个氨基
酸，而不会影响该抗体的特异性或抗原识别。融合肽氨基酸的加入可
向抗体添加额外的功能，例如作为标记(例如，表位标签，例如myc或 flag)。
其他的微生物，例如酵母，同样也可用于表达。酵母属 (Saccharomyces)是优选的酵母宿主，其具有适合的载体，所述载体 拥有所希望的表达控制序列(例如，启动子)，复制原点，终止序列等等。 常见的启动子包括3-磷酸甘油酯激酶和其他的糖酵解酶。可诱导的酵 母启动子包括，特别是，来自乙醇脱氢酶，异细胞色素C，以及负责麦 芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
或者，可在转基因植物(例如，烟草，玉米，大豆和紫花苜蓿)中制 备本发明的抗体。改良的'植物抗体，载体(Hendy等人(1999) J. Immunol. Methods 231:137-146)和纯化策略以及可转化作物品种的增加 使得这样的方法不仅对人类和动物治疗，而且还对工业应用(例如，催 化性抗体)成为制备重组免疫球蛋白的实际和有效的方法。而且，植物 制备的抗体还表现得安全而有效且避免了使用源自动物的材料，且因 此避免了具有传染性海绵脑病(TSE)制剂的污染风险。此外，植物和哺
乳动物细胞制备抗体的糖基化模式差异对抗体结合或特异性影响微弱 或没有影响。而且，在接受源自植物的分泌性二聚体IgA抗体的局部 口服应用的患者中也没有观察到毒性或HAMA的证据(参见，例如， Larrick等人(1998) Res. Immunol. 149:603-608)。可使用多种方法在转基因植物中表达重组抗体。例如，可将抗体
重链和轻链独立地克隆入表达载体(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)载体)，然后使用重组细菌或直接转化的方法在体外进行 植物组织转化，例如，使用随后采用轰击方式被物理性导入植物组织 的载体所包被的颗粒。随后，将表达单独链的整株植物重建，然后进 行有性杂交，最终制备了完全组装和具有功能的抗体。类似的规程已 被用于在烟草植物中表达功能性抗体(参见，例如，Hiatt等人(1989) Nature 342:76-87)。在不同实施方案中，可使用信号序列来启动所述表 达，通过将所述链指引入适当的植物环境(例如，apoplasm或其他特定 植物组织，包括块茎、果实或种子的水环境)中对未组装的抗体链进行 结合和折叠(参见Fiedler等人(1995) Bio/Technology 13:1090-1093)。植 物生物反应器同样可用来提高抗体产量，和明显降低成本。
适合的宿主细胞在Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego， Calif—书中
有更详细的讨论。或者，可使用，例如T7启动子调节序列和T7聚合 酶在体外对重组表达载体进行转录和翻译。
可根据细胞宿主的各种类型，通过公知的方法，将含有感兴趣多 核苷酸序列的载体(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)转入宿 主细胞中。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理，电 穿孔，脂质体转染，基因枪(biolistic)或基于病毒的转染则可用于其 他细胞宿主(通常可参见Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press， 2nd ed.， 1989，出于全部 目的在此将其全文引用作为参考)。其他用于转化哺乳动物细胞的方法 包括聚凝胺(polybrene)，原生质体融合，脂质体，电穿孔，和显微 注射(通常可参见，Sambrook等人得著作，以上所述)。为了制备转基因动物，可将转基因显微注射入受精卵中，或整合入胚胎干细胞的基 因组中，并将这种细胞的细胞核转入去核的卵细胞中。
当重链和轻链被克隆至单独的表达载体上时，可将所述载体共转 染从而获得完整免疫球蛋白的表达和组装。
一旦得以表达，可使用本
领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀，亲合柱，柱层析，HPLC纯化，凝
胶电泳等纯化本发明的完整抗体，其二聚体，单独的轻链和重链，或
其他免疫球蛋白形式(通常可参见Scopes ， Protein Purification (Springer-Verlag， N. Y.， (1982))。对制药而而言，至少约90-95%同质 的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，而98-99%或更高的同质性是更优 选的。
如本发明所述制备的免疫球蛋白或抗体可进行衍生或连接于其他 功能性分子(例如，其他肽或蛋白)。因此，可对本说明书中本发明的抗 体或抗体部分或所述抗体的修饰形式进一步地衍生从而用于研究，诊 断和/或治疗性范围。例如，可将本发明的抗体或抗体部分功能性地连 接于(通过化学偶联，遗传融合，非共价连接或其他)一种或多种其他分 子实体，例如其他抗体(例如双特异性抗体或双特异抗体(diabody))， 可检测试剂，细胞毒性剂，药物制剂，和/或蛋白或肽，这些实体可介 导所述抗体或抗体部分与其他分子(例如链亲和素核心区或聚组氨酸标 签)连接。
可通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型的，例如，来 制备双特异性抗体)制备一类衍生抗体。适合的交联剂包括那些异源双 功能的交联剂，其具有被适当间隔物(例如，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同源双官能团(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)分 隔的具有不同反应活性的基团。这类交联剂可购自Pierce Chemical
Company, Rockford， IL。示例性的荧光可检测剂包括荧光素，荧光素异硫氰酸酯，若丹明， 5-二甲基胺-l-萘磺酰氯，藻红蛋白等等。也可使用可检测的酶，例如 碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，P-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖 氧化酶等等对抗体进行衍生。当用可检测的酶对抗体进行衍生时，可
通过加入所述酶用来产生可检测反应产物的其他试剂来进行测定。例 如，当存在辣根过氧化物酶检测剂时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加 入可导致有颜色的反应产物，该产物是能被检测的。还可以使用辅基(例 如，链亲和素/生物素和亲和素/生物素)对抗体进行衍生。例如，可使用 生物素对抗体进行衍生，并通过间接测定亲和素或链亲和素结合的来 进行检测。适当的荧光材料示例包括伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰 酸酯，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材 料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶，虫荧光 素和水母发光蛋白，且适合的放射性材料示例包括1251， 1311， "S或311。
还可将抗体(或其片段)结合于治疗性部分，例如细胞毒素或其他治疗性 蛋白。或者，可将抗体结合于第二抗体从而形成抗体异源结合物，如
Segal等人的美国专利第4，676，980号所述。
用于降低或消除不希望的多肽副产物的表达载体 在开发适用于治疗性蛋白的蛋白表达系统过程中，对纯化靶产物 的HPLC分析鉴定了意外低分子量(LMW)类型的肽。更具体地，在开 发用于表达3D6抗体的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中观察到了意外的 多肽副产物。在别处也有对该抗体的描述，同时该抗体也是开发适用 于治疗阿耳茨海默氏病的免疫治疗剂的诸多努力的结果。其具有对于
八-/3肽的特异性并被证明了可有效清除A-Z3斑块。除了用于对含有表达 盒细胞进行选择性培养的基因，还可使用本领域可接受的方法以及含 有的3D6抗体重链和轻链的拷贝开发CHO细胞系。对所述细胞的众多克隆分离物进行的检测表明，LMW类型的产生 并不是被使用的该克隆特异性现象，即，在全部被测细胞系中所产生 的全部蛋白只有一少部分是意外的LMW类型。还进一步观察到，当蛋 白表达受到诱导时，相对于总蛋白LMW类型的比例有所增加。使用质 谱对多肽的进一步测定说明，所述LMW类型含有所述基因的外显子序 列未能预测出的氨基酸。
图1的顶部图版示意性地表示出了具有内含子和外显子关系以及 内部核糖体进入位点(IRES)和二轻叶酸还原酶(DHFR)选择性标记基因 的位置的3D6重链表达盒。所示的外显子是可变区重链(VHl),铰链区 和恒定区重链l， 2，和3(Ch1， Ch2， Ch3)。所述表达盒的内含子被表 示为Intl, Int2， Int3和Int4。图1还给出了从得自表达盒的mRNA所 预测的正确的剪接事件。中部的图版所示为仅含有双顺反子转录物内 含子序列的正确剪接的mRNA。
在表达载体中的内含子和外显子序列进行的仔细检查以及质谱数 据指出了对特异性剪接位点接头的RNA聚合酶内含子连读(IRT)。因为
在所述表达载体中内含子和外显子以及剪接位点供体和受体位点之间 的组织结构与所述基因原始基因组结构中的情况基本上一致，所以错 误间接事件是很难预测的。
图1的底部图版所示为由第四内含子的内含子连读所产生的预测 产物。图2提供了 3D6抗体表达载体基因组序列第四内含子区域中 DNA序列正义和反义链的序列信息。剪接接头(剪接供体和受体位点) 由与该核酸序列垂直的竖线表示。对应于内含子序列的DNA以下划线 和斜体表示。所希望产物的和连读副产物多肽的预测氨基酸表示在基 因组DNA的反义链下方。得自正确剪接RNA的多肽的氨基酸序列以 粗体的大写字母表示；得自错误剪接RNA的多肽副产物以小写字体表示。
本发明描述了设计蛋白表达盒以及载体的材料和方法，从而使得
可以在很大程度上降低或完全消除内含子连读(IRT)和不希望的多肽副 产物。部分地，本发明提供了新的载体设计，其中在编码感兴趣蛋白 的分离核酸中的内含子和外显子天然可操作连接被改变，从而降低或 消除了 IRT，由此降低或消除了不希望的IRT多肽类型。所述独特的 改变特别适合于IgGl或lgG4抗体，但可用于任意感兴趣的基因。此 外，具有改变后的天然可操作连接的内含子和外显子的本发明载体显 示，与使用本领域公认的标准技术设计的载体相关，不仅降低或消除 了IRT副产物，还增加了蛋白表达水平。
实施例 材料与方法
在所有实施例中，除非特别指明，否则所使用的都是下文所例示 的材料和方法
一般地，本发明的实施采用了在分子生物学，重组DNA技术，以 及免疫学，尤其是，例如抗体技术领域中公知的技术。参见，例如， Sambrook， Fritsch and Maniatis， Molecular Cloning (分子克隆)Cold Spring Harbor laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (抗体工程规程)(Methods in Molecular Biology (分子生物学方法))， 510， Paul, S,， Human Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (抗体工程实用方法)(Practical Approach Series, 169)， McCafferty, Ed IRL Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual (抗 体实验室手册)，Harlow等，Cold Spring Harbor Press, (1999);和 Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学最新夫见禾呈)eds. Ausubel等，John Wiley & Sons (1992)。实施例l内含子连读转录的定量
为了对内含子连读所形成异常转录本的相对量进行定量，设计了
定量PCR分析。评价IRT转录的方法已在图3中所示。具体地，使用 TaqMan3系统设计定量PCR分析，其中使用PCR扩增来定量感兴趣的 核酸类型。设计了三组探针引物来确定所产生的内含子连读mRNA部 分。第一组探针引物被设计成定量与感兴趣内含子天然可操作连接的 外显子序列的转录水平。在3D6重链表达盒的情况中，含有3D6第二 恒定区重链(CH2)外显子的mRNA类型是靶位点。这为3D6 mRNA的 总产物提供了度量方式。第二组探针引物桥接了可操作连接的内含子 和外显子，在这里，连接的是3D6表达盒的CH2外显子-第四内含子的 界面。对来自这一探针引物组的扩增说明了存在有含有5'剪接供体序 列的内含子连读转录物，以及存在有桥接有CH2外显子和内含子4的 序列。第三组探针引物靶定的是第四内含子的序列。这组探针提供了 对含有内部内含子4序列的错误剪接RNA部分的定量分析。
图4所示为使用所述探针引物组得到的Q-PCR分析结果。简言之， 将含有稳定整合有表达载体的CHO细胞接种并在培养基中维持两周。 在第7天对培养物进行诱导从而提高增强表达。在实验过程中，将细 胞培养物的样本裂解，并使用如前一段中所述的对CH2外显子或内含 子具有特异性的探针和引物组进行分析对RNA含量进行评估。图表所 示为在诱导之前低水平的错误剪接RNA产物，以及在诱导之后含有内 含子4的RNA百分比随时间而增高。在此所述的Q-PCR方法可预测 这样的可能性，即含有以天然可操作连接的内含子和外显子的特定表 达盒能够产生内含子连读副产物。
尽管已经清晰地提供了对3D6抗体表达系统的IRT进行定量的详 细内容，但依然能够在存在有潜在IRT的任意蛋白表达系统中实施该 项技术。本发明的新方法，因此，特别适用于评估是否本发明的载体(以下详述)能够适合特定的感兴趣蛋白，从而避免不希望的IRT多肽副产 物的产生。当IRT转录本的丰度大于约0.1%-1%时，可使用具有经改 变的天然可操作连接的载体来表达所希望的蛋白。本领域所属技术人 员应该很容易理解，测定内含子连读mRNA的方法，以及由此，预测 是否可将内含子连读多肽应用于其中发生剪接事件的任意蛋白表达系 统的方法。例如，所述系统可用于任意真核细胞系统，例如，酵母， 果蝇，小鼠，猴子，兔子，大鼠，或基于人类细胞的系统。
实施例2具有修饰的天然可操作连接的内含子和外显子的载体 可对表达载体进行设计，其中对内含子和外显子的天然可操作连 接进行修饰。两种示例性的载体序列可见于图5。该图所示为开发用于 解决内含子连读副产物问题的表达构建体。顶部图板所示为含有可变 区(Vh)，三个恒定区(ChI, Ch2， CH3)和铰链区外显子的一般性抗体重 链的基因组，内含子-外显子组织结构。中部和底部图板描述了对整合 入表达载体的基因组序列进行的修饰，其能够消除内含子连读重链副 产物。
可使用具有3D6抗体完整基因组重链序列或其中内含子和外显子 的天然可操作连接受到修饰的经过修饰的3D6重链表达载体来转化表 达3D6轻链的CHO细胞。可使用如材料与方法中所述的用于蛋白表达 目的的标准技术来培养所述细胞。从经过处理的上清液中纯化抗体， 并随后是用变性反相(RP)HPLC进行级分分离(图6)。通过过柱使得抗 体的重链和轻链组分得以分离。
在代表3D6基因组克隆蛋白制备组分的顶部轨迹中，重链和轻链 的峰是显而易见的。此外，还可在重链和轻链组分之间辨识到对应于 重链内含子连读产物的一个小峰。底部的轨迹是减少了内含子连读问题的表达系统的示例。与顶部
的轨迹一样，轻链和重链峰都是清晰可见的，然而，IRT的水平却降低 到了检测限以下。可将这一发现扩展到内含子和外显子的天然可操作 连接受到改变的其他载体中去。例如，图5所示的HCA内含子4序列 就类似地将IRT降低至不可检测的水平。
表1所示为图5所示HCA内含子4序列的详细情况。
表1:hu3D6 v2 HC-A4GTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGG CTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGG GCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCC CCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGG GCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGC AGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCC
TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAA ATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT GCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA
实施例3去除内含子增强蛋白表达
为了测定内含子去除对抗体表达的效果，可使用不同数量内含子构建的抗体的表达构建体。12A1W3.1可变区在CHO细胞中是稳定表 达的，与此同时具有基因组序列、cDNA序列和缺失了三个内含子(即， CH1和铰链区之间的内含子，铰链区和CH2之间的内含子，以及CH2 和CH3之间的内含子)的基因组序列的三个恒定区表达构建体也可在 CHO细胞中稳定表达。对12Allv3.1而言，内含子的去除使得抗体表 达明显增加。更具体地，与基因组序列相比，缺失了 12Allv3.1的三 个内含子的构建体测定的表达升高了约5倍。与基因组序列相比，具 有cDNA序列的12Allv3.1构建体表现出约6倍的表达升高。然而， 表达良好的抗体通常在CHO-细胞表达时并不表现出在内含子缺失序 列和基因组序列之间之间的明显变化
虽然出于明确理解的目的已对前述发明进行了详细描述，但显而 易见可在所附权利要求的范围之内进行某些修饰。出于全部目的，本 说明书所引用的全部出版物和专利文件，以及出现在图表和序列表中 的全部文字，在此都被全文引用作为参考，其程度就像其中的每个都 被单独指明那样。
根据在此被引作参考的说明书范围之内的参考文献的教导，可以 完全理解本说明书。在说明书范围内的实施方案提供了在本公开中对
实施方案的说明并且不应该被解释为是对本发明范围的限制。本领域 所属技术人员可容易地理解许多其他的实施方案都包括在本公开之 内。本公开中所有被引用的出版物和专利以及通过获取号或数据库参
考编号鉴定的序列都被全部引用作为参考。就参考文献与本说明书中 相互冲突或不一致的材料而言，本说明书可替代任意的这类材料。在 此所引用的任意参考都并非意味着承认这些参考是本公开的现有技 术。
除非特别指明，所有表示成份量，细胞培养，处理条件，以及用于本说明书中，包括权利要求中的数字，都应该被理解成在所有情况下都被术语"约" 所修饰。因此，除非另外表明相反的意思，数字参数都是大约值，且可以根 据旨在获得本发明所希望性质的情况变化而变化。除非另有所指，可将在一 些列成份之前的术语"至少"理解为是指该系列中的每一个成份。本领域所 属技术人员应该意识到，或能够确定，在不使用超过常规实验的条件下，存 在有许多在此所述的本发明特定实施方案的等同替换。这些等同替换也被包 括在以下权利要求的范围之内。
权利要求
1.编码Aβ-抗体链的核酸分子，所述核酸分子含有具有一或多个内含子和外显子序列的核苷酸序列，与天然存在的基因组序列相比较，其中至少一个内含子序列缺失从而降低了错误剪接或内含子连读(IRT)副产物。
2. 编码A/3-抗体链的核酸分子，所述核酸分子含有具有一或多个内含子和外显子序列的核苷酸序列，与天然存在的基因组序列相比较， 其中至少一个内含子序列缺失从而增强了蛋白表达。
3. 权利要求1或2的核酸分子，其中至少3个内含子序列缺失。
4. 权利要求1-3任一项的核酸分子，其中所述抗体链是重链或其 片段。
5. 权利要求4的核酸分子，其中所述抗体重链或其片段含有人免 疫球蛋白G亚型的重链可变区，铰链区，第一恒定区(CH1)，第二恒定 区(CH2)和第三恒定区(CH3)。
6. 权利要求5的核酸分子，其中所述免疫球蛋白G亚型是人IgGl 或人IgG4。
7. 权利要求6的核酸分子，其中所述人IgGl或人IgG4是突变的。
8. 权利要求5的核酸分子，其中位于所述免疫球蛋白重链恒定区 的CH2区和CH3区之间的内含子缺失。
9. 权利要求8的核酸分子，还包括位于CH1区与铰链区之间的内 含子的缺失。
10. 权利要求8的核酸分子，还包括位于铰链区与CH2区之间的 内含子的缺失。
11. 权利要求5的核酸分子，所述核酸分子具有含有位于重链可 变区与CH1区之间的一个内含子的重链。
12. 权利要求5的核酸分子，其中编码重链铰链区，以及第一， 第二和第三恒定区的核苷酸序列含有与图8(SEQIDNO: l)所示核苷酸 序列至少95%同一性的序列。
13. 权利要求5的核酸分子，其中编码重链铰链区，以及第一， 第二和第三恒定区的核苷酸序列含有与图9(SEQ ID NO: 3)所示核苷酸 序列至少95。/。同一性的序列。
14. 权利要求8的核酸分子，其中在CH2和CH3之间内含子的缺 失对应于图8(SEQIDNO: l)所示的人IgGl的约1409-1505位核苷酸。
15. 权利要求8的核酸分子，其中在CH2和CH3之间内含子的缺 失对应于图9(SEQIDNO: 3)所示的人IgG4的约1401-1497位核苷酸。
16. 权利要求9的核酸分子，其中在CH1和铰链区之间内含子的 缺失对应于图8(SEQIDNO: l)所示的人IgGl的约525-915位核苷酸。
17. 权利要求9的核酸分子，其中在CH1和铰链区之间内含子的 缺失对应于图9(SEQ ID NO: 3)所示的人IgG4的约525-916位核苷酸。
18. 权利要求10的核酸分子，其中在铰链区和CH2之间内含子的 缺失对应于图8(SEQ ID NO: l)所示的人IgGl的约961-1078位核苷酸。
19. 权利要求10的核酸分子，其中在铰链区和CH2之间内含子的 缺失对应于图9(SEQ ID NO: 3)所示的人IgG4的约953-1070位核苷酸。
20. 含有编码人IgGl核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序 列与图IO(SEQIDNO: 5)所示的序列具有至少卯％的同一性。
21. 含有编码人IgG4核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序 列与图ll(SEQIDNO: 6)所示的序列具有至少90%的同一性。
22. 编码人重链恒定区的基因组核苷酸序列，或其突变形式，其 中所述核苷酸序列缺少至少一个存在于天然存在基因组序列中的内含 子，且其中该内含子促进内含子连读。
23. 编码人IgGl的基因组核苷酸序列，或其突变形式，其中所述 核苷酸序列缺少至少一个存在于天然存在基因组序列中的内含子，且 其中所述内含子促进内含子连读。
24. 权利要求22或23的核苷酸序列，其中的至少一个内含子是 位于恒定区CH2和CH3之间的内含子。
25. 编码人IgG4的基因组核苷酸序列，或其突变形式，其中所述 基因组序列缺少三个存在于天然存在基因组序列中的内含子。
26. 权利要求25的核苷酸序列，其中所述内含子是位于CH1和铰 链区之间的内含子，位于铰链区与CH2之间的内含子，以及位于CH2 和CH3之间的内含子。
27. 编码选择性结合A/3肽的抗体的核酸分子，所述核酸分子含有 下式所代表的核苷酸序列VH-Intl-CHl-Int2-铰链-Int3-CH2-CH3，其中vh是编码重链可变区的核苷酸序列； CH1， CH2和CH3是编码对应重链恒定区的核苷酸序列； 铰链是编码重链恒定区的铰链区的核苷酸序列；且 Intl, Int2和Int3是来自重链基因组序列的内含子。
28. 权利要求27的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码人免疫 球蛋白G的重链。
29. 编码选择性结合A/3肽的抗体的核酸分子，所述核酸分子含有 如下式所代表的核苷酸序列VH-Intl -CH1 -铰链-CH2-CH3 ，其中vh是编码重链可变区的核苷酸序列；CH1， Ch2和Ch3是编码对应重链恒定区的核苷酸序列；铰链是编码重链恒定区的铰链区的核苷酸序列；以及Intl是来自重链基因组序列的内含子。
30. 权利要求29的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码人免疫 球蛋白G的重链。
31. 含有权利要求5的核酸分子的表达盒。
32. 含有权利要求5的核酸分子的表达载体。
33. 权利要求32的表达载体，进一步含有在宿主细胞中增强复制， 选择，mRNA转录，mRNA稳定性，蛋白表达或蛋白分泌的一或多个 核苷酸序列。
34. 含有权利要求5的核酸分子的宿主细胞。
35. 含有权利要求31的表达盒的宿主细胞。
36. 含有权利要求32的表达载体的宿主细胞。
37. 权利要求36的宿主细胞，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞。
38. 表达选择性结合A/3肽并且基本上不含内含子连读(IRT)产物 的重组抗体或其片段的方法，所述方法包括向哺乳动物宿主细胞中引入权利要求5的核酸分子； 在允许表达重组抗体或其片段的条件下培养所述宿主细胞，由此 产生了宿主细胞的培养物；以及从宿主细胞的培养物中获得重组抗体或其片段。
39. 权利要求38的方法，进一步包括在来自所述宿主细胞的核酸 样品中鉴定IRT产物的步骤。
40. 权利要求39的方法，其中所述鉴定步骤包括 从宿主细胞的培养物中获得核酸样品；在允许所述核酸样品和探针杂交的条件下，将所述核酸样品与互 补于内含子和邻近的外显子序列的核酸探针接触；检测所得复合物，其中使用互补于内含子序列的核酸探针在所述 复合物样品中的检测显示了 IRT产物的存在。
41. 权利要求3S的方法，其中所述宿主细胞含有编码轻链可变区 和恒定区的核苷酸序列。
42. 增强选择性结合A/5肽的重组抗体或其片段的表达的方法，包括向哺乳动物宿主细胞中引入权利要求5的核酸分子；在允许表达重组抗体的条件下培养所述宿主细胞，由此产生了宿主细胞的培养物；以及从宿主细胞的培养物中获得重组抗体。
43. 权利要求42的方法，其中所述宿主细胞含有编码轻链可变区 和恒定区的核苷酸序列。
44. 制备选择性结合A/ 肽而且基本上不含内含子连读(IRT)重链 副产物的重组抗体或其片段的方法，所述方法包括在使重链和轻链表达的条件下，培养哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞含有权利要求5的核酸分子和编码选择性结合A/3肽的 抗体的抗体轻链的核酸。
45. 权利要求44的方法，进一步包括从所述培养物中纯化重链和 轻链。
46. 增强选择性结合A/3肽的重组抗体或其片段表达的方法，包括 在使重链和轻链表达的条件下，培养哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物细胞含有权利要求5的核酸分子和编码选择性结合A/3肽的抗体 的抗体轻链的核酸。
47. 权利要求46的方法，进一步包括从所述培养物中纯化重链和 轻链。
48. 在样品中检测IRT产物的方法，包括 从重组细胞中获得核酸样品；在允许所述核酸样品和探针杂交的条件下，将所述核酸样品与互 补于内含子和邻近的外显子序列的核酸探针接触；检测所得复合物，其中使用互补于内含子序列的核酸探针，在所 述复合物样品中的检测显示了 IRT产物的存在。
49. 选择性结合A/3肽的抗体或其抗原结合片段，是在允许抗体或 片段表达和组装的适当条件下，通过包括权利要求40所述步骤的方法制备的。
50. 权利要求49的抗体，所述抗体是嵌合抗体，人源化抗体，CDR-接枝抗体或体外生成的抗体。
51. 权利要求50的抗体，是人源化抗体。
52. 权利要求51的抗体，结合于人5T4。
53. 含有权利要求49的抗体以及药用载体的药物组合物。
54. 编码选择性结合A^肽的抗体重链的分离的核酸分子，所述核 酸分子含有修饰的可操作连接的人基因组内含子和外显子序列，其中 对内含子和外显子序列的天然可操作连接的修饰降低或消除了内含子 连读重链副产物的表达。
55. 权利要求54的分离的核酸分子，其中与含有天然可操作连接 的人基因组内含子和外显子序列相比，所述重链的表达被增强。
56. 权利要求55的核酸分子，其中的基因组外显子序列编码可变 区，铰链区，以及第一，第二和第三恒定区。
57. 权利要求56的核酸分子，其中第一，第二和第三恒定区是IgGl 恒定区。
58.权利要求56的核酸分子，其中第一，第二和第三恒定区是IgG4 恒定区
59. 权利要求56的核酸分子，其中的可变区是人源化可变区。
60. 权利要求56-59的核酸分子，其中的可变区特异性结合于A/3肽。
61. 权利要求56-59的核酸分子，其中的可变区含有来自小鼠3D6 抗体的互补决定区(CDRs)。
62. 权利要求54的核酸分子，含有一个内含子序列。
63. 权利要求54的核酸分子，含有两个内含子序列。
64. 权利要求54的核酸分子，含有三个内含子序列。
65. 编码结合A/3肽的抗体重链的核酸分子，所述核酸分子含有编 码可变区的外显子，该外显子可操作地连接于编码第一，第二和第三 恒定区的外显子，所述核酸分子还含有至少一个内含子序列，其中与 不含有所述内含子的结合于A^肽的编码抗体重链的核酸分子相比，所 述内含子序列增强了来自所述核酸分子的所述重链的表达，且其中所 述核酸分子并未导致内含子连读(IRT)重链副产物的翻译。
66. 含有前述权利要求任一项所述核酸分子的表达盒。
67. 含有前述权利要求任一项所述核酸分子的表达载体。
68. 权利要求67的表达载体，进一步含有编码选择性标记以及内 部核糖体进入位点序列(IRES)的基因。
69. 含有权利要求54-6S任一项的核酸分子的细胞。
70. 含有权利要求66的盒的哺乳动物细胞。
71. 含有权利要求67或68的载体的哺乳动物细胞。
72. 权利要求70或71的细胞，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞。
73. 编码IgGl重链的核苷酸序列，所述序列具有以下通式 VH-Int卜CHl-Int2-铰链-Int3-CH2陽CH3其中VH是任意的编码重链可变区的外显子；CHI， CH2和CH3是获自天然存在的IgGl重链基因的编码人重链 恒定区的外显子；Intl， Int2和Int3是得自所述基因的对应内含子，且Int2和Int3 可任选存在；且铰链是获自所述基因的编码铰链的外显子。
74. 权利要求73的序列，其中存在Int2和Int3。
75. 制备基本上不含内含子连读(IRT)重链副产物的抗体制剂的方 法，包括在使重链和轻链表达，以及在缺乏内含子连读(IRT)重链副产物时 将重链和轻链可操作连接的条件下，培养权利要求70-72任一项所述的 细胞，该细胞进一步包括结合A/3肽的编码抗体轻链的核酸分子。
76. 权利要求1或2的核酸分子，其中的抗体链具有SEQIDNO: 12所示的序列。
77.权利要求1或2的核酸分子，其中的抗体链具有SEQIDNO: 13所示的序列。77. 含有重链的A/3抗体，所述重链含有由SEQIDNO: 6-11中任 一核酸编码的恒定区和SEQIDNO: 2的核酸编码的可变区。
78. 含有重链的Ai8抗体，所述重链含有由SEQIDNO: 6-11中任 —核酸编码的恒定区和SEQIDNO: 4的核酸编码的可变区。
79. 含有重链的A]3抗体，所述重链含有由SEQIDNO: 6-11中任 一核酸编码的恒定区和具有图12-14或16C-D中任一图所示氨基酸序 列的可变区。
80. 权利要求77-80任一项的抗体，还包括图15或16A-B中一个 图所示的对应轻链。
全文摘要
本发明公开了经过修饰从而增强重组蛋白表达，例如，Aβ肽结合抗体的表达，和/或降低或消除错误剪接和/或内含子连读(IRT)副产物的核酸分子。本发明还提供了在适合重组Aβ肽结合抗体表达的细胞培养条件下，通过表达这样的核酸分子，制备没有错误剪接和/或内含子连读副产物的Aβ肽结合抗体的方法。
文档编号A61K31/70GK101287471SQ200580034045
公开日2008年10月15日 申请日期2005年10月5日 优先权日2004年10月5日
发明者杰森·劳斯, 马丁·西纳科雷 申请人:艾兰制药国际有限公司;惠氏公司